Diagnóstico anclivepa

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Diagnóstico anclivepa

  1. 1. CRITÉRIOS PARA ESCOLHA DE TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO: NA BANCADA E NO LABORATÓRIO CLÍNICO RICARDO WAGNER DIAS PORTELA, DVM PhD LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE UFBA
  2. 2. COM TANTAS TÉCNICAS DIFERENTES, E COM MUITAS DELAS DESTINADAS A DIAGNOSTICAR AS MESMAS PATOLOGIAS, QUAIS ESCOLHER? EM QUE SE BASEAR NA HORA DE RECEITAR OU UTILIZAR NA ROTINA LABORATORIAL?
  3. 3. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: </li></ul><ul><li>Especificidade </li></ul><ul><li>Diversidade </li></ul><ul><li>Memória </li></ul><ul><li>Especialização </li></ul><ul><li>Autolimitação </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  4. 4. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: </li></ul><ul><li>Especificidade – conferida por duas moléculas principais: </li></ul><ul><li>- TCR – presente na membrana de linfócitos; </li></ul><ul><li>- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais. </li></ul>
  5. 5. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.2- Principais isotipos de anticorpos </li></ul><ul><li>IgM </li></ul><ul><li>IgG </li></ul><ul><li>IgA </li></ul><ul><li>IgE </li></ul><ul><li>IgD </li></ul>
  6. 6. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.2- Principais isotipos de anticorpos: </li></ul><ul><li>IgM </li></ul><ul><li>IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade </li></ul><ul><li>IgA </li></ul><ul><li>IgE </li></ul><ul><li>IgD </li></ul>
  7. 7. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.2- Principais isotipos de anticorpos : </li></ul><ul><li>IgM </li></ul><ul><li>IgG – MARCADOR DE CONTATO DO INDIVÍDUO COM O AGENTE INFECCIOSO </li></ul><ul><li>IgA </li></ul><ul><li>IgE </li></ul><ul><li>IgD </li></ul>
  8. 8. Testes sorológicos Detecção de anticorpos específicos no soro, produzidos por um indivíduo após contato com agente infeccioso Anticorpo – marcador de infecção Somente produzido após contato com o Antígeno – RI Adaptativa
  9. 9. Estrutura dos Isotipos de Anticorpos: Os diferentes isotipos de Acs apresentam estruturas variadas
  10. 10. <ul><li>IgM </li></ul><ul><li>- Neutralizam toxinas </li></ul><ul><li>Fixam o complemento </li></ul><ul><li>Receptor de antígenos na superfície dos Linf. B </li></ul><ul><li>Marcador de fase aguda de doenças infecciosas </li></ul>
  11. 11. <ul><li>IgG </li></ul><ul><li>- Quatro subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 </li></ul><ul><li>neutralizam toxinas (todos) </li></ul><ul><li>fazem opsonização (IgG1 e IgG3) </li></ul><ul><li>fixam complemento (IgG1, IgG2 e IgG3) </li></ul><ul><li>são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2) </li></ul>
  12. 12. <ul><li>IgA </li></ul><ul><li>- neutralizam toxinas </li></ul><ul><li>bloqueiam a ligação de antígenos nas mucosas </li></ul><ul><li>Apresentam-se na forma dimérica </li></ul>
  13. 13. <ul><li>IgE </li></ul><ul><li>Levam a degranulação de mastócitos e basófilos. </li></ul><ul><li>Participam da imunidade contra helmintos </li></ul><ul><li>Participam das reações de Hipersensibilidades </li></ul>
  14. 14. Características dos Isotipos de Anticorpos:
  15. 15. Características dos Isotipos de Anticorpos:
  16. 16. Características dos Isotipos de Anticorpos:
  17. 17. Principais Características dos Ensaios de Imunodiagnóstico: <ul><li>Especificidade </li></ul><ul><li>Sensibilidade </li></ul><ul><li>Repetitividade </li></ul><ul><li>Reprodutibilidade </li></ul><ul><li>Limite de Detecção </li></ul><ul><li>Linearidade </li></ul>
  18. 18. <ul><li>ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE </li></ul><ul><li>- Especificidade : Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado. </li></ul><ul><li>Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas. </li></ul>
  19. 19. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Especificidade : Importante principalmente quando aplicada a doenças infecciosas. Doenças de notificação obrigatória – confere a certeza sobre o status infeccioso do paciente ou, no caso animal, evitando sacrifícios desnecessários e prejuízos. Importante para um correto controle sanitário de rebanho, evitando a introdução de animais infectados e a disseminação da doença. OBRIGATÓRIA ALTA ESPECIFICIDADE EM TESTES CONFIRMATÓRIOS
  20. 20. <ul><li>ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE </li></ul><ul><li>- Sensibilidade : Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada </li></ul><ul><li>-Quanto MAIOR a sensibilidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-negativos, MAIOR a possibilidade de detecção precoce de doenças. </li></ul><ul><li>Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes. </li></ul>
  21. 21. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Sensibilidade : Importante característica que se aplica principalmente a doenças infecciosas, marcadores tumorais e hormônios encontrados em baixa concentração. Um kit de alta sensibilidade permite a detecção precoce de patologias, levando a um tratamento mais efetivo e mais rápido, melhorando o prognóstico do paciente. ALTA SENSIBILIDADE OBRIGATÓRIA EM TESTES DE TRIAGEM
  22. 22. Curso do Processo Infeccioso: Parasitemia / Viremia / Bacteremia
  23. 23. Curso da Infecção: Concentração de Anticorpos e Número de Linfócitos T Efetores
  24. 24. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Exemplos Práticos: Ensaio com boa especificidade e baixa sensibilidade Interpretação dos Resultados: Resultado + - Confiável Resultado - - A confirmar
  25. 25. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Exemplos Práticos: Ensaio com alta sensibilidade e média especificidade Interpretação dos Resultados: Resultado + - A confirmar Resultado - - Confiável
  26. 26. CUSTO DO ENSAIO + SENSIBILIDADE / ESPECIFICIDADE = RELAÇÃO CUSTO / BENEFÍCIO
  27. 27. <ul><li>ADEQUAÇÃO DA AMOSTRA </li></ul><ul><li>As amostras disponíveis são compatíveis com a metodologia a ser empregada/proposta </li></ul><ul><li>AMOSTRA NÃO É SÓ SORO: Urina Fezes Líquido Céfalo-raquidiano Sêmen Lágrima Saliva </li></ul><ul><li>O perfil dos componentes das amostras podem interferir nos testes, p. ex. as enzimas da saliva, as bactérias das fezes... </li></ul>
  28. 28. <ul><li>Um teste sorológico pode ser qualitativo, </li></ul><ul><li>semi-quantitativo ou quantitativo: </li></ul><ul><li>- qualitativo , se os seus resultados informam apenas se </li></ul><ul><li>houve ou não reação / detecção ( positivo ou negativo ). </li></ul><ul><li>Veja um laudo imaginário: </li></ul><ul><li>Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra rubéola </li></ul><ul><li>Resultado: positivo </li></ul><ul><li>semi-quantitativo , se a amostra testada (soro) foi diluída – </li></ul><ul><li>a maior diluição a apresentar reação é o seu título. </li></ul><ul><li>Veja um laudo imaginário: </li></ul><ul><li>Teste – detecção por imunofluorescência de anticorpos IgG contra o T. cruzi </li></ul><ul><li>Resultado: positivo até a diluição de 1:320 </li></ul><ul><li>quantitativo, se é capaz de informar a quantidade absoluta do material detectado. </li></ul><ul><li>Veja um laudo imaginário: </li></ul><ul><li>Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra o T. gondii </li></ul><ul><li>Resultado: 63 UI/ml </li></ul>
  29. 29. Resultado de um teste ELISA Esta placa será lida por um fotocolorímetro, que informará os valores de den- sidade ótica. Todos aqueles que apresentarem resultados abaixo do “ cut-off” serão considerados negativos, enquanto que os que mos- trarem valores maiores, serão positivos. Trata-se portanto de um teste qualitativo Cont. negativo Cut-off Cont. positivo
  30. 30. Hemoaglutinação Passiva Teste semi-quantitativo Soros testes controle positivo controle negativo diluições seriadas dos soros testes de 1: 2 a .................. 1:1024 Na primeira fileira (de cima para baixo), a reação foi positiva até a diluição de 1:32 . Já na segunda fileira o resultado foi negativo em todas as diluições. O resultado do primeiro soro teste acima referido é: reagente até a diluição de 1:32 (ou título:1:32 ). O segundo soro teste é não reagente .
  31. 31. A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual é a sua finalidade. - Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados os testes falso-positivos. - Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares)– os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos (a repetição de um teste com resultado falso-positivo custa pouco, entretanto, a disseminação da doença em conseqüência de um resultado falso-negativo, tem que ser impedida a todo custo).
  32. 32. <ul><li>O QUE LEVAR EM CONTA NA HORA DE ESCOLHER O MÉTODO DE DIAGNÓSTICO? </li></ul><ul><li>-Sensibilidade; </li></ul><ul><li>Especificidade (confiabilidade de resultados); </li></ul><ul><li>Custo (PRIMORDIAL NA MED. VETERINÁRIA); </li></ul><ul><li>Disponibilidade de material; </li></ul><ul><li>Segurança; </li></ul><ul><li>Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada; </li></ul><ul><li>Tempo de realização do método. </li></ul>
  33. 33. <ul><li>Utilização de ensaios sorológicos: </li></ul><ul><li>Definição da suspeita clínica </li></ul><ul><li>Diferenciação de fases da doença </li></ul><ul><li>Diagnóstico de doença congênita </li></ul><ul><li>Triagem sorológica em banco de sangue </li></ul><ul><li>Seleção de doadores e receptores de órgãos para transplante </li></ul><ul><li>Prognóstico da doença </li></ul><ul><li>Avaliação / monitoramento da terapêutica </li></ul><ul><li>Diferenciação da imunidade naturalmente adquirida ou artificialmente </li></ul><ul><li>induzida </li></ul><ul><li>Estabelecimento da prevalência da doença </li></ul><ul><li>Verificação de erradicação da doença </li></ul><ul><li>Verificação de reintrodução de novos casos em áreas consolidadas </li></ul>
  34. 34. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS HISTÓRICO CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
  35. 35. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.1- Imunodifusão : Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar) </li></ul><ul><li>Diversos tipos: </li></ul><ul><li>Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente; </li></ul><ul><li>- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência. </li></ul>
  36. 36. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método qualitativo empregado para doenças infecciosas e autoimunes – Baixa Sensibilidade, boa especificidade Usado antigamente para diagnóstico sorológico de Brucelose, e algumas doenças virais EM DESUSO
  37. 37. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método quantitativo empregado para dosagem de moléculas presentes em alta quantidade em amostras, por exemplo, dosagem de Imunoglobulinas Totais. Baixa Precisão, baixa sensibilidade
  38. 38. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.2- Imunodifusão: </li></ul><ul><ul><li>Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado </li></ul></ul><ul><ul><li>Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas. </li></ul></ul><ul><ul><li>- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais. </li></ul></ul>
  39. 39. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos. </li></ul><ul><li>- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac; </li></ul><ul><li>Variações no método: Inibição da Aglutinação . </li></ul>
  40. 40. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método qualitativo e semi-quantitativo empregado para detecção de anticorpos específicos e moléculas abundantes em membranas de células. Utilizado ainda em Med. Veterinária, apesar de impreciso.
  41. 41. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.3- Hemoaglutinação: </li></ul><ul><li>Vantagens : Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Baixa sensibilidade e média especificidade, devido a mau armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos. </li></ul>
  42. 42. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.4- Fixação do Complemento : Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac. </li></ul><ul><li>Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento. </li></ul>
  43. 43. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento:
  44. 44. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.4- Fixação do Complemento: </li></ul><ul><li>Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer. </li></ul>
  45. 45. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor; </li></ul><ul><li>Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo </li></ul>
  46. 46. Outros componentes do soro ELISA “SANDWICH” Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase
  47. 47. ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase
  48. 48. ELISA DE CAPTURA Anticorpo anti-IgM IgM a ser detectada IgM inespecífica Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase
  49. 49. ELISA INDIRETA Antígeno purificado IgM a ser detectada IgM inespecífica Anticorpo conjugado TMB
  50. 50. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA: </li></ul><ul><li>Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. </li></ul><ul><li>Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação. </li></ul>
  51. 51. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA: </li></ul><ul><li>Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. </li></ul><ul><li>Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação. </li></ul>
  52. 52. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA: </li></ul><ul><li>Método Quantitativo de melhor relação custo/benefício em veterinária, para quantificação de hormônios (sexuais, tireoidianos, hipofisários, metabólicos...) </li></ul><ul><li>Método de triagem para detecção de doenças infecciosas, alta sensibilidade, alta especificidade, mas podendo apresentar resultados falso-positivos, que devem ser confirmados por outros ensaios. </li></ul>
  53. 53. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica : Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos (IF Direta) e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos (IF Indireta) </li></ul><ul><li>Métodos de alta especificidade e boa especificidade </li></ul><ul><li>Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) </li></ul>
  54. 54. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
  55. 55. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: </li></ul><ul><li>Vantagens: Alta especificidade e boa sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular. </li></ul><ul><li>Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis. </li></ul>
  56. 56. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.7- Western-Blot : Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas </li></ul><ul><li>Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido </li></ul><ul><li>Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos </li></ul>
  57. 57. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:
  58. 58. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: Pode auxiliar na diferenciação de espécies de Leishmania que infectam o animal Diferenciação do animal infectado do vacinado (dependendo do tipo de vacina)
  59. 59. <ul><li>2.7- Western-Blot: </li></ul><ul><li>Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança. </li></ul><ul><li>POUCO DISPONÍVEL AINDA PARA VETERINÁRIA </li></ul>2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
  60. 60. <ul><li>Métodos de Diagnóstico utilizando </li></ul><ul><li>Avanços Biotecnológicos no Brasil </li></ul><ul><li>Leishmaniose canina – PCR, RFLP. </li></ul><ul><li>Babesia canis, Ehrlichia canis – RFLP, RAPD. </li></ul><ul><li>Leishmaniose – Citometria de Fluxo, Ags específicos </li></ul><ul><li>Animais de Produção – Busca de diagnóstico rápido e preciso, podendo ser realizado a campo. </li></ul>
  61. 61. SITUAÇÃO DA BIOTECNOLOGIA ANIMAL NO BRASIL: MERCADO BIOTECNOLÓGICO ANIMAL: Mercado brasileiro de vacinas: US$ 221 milhões (2006) Principalmente animais de produção, com participação de animais de companhia MERCADO EM FRANCA EXPANSÃO Não há dados disponíveis quanto ao diagnóstico veterinário
  62. 62. Colaboradores: Prof. Vasco Azevedo – ICB/UFMG Profa. Maria de Fátima Costa – ICS/UFBA Prof. Luis Pita – EMEV/UFBA Dr. Rodrigo Soares – CPqRR/FIOCRUZ-MG Dr. Lain Pontes-Carvalho – CPqGM/FIOCRUZ-BA Prof. Joaquin Patarroyo – DVT/UFV Doutorandos: Bruno Bastos Soraya Correa Mestrandos: Daniele Dantas Miriam Rebouças Gabrielle Rodrigues Ítala Fehlberg Inara Rodrigues Marcos Silva Andrea Magalhaes Osman Silva Jr. Patrícia Cisneiros Iniciação Científica: Ana Paula Portela Marilia Marques Jose Tadeu Raynal Ludmila Sena Aretha Alves Rejane Rodrigues Pesquisadores: Prof. Roberto Meyer Dra. Songeli Freire Profa. Lilia Moura Costa Profa. Vera Vale Prof. Ricardo Portela Dr. Edson Rodrigues Profa. Kyioko Abe-Sandes Profa. Ivana Nascimento www.labimuno.org.br

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