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Introdução   Cultivo de camarão no Brasil    (FAO, 2007) 2003: 90.190 t 2007: 65.000 t Enfermidades: desafios da ativi...
Introdução Medicamentos veterinários Oxitetraciclina (OTC) Prevenir ou tratar Exigências dos mercados: segurança  alim...
IntroduçãoObjetivou-se     validar   um   método      paradeterminação de OTC em camarão cultivado,utilizando a técnica de...
Revisão de literatura Produção de camarões   Tabela 1. Principais países produtores de camarão em 2005.   Principais país...
Revisão de literatura Brasil (ABCC, 2005a)                      Antidumping e                      enfermidades          ...
Revisão de literatura Enfermidades Vírus e bactérias     Figura 1. Camarão em grampo     Figura 2. Lesão no hepatopâncre...
Revisão de literatura Antibióticos na aquicultura Uso disseminado Ecotoxicidade em ambientes aquáticos Formas de admin...
Revisão de literatura Oxitetraciclina Ação e locais de ligação (ALIABADI e LEES,  2000; COUTO, 2000; OKA et al., 2000) ...
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Revisão de literatura Legislação para utilização de fármacos  em espécies animais BRASIL PCRP (BRASIL, 2006) PAMVet (BRA...
Revisão de literatura Métodos de análise de OTC em matrizes  animais Métodos oficiais  CLAE - músculo de bovinos e suíno...
Revisão de literatura Métodos para detecção de OTC por CLAE Macrobrachium rosenbergii (BRILLANTES et al., 2001) Penaeus j...
Revisão de literatura Validação de métodos analíticos Resultados confiáveis e qualidade analítica Exigência dos mercado...
Revisão de literatura   De acordo com o exposto, fatores    econômicos,      aspectos     sanitários   e    ambientais da...
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Artigo científico – Material e Métodos MaterialOTC comercial contendo 50% (m/m) de OTC baseRação contendo 35% de proteína...
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Artigo científico – Material e Métodos Validação da metodologia de análiseLaboratório de Contaminantes Químicos e Biológi...
Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalEstação Experimental Prof. Johei Koike (UFRPE)Camarões de faze...
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Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalAnimais coletadosCarapaça e músculo: congeladas para análise d...
Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalTemperatura           OxímetroOxigênio dissolvidoSalinidade - ...
Artigo científico – Material e Métodos RaçãoFornecida a aproximadamente 4% biomassa por dia e  dividida em duas alimentaç...
Artigo científico – Material e Métodos Análise de Vibrio sppSilva et al. (1997)Remoção dos hepatopâncreasDiluição, inocul...
Artigo científico – Material e Métodos Análise estatísticaExperimento OTC:Teste de Tukey com p< 0,05Bacteriologia: técnic...
Artigo científico – Resultados Resultados Metodologia e parâmetros de validaçãoTempo de retenção OTC: 6,2 – 6,9 minutos ...
Figura 2. Cromatogramas para OTC:(A) solução padrão OTC 0,1 µg mL-1(B) extrato do músculo do camarãofortificado a 0,1 µg g...
Figura 3. Cromatogramaspara carapaça isenta de OTC(A) e para carapaça comOTC (B).
Artigo científico – Resultados           Eliminação de resíduo de OTC no músculo e na            carapaçaTabela 1. Tempo ...
Artigo científico – Resultados                       0,20                                                   -1            ...
Artigo científico – ResultadosAnálise da OTC comercial utilizada nos tratamentosRótulo: 50%Resultado da análise: 5%Análise...
Artigo científico – ResultadosAnálise da águaTemperatura: 30,54 ± 2,78ºCSalinidade: 30,18 ± 0,61 g L-1pH: 8,36 ± 0,34Oxigê...
Artigo científico – Discussão Discussão LDM abaixo do LMR de 0,1 µg g-1 (EMEA, 1990) e o  mais baixo para um método que ...
Artigo científico – Discussão Os coeficientes de correlação linear em solução e no  extrato da matriz fortificado foram a...
Artigo científico – Discussão Observou-se que o número de Vibrio spp no  hepatopâncreas foi, em média, superior ao verifi...
Artigo científico – Discussão                     OTC x Interrupção                        crescimento                    ...
Artigo científico – Discussão Os níveis de OTC na carapaça podem diminuir em até  20% quando aplicou-se processos com ele...
Artigo científico – Conclusão ConclusãoFicou demonstrado que o método definido e validado   atende ao uso pretendido, por...
Artigo científico – Agradecimentos AgradecimentosUniversidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)Conselho Nacional de Des...
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Oxitetraciclina em camarão cultivado

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Oxitetraciclina em camarão cultivado

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE PESCA E AQUICULTURAPROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E AQUICULTURA Beatriz Regina Brito de Oliveira VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO Orientadora: Profa Dra Emiko Shinozaki Mendes Recife/PE Agosto, 2008
  2. 2. Introdução Cultivo de camarão no Brasil (FAO, 2007) 2003: 90.190 t 2007: 65.000 t Enfermidades: desafios da atividade Desequilíbrio ambiental Vulnerabilidade Bactérias oportunistas
  3. 3. Introdução Medicamentos veterinários Oxitetraciclina (OTC) Prevenir ou tratar Exigências dos mercados: segurança alimentar Europa (RASFF) Análise de resíduos Utilização de metodologias validadas Técnicas conceituadas
  4. 4. IntroduçãoObjetivou-se validar um método paradeterminação de OTC em camarão cultivado,utilizando a técnica de cromatografia líquida dealta eficiência (CLAE), e avaliar os níveis deresíduos da droga in vivo.
  5. 5. Revisão de literatura Produção de camarões Tabela 1. Principais países produtores de camarão em 2005. Principais países Produção (t) Produtividade produtores (kg/ha/ano) China 1.024.949 3.416 Tailândia 375.320 5.864 Vietnã 327.200 453 Indonésia 279.539 708 Índia 130.805 769 Equador 130.000 867 México 72.279 1.681 Brasil 65.000 4.333 Bangladesh 63.052 435 Filipinas 39.909 1.330 América Central* 41.919 1.048 * (Bahamas, Belize, Costa Rica, Cuba, El Salvador, Guatemala, Honduras, Jamaica, Nicarágua, Panamá, Porto Rico, República Dominicana) Fonte: FAO (2007)
  6. 6. Revisão de literatura Brasil (ABCC, 2005a) Antidumping e enfermidades 2003: 2004: 90.190 t 75.904 t Região Nordeste (SAMPAIO e COSTA, 2003):93% da produção nacionalEmpregos diretos e indiretos
  7. 7. Revisão de literatura Enfermidades Vírus e bactérias Figura 1. Camarão em grampo Figura 2. Lesão no hepatopâncreas Fonte: Lightner (1996) Fonte: Lightner (1996)Infecções secundárias: bacteriosesNHP: Rickettsia (FRELIER et al., 1992; LOY et al., 2003)Vibrioses: Vibrio spp (LIGHTNER, 1996)
  8. 8. Revisão de literatura Antibióticos na aquicultura Uso disseminado Ecotoxicidade em ambientes aquáticos Formas de administração Oxitetraciclina (LALUMERA et al., 2004; DIETZE et al., 2005; LYLE-FRITCH et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2006) Figura 3. Estrutura molecular da OTC. Fonte: (USP, 2005)
  9. 9. Revisão de literatura Oxitetraciclina Ação e locais de ligação (ALIABADI e LEES, 2000; COUTO, 2000; OKA et al., 2000) CIM vibrioses: 0,2 a 100 ppm ou mg L-1 (RUANGPAN e KITAO, 1992; LIGHTNER, 1997) Concentração OTC na ração:1,5 g Kg-1 por 14 dias (MOHNEY et al., 1997)4,5 a 22,5 g Kg-1 por 14 dias (BRAY et al., 2006)4,5 g Kg-1 por 14 dias (NOGUEIRA-LIMA et al., 2006) Sintomas (efeitos tóxicos para humanos)
  10. 10. Revisão de literatura Resistência bacteriana e implicações Subdosagens e superdosagens (MENDES et al., 2004) Bactérias resistentes: Seleção e propagação de genes de resistência (MORIARTY, 2004); Isolamento de cepas em áreas de aquicultura (TENDÊNCIA e DE LA PENA, 2001; LE et al., 2005); Efeitos dos fármacos em organismos não- alvo (HALLING-SORENSEN et al. 2000) Uso restritivo e consequências (HOLMSTRÖM, 2003)
  11. 11. Revisão de literatura Legislação para utilização de fármacos em espécies animais BRASIL PCRP (BRASIL, 2006) PAMVet (BRASIL, 2003) LMR para OTC FDA (1998): 2000 µg kg-1 em alimentos frescos EMEA (1990): 100 µg kg-1 de OTC CODEX (2006): 200 µg kg-1 de OTC em músculo de pescado
  12. 12. Revisão de literatura Métodos de análise de OTC em matrizes animais Métodos oficiais CLAE - músculo de bovinos e suínos (AOAC, 1995) Bacillus cereus (AOAC, 2000) Técnicas Eletroforese capilar Cromatografia Camada Delgada CLAE-DAD*
  13. 13. Revisão de literatura Métodos para detecção de OTC por CLAE Macrobrachium rosenbergii (BRILLANTES et al., 2001) Penaeus japonicus (UNO, 2004) Penaeus monodon (SANBGRUNGRUANG et al., 2004) Litopenaeus setiferus (REED, 2006) Litopenaeus vannamei (NOGUEIRA-LIMA et al., 2006*; FROONGSARNG et al., 2007; GOMEZ-JIMENEZ et al., 2008)
  14. 14. Revisão de literatura Validação de métodos analíticos Resultados confiáveis e qualidade analítica Exigência dos mercados ISO, USP, FDA, AOAC Documentação Características de desempenho ou parâmetros de validação (INMETRO, 2007)
  15. 15. Revisão de literatura De acordo com o exposto, fatores econômicos, aspectos sanitários e ambientais da utilização de OTC na carcinicultura ainda são pouco conhecidos e, portanto, faz-se necessária a validação e a implantação de metodologias para análise de OTC por CLAE. Ferramenta: Qualidade processo Métodos validados e produto Consolidação do Saúde pública consumo Estudos ambientais
  16. 16. Artigo científico“ DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR CLAE-DAD EM CAMARÃO MARINHO Litopenaeus vannamei (Boone, 1931)” REVISTA AQUACULTURE
  17. 17. Artigo científico – Material e Métodos Material e Métodos MaterialSolventes e reagentes grau CLAEPadrões de referência da USP (OTC e TC)
  18. 18. Artigo científico – Material e Métodos MaterialOTC comercial contendo 50% (m/m) de OTC baseRação contendo 35% de proteína brutaCamarões isentos de OTC e adicionados in vitro para os testes de validação
  19. 19. Artigo científico – Material e Métodos Preparação da amostraNogueira-Lima et al. (2006) com modificações: amostras de músculo e carapaça
  20. 20. Artigo científico – Material e Métodos  Técnica de extração da OTCTampão McIlvaine Adição de TCA 24% Amostra (1,0 g) Centrifugação SPE e evaporação Hexano, centrifugação e Repetição da extração e descarte da fase união dos sobrenadante superiorCLAE
  21. 21. Artigo científico – Material e Métodos Análise de OTC por CLAECondições cromatográficas:C18 Phenomenex (250 x 4,0 mm; 5 µm)Injeção: 50 µLDetecção: 365 nmFM (75:18:7):(A)OXA 0,01 M(B)ACN(C)MeOHFluxo: 1 mL minuto-1
  22. 22. Artigo científico – Material e Métodos Validação da metodologia de análiseLaboratório de Contaminantes Químicos e Biológicos(LEMI/ITEP)INMETRO (2007)Tempo de retençãoLinearidadeFaixa de trabalhoRecuperaçãoLimites de Detecção e Quantificação do Método (LDM e LQM)Seletividade
  23. 23. Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalEstação Experimental Prof. Johei Koike (UFRPE)Camarões de fazenda aclimatados por 30 dias em tanques de 500 L contendo água marinha tratada
  24. 24. Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalDensidade: 28 cam/tanqueTratamentos (duplicata):OTC na ração por 14 dias Testemunha 3000 µg OTC g-1 5000 µg OTC g-1 7000 µg OTC g-1
  25. 25. Artigo científico – Material e MétodosDesenho experimentalCÁ
  26. 26. Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalAnimais coletadosCarapaça e músculo: congeladas para análise de OTCHepatopâncreas: análise de Vibrio spp
  27. 27. Artigo científico – Material e Métodos Desenho experimentalTemperatura OxímetroOxigênio dissolvidoSalinidade - RefratômetropH – pHmetroAvaliados todos os tanques diariamente
  28. 28. Artigo científico – Material e Métodos RaçãoFornecida a aproximadamente 4% biomassa por dia e dividida em duas alimentações diáriasConcentração teórica de OTC fornecida na ração para cada tratamento:3000 µg g-1 120 µg g-15000 µg g-1 200 µg g-17000 µg g-1 280 µg g-1
  29. 29. Artigo científico – Material e Métodos Análise de Vibrio sppSilva et al. (1997)Remoção dos hepatopâncreasDiluição, inoculação, incubação e leitura
  30. 30. Artigo científico – Material e Métodos Análise estatísticaExperimento OTC:Teste de Tukey com p< 0,05Bacteriologia: técnica dos máximos e mínimosValidação: INMETRO (2007)
  31. 31. Artigo científico – Resultados Resultados Metodologia e parâmetros de validaçãoTempo de retenção OTC: 6,2 – 6,9 minutos (Figuras 1 e 2)Linearidade (coeficiente de correlação linear) na faixa de trabalho de 0,02 a 0,4 µg mL-1 ou g-1 : Em solução: 0,9998 Em extrato da matriz: 0,9997Recuperação relativa e incerteza de medição a 0,1 µg g -1: 106,0 ± 17,1%Repetitividade (coeficiente de variação): 16,1%LDM e LQM: 0,006 e 0,019 µg g-1, respectivamente.Seletividade: sem interferentes no TR do analito (Figura 2)
  32. 32. Figura 2. Cromatogramas para OTC:(A) solução padrão OTC 0,1 µg mL-1(B) extrato do músculo do camarãofortificado a 0,1 µg g-1 e(C) extrato do músculo de camarãoisento de OTC.
  33. 33. Figura 3. Cromatogramaspara carapaça isenta de OTC(A) e para carapaça comOTC (B).
  34. 34. Artigo científico – Resultados  Eliminação de resíduo de OTC no músculo e na carapaçaTabela 1. Tempo de depleção da OTC Tratamentos (µg g-1) Dia após a 3000 5000 7000 medicação Músculo Carapaça Músculo Carapaça Músculo Carapaça 1º 0,028 ± 0,006 0,14 ± 0,06 0,037 ± 0,007 0,15 ± 0,09 0,014 ± 0,004 0,051 ± 0,006 5º ND 0,049 ± 0,001 ND 0,045 ± 0,001 ND 0,017 ± 0,007 10º ND 0,019 ±0,007 ND ND ND ND 13º ND ND ND ND ND NDN = 4: ND = não detectável
  35. 35. Artigo científico – Resultados 0,20 -1 3000 µg g y = -50,638Ln(x) + 133,87 2 R = 0,7549 -1 0,16 5000 µg g y = -65,023Ln(x) + 149,61 2 R = 0,7643 -1 7000 µg g Nível OTC (µg g ) 0,12 y = -22,706Ln(x) + 49,309 -1 2 R = 0,9237 0,08 0,04 0,00 0 2 4 6 8 10 12 14 Dias após suspensão da medicaçãoFigura 3. Níveis de resíduo de OTC na carapaça nos diferentestratamentos
  36. 36. Artigo científico – ResultadosAnálise da OTC comercial utilizada nos tratamentosRótulo: 50%Resultado da análise: 5%Análise da ração utilizada nos tratamentosTratamento Concentração teórica Concentração real de OTC fornecida* de OTC fornecida*3000 µg g-1 120 µg g-1 8 µg g-15000 µg g-1 200 µg g-1 16 µg g-17000 µg g-1 280 µg g-1 20 µg g-1* Por camarão/dia
  37. 37. Artigo científico – ResultadosAnálise da águaTemperatura: 30,54 ± 2,78ºCSalinidade: 30,18 ± 0,61 g L-1pH: 8,36 ± 0,34Oxigênio dissolvido: 5,75 ± 0,82 mg L-1 Análise de Vibrio spp Tabela 2. Valores máximos e mínimos obtidos na contagem de Vibrio spp UFC mL-1 Tratamento (µg g-1) Máximo Mínimo Hepatopâncreas Água 3000 7,4 x 105 1,1 x 102 5000 8,9 x 105 4,2 x 102 7000 9,0 x 103 1,15 x 102
  38. 38. Artigo científico – Discussão Discussão LDM abaixo do LMR de 0,1 µg g-1 (EMEA, 1990) e o mais baixo para um método que utiliza CLAE-DADNogueira-Lima et al. (2006): 0,05 µg g-1Uno, 2004; Reed et al., 2004; Uno et al., 2006; Reed et al., 2006; Froongsarng et al., 2007; Gomez-Jimenez et al., 2008: entre 0,008 e 0,5 µg g-1. Recuperação relativa e repetitividade aceitáveis pelo Codex (2002) e recuperação maior que a obtida no método originalNogueira-Lima et al. (2006): 81,68 ± 1,54%
  39. 39. Artigo científico – Discussão Os coeficientes de correlação linear em solução e no extrato da matriz fortificado foram aceitáveis segundo INMETRO (2007); As concentrações reais de OTC fornecidas nas rações se encontraram abaixo da administração indicada por Lightner (1996) de 45 a 150 µg g-1 por camarão/dia devido a baixa concentração do fármaco comercial utilizado; RESISTÊNCIA SUBDOSAGENS BACTERIANA TRANSFERÊNCI ECOSSISTEMAS ADE SAÚDE HUMANA RESISTÊNCIA Holmström et al., 2003; Lalumera et al., 2004; Xuan Le et al., 2005; Christensen et al., 2006; Lyle-fritch et al., 2006
  40. 40. Artigo científico – Discussão Observou-se que o número de Vibrio spp no hepatopâncreas foi, em média, superior ao verificado na água; Não foi verificada diferença estatística entre os tratamentos em relação aos resultados bacteriológicos, assim como também não foi possível estabelecer relação entre estes e os níveis de OTC na carapaça e no músculo; O tempo de depleção da OTC na carapaça (13 dias) foi maior que no músculo (5 dias); Nogueira-Lima et al. (2006): 25 dias (4500 µg g-1) Gómez-Jimenez et al. (2008): 10 dias (4500 µg g-1)
  41. 41. Artigo científico – Discussão OTC x Interrupção crescimento exoesqueleto (Bray et al., 2006) Propriedade deImportante lugar formar complexospara distribuição c/ cátions de OTC CARAPAÇA divalentes (Uno, 2004) (Arias et al., 2007) Formada 15 a 20% de quitina, 25 a 40% de proteína e 40 a 55% de sais carbonato cálcio (Martur e Narang, 1990)
  42. 42. Artigo científico – Discussão Os níveis de OTC na carapaça podem diminuir em até 20% quando aplicou-se processos com elevadas temperaturas; Quando o mesmo processo é aplicado em músculo, observou-se uma diminuiç4ao de até 80% (uno et al., 2006); Necessidade de avaliar o camarão inteiro e não somente o músculo, como recomendado pelo FDA e pela CE, que estabeleceram LMR de 0,1 e 0,2 para OTC em tecidos animais (EMEA, 1990; Codex, 2006).
  43. 43. Artigo científico – Conclusão ConclusãoFicou demonstrado que o método definido e validado atende ao uso pretendido, por apresentar um dos mais baixos limites de detecção definidos para métodos que empregam a CLAE-DAD; Os resultados de coeficientes de correlação para OTC em solução e no extrato da matriz fortificado, faixa de trabalho, recuperação relativa e repetitividade foram satisfatórios de acordo com as normas vigentes. O acúmulo de resíduo de OTC, quando administrada na ração, é maior na carapaça que no músculo devido sobretudo à composição estrutural da carapaça.
  44. 44. Artigo científico – Agradecimentos AgradecimentosUniversidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE)Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq)Agência Financiadora de Estudos (FINEP)Instituto de Tecnologia de Pernambuco (ITEP)

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