O artigo descreve um estudo que avaliou a atividade antifúngica in vitro e em alimentos do óleo essencial extraído das folhas de pompia (Citrus limon var. Pompia) contra Penicillium digitatum aplicado por contato de vapor. Os resultados mostraram que o óleo essencial inibiu significativamente o crescimento do fungo in vitro e reduziu a podridão de limões inoculados em 48%. O óleo essencial mostrou potencial como fumigante natural para controle pós-colheita de

1. [Limão Siciliano 009]
Óleo essencial: Citrus limon
Composto: Acetato de linalila, limoneno e isômeros de citral (neral e geranial)
Título: Antifungal activity in vitro and on food of the essential oil extracted from pompia
(Citrus limon var pompia) leaves against Penicillium digitatum applied by vapor contact
“Atividade antifúngica in vitro e em alimentos do óleo essencial extraído de folhas de
pompia (Citrus limon var pompia) contra Penicillium digitatum aplicado por contato de
vapor”
Autor: Donatella Danzi, Gianfranca Ladu, Cristina Veltkamp Prieto, Amada Garitas
Bullon, Giacomo L. Petretto, Francesco Fancello, e Tullio Venditti
Journal: Science of Food and Agriculture
Vol/Issue: Early View
Ano: 2020
DOI: 10.1002/jsfa.10394
TAGs: Pompia; limão; antifúngico; cadeia de alimentos; patógenos; micotoxinas;
extrato de folhas; contato de vapor; acetato de linalila; limoneno; in vitro; in vivo;
pesticida volátil; pesticida natural; atividade antimicrobiana; Penicillium digitatum; fungo;
contato de vapor; fumigação; fungicida; neral; geranial; propriedades organolépticas;
infecção fúngica; decomposição patológica de alimentos; segurança alimentar; frutas;
verduras; leguminosas; grãos; mofo verde; doença pós-colheita; frutas cítricas.
Sobre o artigo:
A decomposição patológica devido a infecções fúngicas é a principal causa que altera a
segurança e as propriedades organolépticas das culturas perecíveis (frutas, verduras,
leguminosas, grãos, etc) durante o armazenamento.

2. O valor dos alimentos diminui por causa da destruição de substâncias funcionais, a
produção de “Off-flavors” (sabor ou aspecto diferente do padrão) e por conta do risco
de doenças transmitidas relacionadas à ingestão de alimentos inseguros.
Os fungos são agentes biológicos universais capazes de colonizar frutas e vegetais ao
produzir várias enzimas degradantes da parede celular, que despolimerizam os
polissacarídeos da parede celular vegetal, causando distúrbios patológicos.
Como exemplo, o mofo verde, causado por Penicillium digitatum, que é a doença
pós-colheita mais importante de frutas cítricas produzidas em áreas com clima do tipo
mediterrâneo.
A infecção pode ocorrer no campo, mas durante o armazenamento, frutas e vegetais
são mais suscetíveis devido ao seu baixo pH, conteúdo de água, composição de
nutrientes e diminuição da resistência natural.
O desenvolvimento de cepas toxigênicas de fungos resulta em grandes perdas de
qualidade, teor de nutrientes e valor monetário. Além disso, os fungos filamentosos
apresentam notável potencial de produção de metabólitos secundários.
Esses metabólitos fúngicos venenosos, comumente chamados de micotoxinas, são de
grande importância para a segurança alimentar, portanto, a inibição do crescimento de
fungos é uma forma eficaz de prevenir o acúmulo dessas micotoxinas.
Produtos químicos são usados atualmente para controlar a decomposição durante o
armazenamento, mas sua utilização contínua tem sido uma das principais causas da
proliferação de cepas de patógenos resistentes.
Além disso, os consumidores estão mais conscientes dos riscos potenciais à saúde
associados aos resíduos de fungicidas sintéticos e estão cada vez mais interessados
em produtos tratados com compostos de fontes naturais.
Por isso, novas tecnologias mais seguras, sem riscos para os consumidores e com
baixo impacto ao meio ambiente, são cada vez mais solicitadas. Nesse sentido, os
óleos essenciais, que são metabólitos secundários das plantas, ricos em terpenos e

3. fenóis, são tradicionalmente utilizados por suas propriedades antibacterianas e
antifúngicas.
Muitos deles, como cravo, orégano, tomilho, manjericão ou canela, são classificados
como GRAS (geralmente reconhecido como seguro) pelo US-FDA (Food and Drug
Administration).
Atualmente, os esforços para desenvolver conservantes naturais no manejo
pós-colheita têm aumentado o interesse em aplicações de OEs que podem servir como
uma alternativa eficaz aos agentes antimicrobianos convencionais.
Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de determinar a composição
química e a atividade antifúngica, tanto in vitro quanto em alimentos de OE vegetais,
entre eles um cuidado especial foi dedicado aos extraídos de cítricos (OECs).
Em algumas áreas da costa nordeste da Sardenha, Itália, é cultivada uma variedade
endêmica de cítrico chamada pompia (Citrus limon var. Pompia), cujas origens ainda
são incertas, embora se pense que seja um híbrido entre cidra e limão ou cidra e
toranja.
Recentemente, pesquisadores relataram sobre a composição química dos extratos da
casca da fruta e o efeito protetor contra o estresse oxidativo nas células da pele,
enquanto outros concentraram suas pesquisas na caracterização química do OE das
folhas e na capacidade antioxidante e atividade antimicrobiana contra bactérias e
leveduras.
No entanto, até onde se sabe, não foram realizados estudos sobre a atividade
antifúngica do OE extraído de folhas de pompia para o controle de patógenos
pós-colheita.
Os métodos mais usados para avaliar as propriedades antimicrobianas dos OEs são a
difusão em ágar e a diluição em caldo, mas, na verdade, há uma falta geral de
sistemas capazes de simular condições reais de pré-tratamento.

4. Devido à sua bioatividade na fase de vapor, os OEs podem ser administrados como
fumigantes durante a proteção pós-colheita.
No entanto, em comparação com a abundância de evidências da eficácia dos OEs na
fase líquida, há poucos relatórios sobre os vapores dos OEs e, particularmente, sobre
os vapores dos OECs.
Diante do exposto, o objetivo dos pesquisadores desse estudo foi caracterizar o OE
extraído de folhas de pompia e avaliar, in vitro e em alimentos, sua eficácia contra
Penicillium digitatum quando aplicado por contato com vapor.
Para isso utilizou-se um aparelho adequado, desenhado e montado em laboratório, que
permite reproduzir condições reais em grande escala. Os resultados também foram
comparados com o Citral, um dos principais componentes presentes no OE extraído de
Citrus, aos quais muitos autores atribuem à eficácia antimicrobiana.
Resultados:
A análise dos dados apontou que a composição química do OE foi caracterizada por
grande quantidade de acetato de linalila (213,9 µg/mL), seguido do limoneno (219,7
µg/mL) e dos dois isômeros do Citral, o neral e geranial, que representou 77,1 e 105,4
µg/mL, respectivamente.
Os compostos detectados na fase de vapor dentro da caixa após 45 minutos foram os
mesmos identificados no óleo bruto. 27 componentes foram reconhecidos,
representando 99,5% de toda a composição do óleo, dos quais mais de 55% foram
representados por compostos oxigenados, onde o principal deles foi o limoneno (24%)
seguido pelo acetato de linalila que representou 17%.
A dinâmica de crescimento radial do patógeno, registrada por sete dias após a
inoculação do PDA, é relatada nas figuras 1, 2 e 3.
No ensaio de atividade antifúngica in vitro o tratamento realizado em T0 (tempo inicial)
indicou que o diâmetro da colônia aumentou com o tempo de incubação, mas foi

5. consideravelmente reduzido com o aumento da concentração de ambos os compostos
avaliados.
Em particular, com o OEP, o desenvolvimento micelial (desenvolvimento do fungo) foi
reduzido em 29%, em comparação ao controle, quando a fumigação foi realizada na
concentração de 50 µL/L (-1) e mais de 53% a 100 µL/L (-1) (Fig. 1a).
Figura 1: Crescimento radial de Penicillium digitatum colocado como suspensão de conídios e
exposto ao contato de vapor de (a) OEP ou (b) Citral, após 0 horas (T0) nas concentrações de
0, 50 ou 100 µL/L (-1). Os resultados são expressos como médias de diâmetros.
O efeito da fumigação realizada com Citral em T0 foi semelhante ao obtido com OEP
na concentração de 100 µL/L(-1), mas foi ligeiramente mais eficaz a 50 µL/L (-1) (Fig.
1b).

6. O crescimento micelial foi retardado ou completamente inibido quando as fumigações
foram adiadas por 24 horas, com algumas diferenças entre os dois compostos (Fig. 2a
e 2b).
Figura 2: Crescimento radial de Penicillium digitatum colocado como suspensão de conídios e
exposto ao contato do vapor de (a) óleo essencial de folhas de pompia ou (b) Citral, após 24
horas (T24) da inoculação do fungo, nas concentrações de 0, 50 ou 100 µL L -1. Os resultados
são expressos como médias de diâmetros.
O desenvolvimento do patógeno foi retardado por 72 h nas doses de 50 µL/L (-1) com
Citral ou 50 e 100 µL/L (-1) com OEP, mas depois voltou a crescer.
A redução final dos diâmetros das colônias registrada após 7 dias, foi de 51% com
Citral na concentração de 50 µL/L (-1) e 57 ou 71% com OEP nas doses de 50 e 100
µL/L (-1), respectivamente.

7. A fumigação mais eficaz foi obtida com Citral na dose de 100 µL/L (-1) que inibiu
completamente o desenvolvimento do patógeno.
Observou-se um mau controle do crescimento do fungo com os tratamentos realizados
em T48 (Fig. 3a e 3b), pois apenas 22,3 ou 29,4% de redução das colônias foi
alcançada, após 7 dia com OEP em concentrações de 50 ou 100 µL/L (-1), enquanto as
fumigações feitas com Citral tiveram ainda menos sucesso.
Figura 3: Crescimento radial de Penicillium digitatum colocado como suspensão de conídios e
exposto ao contato do vapor de (a) óleo essencial de folhas de pompia ou (b) Citral, após 48
horas (T48) da inoculação do fungo, nas concentrações de 0, 50 ou 100 µL/L (-1). Os
resultados são expressos como médias de diâmetros.
As observações de microscopia eletrônica de varredura foram realizadas para obter
mais informações sobre as alterações ultra-estruturais das células tratadas de P.
digitatum (Fig. 4a).

8. As hifas colapsadas foram particularmente evidentes como resultado do tratamento em
T0 com OEP a 100 µL/L (-1), enquanto os conídios relataram leves danos (fig. 4b). Os
tratamentos em T48 com OEP ou Citral causaram menos danos do que fumigações em
T0, os conídios estão desidratados mas as hifas não mostraram alterações (Fig. 4c e
Fig. 4d).
Figura 4: Micrografias eletrônicas de varredura de placas com Penicillium não tratadas e
tratadas (com óleo essencial de pompia ou Citral); (a) não tratado (1,000x): hifas e conídios não
danificados são claramente visíveis; (b) tratamento realizado em T0 com 100 µL/L (-1) de óleo
essencial de folhas de pompia (1,000x): as hifas estão completamente colapsadas enquanto os
conídios relataram leve dano;
(c) tratamento realizado em T48 com 100 µL/L (-1) de óleo essencial de folhas de pompia
(1.000x): conídios relataram danos leves (desidratação) enquanto hifas não são afetadas por

9. alterações; d) tratamento realizado em T48 com 100 µL/L (-1)de Citral (1.000x): hifas e conídios
relataram apenas leve dano.
No ensaio da atividade antifúngica em alimentos, no que se refere ao ensaio in vivo
realizado em limões inoculados artificialmente, as fumigações com OEP reduziram a
incidência de frutos infectados em relação ao controle, com um claro efeito
correlacionado com a concentração.
Após 7 dias de incubação a 20°C, o tratamento a 50 µL/L (-1) reduziu a podridão dos
frutos em 21%, enquanto a fumigação realizada a 100 µL/L (-1) foi mais bem-sucedida
com redução de 48% (Fig. 5).
Figura 5: Efeitos das fumigações com 0, 50 ou 100 µL/L (-1) de óleo essencial de pompia ou
Citral, sobre a porcentagem de feridas criadas em limões, inoculados artificialmente com
Penicillium digitatum.
Letras minúsculas diferentes, dentro da mesma concentração, indicam valores
significativamente diferentes. Letras maiúsculas diferentes, dentro do mesmo composto,
indicam valores significativamente diferentes.

10. Foi observado um efeito fraco nas frutas com as fumigações realizadas com Citral,
principalmente a 100 µL/L (-1), neste caso apenas 11,5% de redução da podridão foi
alcançada.
Portanto, pode-se compreender que o tratamento por contato de vapor com o OE foi
eficaz no controle do crescimento de patógenos in vitro, mas, acima de tudo, foi
bem-sucedido ao reduzir em 50% as partes podres in vivo.
Portanto, devido à sua bioatividade na fase de vapor, os OEs podem então ser usados
como fumigantes durante a proteção pós-colheita.
Na prática:
Os resultados do laboratório indicaram que o OE de Citrus limon variedade pompia é
um dos candidatos mais encorajadores, seguros e ecologicamente corretos para
gerenciar interações de patógenos nas plantas, contaminantes e deteriorações
alimentares. Portanto, pode ser considerado um potencial substituto dos fungicidas
sintéticos convencionais.