O documento descreve o ciclo de Krebs e a cadeia respiratória mitocondrial. O ciclo de Krebs converte acetil-CoA em oxaloacetato, gerando moléculas energéticas como NADH e FADH2. Estas moléculas transferem elétrons na cadeia respiratória, bombeando prótons através da membrana mitocondrial e gerando energia na forma de ATP.

1. Metabolismo

2. Metabolismo – Ciclo de Krebs Ciclo de Krebs (ou dos Ácidos TriCarboxílicos (TCA) ou do Citrato)

3. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) O Ciclo de Krebs inicia-se com a Acetil-CoA. Esta é produzida por desidrogenação do piruvato proveniente da glicólise. A Acetil-CoA pode tb. ser originada pela β -oxidação dos ácidos gordos ou a partir de aminoácidos e de corpos cetónicos. É um processo aeróbico que ocorre nas mitocôndrias . Não é apenas um processo energético. É uma via para a interconversão de diversos metabolitos, produção de substratos para a biossíntese de aminoácidos e de ácidos gordos e para a gluconeogénese. Dada a sua dupla natureza – catabólica e anabólica – diz-se que é um processo Anfibólico .

4. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) O processo de oxidação do piruvato a Acetil-CoA nas mitocôndrias é catalisado pelo complexo formado por um conjunto de 3 enzimas denominada piruvato-desidrogenase (também chamado piruvato-descarboxilase ). Há a formação de acetil-CoA e a libertação de uma molécula de CO2 por cada piruvato oxidado. É formado, também, um NADH na reação de desidrogenação, indo para a cadeia respiratória, uma vez que já está dentro das mitocôndrias. O processo envolve a participação de 5 coenzimas : - Pirofosfato de tiamina, Coenzima A, ácido lipóico, NAD + e FAD.

5. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) Complexo enzimático Piruvato Desidrogenase é constituído por 3 sub-unidades, com diferentes funções na conversão do piruvato a Acetil-CoA: Complexo Piruvato Desidrogenase

6. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) A actividade do Piruvato Desidrogenase é regulada alostéricamente (aumento das concentrações de NADH, Acetil-CoA e ATP inibe a actividade) por modificação covalente da estrutura do complexo promovida enzimaticamente. A inactivação do complexo ocorre quando as necessidades energéticas diminuem.

7. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.)

8. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) O Ciclo de Krebs compreende oito passos: Condensação Acetil-CoA (2C’s) com o Oxaloacetato (4C’s) , gerando Citrato (6C’s). Reacção catalisada pela Citrato Sintase . Isomerização Citrato – IsoCitrato catalizada pela enzima aconitase. Formação de cis -aconitato (produto intermédio) ligado à enzima. Oxidação do Citrato a β -Cetoglutarato catalizada pela Isocitrato Desidrogenase . NADH como transportador de electrões e libertação de CO 2 , proveniente do Acetil-CoA. Formação do intermediário Oxalo-Succinato ligado à enzima.

9. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) Descarboxilação oxidativa do α -Cetoglutarato a Succinil-CoA catalisada pelo complexo enzimático α -Cetoglutarato desidrogenase. Utiliza o NADH como transportador de H. Há libertação de mais uma molécula de CO 2 , último C proveniente do Acetil-CoA. Os passos seguintes têm como objectivo regenerar o oxaloacetato para reiniciar o ciclo. Desacilação do Succinil-CoA a Succinato catalisada pela succinil-CoA sintase gerando uma molécula de GTP (guanosina trifosfato), posteriormente convertida a ATP. Oxidação do Succinato a Fumarato catalisada pela enzima Succinato desidrogenase . FADH 2 como transportador de H.

10. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) Hidratação do fumarato a malato catalisada pela enzima fumarase ou fumarato hidratase . Desidrogenação do malato com regeneração do oxaloacetato , catalisada pela malato desidrogenase. NADH como transportador de electrões. O Ciclo de Krebs não termina verdadeiramente aqui pois há condensação com outra molécula de Acetil-CoA.

11. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) O C.K. é um processo metabólico que se inicia com a condensação de uma molécula com 2C’s (Acetil-CoA) com uma outra de 4C’s (Oxaloacetato) que resulta numa de 6C’s (Citrato) que é “trabalhada” para a libertação, separadamente, de 2C’s na forma de CO 2, regenerando o oxaloacetato para o reinício do ciclo. A sequência continua para mais 1 ciclo, correspondente à degradação total de uma molécula de glucose (1 glucose (6C’s) = 2 piruvato (3 C’s)  2 Ac-CoA). Os carbonos da Acetil-CoA incorporados na molécula de citrato só são de facto libertados na 2ª volta do ciclo de Krebs sob a forma de CO 2 . Isto não diminui o facto de estes carbonos terem realmente origem na molécula de Ac-CoA. São produzidos 3NADH, 1FADH 2 e 1ATP (moléculas energéticas) em cada volta do ciclo. O C.K. converte uma grande quantidade de Acetil-CoA com o consumo mínimo de oxaloacetato. Este último é apenas um substrato temporário dado ser regenerado no final de cada ciclo. 1NADH = 3 ATP; 1FADH 2 = 1 ATP (por oxidação)

12. Metabolismo – Ciclo de Krebs (cont.) Regulação do Ciclo de Krebs Este valor baixa para 36 ATP’s devido ao consumo energético necessário ao transporte do NADH que se forma na glicólise do citoplasma para a mitocôndria, de forma a ficar disponível para os processos de transferência de electrões da cadeia respiratória.

13. Metabolismo – Cadeia respiratória O papel da Cadeia Respiratória, processo que ocorre na mitocôndria, é a conversão da energia fornecida pelos alimentos em ATP por meio de uma sequência de reacções de oxidação-redução (transferência de electrões).

14. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A mitocôndria, onde ocorre o Ciclo de Krebs e a Cadeia Respiratória (inclui Fosforilação oxidativa com transferência de electrões) é constituída por uma membrana externa, mais simples, e uma membrana interna de maior complexidade. O espaço entre a membrana interna e a membrana externa é o espaço intermembranar . A cadeia respiratória está associada a processos de transferência entre estas membranas com produção de energia sob a forma de ATP.

15. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) As células dos mamíferos podem conter entre 800 a 2500 mitocôndrias. A membrana interna contém inúmeras dobras, o que lhe confere uma grande superfície ocupando um pequeno volume. As dobras são conhecidas como cristae ( cristas ) e delimitam a matriz mitocondrial onde se encontram as enzimas envolvidas no ciclo de Krebs e de outros processos oxidativos (com excepção da succinato desidrogenase que se localiza na própria membrana interna). Os eritrócitos, células cuja única função é o transporte de O 2 não possuem mitocôndrias (obtêm energia apenas por processos de fermentação láctica).

16. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) As coenzimas NADH e FADH 2 têm uma forte tendência para sofrer oxidação, ou seja, para fornecer electrões a outras espécies. A energia libertada neste processo é empregue na fosforilação do ADP com produção de ATP. O potencial de redução padrão ( ε º ) permite avaliar a tendência das espécies químicas para serem oxidadas ou reduzidas e, assim, prever em que sentido um determinado processo irá evoluir em determinadas circunstâncias.

17. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O potencial de redução padrão está relacionado com a energia livre padrão: n – nº de electrões envolvidos na troca; F – Constante de Faraday (96,485 J/V.mol); Δε º ’ – Diferença entre os potenciais de redução da espécie dadora e da espécies receptora. Em sistemas biológicos a oxidação é frequentemente sinónimo de desidrogenação.

18. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O potencial de redução padrão é definido sempre em relação a um sistema de referência. Este sistema de referência é o par redox H + /H 2 , cujo ε º é, por convenção, 0 Volts (V). Em termos práticos, quanto mais positivo o valor de Δε º ’, maior a tendência para o processo ocorrer e, consequentemente, mais negativo o valor de Δ Gº’ . A comparação dos valores de ε º permite prever qual o processo de redução e qual o processo de oxidação.

19. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) Potenciais de redução padrão de algumas semi-reacções que ocorrem em sistemas biológicos:

20. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A energia metabólica retirada dos alimentos é canalizada para a redução de coenzimas (NADH) e flavoproteínas (FADH 2 ). Na cadeia respiratória estas espécies são novamente oxidadas e a energia libertada utilizada na síntese de ATP. Os electrões libertados pelo NADH e FADH 2 são transferidos para moléculas de O 2 que é o receptor final de electrões da cadeia.

21. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A reoxidação do NADH envolve as semi-reacções: Δ Gº = -219kJ/mol ? – Qual é a espécie que se reduz e qual é a que se oxida ...... Embora os electrões se movam de um menor potencial de redução para um maior potencial de redução, este não é um processo linear – formação de complexos intermédios de transporte de electrões.

22. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A cadeia de transporte de electrões (c.t.e.) envolve várias espécies moleculares como intermediários do processo: - Flavoproteínas com FMN ou FAD como grupos prostéticos. Transferência de 1 ou 2 e - s; - Coenzima Q (CoQ) ou Ubiquinona (UQ). Transferência de 1 ou 2 e - s; - Citocromos (proteínas com o grupo prostético heme ) envolvidos no transporte ou transferência de 1 e - . Neste processo o Fe é oxidado e reduzido Fe 2+ /Fe 3+ . Inclui os citocromos a, a3, b, c e c1; - Diversas proteínas Fe-S que participam na transferência de um electrão entre os estados Fe 2+ /Fe 3+ ; - Proteínas associadas ao cobre , envolvidas na transferência de um e - entre os estados Cu + /Cu 2+ .

23. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A transferência de e - s dá-se entre vários complexos enzimáticos (I, II, III, IV e V): (Fase P) (Fase N)

24. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.)

25. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O NADH transfere 2 electrões para o Complexo proteico I ou complexo da NADH desidrogenase , composto por mais de 25 flavoproteínas fixas na matriz mitocondrial e que estabelecem a ponte com o espaço intermembrana. O receptor final dos electrões neste complexo é a Ubiquinona que se reduz a Ubiquinol .

26. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O Complexo II ou Complexo succinato-ubiquinona é uma única enzima fixa na crista mitocondrial não fazendo a comunicação entre a matriz e o espaço intermembranas relativamente ao fluxo de protões H + . Esta enzima é a succinato desidrogenase . Participa na 6ª reacção do Ciclo de Krebs e é formada por um FAD + ligado a centros de Fe-S. Transfere os electrões provenientes do FADH 2 (proveniente do C. de Krebs) para o Complexo III.

27. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A transferência dos e - s do complexo I para a ubiquinona promove o fluxo de protões para o espaço intermembranar. Isto leva à deslocação da ubiquinona (transportador móvel) do complexo I para o Complexo III , tb. denominado Complexo dos Citocromos bc1 ou Ubiquinona–citocromo c oxidorredutase. Este complexo contém os citocromos b562, b566, c1 e c , ligados a uma proteína ferro-enxofre e cerca de outras seis proteínas. Todo este complexo III está fixo na crista mitocondrial e é transmembranar, conectando a matriz e o espaço intermembrana (com exceção do citocromo c – receptor final de e - s deste complexo - que se liga apenas ao espaço intermembrana).

28. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O Complexo IV (ou Citocromo Oxidase) recebe os e - s provenientes do complexo III. Esta transferência gera o fluxo de um H + (o 2º) da matriz para o espaço intermembranas. O citocromo c, que transporta os electrões do complexo III para o complexo IV, é um transportador móvel . O complexo IV contém os citocromos a e a3 que possuem um grupo heme (com um átomo de ferro), estando ligados a uma proteína que conecta a matriz com o espaço intermembranar. Esta proteína possui dois átomos de cobre que possibilitam o transporte de electrões para o receptor final, o oxigénio ( O 2 ) que se reduz com formação de água.

29. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) O fluxo de protões gerado pela passagem dos electrões pelos complexos I, III e IV (conhecidos, por isso, como bomba de H + ), fornece energia suficiente para a síntese de três ATP’s, o que corresponde a uma relação de uma molécula de ATP por cada protão bombeado ou 3 moléculas de ATP por cada par de electrões que passe pelos três complexos.

30. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) Em estudos experimentais observou-se que há uma proporção de 3 moles de ATP formadas por cada mol de NADH oxidado (e, consequentemente, por mol de O2 reduzido em H2O). Da mesma forma, 2 moles de ATP são formadas por cada mol de FADH2 oxidado . A Teoria Quimiosmótica que justifica esta proporção, postulada por Peter Mitchell , na década de 60 admite que os protões bombeados para o espaço intermembranar, durante o fluxo de electrões na cadeia respiratória, criam um gradiente de baixo pH (devido à alta concentração de H+) e carga eléctrica positiva no espaço entre as membranas. Essas diferenças de gradientes accionam uma outra bomba de prótons, agora no sentido do espaço intermembrana para a matriz mitocondrial, favorecida por complexo enzimático ( complexo V) que corresponde à enzima ATP sintase. Nesta passagem há a libertação de calor suficiente para a união do Pi com o ADP para formar o ATP.

31. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) A Teoria Quimiosmótica de Mitchell:

32. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) Existem diversos agentes químicos inibidores do processo de fosforilação oxidativa . A inibição dos complexos I, II e III leva ao bloqueio do transporte de electrões.

33. Metabolismo – Cadeia respiratória (cont.) Locais de acção de diversos inibidores da cadeia de elctrões/fosforilação oxidativa.

34. Metabolismo – Transporte de ATP O ATP produzido nas mitocôndrias durante a respiração tem que sair para o citosol de forma a fornecer a energia necessária ao funcionamento da célula; o ADP tem que ser introduzido na mitocôndria para reprocessamento. Este duplo movimento é mediado pelo complexo enzimático ATP-ADP Translocase presente na membrana mitocondrial. Por cada ATP transportado para o exterior há um ADP mobilizado para a matriz da mitocôndria.

35. Metabolismo – Transporte de ATP (cont.) A diferença de potencial entre a mitocôndria e o citosol favorece o processo.

36. Metabolismo – Transporte de ATP (cont.) Apesar de favorecido pela diferença de potencial entre a matriz mitocondrial e o citosol, há um consumo de energia para que o processo ocorra. Cerca de ¼ da energia produzida na cadeia respiratória é consumida no transporte de ATP-ADP sob a forma de energia electroquímica.

37. Metabolismo – Transporte de ATP (cont.) Esquema do Funcionamento do complexo ATP-ADP translocase

38. Metabolismo – Transporte de metabolitos A maior parte do NADH é produzido no interior da mitocôndria com vista à sua oxidação a NAD + na matriz mitocondrial (processo activado pelo complexo I). A membrana da mitocôndria é impermeável a este metabolito. Há NADH produzido durante a glicólise que deve ser regenerado a NAD + para que este processo não fique bloqueado devido à escassez da forma oxidada. Essa regeneração NADH  NAD + é efectuada na mitocôndria. O transporte do NADH para a matriz, dada a impermeabilidade da sua membrana a este composto, é efectuada por transportadores denominados shuttles . Estes funcionam como cápsulas de transporte de electrões, contornando a resistência oferecida pela membrana mitocondrial à passagem do NADH.

39. Metabolismo – Transporte de metabolitos (cont.) Shuttle do glicerol-3P Duas enzimas glicerofosfato desidrogenase, uma no citoplsma e outra na face externa da membrana mitocondrial interior, trabalham conjuntamente para efectuar o transporte de electrões. O NADH transfere os seus electrões para o dihidroxiacetona fosfato , reduzindo-o a glicerol-3-fosfato . Este é reoxidado na mitocôndria, passando os seus e - s para o FAD + (passa a FADH 2 ) entrando assim na cadeia respiratória. É um processo irreversível com consumo de energia mas essencial para a célula (regeneração do NAD + para a glicólise). Este processo funciona mesmo quando a concentração de NADH no citosol é menor que na matriz da mitocôndria.

40. Metabolismo – Transporte de metabolitos (cont.) Shuttle do glicerol-3-fosfato

41. Metabolismo – Transporte de metabolitos (cont.) Shuttle do malato-aspartato O oxaloacetato é reduzido a malato, no citosol, recebendo os e - s do NADH (passa a NAD + ). O malato é transportado através da membrana interna da mitocôndria onde é reoxidado por acção da malato-desidrogenase, convertendo o NAD + mitocondrial a NADH que rapidamente entra na cadeia de transporte de electrões. O oxaloacetato produzido é convertido em aspartato para que possa atravessar a membrana em direcção ao citosol, onde é de novo convertido em oxaloacetato. É um processo reversível que apenas ocorre se o quociente [NADH]/[NAD + ] for maior no citosol que na matriz. Como é aí produzido NADH o processo não envolve o consumo de energia (é motivado pelo gradiente de concentrações [NADH]/[NAD + ] entre o citosol e a matriz).

42. Metabolismo – Transporte de metabolitos (cont.) Shuttle do malato-aspartato

43. Outras vias metabólicas O metabolismo não consiste numa série de processos a operar independentemente. Pelo contrário, diversas vias metabólicas ocorrem simultaneamente, sendo interdependentes, isto é, produzem substratos que serão utilizados noutros processos e processam metabolitos provenientes de outras vias. O seu funcionamento simultâneo e integrado produz, por si só, um efeito de regulação mútua.

44. Outras vias metabólicas (cont.)

45. Outras vias metabólicas (cont.)

46. Outras vias metabólicas (cont.) Os aminoácidos (obtidos por síntese e ingestão) são fundamentais nos processos biológicos, tanto na constituição de proteínas como na participação em processos bioquímicos diversos (enzimas). Ciclo do azoto , elemento fundamental na constituição das proteínas.

47. Outras vias metabólicas (cont.) Processos metabólicos que ocorrem ao nível hepático:

48. Outras vias metabólicas (cont.) Ciclo da Ureia A ureia é o principal metabolito da degradação de compostos azotados. É a forma do organismos libertar amónia (tóxica) resultante de reacções de desaminação oxidativa. Dada a elevada toxicidade da amónia, o bloqueio de qualquer dos passos do ciclo é fatal (não se conhecem vias alternativas para a eliminação de amónia).

49. Outras vias metabólicas (cont.) Síntese e β oxidação de ácidos gordos . Integração no Ciclo de Krebs. Síntese Β oxidação

50. Outras vias metabólicas (cont.) Glicogénese (síntese de glicogénio) ocorre principalmente no fígado e nos músculos e sempre em situações de excesso de glucose.

51. Outras vias metabólicas (cont.) Glicogenólise é o processo de degradação do glicogénio para obtenção de glucose em situações de carência deste açúcar ou em circunstâncias de necessidades adicionais de energia.

52. Outras vias metabólicas (cont.) Via das pentose-fosfato produz, consoante as necessidades do organismo, ribose-5-fosfato, substrato para a síntese de nucleótidos, NADPH ou gliceraldeído-3-fosfato ou frutose-6-fosfato (para síntese de ATP na glicólise).