Diagnóstico Molecular Escherichia Coli.

E Q U I P E :
A L I N E V I T O R I A N O , D A I A N Y VA S C O N C E L O S , E C I A N E L O P E S ,
D E B O R A H C O S TA .
D I S C I P L I N A : B I O L O G I A M O L E C U L A R
P R O F. : VA L E S K A P O R T E L A
Escherichia Coli

E. Coli - Características
 Foi descrito pela primeira vez em 1885, pelo pediatra
alemão Theodore Escherich.
 Gram negativa.
 Enterobacteriaceae.
 Forma de bastonetes (bacilos).
COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e
do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p1, mar, 2013.
The Canadian Press, Published Wesnesday, February 3, 2016 3:53PM EST

E. Coli - Características
 Pode ser móvel ou imóvel.
 Apresenta metabolismo tanto fermentativo quanto
oxidativo.
 Faz parte da microbiota intestinal.
 Antígenos somáticos (O), flagelados (H) e capsulares
(K).

Linhagens particulares
 E. coli comensal (colonizadores intestinais não-
patogênicos).
 E. coli patogênica intestinal ou enteropatogênica
(categorias diarreiogênicas).
 E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC)

Infecções ou síndromes especificas (ExPEC)
 E. coli uropatogênica (UPEC).
 E. coli associada ao quadro de sepse (SEPEC).
 E. coli associada ao quadro de meningite neonatal
(NEMEC)

Infecções intestinais ou entéricas
 E. coli enteropatogênica (EPEC).
 E. coli enterotoxigênica (ETEC).
 E. coli enteroinvasora (EIEC).
 E. coli enteroagregativa (EAEC).
 E. coli produtora de toxina Shiga (STEC).

E. Coli Enteropatogênica (EPEC)
 Importante nos primeiros anos de vida.
 Transmissão – Contato direto.
 Mecanismo – Eliminação de microvilosidades.
 Diarréia Aquosa.
COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

E. Coli Enteroxigénica (ETEC)
 Diarréia do viajante.
 Mecanismo – Semelhante a cólera.
 Desequilibrio hidro-salino
 Diarréia aquosa profunda.

E. Coli Enteroinvasora (EIEC)
 Invasivo
 Mecanismo – Semelhante ao da Shiguela
 Disenteria – Diarréia com sangue e muco.

E. Coli Enteroagregativo (EAEC)
 Formam biofilmes.
 Adere o epitélio do intestino e causa desequilíbrio
hidro-salino.
 Diarréia aquosa persistente ( >7 dias).

E. Coli Produtora de toxina Shiga (STEC)
 Subgrupo ( EHEC).
 Transmissão – Água, alimentação ; Direto ou indireto.
 Mecanismo – libera toxina de Shiga no intestino grosso.
 Surtos de diarréia sanguinolenta.
 Pode causar SHU.

Diagnóstico
 Exame de fezes.
 Isolamento do microorganismos.
 Caracterização fenotípica:
• Tipagem sorológica;
• Ensaios enzimáticos e de citotoxidade em cultura celular;
• Testes de sensibilidade.

Técnicas Moleculares
 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).¹
 Eletroforese em campo pulsado (PFGE).¹
 PCR Multiplex.²
 RT-PCR.
1- COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados
de Rondônia e do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p12-13, mar, 2013.
2- COSTA ARF, et al. Desenvolvimento de PCR multiplex, Ver Pan-Amaz Saude , Belém, Pará, Brasil, v. P77-84, 2010.

Isolamento e Identificação
 Meios de cultura de baixa seletividade:
• Ágar MacConkey;
• EMB/Teague.
 Utilizadas para a diferenciação de colônias da E. coli
fermentadoras ou não de lactose.
 Teste de Elisa
do Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

Ágar MacConkey
 Leitura:
• Cor Original: Rosa avermelhado.
• Colônias cor de rosa: fermenta-
doras de lactose.
• Colônias incolores: não fermen-
tadoras de lactose.
• Não há crescimento de cocos Gram-positivos.
Povilas Kavaliauskas, Vinius Universaty, March 31, 2015

Teste de Elisa
Povilas Kavaliauskas, Vinius Universaty, March 31, 2015

PCR
 Amplifica uma sequência de DNA;
 Obejetivo : tornar a sequência de DNA abundante e
disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do Rio de Janeiro,
82f, Rio de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

PCR – Etapas do Procedimento
 Desnaturação Inicial
 Desnaturação
 Anelamento
 Extensão
 Extensão Final
 Número de ciclos
94 – 96°C (3 – 5’);
94 – 94°C (30’’ – 2’);
55 – 64°C (30’’ – 2’);
72°C (30’’ – 2’);
(3 – 5’);
25-40.
COSTA, Cristiane Mara Silva da. Caracterização molecular de amostras de Escherichia carreadoras dos genes stx isolados de bovinos nos estados de Rondônia e do
Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro,, v3. , n35., p11, mar, 2013.

PCR – Reagentes
 Primer;
 DNA molde;
 Taq polimerase;
 Solução tampão;
 MgCl2;
 dNTP;
 H20.
Herman Sabala da Fonseca, 2010

 Desnaturação
• Primeira etapa do processo;
• As cadeias de DNA são separadas pelo aquecimento a 95°C;
• As ligações de hidrogênio se rompem;
• Duração de 3 - 5 minuto.
Rio de Janeiro, 82f, Rio de Janeiro, v3. , n35.,p11, mar, 2013

 Anelamento
• Segunda etapa do processo;
• Ocorre a formação de pontes de hidrogênio;
• O anelamento da sequência alvo e o primer ocorre após o
resfriamento a 55 °C;
• Duração de 45 segundos.

 Extensão
• Taq Polimerase se liga ao DNA template e começa a adicionar
nucleotídeos;
• Reação ocorre a 72°C;
• Duração de 1 a 2 minutos.

PCR
HermanSabaladaFonseca,2010

PCR – E. Coli
 Não detecta a presença de E. coli, quando aplicada
diretamente nas amostras fecais.
 Isolamento e identificação das amostras.
 O produto amplificação é adicionada a PCR para
análise.

PCR – E. Coli
 Esta técnica apresenta dentre as suas vantagens facilidade e
rapidez de execução, baixo custo, especificidade e
sensibilidade.
 Necessita de um pré-enriquecimento para aumentar a
sensibilidade da técnica.
 Os resultados sugerem que a técnica reduz o tempo de
detecção do microorganismo

PCR – STEC

PFGE
 Eletroforese em Gel de campo pulsado.
 Tecnica mais utilizada para análise epidemiologica para
a maioria das bactérias patogênicas.
 Deriva da eletroforese convencional do DNA, mas a
principal diferença é a repetida orientação do campo
eletrico.

PFGE
 Essa mudança provoca um re-arranjo da estrutura
conformacional da molécula, permitindo a sua migração
no gel.
 Capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir
de diferentes municípios.

PFGE
Food safty news, august 31, 2009

PFGE – E. Coli
 Sistemas empregados para a tipagem destes
microrganismos.
 Este método molecular tem como base o estudo da
diversidade genética.
 Permite investigar as relações de clonalidade entre
diferentes amostras.

PFGE – E. Coli
 Contribui para a elucidação dos aspectos biológicos e
epidemiológicos desses agentes infecciosos.

PCR Multiplex
 É uma reação de amplificação;
 Detecta múltiplas sequências-alvos numa mesma
amostra;
 Vários pares de primers;
 Desenvolvimento para detecção simultânea de vários
genes.

PCR Multiplex
 Vantagens:
• Diminuição da intensidade
e do período de trabalho
laboratorial.
• Redução do número de
reagentes.
• Redução dos custos.
 Desvantagens:
• Redução da sensibilidade
de detecção.

PCR Multiplex
 Identificação e diferenciação de ETEC, EPEC e STEC via
amplificação simultânea de genes.
 Associados à virulência comumente encontrados em
amostras de E.coli causadoras de diarréia.
 Tipagem de Escherichia coli patogênicas causadoras de
diarréia.
ANDRADE, G. I,; SANTOS, E. L. D. S.; COURA, F. M.. PCR multiplex para determinação de marcadores de virulência em escherichia coli isoladas de bovinos
com diarréia em Minas Gerais. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE BUIATRIA, VIII, 2009, Minas Gerais, Minas Gerais: Ciência Animal Brasileira, 2009, p.
436-441.

PCR Multiplex
Primier Biosoft, August 31, 2007

PCR Multiplex

Classificação molecular das categorias
diarreiogênicas de E. coli

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