17/06/2009 Presentation Qualis A - Qualificação para Doutorado Biofísica IBCCF. O objetivo do exame de qualificação é avaliar a capacidade do aluno de selecionar conteúdo com base na relevância, organizá-lo, sintetizá-lo e apresentá-lo com clareza nos conceitos, concisão, coerência, coesão e objetividade. O tema escolhidos deve ser, obrigatoriamente, fora do tema da tese do aluno. Qualify ubiquitin - Presentation before PhD thesys - AIM: endereçamento e exportação de proteinas para degradação, ubiquitin-proteasome pathways signaling, proteasome, ubiquitin, via ubiquitina-proteassoma

2. Proteólise intracelular
Sumário dos Sistemas Proteolíticos Intracelulares
Sistema
Localização
Especificidade/Substrato/Função
Lisossomo
Citoplasma
Degradação intracelular de proteínas por endocitose.
Ubiquitinaproteassoma (UPS)
Citoplasma, Núcleo, Co
mpartimentos
Ação sobre muitas proteínas intracelulares, bem como
degrada a maioria das proteínas danificadas/unfolding.
Via dependente de ATP.
Via dependente
Cálcio - Calpaínas
Citoplasma
Degrada proteínas do citoesqueleto.
Cascata das
Caspases
Citoplasma
Relacionadas a apoptose celular e com as vias de resposta
do sistema imune/citocinas/TNFs.
São reguladas pos-traducionalmente.
Proteinases
Mitocondriais
Mitocôndrias
Degradam proteínas mitocondriais oxidadas. Degradação
parcial de proteínas para importação do citoplasma para
mitocôndria e vice-versa (dependente de UPS).
Proteinases de
Membranas
Retículo
Endoplasmático (ER),
Membrana plasmática
e Mitocôndria
Degradação parcial de proteínas secretadas, endocitadas e
importadas. Degradação de proteínas defeituosas, recém
sintetizadas.
Modificado de: Donohue, TM Jr & Osna NA. Alcohol Res. Health, 2004: 27(4).

3. Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
• REGULADORES DO CICLO CELULAR: proteínas que são ubiquitinadas e endereçadas para proteólise
cumprem um papel essencial para as células que fazem parte de vias regulatórias. Ex. ubiquitinação das
ciclinas durante a fase G1 da mitose.
• PROMOVE FATORES PARA LINFÓCITOS: estimulando a diferenciação dos linfócitos B e T.
• EXPORTAÇÃO E IMPORTAÇÃO PROTEÍNAS: intracelularmente. Ex.
Monoamina oxidase A e B,
dependentes de ATP e que são associadas com outras proteínas de membranas para entrar e sair de
mitocondrias.
• HEAT SCHOCK PROTEINS: como resposta rápida ao aumento de temperatura, observa-se um
aumentando da expressão gênica de ubiquitinas, promovendo um aumento na degradação de proteínas
que perderam a conformação e que não voltaram a sua conformação funcional, mesmo com a assitencia
ou não das chaperonas, evitando oxidação celular.
• FATORES PARA COMPONENTES NEURONAIS: a via tem funções importantes para degradação de proteínas
que perderam a sua
conformação e/ou formação de agregados (fibras) no sistama nervoso central.
Principalmente de pessoas cometidas por doenças neurodegenarativas como Alzheimer, Parkinson,
Machado-Joseph, Síndrome de Rett, Doença de Huntington, entre outras.

4. Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
• APARATO IMUNITÁRIO: ubiquitinação de proteínas como resposta imune-primária.
• REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA DE HISTONAS H2A: mono-ubiquitinação de regiões transcritas
sendo desviadas do endereçamento para proteólise, sugere que a ubiquitina pode influenciar na
expressão gênica.
• MANUTENÇÃO DA ESTRUTURA DA CROMATINA: histonas H2A que são mono-ubiquitiniladas, e não
proteolisadas, sugerindo que a ubiquitina pode ter influência na conformação da cromatina.
• ATUAÇÃO EM IMUNOFILINAS: ubiquitina atua em ligações com FK506 e rapamicinas promovendo uma
ação inibitória da fosfatase calcineurina (proteína que se liga ao cálcio e a calmodulina do SNC).
Recentemente, mostrou-se que a calcineurina desfosforila várias fosfoproteínas, incluindo histonas,
cadeia leve da miosina e a subunidade reguladora da proteína quinase dependente de cAMP.

5. Funções Biológicas específicas : Via Ubiquitina-proteassoma
•IMUNOMODULADORA – alguns estudos noticiaram que fragmentos de ubiquitina podem trabalhar do lado de
fora das célula, especialmente os resíduos 51-59, como biopolímeros, podem diminuir uma resposta imune
humoral e celular. Alguns análogos da ubiquitina podem ser comparáveis a ciclosporina A ou FK506, usados
como drogas imunosuppressoras para pessoas transplantadas.
•BIOGÊNESE DE RIBOSSOMOS – ubiquitina é expressada frequentemente em células como copia única fusionadas
a algumas proteínas rbossomais, como L40 ou S27A. Após a tradução as proteínas fusionadas são clivadas
da ubiquitina.
• REPARO DE DNA – genes implicados nas respostas ao estresse genotóxico relacionado ao sistema do retículo
endoplasmático (ERAD) têm funções ligadas a via ubiquitina-proteassoma e com UPR (unfolded protein
response). Vlachostergios PJ, Patrikidou A, Daliani DD, Papandreou CN. 2009. The Ubiquitin-Proteasome System in cancer, a major player
in DNA Repair. Part 1: Post-translational regulation. J Cell Mol Med.

6. Via Ubiquitina-proteassoma
Função Biológica GERAL
• Ubiquitinação de proteínas e endereçamento para degradação no proteassoma.
30% das proteínas recém-sintetizadas de uma
célula sofrem regulação proteolítica pela via da
ubiquitina-proteassoma, por serem reprovadas
pelo rigoroso controle de qualidade intracelular.
Essa via é “balanceada” pela presença de
chaperonas do citoplasma e do núcleo, pois
muitas proteínas precisam do unfolding/folding
protéico para exercer as suas funções dentro da
célula, antes que sejam marcadas e endereçadas a
degradação.
Cam Patterson (2006). Search and destroy: the role of
protein quality control in maintaining cardiac function.
Editorial. JMCC (40).

7. A molécula da Ubiquitina
 76 aminoácidos de 85 kDa
 Conservada nos eucariotos (difere no máximo em 4 aa).
 Presente no citosol, núcleo e demais compartimentos.
 Grande tolerância a mudanças de pH e temperatura.
 Podem se ligar formando cadeias poliubiquitinas
(ligação ocorre entre os resíduos Gly76 +
Lys48, podendo ocorrer mais de uma vez formando di-
tri-tetraubiquitinas. (Kim JH et al, 2003).
 É sintetizada diretamente pelos ribossomos.


8. Enzimas – Ubiquitinação
Quatro enzimas são necessárias para a ubiquitinação:
E1 - enzima ativadora da ubiquitina
E2 - enzima conjugadora da ubiquitina
E3 - ubiquitina ligase (mais específica/substrato)
E4/E3 - coopera com a E3 para extender a cadeia de poliubiquitina (mais rara).

9. Enzimas - Ubiquitinação
E1 – enzima ATIVADORA da ubiquitina
• O enzima E1 é codificada por um único Gene.
Sua deleção provoca inviabilidade celular, embora em mamíferos sejam conhecidas duas
isoformas, E1a e E1b, que resultam da iniciação da tradução em dois locais diferentes.
• O primeiro passo de ubiquitinação envolve a formação de um adenilato de ubiquitina
intermediário (concomitante hidrólise de ATP) e a transferência da ubiquitina ativada para o
grupo tiol da cisteína do centro ativo do enzima E1 (com a libertação de AMP).
• Cada enzima E1 pode no máximo transportar duas moléculas de ubiquitina, uma como tiol-éster
e outra como adenilato.
• A ubiquitina ativada é transferida para a cisteína do centro ativo de E2.

10. Enzimas - Ubiquitinação
E2 – enzima CONJUGADORA da ubiquitina
• Ao contrário de E1, cada célula contém muitas enzimas E2. Em Saccharomyces são 11 capazes
de transportar ubiquitina, enquanto que em mamífero são conhecidas mais de 30.
• Possuem um domínio muito conservado (UBC – ubiquitin conjugation) com cerca de 150
resíduos de aminoácidos contendo uma cisteína que é o centro aceptor da ubiquitina
ativada por E1.
• As diferenças situam-se nas regiões dos terminais N e C, podendo alguns casos existirem
inserções no domínio UBC.
• Estas sequências estão envolvidas na interação com os enzimas E3.

11. Enzimas - Ubiquitinação
E3 – ligases de ubiquitina
•
Enquanto que os enzimas E2 têm grande semelhança nas suas sequências e estruturas, os enzimas E3 são
pouco semelhantes entre si, em parte porque estes são responsáveis pelo reconhecimento de sinais de
destruição nas proteínas/substrato.
•
Existem duas classes distintas de E3.
• A primeira classe é caracterizada por ter um domínio designado HECT (homologous to the E6-AP protein
C-terminus). A proteína E6-AP foi a primeira ligase identificada desta classe e foi descoberta por participar
na degradação da proteína supressora de tumores P53 ao interagir com a proteína E6 do papilomavírus
humano. O domínio HECT é constituído por 80 resíduos de aminoácidos e inclui a cisteína do centro ativo
que forma uma ligação tiol com a ubiquitina.
• A segunda classe de E3 é definida pela existência de um domínio RING finger, assim designado porque o
gene que codifica a primeira proteína descrita contendo este domínio tem o nome de "really interesting
gene 1". O domínio RING finger possui a capacidade de quelar dois Íons de zinco, através dos seus 8 locais
de coordenação constituídos por histidinas e cisteínas, e medeia interações com as proteínas E2.

12. Enzimas - Ubiquitinação
E3 – ligases de ubiquitina
•
As proteínas E3 pertencentes a última classe facilitam a transferência direta de ubiquitina de enzimas E2
para os substratos sem o envolvimento de um intermediário tiol-éster E3-Ub, como acontece com as E3 do
tipo HECT. Encontram-se nesta situação UBL ligases envolvidas no ciclo celular como os complexos APC
(anaphase promoting complex), uma E3 constituída por várias subunidades que permite a progressão do
ciclo de divisão celular em vários pontos) e SCF-RING (E3 constituída por Skp1/Skp2, Culina, uma
subunidade variável com um domínio designado por proteínas F-box ou SOCS). Acumulando evidencias que
indicam a adicional modulação de fatores da proteólise sobre os substratos poli ou monoubiquiotinados.
Pines J & Lindon C. 2005. Proteolysis: anytime, any place anywhere? (Perspective). Nature Cell Biol.: 8(7).

14. Enzimas Ubiquitinação
Proteolítica e Não Proteolítica

15. Diferentes vias /funções UPS
a) Proteassoma dependente da
degradação de proteínas para
síntese de “novo”;
b) Mono ou oligoubiquitinação
(dependente de enzimas
regulatórias da via) para
endereçamento ao endossomo ou
lisossomo.
c) Monoubiquitinação endereçando a
proteína do citosol para o interior
do núcleo. Essa via é dependente de
chaperonas nucleares HSP60 que
mantém o folding protéico após a
sua entrada.
d) Modificação simples feita pela enzima
UBL (E3) na proteína, como a SUMO,
pode endereçar tanto para proteínas
do poro de membrana (NPC) como
para o interior do núcleo.
e) Poliubiqutinação de proteínas,
endereçando proteínas para o
núcleo, como a Proteína Y, que pode
regular fatores transcricionais,
direta ou indiretamente.

16. Proteassoma: o coadjuvante da via UPS
A degradação de proteínas
• As proteínas multi-ubiquitiniladas são degradadas pelo proteassoma 26S.
• É uma protease multimérica dependente de ATP com 2000 kDa, constituída por dois
complexos regulatórios 19S (α) e por um complexos catalítico de 700 kDa, designado
por proteassoma 20S (β). Este ultimo pode apresentar diferentes composições e
rearranjos proteolíticas, conforme a espécie. Está presente desde arqueobactérias até os
mamíferos.

17. Especificidade do Proteassoma
Função de ligação e reconhecimento da Ubiquitina = 19S
• O proteassoma 19S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente
ubiquitinadas.
• Desenrrolameno protéico.
• Translocação para o interior da câmara catalítica 20S.
Função catalíticas do proteassoma = 20S
• O proteassoma 20S faz a parte de reconhecimento de proteínas somente
ubiquitinadas.
• Está disposto em forma de cilindro complexo, com 2 tipos de subunidades α e β
formando um heptâmero com centro catalítico internalizado com 3 funções
catalíticas diferentes:
1. ATIVIDADE PÓS-ACÍDICA (clivagem de ligação peptídica após resíduo ácido);
2. ATIVIDADE TRÍPTICA (clivagem após um resíduo básico);
3. ATIVIDADE QUIMOTRÍPTICA (clivagem após resíduo hidrofóbico).

18. Especificidade do Proteassoma
Alfred L. Goldberg. On Prions, Proteasomes, and Mad Cows.
N Engl J Med. 2007 Sep 13; 357(11).

19. O balanço delicado do Proteassoma

20. Controle de Qualidade de Proteínas

21. Controle de Qualidade de Proteínas

22. Controle de Qualidade de Proteínas

23. Caracterização Estrutura

24. Caracterização Estrutura

26. Animando a Via Ubiquitina-proteassoma
Huda Y Zoghbi. Howard Hugues Medical Institute (HHMI).
Grupo de Estudos de Doenças Neurodegenerativas, Maryland/EUA.
HHMI Internacional Research Scholars in Infectious Diseases and Parasitology 2005,
Lisbon-Portugal.