metodos enzimaticos para determinação em alimentos

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Jacyenne Janne
Jessica Bezerra
Myrella Cariry
Whyara Almeida

2. 1814 - Kirchhoff
Glúten da cevada
INTRODUÇÃO
 Utilização de enzimas
1783 - Spallanzi
Carne
Suco gástrico
Amido Açúcar

3. INTRODUÇÃO
 Foi a partir das primeiras décadas do século XX
que o desenvolvimento da tecnologia de enzimas
se intensificou.
A maior parte das enzimas utilizadas pela tecnologia
pertence a:
• Hidrolases;
•Proteases;
•Lipases;
•Esterases.

4. INTRODUÇÃO
 Vantagens da utilização de enzimas:
 Aumentam a qualidade e estabilidade de produtos
alimentícios;
 Possibilitam a obtenção de produtos derivados e
sintéticos;
 Estabelecem e exalam o sabor de alimentos;
 Catalisam reações sem produzir efeitos secundários;
 São constituintes naturais, desprovidos de toxicidade;
 Exercem atividade em temperaturas e pH moderados;
 Com adequação do pH, temperatura e número de
enzimas, exerce o controle de velocidade das reações;
 Permite maior velocidade dos processos de extração.

5. INTRODUÇÃO
Métodos enzimáticos
São procedimentos
laboratoriais que medem a
velocidade de reações
enzimáticas

6. INTRODUÇÃO
 Radiométricos
Existem vários métodos:
 Espectrofométricos
Medem a mudança de absorbância da luz entre
produtos e reagentes
Envolvem a incorporação ou libertação de
radioatividade para medir a quantidade de produto que
surge ao longo do tempo
Os ensaios espectrofotométricos são mais convenientes pois
permitem a medição contínua da velocidade de reação. Embora os
ensaios radiométricos exijam a remoção e contagem de amostras (ou
seja, são ensaios descontínuos), são habitualmente de grande
sensibilidade e podem medir vários níveis da atividade enzimática

7. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
 Consiste em tratar o alimento com diversas enzimas
fisiológicas, simulando as condições do intestino humano,
permitindo separar e quantificar gravimetricamente o
conteúdo total da fração fibra e/ ou as frações solúveis e
insolúveis
 Ex. enzimas:
 α – amilase termorresistente;
 Protease;
 Amiloglicosedase.
Método enzimático gravimétrico

8. DETERMINAÇÃO DE
FIBRA ALIMENTAR
AMOSTRA DESENGORDURADA
Tratamento enzimático ( -amilase,
protease, amiloglicosidase)
Filtrado Resíduo 
FAI
Filtração
EtOH
98%
Precipitação
EtOH
78%
EtOH
95%
acetona
Lavagens
Secagem
Determinaçã
o de
proteínas
Determinaçã
o de cinzas
FAS
FAT = FAS + FAI

9. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
 Este método é bastante utilizado para quantificação de
açucares redutores
 Vantagens:
 Específicos;
 Econômicos;
 Não necessitam de equipamentos sofisticados.
Método enzimático espectrofotométrico

10. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
 Utilização:
 Líquidos biológicos  sangue, urina.
 Alimentos
 Enzimas:
 Glicose oxidase;
 Peroxidase;
 4-aminoantipirina.
Método enzimático espectrofotométrico

11. Método enzimático espectrofotométrico
GLICOSE
ÁCIDO GLUCÔNICO
O₂
Glicose oxidase
PERÓXIDO DE
HIDROGÊNIO
PRODUTO DE COLORAÇÃO
AVERMELHADA
4 –
aminoantipira
peroxidase

12. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Método enzimático espectrofotométrico
O produto de coloração avermelhada será de
intensidade diretamente proporcional a
concentração de glicose, e devera ser lido por
espectrofotômetro.

13. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
 Análise de Colesterol: Pode ser determinado pelo
método enzimático colorimétrico de colesterol-
oxidase
 Enzimas:
 Colesterol oxidase;
 Peroxidase;
 4-aminoantipirina.
Método enzimático calorimétrico

14. Método enzimático calorimétrico
COLESTEROL
Colesterol oxidase
Peroxidase
PERÓXIDO DE
HIDROGÊNIO
PRODUTO DE COLORAÇÃO
AVERMELHADA
4 –
aminoantipira
Fenol

15. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Método enzimático calorimétrico
O produto de coloração avermelhada será de
intensidade diretamente proporcional a
concentração de colesterol na amostra, os
resultados são expressos em mg/dl.

16. ARTIGO: AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE DOIS
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL
EM CARNES E LEITE
 Busca metodologias para determinação de colesterol ,
que apresentem simultaneamente especificidade,
sensibilidade, precisão e exatidão, além de rapidez e
baixos custos operacionais.
 Metodologia enzimática
Colesterol Peróxido de hidrogênio
cor
enzima
Colesterol-oxidase
Reação
secundária
A intensidade de cor produzida é diretamente
proporcional a quantidade de colesterol contida
na amostra

17. ARTIGO: AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE DOIS
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL
EM CARNES E LEITE
 Métodos Cromatográficos
 Apesar de eficazes, são bastante onerosos. A CLAE
tem sido empregada em detrimento à CG na
determinação do colesterol em alimentos, devido ao
fato de utilizar temperaturas relativamente baixas
(30ºC), impedindo a oxidação do colesterol.

18. ARTIGO: AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE DOIS
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL
EM CARNES E LEITE

19. ARTIGO: AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE DOIS
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL
EM CARNES E LEITE

20. ARTIGO: AVALIAÇÃO COMPARATIVA ENTRE DOIS
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DO COLESTEROL
EM CARNES E LEITE
 As taxas de recuperação obtidas foram de 95% nas
amostras de carne e 97% nas amostras de leite para
ambas metodologias, comprovando a eficiência dos
métodos avaliados.
 A metodologia enzimática apresentou-se exata e
precisa, podendo ser empregada com segurança por
indústrias de alimentos e laboratórios de pesquisa na
determinação dos teores de colesterol em carne e leite,
sendo uma opção barata e rápida, especialmente
quando um grande número de amostras é analisado.
Entretanto, ao contrário da metodologia
cromatográfica, necessita de controle rigoroso das
condições de análise.

21. MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS
Vantagens dos métodos imunoenzimáticos:
 Sensibilidade;
 Especificidade;
 Rapidez;
 Simplicidade;
 baixo custo e ambientalmente positivo.
No Brasil, bem poucos grupos desenvolvem
pesquisas com técnicas imunoquímicas.

22. MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS
 O desenvolvimento de um imunoensaio para
análise de alimentos compreende quatro fases
bem diferenciadas:
1. Seleção do composto de interesse
2. Preparo dos reagentes
3. Projeto do ensaio
4. Otimização e avaliação do ensaio.

23. GRUPOS DE ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
(EIA’S)
HOMOGÊNEOS HETEROGÊNEOS
MÉTODO ELISA

24. MÉTODO ELISA
 É uma técnica baseada no princípio da interação
específica entre anticorpo e antígeno.
 O método apresenta dois passos:
AMARAL e JÚNIOR (2006)
1°) Reação entre o anticorpo e o antígeno
2°) Reação de hidrólise enzimática entre o complexo
antígeno-enzima e o substrato.

25. MÉTODO ELISA
VANTAGENS
 Alta sensibilidade;
 Especificidade;
 Rapidez;
 Facilidade de manuseio;
 Baixo custo;
 Não exige mão-de-obra especializada.
DESVANTAGENS
 Alta incidência de resultados falso-positivos;
 Variabilidade de resultados, de 30 a 300%;
 Baixa reprodutibilidade;
 Possibilidade de resultado falso-negativo.
OLIVEIRA et al., 2000; AMARAL e JUNIOR, 2006; SCOTT, 1995; WHITAKER et al., 1994 apud
KAWASHIMA, 2004; WHO, 2001; ZHENG et al., 2006

26. ALIMENTOS ANALISADOS
 Gelados
 Produtos à base de cereais e farinhas (cereais peq. almoço,
pão, farinha maizena)
 Produtos congelados
 Vegetais
 Batatas
 Pratos de Bacalhau, de arroz, Pastéis de bacalhau
 Sopas
 Produtos cárneos
 Molhos industriais
 Gelatinas
 Massa folhada
 Iogurte de soja

27. MÉTODO ELISA
 TIPOS DE ELISA
COMPETITIVO
DIRETO
COMPETITIVO
INDIRETO
MÉTODO SANDUICHE

28. MÉTODO ELISA
• ELISA COMPETITIVO DIRETO
Fonte: Adaptada de ONO et al. (2004)

29. MÉTODO ELISA
Fonte: Adaptada de ONO et al. (2004)
• ELISA COMPETITIVO INDIRETO

30. MÉTODO ELISA
• MÉTODO SANDUÍCHE
Fonte: Adaptada de ONO et al. (2004)

31. MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DE DETECÇÃO DE
AFLATOXINAS: VANTAGENS E DESVANTAGENS
Maria Amélia Amado *
 As aflatoxinas são micotoxinas produzidas por
espécies do género Aspergillus.
 Merecem especial atenção por parte da indústria
dos alimentos, porque são substâncias altamente
tóxicas e carcinogenéticas.
 Nos últimos anos, há uma intensa investigação no
sentido de as detectar e prevenir, utilizando
diversos métodos analíticos, os chamados Métodos
imunoenzimáticos.

32. MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS PARA
AFLATOXINAS
1. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay);
2. RIA (radio-imuno-assay);
3. EIA (ENSAIO IMUNOENZIMOLOGICO);
4. IAC (immunoaffinity chromatography).
SCOTT, 1990

33. RIA (RADIO-IMUNO-ASSAY)
FONTE: AMADO, 2002.

34. RIA (RADIO-IMUNO-ASSAY):
 São poucos os casos de aplicação dos métodos RIA
realizados e publicados na investigação de
micotoxinas.
DESVANTAGENS DO MÉTODO:
 requer laboratórios apropriados;
 baixa selectividade;
 poucos anticorpos comercialmente disponíveis;
 limitada duração da atividade dos radioisótopos;
 problemas da eliminação dos resíduos;
 certo grau de reatividade cruzada com interferentes
existentes na amostra que podem originar falsos-
positivos.

35. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIA)
1971
Detecção de antígenos e
anticorpos: = RIA (≠ enzimas)
Vantagens:
o maior estabilidade dos reagentes;
o maior especificidade, devido ao uso de antígenos
marcados com enzima;
o produzirem, de modo geral, ensaios homogêneos;
o ausência do perigo de radiações.

36. ELISA
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIA)
Representação esquemática de um ELISA - Enzyme Linked Imunoabsorbent
Assay. Figura 1 – ELISA competitivo homogêneo. Figura 2 – ELISA
competitivo heterogêneo. O analito aparece em concentrações variáveis na
mistura da reação em contato com o anticorpo especifico, e compete com uma
quantidade constante de analito previamente imobilizado na fase sólida.
(PUCHADES et al., 1992)

37. Enzimas marcadoras: catalase, glucose-oxidase, a-galactosidase,
fosfatase alcalina e peroxidase.
Segundo Scott (1990), este método tem sido posto em causa devido a
possíveis interferências de outros componentes da amostra e variabilidade
devida às condições do teste. Outro problema possível é a especificidade e
seletividade do ELISA (Amado, 1999).
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIA)

38. Vantagens:
→ sensibilidade;
→ grande quantidade de
amostras que se podem manipular
num dia;
→ baixos custos por análise;
→ necessidade de pequenas
quantidades de anticorpo diluído.
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (EIA)

39. CROMATOGRAFIA DE IMUNOAFINIDADE (IAC)
Com as colunas de imunoafinidade o procedimento para o
pré-tratamento da amostra total é reduzido a uma única
extração em fase sólida (MORTIMER et al., 1997).
Fundamenta-se na interação fraca que envolve apenas
ligações covalentes, principalmente de Van der Waals e
eletrostáticas, entre um anticorpo e um antígeno:
Ac + Ag <=> AcAg
Princípio da purificação da colunas por imunoafinidade (CASTILHO, 1996).

40. CROMATOGRAFIA DE IMUNOAFINIDADE (IAC)
Características dos anticorpos:
especificidade;
afinidade;
estabilidade;
reversibilidade.
O suporte inerte sólido onde os anticorpos são
imobilizados na coluna por uma ligação covalente, é
constituído por agarose gel, trisacril,
poliacrilamida ou celulose, previamente ativados
por uma reação com brometo de cianogénio ou com
carbonildiimidazol, formando-se o imunoadsorvente.

41. CROMATOGRAFIA DE IMUNOAFINIDADE (IAC)
Desvantagens:
fragilidade das colunas;
perigo de contaminação de uma extração para outra;
Nº de moléculas a ser controladas;
custo elevado dos kits;
disponibilidade de anticorpos no comércio.

42. VALIDAÇÃO DE MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS
PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE
ANTIMICROBIANOS NO LEITE
Avaliou-se a eficiência dos kits Charm MRL
BL/TET, SNAP beta-lactâmico e SNAP
tetraciclinas na detecção de resíduos de
antimicrobianos inoculados experimentalmente
em quatro concentrações distintas em leite isento
de resíduos, considerando o limite de detecção
declarado pelo fabricante e o limite máximo de
resíduo (LMR) estabelecido pela legislação
brasileira (Instrução Normativa
nº42/1999/MAPA).
(ARAÚJO, M. M. P. – 2010.)

43. Testes disponíveis para pesquisa de resíduos de antimicrobianos
em leite e o princípio em que se baseiam
Princípio do teste Nome do teste
Inibição do crescimento microbiano Teste do disco
BR-Test (Brilliant black reduction test)1
BR-Test ―Blue Star‖, BR-Test AS1
Charm Farm Test, Charm inibition assay2
Delvotest-P, Delvotest-SP3
Copan ATK P & S Microplate7, Copan ATK P & S Single7
Valio T101 test
Receptor Charm Cowside Test2
Charm I Test, Charm II Test2
Charm MRL BL/TET2
Ligação à proteína CITE Probe (β-lactâmico)
ELISA CITE Probe (Tetraciclinas)4
CITE Probe Gentamicina4CITE CITE Sulfa-trio (sulfametazina,
sulfatiazol, sulfametazina)4
EZ-Screen
Lactek (Beta-lactâmicos); Lactek (sulfametazina); Lactek
(Gentamicina)5
Signal (gentamicina); Signal (sulfametazina); Signal (neomicina)5
Enzima Penzyme 6
Snap (Beta-lactâmicos)8
Snap (Tetraciclina)8
Método de bioluminescência (ATP) 9
Aglutinação em látex ―Spot‖ test
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS
PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE
ANTIMICROBIANOS NO LEITE

44. Método SNAP
Testes qualitativos que detectam substâncias inibitórias no leite por
reação imunoenzimática, com alteração na intensidade da cor no círculo de
ativação da amostra e do controle, de azul escuro em ambos os orifícios
(Teste negativo) a azul claro ou ausência de coloração no círculo teste (teste
positivo). A detecção destes resíduos de antimicrobianos no leite é rápida e
tem como objetivo, atender aos requisitos do FDA - USA, LMR-Codex
Alimentarius, Ministério da Saúde e Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (BR) (Rugged..., 2009).
Método CHARM
Utiliza um receptor específico com afinidade às drogas beta-
lactâmicas/tetraciclinas que são covalentemente ligados a partículas de ouro
visíveis. Eles são pulverizados sobre um suporte sólido (membrana do
dispositivo de teste) e tornam-se móveis quando são reidratados com a
amostra de leite. O complexo formado (leite + receptor) escorre pela
membrana lateralmente e na presença de resíduo de antimicrobianos na
amostra, este se liga ao receptor. Ao passar por uma cavidade fixa contendo
um conjugado, a quantidade de receptor disponível será menor, formando
uma linha vermelha de menor intensidade de cor (linha Teste BL e/ou TE).
VALIDAÇÃO DE MÉTODOS IMUNOENZIMÁTICOS
PARA DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE
ANTIMICROBIANOS NO LEITE

45. Obrigada!