O documento descreve um estudo sobre os efeitos da prolactina no rim. O estudo avaliou os efeitos da prolactina no túbulo proximal microperfundido, no rim isolado e na função renal de ratos submetidos a sobrecarga de volume e sal. Os objetivos específicos foram estudar o papel da prolactina no metabolismo renal do sal em experimentos in vivo e in vitro e investigar os mecanismos de transporte tubular proximal do sódio diante da prolactina.

1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
DOUTORADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
ARIANA GOMES DA SILVA
Orientador: Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento
Co-orientador: Dr. Rafael de Morais Campos
Fortaleza-CE
2022

2. EFEITOS DA PROLACTINA NO TÚBULO PROXIMAL
MICROPERFUNDIDO, RIM ISOLADO E NA FUNÇÃO RENAL DE
RATOS SUBMETIDOS A SOBRECARGA DE VOLUME E SAL

3.  INTRODUÇÃO
 A prolactina (PRL) é um homônimo conhecido na regulação da lactação em
mamíferos.
 Hormônio versátil (300 funções biológicas )
 Regulação no metabolismo da glicose
 Modulação no sistema imunológico
 Modificação comportamental
 Efeitos na regulação do balanço de água e sal
(BORBA et al, 2019)
(ABRAMICHEVA et al, 2017; BORBA et al, 2017; BROBA et al, 2019)
3

4.  INTRODUÇÃO
(FREEMAN et al, 2000; AIRES, 2013; )
4

5.  INTRODUÇÃO
 Receptores de prolactina são expressos em diversos tecidos
PRLR
(BOLE-FEYSOT et al, 1998)
5

6.  REABSORÇÃO DE SÓDIO Filtração
NaCl
NaCl
67%
Na+/H
33%
Segmento fino
descendente
Segmento
espesso
Ascendente
NaCl
25%
8%
NKCC2
Túbulo distal
4%
NaCl
4%
Ducto coletor
cortical
Ducto coletor
medular
NaCl
3%
1%
ENaC
Na+/Cl-
(AIRES, 2013)
 INTRODUÇÃO
6

7.  INTRODUÇÃO
 Mecanismo de regulação de excreção de Na+
Sistema Renina-Angiotensina-
Aldosterona
Sistema nervoso simpático
Peptídeo Atrial Natriurético
Prolactina??
FIDCHENKO et al, 2014; AIRES, 2013)
7

8.  INTRODUÇÃO
PRL (-) Na+/K+ -ATPase
 Níveis elevados de PRL pode estar
associado a várias patologias
PERTURBAÇÕES NO BALANÇO
HÍDRICO E SALINO
(ABRAMICHEVA et al, 2017)
8
Não tem nada do que você está dizendo
aqui nas suas notas no artigo de
Abramicheva et al., 2017. Você leu este
artigo inteira de maneira crítica???

9. 9

10.  JUSTIFICATIVA
• Como os rins desempenham um papel central no controle do sal corporal e
do equilíbrio hídrico, são alvos frequentes para o tratamento da hipertensão,
especialmente aquelas formas sensíveis ao sal da dieta. A descoberta de
novas vias de excreção de sódio acarreta em novos alvos terapêuticos.
ESPERA-SE COM ESSA PESQUISA ESCLARECER SE
PROLACTINA TEM EFEITO RENAL DIRETO EM
CONCENTRAÇÕES ACHADAS NO PLASMA DO HOMEM OU
MULHERES NÃO GRÁVIDAS.
• PRL é sugerida por evidências indiretas como um hormônio Natriurético,
porém seu efeito direto e/ou mecanismos não são claros.
10

11.  OBJETIVO
• Avaliar os efeitos agudos da prolactina na função renal de rins de ratos
isolados, em modelo de hipertensão arterial com sobrecarga de volume e
sal “in vivo” e em túbulos proximais por microperfusão renal.
11
A Ordem deve (ou deveria)
respeitar o título e daí seguir po
toda apresentação

12.  OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Estudar o papel da prolactina no metabolismo renal do sal em experimentos in
vivo em modelo de hipertensão arterial por expansão de volume ( DOCA-SAL)
• Investigar o mecanismo do transporte tubular proximal do Na+ diante da
prolactina através de experimentos de microperfusão;
• Avaliar dos efeitos diretos da prolactina em rins de ratos isolados pelo sistema de
perfusão renal.
12

13.  METODOLOGIA
ANIMAIS
Ratos machos WKY
(250 - 300g)
Ciclo claro e escuro
12h
Temperatura média
22±2°C
Aprovada pelo
CEUA número de
protocolo
11503240/2019
13
Melhor apresentar método,
resultado e discussão para
cada técnica separado
Ex. Apresenta tudo de
hemodinâmica
Depois tudo de perfusão e
depois tudo d e microperfusão

14.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
 Estudar efeitos diretos da prolactina no metabolismo renal do sal in vitro
 Ratos normotensos WKY machos (250 - 300g)
Grupo WKY controle
Grupo Tratado c/ PRL
(30ng/mL)
Pentobarbital de
sódio 60mg/kg
14

15.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
 Procedimento Cirúrgico
15

16.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
 Procedimento Cirúrgico
16

17.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
Solução de krebs
modificada
6% de BSA 1,05%
inulina
17

18.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
18

19.  EXPERIMENTO DE RIM ISOLADO EM PERFUSÃO RENAL
Tempo de experimento
Controle interno
(30 min)
00 min
Urina Perfusato
30 min 60 min
PRL 30ng/mL
90 min
120 min
A cada 10 min
Perfusato
Urina
A cada 10 min A cada 10 min
 Protocolo Experimental
 O grupo controle foram perfundidos apenas com a solução perfusora
19

20.  METODOLOGIA
 Modelo DOCA-SAL (acetato de desoxicorticosterona + 1% NACL na água
)
Anestesia inalatória (Isoflurano)
1% NACL
( água)
Indução 5 semana
Nefrectomia
1 semana 4 semana
3 semana
2 semana
Injeções de DOCA
(25mg/Kg via
subcutânea + 1%
NACL )
Hemodinâmica renal
 Efeitos agudos da PRL na função renal in vivo
20

21.  METODOLOGIA
GRUPOS
Controle
Controle +
PRL
Doca-Sal
+PRL
Doca-sal
controle
 Ratos hipertensos receberam PRL em bolus + infusão constante de
prolactina (0,03UI/min);
 Ratos Hipertensos receberam apenas solução de infusão
 Ratos normotensos receberam PRL bolus + infusão constante de prolactina
(0,03UI/min)
 Ratos normotensos receberam apenas solução de infusão controle
21
Na tese está diferente ?? Quanto esta UI corresponde em ng??

22. Pentobarbital sódico
(60mg/ kg)
Placa de
aquecimento
térmico (37°C)
Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
22

23. Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
23

24. Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
24

25. Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
25

26. Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
26

27. Avaliação do
FSR
Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
27

28. (IVY; BAILEY, 2014)
Bomba de Infusão
10µl/min
Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
28

29. Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
29

30. Tempo de experimento
Controle interno (min)
30 min
U60
S2
U30
UNP
S1
60 min 90 min 180 min
 Protocolo Experimental
Bolus PRL 120 min
U120
U90
150 min
Infusão constante de PRL
0,03UI/mL
(taxa 10μL/min)
Bomba de Infusão
10µl/min
Hemodinâmica renal (in vivo)
 METODOLOGIA
30
10ng/min

31. Cateterizado
PE-10
V. Jugular
Traqueostomia
PE-240
PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
• Traqueostomia;
• Canulação da veia jugular esquerda;
• Manitol 3% em NaCl 0,9%;
• Bomba de infusão contínua (0,1 mL/min).
• Exposição do rim esquerdo;
• Posicionamento na câmara de Lucite;
• Fixado em gel de agarose 5%.
 MICROPERFUSÃO ESTACIONÁRIA IN VIVO
 Investigar o impacto da prolactina na função do trocador NHE3,
responsável por mais de 50% da reabsorção de sódio no túbulo
proximal
31

32. Micropipeta dupla
Solução Perfusora (SP)
• Solução salina;
• 25 mM NaHCO3.
Óleo de rícino
• Bloqueio da coluna de fluido.
 MICROPERFUSÃO ESTACIONÁRIA IN VIVO
32

33. Microeletrodo de dois ramos
Ramo grosso:
Resina sensível a H+;
Solução de complemento (solução condutora - pH 7,0).
Ramo fino:
Solução de referência (KCl 1M);
Fio de prata.
PRL (30ng/mL ou 100ng/ml)
S3226
 MICROPERFUSÃO ESTACIONÁRIA IN VIVO
33

34. pH estacionário
no TP
registro de PH estacionário
 MICROPERFUSÃO ESTACIONÁRIA IN VIVO
34

35. A taxa de acidificação tubular
(Nível de reabsorção de HCO3
-
Análise dos parâmetros ácido-base
1 - pH intratubular;
2 - Perfusão - solução perfusora;
3 - Recuperação do pH;
4 - pH estacionário ao fim da
perfusão.
 MICROPERFUSÃO ESTACIONÁRIA IN VIVO
35

36.  ANÁLISE ESTATÍSTICA
 Os dados serão apresentados como média ± erro padrão da média. As
variações foram expressas como percentual de incremento acima do
controle. A significância estatística foi determinada pelo uso da análise
variância ANOVA seguida pelo teste de comparações múltiplas de Student
Newman-Keuls. foram aceitos como significativos resultados com
probabilidade de ocorrência da hipótese nula menor que 5%.
36

37.  RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Experimento de rim isolado em perfusão renal
 Estudar o papel da prolactina no metabolismo renal do sal in vitro
37
Tempo (min.)
PPR(
mmHg
%
controle)
60 90 120
0
20
40
60
80
100
WKY controle
WKY PRL
*
*
*
*
*
*


#
#
T e m p o (m in .)
R
V
R
(
m
m
H
g
/m
L
.g
-1
.m
in
-1
%
d
o
c
o
n
t
r
o
le
)
6 0 9 0 1 2 0
0
5 0
1 0 0 W K Y c o n tro le
W K Y P R L
*
* 

* *
*
*
#
#
#
#

38. 38
 Em estudo in vivo observou um aumento da pressão arterial e
na resistência vascular renal. (PATEL et al., 1996)
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

39. T e m p o (m in .)
V
'
(
m
L
/g
/m
in
%
c
o
n
t
r
o
le
)
3 0 6 0 9 0 1 2 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
W K Y c o n tro le
W K Y P R L
T e m p o e x p e rim e n ta l
*
* *
*

*
*
 #
#
T e m p o (m in .)
R
F
G
(
m
L
/g
/m
in
%
c
o
n
t
r
o
le
)
3 0 6 0 9 0 1 2 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0 W K Y c o n tro le
W K Y P R L
T e m p o e x p e rim e n ta l
*
*
* # #
*
*
*
# #

 
39
 Em estudo de hiperprolactinemia causado por colestase induzida em rats
prenhes;
 Aumento na fluxo urinário sem efeito nos níveis de AQP2 e AQP3
 Efeito diurético é secundário ao efeito natriurético.
(FIDICHENKO et al., 2012)
 Quando há uma vasodilatação na arteríola aferente o RFG aumento
 Acredita-se que a PRL causa um efeito vasorelaxante em A.A sendo
responsável pelo aumento no RFG.
(AIRES, 2018; REN et al., 2002).
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

40. 40
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
T e m p o (m in .)
U
N
a
+
V
'
(

E
q
/g
/m
in
%
c
o
n
t
r
o
le
)
6 0 9 0 1 2 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
W K Y c o n tro le
W K Y P R L
*
*
*
*
*
*
# #
#
#




41. 41
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Várias isoformas de receptores de prolactina são expressas em todos os
seguimentos do néfron;
 A isoforma média curta foi a principal encontrada túbulo proximal
 Efeitos natriuréticos da PRL está associado com inibição da Na+ / K+ -
ATPase;
 Via sistema dopaminérgico: antagonista de receptores D1 aboliu os efeitos
da PRL a
 Outros transportados de sódio, tais como o Na+/K+/2Cl- (NKCC),
transportador Na+/Cl- e o permutador Na+/H+ na isoforma 3 (NHE3)
envolvidos nos efeitos diretos da PRL.

42. 42

43. 43

44. 44

45. 45
 Outros candidatos as ações da PRL (1 µg/ml in vitro): NKCC2, NCC,
ENaC
 Estudos são limitados.
 Tilápia mozambique cunduzido por Seale e cols. (2014), demostraram
que ao retirar a glândula pituitária do animal, a expressão de mRNA de
NKCC2 no intestino e injeçoes de PRL aumentava a expressão.
 Greenlee e colaboradores (2015), PRL (1 µg/ml in vitro) estimula o
transporte epitelial de Na+ e Cl- em células epiteliais renais A6
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

46. 46
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
T e m p o (m in .)
d
T
k
+
(

E
q
/g
/m
in
%
c
o
n
t
r
o
le
)
6 0 9 0 1 2 0
-2 0 0
-1 0 0
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
W K Y c o n tro le
W K Y P R L
#
#
*
*
*
*


*
#
#

*
T e m p o (m in .)
U
K
+
V
'(

E
q
/g
/m
in
%
c
o
n
t
r
o
le
)
6 0 9 0 1 2 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
W K Y c o n tro le
W K Y P R L
*
*
*
*
*
*
#
#
#
#




47. 47
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Hiperprolactinemia em ratas grávidas aumentou RFG com aumento
da excreção de cálcio, fosfato e potássio.
 Hiperprolacnemia por sulpirida a hipercalcemia foi associada ao
efeito indireto da natriurese principalmente em DC

48. 48
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Avaliar os efeitos da prolactina na função renal de ratos in vivo e
observar se esses efeitos se correlacionava com os obtidos em rim
isolado.
 Hemodinâmica renal
in fu s ã o d e P R L
P
A
M
(m
m
H
g
)
C P 1 P 2 N P
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
N o rm o te n so
N o rm o te n so + P R L
D o c a -s a l + P R L
D o c a -s a l c o n tro le
# #
 

49. 49
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

50. 50
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Onde está a natriures pressórica do
normotenso???? Cadê a Fração de
excreção???Aparentemente
prolactina tem efeito negativo na
diurese pressórica e efeito
antinatriurético nos DOCA.. Vamos

51. 51
Roman RJ, Cowley AW Jr. Characterization of a new model for the study
of pressure-natriuresis in the rat. Am J Physiol. 1985 Feb;248(2 Pt
2):F190-8.

52. 52
• Pesquisa realizada por Ibarra e colaboradores na função de ratos
normotensos in vivo mostrou que a prolactina aumentou a carga
excretada de sódio, potássio e fluxo urinário sem alterações no RFG.
•
• Essas diferenças podem ser devido ao modelo experimental e dose de
PRL (400ng/min)
 Pesquisa relacionas com efeito da prolactina in vivo são escassos e não
mostram com clareza as ações da prolactina renal se diurética ou
antinatriurética.
 RESULTADOS E DISCUSSÃO

53. 53
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Investigar se a PRL exerce seus efeitos via permutador NHE3
 Microperfusão renal in vivo
C
o
n
t
r
o
l
e
P
R
L
3
0
n
g
/
m
L
P
R
L
1
0
0
n
g
/
m
L
S
3
2
2
6
S
3
2
2
6
+
P
R
L
1
0
0
n
g
/
m
L
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
C o n tro le
J
H
C
O
-
3
n
m
o
l.c
m
-
2
.
s
-
1
P R L 1 0 0 n g /m L
S 3 2 2 6
S 3 2 2 6 + P R L 1 0 0 n g /m L
P R L 3 0 n g /m L
* *
*
# #
#
 Estudos conduzidos por Sjaastad e colaboradores em 1993, avaliaram os
efeitos da prolactina em células epiteliais mamárias
 Inibição do NHE3

54. 54
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
C
o
n
t
r
o
l
e
P
R
L
3
0
n
g
/
m
L
P
R
L
1
0
0
n
g
/
m
L
S
3
2
2
6
S
3
2
2
6
+
P
R
L
1
0
0
n
g
/
m
L
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
C o n tro le
J
H
C
O
-
3
n
m
o
l.c
m
-
2
.
s
-
1
P R L 1 0 0 n g /m L
S 3 2 2 6
S 3 2 2 6 + P R L 1 0 0 n g /m L
P R L 3 0 n g /m L
* *
*
# #
#
 A redução do fluxo de bicarbonato pelo prolactina tem associação
com a via do NHE3?

55. 55
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
C
o
n
tro
le
P
R
L
3
0
n
g
/m
L
P
R
L
1
0
0
n
g
/m
L
S
3
2
2
6
S
3
2
2
6
+
P
R
L
1
0
0
n
g
/m
L
0
2
4
6
8
C on tro le
T
1
/2
(s
)
P R L 1 0 0 n g /m L
S 3 2 2 6
S 3 2 2 6 + P R L 1 0 0 n g /m L
P R L 3 0 n g /m L
*
* *
#
#
#
C
o
n
t
r
o
l
e
P
R
L
3
0
n
g
P
R
L
1
0
0
n
g
S
3
2
2
6
S
3
2
2
6
+
P
R
L
1
0
0
n
g
/
m
L
0
2
4
6
8
C o n tro le
[
H
C
O
-
3
]
m
M P R L 1 0 0 n g
S 3 2 2 6
S 3 2 2 6 + P R L 1 0 0 n g /m L
P R L 3 0 n g
*
#

56. 56
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
 A PRL quando atuando diretamente no rim, reduz a resistência vascular
renal produzindo efeitos diuréticos e natriuréticos;
 Ações da PRL em túbulo proximal é devido a inibição do NHE3;
 A infusão de prolactina “in vivo” em taxa de 10ng/min

57. Pela atenção,
obrigada !
57