Duplo híbrido

1. 7
Dissecação da Cadeia de Transdução de Sinais Mediada pelo
Gene de Resistência Sw-5 Por Meio da Utilização do
Sistema Duplo-Híbrido de Leveduras
1. Resumo
O gene Sw-5, que confere ao tomateiro resistência de
amplo espectro a tospovírus, foi recentemente clonado e
caracterizado. Algumas evidências como o fenótipo da
resistência, os domínios estruturais da proteína codificada
e a similaridade com domínios de proteínas que participam
na cadeia de transdução de sinais que resulta em morte
celular programada em animais, sugerem que Sw-5 atue em
uma cadeia de transdução de sinais que leva a morte das
células inicialmente infectadas pelos tospovírus e/ou
ativação de mecanismos de defesa da planta. A meta deste
projeto é a identificação de genes que compõem esta cadeia
de transdução de sinais pela utilização do sistema duplo-
híbrido de leveduras. Além de possibilitar a compreensão do
mecanismo molecular da resistência conferida por Sw-5,
estes genes poderão ser futuramente empregados no
engenheiramento de resistência múltipla a fitopatógenos.

2. 2- Introdução e justificativas
O gene dominante Sw-5, introduzido no tomateiro
cultivado (Lycopersicon esculentum) a partir da espécie
selvagem L. peruvianum, confere resistência aos
tospovírus tomato spotted wilt virus (TSWV), tomato
chlorotic spot virus (TCSV), groundnut ringspot virus
(GRSV) e chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) (Boiteux
e Giordano, 1993; Brommosnchenkel & Tanksley, 1997;
Brommonschenkel et al. 1998; Stevens et al., 1992). Esses
fitovírus causam danos significativos na cultura do
tomateiro. Com base em estimativas, acredita-se que os
prejuízos anuais causados por este grupo de vírus em
cultivos de tomate para mesa e indústria sejam
superiores a 30 milhões de dólares (Nagata et al., 1995;
Pozzer et al., 1996). Além de tomate, os tospovírus
infectam várias espécies de dicotiledôneas e
monocotiledôneas, causando perdas significativas em outras
culturas importantes tais como alface, fumo, pimentão e
ornamentais (Pozzer et al., 1996).
A resistência conferida por Sw-5 caracteriza-se pela
completa ausência de sintomas na planta inoculada ou pela
morte das células inicialmente infectadas pelo vírus
(Figura 1). Os tospovírus podem ser detectados nos bordos
da lesão necrótica por DAS-ELISA, indicando que a
resistência resulta da restrição do movimento viral na
planta por meio da indução de defesas antivirais e/ou
desorganização dos plasmodesmos devido à morte celular. A
morte celular localizada ou reação de hipersensibilidade
(HR) é a expressão fenotípica da resistência em muitas
interações planta-patógeno (Pontier, 1998). A análise

3. 7
Figura 1
genética dessas interações demonstra que a reação de HR é
dependente da interação específica entre o produto de um
gene dominante de resistência da planta (gene R) e produto
de um gene dominante de avirulência (AVR) correspondente
no patógeno (Flor, 1971; Pontier 1998). Ao nível
bioquímico, esta relação gene-a-gene tem sido interpretada
pelo modelo “Receptor-Elicitor” (Gabriel & Rolfe, 1990;
Keen, 1990; Lamb, 1996). Segundo este modelo, genes AVR
produzem direta ou indiretamente um elicitor que é
reconhecido pelo receptor correspondente codificado pelo
gene R. Como conseqüência deste reconhecimento, é ativada
uma cadeia de transdução de sinais que resulta na reação
de hipersensibilidade e também na ativação dos mecanismos
de defesa da planta, culminando na contenção do patógeno
ao sítio de infecção. Estes mecanismos incluem o aumento
intracelular das formas ativas de oxigênio, o
fortalecimento da parede celular vegetal, a produção de
substâncias antimicrobianas (fitoalexinas) e a ativação da
expressão de genes de defesa nos tecidos periféricos e
distantes do local de infecção (Brisson et al., 1994;
Chandra et al., 1996; Dixon et al. 1994; Hammond-kosack &
Jones, 1996; Lamb & Dixon, 1997; Levine et al., 1994).
Vários genes virais capazes de elicitar morte celular
e reações de defesa dependentes da presença de genes de
resistência específicos já foram caracterizados (de Witt,
1997). Embora tal análise ainda não esteja concluída para
o caso de tospovírus, a caracterização molecular do gene
Sw-5 (Brommonschenkel e Tanksley 1997; Brommonschenkel et

4. al., 1998) sugere a atuação deste gene no reconhecimento
direto ou indireto de um elicitor produzido pelos
tospovírus e ativação de uma cadeia de transdução de
sinais. Sw-5 codifica uma proteína hidrofílica constituída
por 1.246 aminoácidos, provavelmente citoplasmática, que
contém um domínio NBS (“nucleotide binding site”)
localizado próximo à região N-terminal e repetições ricas
no aminoácido leucina (“leucine-rich repeats ou LRRs”) na
região carboxi-terminal. Estas características
estruturais são encontradas em outras proteínas R como por
exemplo, Mi, que confere ao tomateiro resistência ao
nematóide Meloidogyne (Milligan et al., 1998) e RPM1 que
em Arabidopsis confere resistência a isolados de
Pseudomonas syringae pv. maculicola que expressam os genes
de avirulência avrB ou avrRpm1 (Hammond-kosack & Jones,
1997).
As LRRs estão envolvidas em muitas interações
proteína-proteína (Kobe & Deinsenhofer, 1994). Desta
forma, a presença deste domínio em proteínas R corrobora o
modelo de interação com um elicitor produzido pelo
patógeno ou com outros fatores envolvidos na cadeia de
transdução de sinais que leva à ativação gênica e resposta
resistente (Jones & Jones, 1996; Warren et al., 1998). A
divergência entre a seqüência de aminoácidos da proteína
codificada por Sw-5 e a codificada pelo seu alelo
recessivo sw-5 na região carboxi-terminal, suporta o
provável envolvimento desta região na especificidade da
resistência (Brommonschenkel, S.H.; 1998; dados não
publicados).
Os domínios NBS são encontrados em várias proteínas
cuja atividade é dependente da ligação aos nucleotídeos
trifosfatados ATP e GTP (Traut, 1994). O domínio NBS da
proteína Sw-5 e de outras proteínas R possui similaridade

5. com o NBS das proteínas CED-4 e APAF-1, que funcionam como
adaptadores na cadeia de transdução de sinais que resulta
em morte celular programada no nematóide Caenorhabditis
elegans e em mamíferos (Brommonschenkel et al., 1998;
Chinnaiyan et al., 1997; Van der Biezen & Jones, 1998). Por
anologia ao modelo das interações moleculares entre os
componentes da maquinaria de morte celular nestes sistemas
(Jacobson, 1997; Figura 2), Van der Biezen & Jones (1998)
sugerem que as proteínas R com NBS/LRRs são adaptadores que
participam em um complexo proteíco de morte celular vegetal
ativado pelo elicitor codificado pelo gene AVR. Neste
modelo, as LRRs dessas proteínas poderiam assegurar que a
ativação do complexo proteíco seja dependente de
reconhecimento. A região amino-terminal poderia estar
envolvida na ativação de efetores após mudanças
conformacionais dependentes da hidrólise de ATP/GTP no NBS.
A comprovação deste modelo depende, dentre outros
fatores, da identificação de todos os genes necessários
para expressar a resistência gene-R dependente. A
mutagênese de uma linhagem contendo um determinado gene R
seguida da identificação de mutantes com maior
sensibilidade ao patógeno tem sido a metodologia comumente
utilizada na identificação de componentes da via de
transdução de sinais em tomate, arabidopsis e centeio
(Innes, 1998). Todavia, o número de genes identificados
nestes estudos tem sido pequeno e, em alguns casos, nenhum
gene novo foi encontrado, apesar da obtenção de repetidas
mutações no gene R. Segundo Innes (1998), estes insucessos
e o número reduzido de genes encontrados podem ter várias
explicações. Primeiro, os componentes da cadeia de
transdução de sinais podem ser codificados por genes
redundantes, de forma que a perda de um produto gênico
individual resulta em pouca ou nenhuma perda de

6. resistência. Alternativamente, alguns componentes da cadeia
de transdução de sinais podem ser essenciais para a
viabilidade da planta, dificultando a obtenção de mutantes.
Figura 2. Modelo da cascata de transdução de sinais que resulta em
morte celular programada (ou apoptose) em animais. A análise genética
no nematóide Caenorhabditis elegans sugere que a ordem funcional dos
genes é a seguinte: ce9-(inibe) ced-4 (ativa) ced-3. As proteínas
correspondentes interagem no sistema duplo-híbrido e in vivo. A
proteína CED9/BCL2, reguladora-negativa de morte celular localizada em
membranas intra-celulares, liga-se a CED4/APAF-1 que por sua vez liga-
se (via região amino-terminal que contém repetições de aminoácidos
denominadas de WD-40) à pro-CED-3, uma cisteína-proteinase (também
conhecida como caspase-3), requerida para morte celular (ou apoptose)
em animais. Estas interações físicas mantêm o complexo de morte
celular (“apoptosomo”) em uma forma inativa e inibem a liberação da
citocromo c oxidase da mitocôndria para o citosol, o que por sua vez
previne a ativação de caspases. Quando o programa de morte celular é
ativado, CED4/Apaf1 dissocia-se de CED9/Bcl-2, a citocromo c oxidase é
liberada e as caspases, agora no citosol, são ativadas e executam o
programa de morte celular (Adaptado de Jacobson, 1997).

7. 7
Uma terceira explicação seria uma ramificação da cadeia de
transdução de sinais mediada por genes R em várias rotas
secundárias, de forma que o bloqueio de uma rota causaria
somente um fenótipo intermediário. Consistente com esta
hipótese, a maioria dos mutantes identificados até o
momento, produzem um fenótipo de resistência intermediário.
Desta forma, é provável que mutantes pouco suscetíveis não
tenham sido selecionados durante as triagens. Com base
nestas experiências, espera-se que a utilização desta
metodologia no caso do gene Sw-5 seja extremamente penosa
e/ou improdutiva. A seleção de mutantes seria dependente da
inoculação mecânica e da quantificação da replicação viral
em um grande número de plantas. Além disso, a ocorrência de
partículas defectivas (Resende et al., 1992) durante a
manutenção mecânica via inoculações sucessivas, necessárias
para a produção da quantidade de inóculo requerida para a
inoculação das grandes populações avaliadas em estudos de
mutação, poderia mascarar a suscetibilidade dos poucos
mutantes presentes na população avaliada.
Com a clonagem e caracterização do gene Sw-5, a
utilização do sistema duplo-híbrido de leveduras destaca-se
como a alternativa mais exeqüível para este tipo de estudo.
Este sistema baseia-se na natureza modular de ativadores
transcricionais (Fields & Song, 1989). Os ativadores são
proteínas que possuem dois domínios funcionais, denominados
domínios de ligação ao DNA (BD) e domínio de ativação (AD)
da transcrição. Os aminoácidos que constituem o domínio BD
reconhecem eficientemente uma seqüência de ativação,
denominada de UAS (“upstream activating sequence”), nos
promotores dos genes ativados, enquanto a seqüência de
aminoácidos que constitui o domínio de ativação interage
com fatores de transcrição que, por sua vez, interagem com
a RNA Polimerase II ativando a transcrição. Estes módulos

8. são capazes de funcionar quando fusionados a diferentes
proteínas que interagem entre si. Se as proteínas
fusionadas (também denominadas de “iscas” e “presas”)
interagem em uma célula de levedura, um ativador
transcricional funcional é reconstituído (Figura 3). O grau
de interação é monitorado através da expressão de um gene
“repórter” que apresenta, na sua região promotora, uma
seqüência reconhecida especificamente pelo domínio de
ligação ao DNA do ativador de transcrição. Diferentes BDs e
ADs têm sido usados com sucesso neste sistema, incluindo os
BDs dos ativadores GAL4, LexA e os ADs do GAL4 e VP16
(Fields e Song, 1989; Zervos et al., 1993). Os genes
“repórteres” comumente utilizados são o gene HIS de
Saccharomyces cerevisae e o gene LacZ de Escherichia coli.
Assim, a interação entre as proteínas fusionadas é
detectada através de um ensaio fenotípico baseado no
crescimento em meio seletivo e/ou no desenvolvimento de
coloração azulada em colônias crescidas em meio com o
indicador X-GAL(Figura 3).
Este sistema tem sido utilizado com sucesso na
dissecação de várias cadeias de transdução de sinais em
células animais (Brent & Filley, 1997) Em estudos da
interação planta-patógeno, o emprego deste sistema
proporcionou, por exemplo, a identificação de genes que
participam na cadeia de transdução de resistência mediada
pelo gene Pto (Zhou et al., 1998) e a demonstração da
interação física da proteína Pto com a proteína de
avirulência Avrpto (Tang et al., 1996; Zhou et al., 1998).
Comparativamente aos métodos bioquímicos tradicionais
utilizados na detecção de interação proteína-proteína (como
por exemplo, co-imunoprecipitação, crosslinking e
copurificação através de gradientes ou colunas

9. Figura 3. Detecção da interação de proteínas por meio da ativação da
transcrição do gene repórter lacZ. A seqüência de ativação GAL4-UAS e
o gene repórter lacZ estão integrados no cromossoma da levedura. (A) a
proteína híbrida GAL4BD-proteína “isca X” liga-se à seqüência GAL4
UAS, localizada na região anterior ao gene repórter lacZ. A proteína
híbrida GAL4AD-proteína “presa Y” liga-se a fatores de transcrição no
núcleo mas não localiza-os na região GAL4-UAS. (B) Se as proteínas
isca X e presa Y interagirem, os domínios GAL4 AD e GAL4 BD são
aproximados e atuam conjuntamente com os fatores de transcrição
ligados ao AD na iniciação da transcrição do gene repórter. Em meio de
cultura contendo X-gal, visualiza-se a ocorrência dessa interação pelo
desenvolvimento de coloração azulada na colônia correspondente em
razão da ativacão de lac-Z e produção da enzima -galactosidase.
AD
Gene Reporter lacZ
BD
BD
Proteína X
Proteína X
Proteína Y
Proteína Y
Gene Reporter lacZ
BD
BD
AD
Proteína X
Proteína X Proteína Y
Proteína Y
TATA
UAS
UAS TATA
(B)
(A)

10. cromatográficas) o sistema duplo híbrido de leveduras
apresenta vantagens tecnicamente significativas. A análise
da base da função estrutural de interações conhecidas, bem
como análises de interações de novas proteínas são
facilitadas pela caracterização direta e manipulação a
nível de DNA. A identificação de uma proteína que interage
com a proteína de interesse também identifica pelo menos
uma porção do gene que a codifica. Além disso, a proteína
isolada e caracterizada pelo sistema duplo híbrido, pode
ser usada como isca na identificação de novas proteínas de
forma sucessiva. O sistema também pode ser adaptado para
estudo de interações conhecidas, incluindo o uso de
estratégias mutacionais para um rápida dissecação das
relações de estrutura e função (Brent e Finley, 1997).

11. 7
3- Objetivos
O objetivo geral deste projeto é a identificação e
caracterização molecular de proteínas que interagem
fisicamente com a proteína codificada pelo gene de
resistência Sw-5, por meio da utilização do sistema duplo-
híbrido de leveduras. Os objetivos específicos incluem: 1)
O isolamento de RNA mensageiro de tecido foliar de
tomateiro e a construção de uma biblioteca de cDNAs
fusionados à seqüência que codifica o domínio AD da
proteína GAL4; 2) A subclonagem do gene Sw-5 no vetor
fagomídeo pBD-GAL4 Cam , de modo a obter a expressão do
gene na forma de uma proteína fusionada ao domínio BD da
proteína GAL4; 3) A triagem da biblioteca de cDNAS
fusionados por meio do sistema duplo híbrido de leveduras,
utilizando-se como isca a construção obtida no ojetivo 2 e
4) a caracterização molecular dos genes que codificam estas
proteínas, por meio de sequenciamento dos respectivos cDNAs
e estudo da homologia destas seqüências com seqüências
depositadas em banco de dados.

12. 7
4- Significância do Projeto
As semelhanças das rotas bioquímicas e mecanismos de
defesa ativados por diferentes genes de resistência após o
reconhecimento de elicitores produzidos pelos patógenos,
sugere que genes da rota de transdução de sinais podem ser
utilizados no engenheiramento de resistência múltipla a
fitopatógenos. Esta possibilidade foi recentemente
demonstrada (Oldroyd & Staskawicz, 1998). Desta forma, além
de contribuir para o entendimento do mecanismo molecular de
atuação do gene Sw-5, os genes identificados neste trabalho
poderão ser utilizados para esta finalidade.

13. 7
5- Material e Métodos
5.1 Vetores de clonagem
O vetor lambda HybridZAP-2.1 e o vetor fagomídeo pAD-
GAL4-2.(Figura 4) possuem um sítio múltiplo de clonagem com
sítios de restrição para as enzimas BamHI, NheI, EcoRI,
XhoI, SalI, XbaI, PstI e BglII, as origem ColE1 e 2 (que
permitem a replicação do plasmídio em E. coli e
Saccharomyces cerevisae, respectivamente) e os genes Leu2 e
Ampr, que são utilizados para seleção de levedura e E. coli
recombinantes, respectivamente. Em leveduras, o promotor
pADH1 de cada plasmídio recombinante controla a expressão
constitutiva de uma proteína fusionada que contêm os
aminoácidos do domínio de ativação da proteína GAL-4 e os
aminoácidos codificados pela sequência do cDNA clonado na
mesma sequência aberta de leitura traducional de GAL-4AD.
O fagomídeo pBD-GAL4 Cam (Figura 5) contêm as origem
de replicação ColE1 e 2 (que permitem a replicação do
plasmídio em E. coli e Saccharomyces cerevisae,
respectivamente), um sítio múltiplo de clonagem com sítios
de clivagem para as enzimas EcoRI, SrfI, SmaI, XhoI, SalI,
XbaI e PstI e os genes marcadores Camr (que confere
resistência ao cloramfenicol) e trp1 (síntese de
triptofano) que permitem a seleção de E. coli e leveduras
recombinantes, respectivamente. Em leveduras o promotor pADH
determina a expressão constitutiva de uma proteína híbrida
constituída dos aminoácidos do domínio de ligação de GAL4 e
dos aminoácidos codificados pela sequência de DNA clonado
na mesma sequência de leitura traducional de GAL4-BD.

14. 7
Figura 4 Mapa molecular do vetor fagomídeo pAD-GAL4-2.1

15. 7
Figura 5 Mapa molecular do vetor fagomídeo pBD-GAL4-2.1

16. 7
5.2 Estirpe de levedura
A estirpe YRG-2 de Saccharomyces cerevisiae, é
auxotrófica para os aminoácidos leucina(leu2),
triptofano(trp1) e histidina(his3). Os marcadores
auxotróficos trp1 e leu2 permitem a seleção das células de
levedura transformadas com os fagomídeos AD e BD,
respectivamente, e o marcador auxotrófico his3, a seleção
de leveduras transformadas com proteínas que interagem. A
estirpe YRG-2 também contém um sistema de seleção de
interações proteína-proteína baseado no gene repórter lacZ.
O cassete repórter LacZ consiste em três cópias da
seqüência consenso (GAL-17mer) de ligação à proteína GAL4
e a região TATA do promotor (pCYC1)do gene iso-1-cytochromo
c (CYC1) que fusionadas ao gene repórter LacZ regulam a sua
expressão. O cassete HIS3 compreende a seqüência ativadora
do gene GAL1 (UASGAL1) e a região TATA do promotor do gene
GAL1 (PGAL1) fusionadas ao gene repórter HIS3. A seqüência
UASGAL1 contêm quatro sítios de ligação ao domínio de
ligação ao DNA da proteína GAL4. A proteína híbrida GAL4
BD liga-se às seqüências UASGAL1 e GAL17-mer localizadas na
região 5’anterior à região TATA dos genes repórteres. Se as
proteínas híbridas interagem, os domínios AD e BD são
trazidos em contato e atuam conjuntamente determinando o
início de transcrição dos repórteres (lacZ e His3),
evidenciando a ocorrência de interações proteína-proteína.

17. 5.3. Isolamento de RNA mensageiro e construção da
biblioteca de cDNAs fusionados à seqüência que codifica o
domínio AD do ativador GAL4
Plantas da linhagem SW99-1 (Sw-5/Sw-5) serão
inoculadas mecanicamente com a estirpe “HR” de tospovírus.
O RNA mensageiro será isolado a partir de tecido foliar
inoculado, coletado a 0, 6, 12, 24 , 36, 48, 72 e 96 horas
após a inoculação. Após a extração, quantidades iguais de
RNAm derivadas destes tratamentos serão combinadas,
convertidas em DNA de fita dupla estável (cDNA) que serão
ligados a adaptadores com sítios de restrição para as
enzimas EcoR1 e XhoI (kit HybridZAP-2.1 two hydrid cDNA
synthesis da Stratagene). Após digestão com as enzimas
EcoR1 e XhoI, os cDNAs serão fracionados em coluna de
Sepharose CL-2B, precipitados e ligados ao DNA do fago
recombinante HybriZAP-2.1, préviamente digerido com EcoRI e
XhoI. Os concatêmeros de DNA serão posteriormente
encapsulados in vitro, conforme instruções do “Gigapack
cloning kit” (Statagene) para gerar a biblioteca prímaria
de cDNA em fago. A seguir, esta biblioteca será amplificada
por procedimento-padrão e armazenada na forma de lisados a
–800C.
5.4 Purificação do DNA dos “plasmídios isca”
Os insertos dos fagos serão excisados massalmente in
vivo na forma de fagomídeos (pADGAL4:cDNAs) por meio da
transdução em E. coli XLOR (Biblioteca de fagomídeos), de
acordo com os procedimentos do kit “GAL4 two-hybrid
phagemid vector”, da Stratagene. O número de insertos
excisados será equivalente a pelo menos 2 x 106 unidades
formadores de placa (pfu’s) da biblioteca primária. As

18. células transdutantes serão cultivadas em meio LB a 370C
por três horas ou até atingir uma OD600 de 0,3-0,4. A
seguir, as células bacterianas serão coletadas por
centrifugação. O DNA dos fagomídeos será isolado a partir
das células sedimentadas, utilizando-se o método de lise
alcalina e extrações com fenol-clorofórmio. Este DNA
plasmidial será posteriormente quantificado e utilizado na
transformação de leveduras visando a detecção de interações
proteína-proteína (ver item 5.7)
5.5 Subclonagem do gene Sw-5 no vetor pBDGAL4-2.1
(“plasmídio ïsca”)
Utilizando técnicas convencionais de subclonagem, o
cDNA que codifica para Sw-5 será inserido no polilinker do
fagomídio pBD-GAL4 (Figura 3), de modo a obter-se a
seqüência aberta de leitura (ORF) do gene na mesma
seqüência de leitura traducional de GAL4BD. Após a
confirmação da obtenção da construção desejada por
sequenciamento, o plasmídio pBDGAL4:Sw-5 será transferido
para a levedura YRG-2 por meio de transformação genética. A
seqüência de nucleotídeos do inserto do fagomídio de alguns
dos clones obtidos será determinada para verificar se estes
insertos não contém mutações. As leveduras transformadas
também serão analisadas para expressão dos genes reporter
LacZ e HIS3, para determinar se a proteína quimérica BD:Sw-
5 é capaz de isoladamente ativar a transcrição. Se o
plasmídio PBDGAL4:Sw-5 ativar a transcrição desses
repórteres, seqüências truncadas de Sw-5 serão
transformadas neste vetor e novamente avaliadas quanto a
sua habilidade de funcionar como fatores transcrionais
isoladamente.

19. 5.6.Detecção de Interações com a Proteína Sw-5 e
caracterização parcial dos cDNAs obtidos
Células competentes de levedura YRG-2 contendo o
fagomídio pBDGAL4:Sw5 (item 4.5) serão transformadas com o
os plasmídios-isca (item 4.4). A reação de transformação
será plaqueada em meio mínimo sintético(SD)-ágar sem
histidina, leucina e triptofano. As placas serão incubadas
invertidas a 30o C até surgirem colônias visíveis (3-7
dias). O crescimento de colônias neste meio indica uma
fraca expressão do gene reporter HIS3 ou interação
específica entre a proteína alvo e a proteína isca,
resultando na expressão do gene HIS3. Para distinguir entre
estas possibilidades, será efetuada a detecção da expressão
do segundo gene reporter (LacZ) por meio do ensaio “filter
lift.” Neste ensaio, as colônias desenvolvidas em meio SD
por 3-7 dias são transferidas para papel de filtro,
permeabilizadas em nitrogênio líquido e avaliadas para a
expressão do gene lacZ, por meio da detecção da atividade
da -galactosidase com uma solução contendo o substrato X -
gal. Neste substrato colônias que expressam o gene lac-Z
produzem -galactosidas e desenvolvem uma coloração
azulada.
Os cDNAs das colônias positivas serão amplificados
diretamente das colônias de levedura via PCR utilizando-se
iniciadores (“primers”) que flanqueiam o sítio múltiplo de
clonagem do vetor GAL4-AD. Os produtos de PCR serão
digeridos com enzimas que reconhecem sítios de restrição de
ocorrência comum (por exemplo, MlnI e MboI), e os
fragmentos de restrição analisados por meio de eletroforese
de alta resolução. A presença de fragmentos de restrição
comuns indicará que os cDNAs tem seqüências de nucleotídeos

20. em comuns e, portanto, permitirá a identificação de clones
únicos e de clones relacionados. Adicionalmente, estes
produtos de PCR poderão marcados e utilizados como sondas
na hibridização de Southern blots contendo DNA de tomate
digerido com várias enzimas de restrição. Estas
caracterizações contribuirão para reduzir o número de
clones positivos que serão reexaminados quanto à
especificidade da interação (item 5.7).
5.7 Verificação da especificidade das interações proteína-
proteína detectadas
Para verificar se as interações positivas são devido à
interação específica da proteína isca com Sw-5 e não com o
domínio BD de GAL4, o DNA total das colônias positivas será
isolado e os fagomídios contendo os cDNAs serão resgatados
por transformação de E. coli e seleção das células
transformadas em meio LB com cloramfenicol. Estes
plasmídios serão isolados e retransformados em clones da
levedura YRG-2 que contêm os plasmídios p53, pLaminC e pBD-
GAL4Cam. O plasmídio controle pGAL4 expressa a sequência
codificadora completa do ativador GAL4. O plasmídio p53
expressa o BD de GAL4 fusionado aos aminoácidos 72-3390 da
proteína p53. O plasmídio pSV40 expressa o AD de GAL4
fusionado aos aminoácidos 84-708 da proteína SV-40.
transformados A seleção das leveduras transformadas e
avaliação da expressão dos genes reporters HIS3 e LacZ.
serão efetuadas, conforme descrito anteriormente (item
5.6).

21. 5.8 Caracterização molecular das proteínas identificadas
Para identificar a proteína codificada pelos clones
positivos, a seqüência de nucleotídeos dos repectivos cDNAs
será determinada e comparada a seqüências depositadas em
bancos de dados por meio dos programas BLASTN e BLASTX. Com
base nos elementos estruturais presentes nas proteínas
identificadas a significância fisiológica das interações
detectadas poderá ser avaliada e testada em experimentos
posteriores (item 6).

22. 7
6. Estudos Futuros
Os insertos dos clones obtidos poderá ser transferido
do vetor pAD-GAL4-2.1 para vetores de expressão de
proteínas e as proteínas purificadas poderão ser utilizadas
na produção de antisoros específicos para cada proteína
“ïsca” Estes antisoros poderão ser utilizados em ensaios de
imunoprecipitação visando detectar a ocorrência “in planta”
das interações com a proteína Sw-5 e a possível localização
celular. A co-localização celular é uma condição essencial
para que uma interação detectada pelo sistema duplo híbrido
seja considerada verdadeira.
As proteínas (cDNAs) identificados poderão ser
utilizados em um novo “screnning” da mesma biblioteca de
cDNA, a fim de identificar novas proteínas que participam
da mesma cadeia de transdução de sinais e assim,
sucessivamente.
Estudos genéticos de perda ou ganho de função poderão
ser conduzidos visando: 1) a quantificação da contribuição
de cada gene identificado na resistência e, 2) a
averiguação da possibilidade de obtenção da indução dos
mecanismos de resistência independente do gene Sw-5 e/ou de
sua interação com o elicitor viral. Nestes estudos, os
cDNAs identificados poderão ser superexpressados ou
expressados de modo antisenso em plantas suscetíveis ou
resistentes, por meio de experimentos de transformação de
plantas. As plantas transgênicas poderão ser avaliadas
quanto ao espectro de resistência a tospovírus e outros
fitopatógenos.
Adicionalmente, a importância para a interação de
cada elemento estrutural das proteínas identificadas e da
proteína Sw-5 na interação poderá ser analisada por meio da

23. mutacões direcionadas nestes elementos estruturais, seguida
da análise da interação no sistema-duplo híbrido e e em
experimentos de transformação de plantas.

24. 7- CRONOGRAMA FÏSICO
Atividades Semestr
e 1
Semestr
e 2
Semestr
e 3
Semestr
e 4
 Extração do mRNA, preparo e
amplificação da Biblioteca
de cDNAs fusionado
(Biblioteca primária).
Excisão massal dos insertos
em fagomídios. Amplificação
da biblioteca de fagomídios
e purificação do DNA
plasmidial.
X X
 Subclonagem do gene Sw-5 no
vetor pAD-GAL4 Cam.
Sequenciamento para
confirmação da construção
obtida.
X X
 Detecção de Interações com
a proteína Sw-5. X X
 Caracterização parcial e
agrupamento dos clones
obtidos em classes
similares com base na
digestão dos insertos
amplificados por PCR e
análise de Southern
blotting
X X
 Confirmação das

25. especificidades das
interações detectadas
utilizando-se um
representante de cada
classe de cDNA
X
 Sequenciamento do clone de
cada classe com maior
inserto. Analise de
similaridade em bancos de
dados (BLASTX e BLASTN)
X X
 Análise e Publicação dos
Resultados
X

26. 8- ORÇAMENTO
8.1- Despesas de Custeio
SIGMA: n-butanol (SIGMA B7906) -01 L; cloreto de lítio
(SIGMA L9650) - 1kg; Acetato de Sódio - 1 kg; N-
lauroylsarcosine (SIGMA L-5777) - 1 kg; Ficoll (F2637) -
500 g; Trizma Base (SIGMA T8524) - 4 kg; MOPS (SIGMA M5162)
- 100 g, diethyl pyrocarbonate (SIGMA D5758) - 200 ml;
ácido bórico ( SIGMA B6768) - 10 kg; dithiothreitol (SIGMA
D9779) - 10g; EDTA (SIGMA E 5134) - 2 kg; HEPES (SIGMA
H0891) - 100g; SDS (SIGMA L4390) - 2 kg; Mercapetanol
(M3148) - 250 ml; óleo mineral (SIGMA M5904)- 2 L; Acetato
de potássio (P1190) - 02 kg; fosfato de potássio bibásico
(P9666) - 02 kg; fosfato de potássio monobásico ( P9791) -
02 kg; fosfato de sódio bibásico (S3264) - 2kg; fosfato de
sódio monobásico (S3139) - 2 kg; espermidine (S0266) - 10
g; TES (T4142) - 100g; Trizma hidrocloreto (T7149) - 01 kg;
isopropanol ( I9516) - 05 L; alcool isoamílico (I9392) - 01
L; espermine (SIGMA S1141) - 10 g; Sephadex G25 (SIGMA
S5772) - 100g; lisozima (SIGMA L7651) - 10g; Ribonuclease
A (SIGMA R 6513) - 250 mg; albumina de soro bovino ( SIGMA
B4287) - 100g; sulfato de dextran ( SIGMA D8906) - 100g;
Salmon testes DNA ( SIGMA D7656) 10 x 1 ml; filme kodak
para autoradiografia e quimiluminescência (SIGMA F5513) -
04 pacotes; filme kodak para autoradiografia e
quimiluminêscia (SIGMA F5263) - 04 pacotes; base
nitrogenada para leveduras sem aminoácidos –200g; L-
isoleucina (SIGMA I2752); L-valina (SIGMA V0500); L adenina
(SIGMA A9126); L-arginina-HCl (SIGMA A5131); L-histidina
monohidratada (SIGMA H8125); L-leucine (SIGMA L8000); L-

27. lysine-HCl (SIGMA L5626); L-metionina (SIGMA M9625); L-
fenilalanina(SIGMA P2126); L-treonina (SIGMA T8625); L-
triptofano(SIGMA T0254), L-tirosina(SIGMA T3754); L-
uracil(SIGMA U0750); ácido l-glutâmico(SIGMA G1251); ácido
L-aspártico(SIGMA A9256); L-serina(S4500); e outros
.................................................$ 4.000,00
GIBCO-BRL: Agarose (GIBCO-BRL # 15510-027) - 02 kg; 1 kb
DNA ladder (GIBCO-BRL # 15615-024) - 02 mg; 0.24-9.5 kb RNA
ladder (GIBCO-BRL # 15620-016) - 75 ug; deoxinucleotídeos
(GIBCO-BRL # 10297-018) - 400 umol; T4 ligase (GIBCO-BRL #
15224-041) - 500 unidades; T4 polinucleotídeo kinase
(GIBCO-BRL # 18004-010) - 200 unidades; kits para a
marcação radioativa de DNA (GIBCO-BRL # 18187-013) - 100
reações; Enzimas de restrição diversas (EcoRI, DraI, EcoRV,
XbaI, HindIII, SacI e outras) e outros .........$ 1.775,00
QIAGEN: kit para isolamento de RNA total de tecido vegetal
(QIAGEN # 70904) - 03 kits; kit para isolamento de RNA
mensageiro a partir de RNA total (QIAGEN # 70061); kit para
purificação de DNA plasmidial para sequenciamento (QIAGEN #
12125) - 01 kit; RNAse de pâncreas bovino (QIAGEN # 19101)
- 500 mg .......................................$ 1.400,00
STRATAGENE – HybridZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack cloning
kit (Stratagene # 235612) - 01 kit; membranas Duralon UV,
rolo de 300 x 30 cm (Stratagene # 420101) - 02 rolos;
papel para impressora térmica (Stratagene # 400193) e
outros ......................................... $ 2.000,00
LABTRADE: ponteiras para até 200 ul, 10.000/pacote (LAB
TRADE # 1030-100) - 04 pacotes; ponteiras até 1000 ul,

28. 1.000/pacote )LAB TRADE # 1040-800) - 05 pacotes; ponteiras
até 5,0 ml, 250/pacote (LAB TRADE # 1022-560) - 02 pacotes
e outros ........................................$ 1.180,00
AMERSHAM: radioisótopos para marcação radioativa de DNA e
sequenciamento; Kits para sequenciamento automático de DNA;
membranas para hibridização......................$ 2.000,00
8.1.2 Material de consumo nacional
Luvas de látex cirúrgicas, tamanho médio - 500 pares; Luvas
de látex cirúrgicas, tamanho grande - 500 pares; papel
placas de petri; oligonucleotídeos, papel alumínio,
algodão, canetas, fina adesiva, água sanitária, álcool
comercial, e outros .. ...................R$ 4.000,00
8.2 Despesas de Capital
8.2.1 Serviço de terceiros(pessoa jurídica): despesas
acessórias de importação........................$ 3.089,00

29. 9. Referências Bibliográficas
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34. Dissecação da Cadeia de Transdução de Sinais Mediada pelo
Gene de Resistência Sw-5 Por Meio da Utilização do Sistema
Duplo-Hídrido de Leveduras
Iraildes Pereira Assunção