Aula sobre o reconhecimento e defesa em plantas contra patógenos

1. Processo de reconhecimento
e defesa em plantas contra
microrganismos

2. 2
ROTEIRO
• Introdução
• I - Sistema imune primário de plantas (PTI - PAMP-triggered immunity)
- Adaptação patogênica
• II - Sistema imune secundário de plantas (ETI - effector triggered
immunity)
- Adaptação patogênica
• Principais conhecimentos gerados
• Perspectivas futuras
OBJETIVO
• Evidenciar os principais avanços a respeito do sistema
imune de plantas, através de uma perspectiva evolucionária

3. • Primeiros registros fósseis datam de 480 milhões de anos
• Sésseis – constante exposição a microrganismos
(patogênicos ou não)
• Resistência à maioria dos patógenos
3
Chisholm et al., 2006
• Evolução e sucesso no desenvolvimento das plantas atuais
• Evolução modelada por interações moleculares com
microrganismos simbiontes, epifíticos e patogênicos
Plantas
Habilidade de detectar microrganismos potencialmente
patogênicos
Desencadear respostas de defesa

4. 4
Patógenos possuem diferentes formas de adaptação para as
respostas de defesa da planta
Longos períodos de COEVOLUÇÃO
Pressão seletiva mútua
Tendência ao equilíbrio
Mudanças na freqüência gênica de plantas levam à
mudanças na freqüência gênica de patógenos
Ehrlich
&
Raven,
1964;
Van
Valen,
1973;
Mac
Key,
1986

5. 5
*Teoria gene a gene – Harold Flor (1955)
*Baseada na interação entre genes R na planta e genes Avr no patógeno
*Resistência: produto do gene R possui reconhecimento específico pelo
produto de um gene Avr - morte celular localizada e inibição do
crescimento do patógeno
Flor, 1955; Flor 1971; Bent & Mackey, 2007
Buchanan
et
al.,
2000
• 15-25 anos:
Virulência x Mecanismos de resistência
• Plantas possuem um gene R para cada raça/estirpe de
um patógeno em potencial?
• Por que os patógenos possuem genes de avr?
• Como funciona a interação “chave-fechadura” entre
produtos de genes R e Avr?

6. • Desenvolvimento de um sistema imune inato
(2 linhas de defesa)
I- primário (reconhecimento através de receptores de
reconhecimento padrão - PRRs – reconhecem regiões conservadas de
micróbios - MAMPs)
II- secundário (reconhecimento através de proteínas de
resistência - PR)
6
Plantas
Patógeno
Membrana plasmática
• Acessar o interior da planta
(folha, raiz, ferimentos ou aberturas naturais)
• Vencer barreira imposta pela parede celular

7. Receptores extracelulares (PRRs – receptores de reconhecimento padrão)
reconhecem moléculas amplamente conservadas – sinais
genéricos da presença de microrganismos (patógenos ou não)
7
I - Sistema imune primário (PTI) de plantas
Superfície membrana plasmática
Indução de respostas de defesa primárias (res. basal ou de não-
hospedeira) alterações na PC e acúmulo de proteínas relacionadas a defesa
(quitinases, glucanases e proteases, ROS)
Afetam negativamente a colonização pelo patógeno em
potencial

8. • Sinais genéricos: PAMPs - padrões moleculares associados
à patógenos
• Altamente conservados em ampla gama de microrganismos
*PTI = Imunidade ativada por PAMPs (PAMP triggered immune response)
8
O que é reconhecido?
Arabidopsis – 22 aa (flg22)
são suficientes para ativar
o receptor do hospedeiro
• Bactérias (Lipopolissacarídeos, Flagelina, EF-tu)
• Fungos (Quitina, Ergosterol)
• Oomicetos (β-glucanos)
I - Sistema imune primário (PTI) de plantas

9. • Habilidade de reconhecer sinais genéricos de patógenos -
elicitores (+/- 30 anos)
• Modelo: Arabidopsis (receptor FLS2)
Pseudomonas syringae (flagelina (PAMP)) (+/- 18 anos)
9
Bent & Mackey, 2007
• Sinalização via cascata MAP- quinase
• Reprogramação transcricional - WRKY
• Indução de genes de defesa
Resistência
PTI

10. 10
Se os receptores de reconhecimento PRRs
reconhecem PAMPs e ativam as respostas de
defesa, como os microrganismos patogênicos
infectam a planta?
Patógenos – Supressão da PTI
Efetores (proteínas efetoras do patógeno =
produtos de genes Avr, que superam componentes
regulatórios específicos do sistema basal de defesa)

11. • Patógenos – interferência na sinalização e na manifestação da
resposta de resistência - efetores
11
Bent & Mackey, 2007
• Bactérias - sistema de secreção tipo III (TTSS) -> injeta muitos
efetores ao mesmo tempo para suprimir a defesa por PTI
• Ação coletiva de efetores possibilita o crescimento do
patógeno (Pseudomonas syringae pode secretar 30-40 efetores durante infecção)
Suscetibilidade
PTI

12. 12
• Brown et al., 1995 - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria pode
suprimir deposição de papila nas células do mesófilo de pimenta
Keshavarzi
et
al.,
2004
Mutante hrp Tipo Selvagem
Resistência - papila Suscetibilidade – sem
ativação de defesas locais
• Avr4 de Cladosporium fulvum inibe as quitinases de tomate,
protegendo a parede celular do fungo da hidrólise (van den Burg et al.,
2006)
Controle (-)
0,3μM quitinase Adição prévia de Avr4
Quitina
• Planta percebe quitina como um PAMP
• Avr4 se liga à quitina = atuante na defesa do fungo

13. Patógenos podem suprimir o sistema imune primário (PTI)
pela produção de proteínas efetoras
13
II - Sistema imune secundário de plantas
(ETI) effector triggered immune response
Reconhecimento de efetores ou perturbações mediadas
por estes em proteínas alvo do hospedeiro - Proteínas R
ou RPs
Bloqueio do crescimento do patógeno,
geralmente resultando em RH (resistência específica
de cultivar ou gene-a-gene)

14. • Imunidade ativada por efetores (ETI) - mecanismo mais
especializado de detecção de microrganismos
• A proteína R (TIR-NB-LRR) reconhece a atividade dos efetores
e restaura a resistência
14
Bent & Mackey, 2007
Resistência
ETI

15. 15
• Localizadas dentro ou fora da célula da planta
* 2 classes – todas possuem domínio LRR
Localização e estrutura de proteínas R
Feys & Parker, 2000; Gu et al., 2005; Chisholm et al., 2006; de Wit, 2007
Com âncora trans-membrana
(Extracellular leucine-rich repeat resistance proteins (eLRR))
*Arabidopsis e arroz: 400 RLKs-LRR
envolvidas no desenvolvimento e defesa
Classe mais abundante (Nucleotide
binding leucine-rich repeat (NB-LRR) resistance proteins)
*Arabidopsis: 150 proteínas NBs-LRR
Xanthomonas oryzae pv. oryzae

16. 16
• Estrutura LRR - especificidade da resistência e interação
proteína-proteína.
Bent & Mackey, 2007
Estrutura com 20-30 aa
Resíduos da face côncava não são
conservados – SELEÇÃO
DIVERSIFICADORA –
reconhecer diferentes efetores

17. 17
Diversidade alélica em loci R mantida ao longo da
evolução
• Esta seleção parece atuar também nos produtos dos genes
de avirulência – seleção balanceada
Yahiaoui et al., 2006; Jones e Dangl, 2006
Oscilação na freqüência de diferentes alelos R na população
hospedeira - polimorfismo
Resposta evolucionária à pressão seletiva imposta por
patógenos

18. • Coevolução do gene RPP13 de Arabidopsis e do gene efetor
ATR13 de Peronospora parasitica (míldio)
- Extrema diversidade alélica tanto de RPP13 como de ATR13
Seleção balanceada
(arranjo diverso de alelos é mantido em estabilidade)
18
Allen et al., 2004
• Patógeno e hospedeiro presos em um
CONFLITO EVOLUCIONÁRIO
• Esforços para escapar da resistência são acompanhados por
novas capacidades de reconhecimento

19. 19
NÃO
Múltiplos efetores possuem como alvo as mesmas proteínas do
hospedeiro
Van der Biezen & Jones, 1998
Com as plantas mantém o sistema de vigilância?
As plantas desenvolveram receptores para cada
possível efetor ?
Proteínas R podem monitorar a atividade enzimática de
diversos efetores ao mesmo tempo, através de suas
perturbações
(+/- 5 anos)

20. 20
• INDIRETAMENTE: “Hipótese-guarda” - proteínas R
reconhecem os efetores indiretamente, através do
monitoramento de alvos no hospedeiro
Como as proteínas R reconhecem a presença de
efetores?
Bent & Mackey, 2007
• DIRETAMENTE: proteínas R no citosol - receptores que
interagem diretamente com os efetores intracelulares
(Ex.TIR-NB-LRR x efetor de P. syringae)
• Interação indireta entre as proteínas de avirulência do
patógeno (Avr) e as proteínas de resistência da planta
parece ser mais comum

21. 21
Feng Shao et al., 2003; Chisholm et al., 2006
• Arabidopsis – proteína R (RPS5) monitora a proteína PBS1
(alvo do efetor)
• Pseudomonas syringae – efetor AvrPphB (protease)

22. 22
• Ativação envolve modificações conformacionais
• Presença do efetor altera a estrutura NB-LRR
Ativação de proteínas R
Bent & Mackey, 2007
Sinalização via MAP-quinase
Fosforilação de fatores de transcrição
Ativação de genes de defesa
Resistência
*Domínio LRR - reconhecimento direto ou indireto de
efetores
*Domínio NB - ativado pela troca de ADP(off-state) por ATP
inativa inativa
ativação ativação

23. 23
Patógeno - adaptação para as respostas de defesa
secundárias da planta
O tipo de adaptação vai depender:
• importância do efetor para a virulência do patógeno
• habilidades competitivas fora do hospedeiro
(antagonistas ou ambientes hostis)
• forma como é reconhecido
Sistema imune secundário (ETI) é eficiente na defesa da
planta - reconhecimento de efetores
*Efetores só contribuem para virulência se não forem reconhecidos

24. • perda ou modificação de efetores – não há reconhecimento
24
Bent & Mackey, 2007
Suscetibilidade
ETI

25. 25
• Deleções
*efetores reconhecidos indiretamente
*há substituição por outro efetor com função relacionada
(casos em que há pouca contribuição para a virulência)
Como os efetores impedem o seu reconhecimento pelas
proteínas R?
Bent & Mackey, 2007
• Mutações – diversificação na seqüência de aa
*rompem interação física com a proteína R
*efetores reconhecidos diretamente
*Mudanças serão compatíveis com a atividade de virulência do efetor?
Geralmente em resíduos que não são requeridos para virulência
Para efetores reconhecidos indiretamente e com grande
contribuição na adaptabilidade do patógeno
Rara a evolução de formas capazes de escapar do
reconhecimento e manter a atividade de virulência
PERMANÊNCIA – maior durabilidade da resistência

26. 26
Que fatores contribuem para a superação da resistência?
• Em algumas interações patógeno-hospedeiro a evolução de
genes efetores é extremamente rápida
• O modo e a rapidez da evolução adaptativa vai depender:
- do papel do efetor na virulência
- habilidade do efetor de evitar reconhecimento
(mantendo a virulência)
- do estilo de vida do patógeno que carrega o efetor
(biotrófico ou necrotrófico)
- potencial evolutivo do patógeno (tipo de reprodução,
número de gerações, mecanismos de dispersão)

27. 27
Inserção de genes de resistência em culturas via
melhoramento convencional
Buchanan et al., 2000
Resistência efetiva
Mutação no gene Avr
“Superação” da resistência
Substituição por
outro gene R

28. 28
Jones & Dangl, 2006
PTI = Imunidade ativada por PAMPs (Sistema imune primário)
ETS = Suscetibilidade conferida por efetores
ETI = Imunidade ativada por efetores (Sistema imune secundário)
...
Resistência
Suscetibilidade
Modelo para evolução e expressão do sistema imune de
plantas
S S
R
R
R

29. 29
• 100 anos de melhoramento genético direcionado
à resistência...
Desanimar ?
Mudança de estratégia?
Constante coevolução...

30. 30
• Limitações
*não estão disponíveis para todas as doenças
*funcionam até que a população patogênica evolua
• Genes R – eficiência inquestionável em algumas
interações patógeno-hospedeiro
• Nos últimos anos - grandes progressos no entendimento
das bases moleculares das respostas de defesa
Questões a serem elucidadas
- Como as plantas reconhecem os patógenos e ativam a
defesa?
- Que proteínas de sinalização atuam imediatamente após a
ativação dos genes R?
- Determinar as funções enzimáticas dos efetores e quais
seus alvos no hospedeiro
- Identificar PAMPs de fungos e oomicetos, quais seus
receptores e de que forma são liberados (haustório?)

31. 31
- Um microrganismos pode ser reconhecido por mais de
um receptor. A ativação de múltiplos receptores PAMPs aumenta a
amplitude da resposta PTI?
- Controle transcricional de PTI e ETI é sobreposto? Se
acredita que uma vez induzido, o mecanismo de resistência se
sobreponha para diferentes PAMPs e efetores, via cascata MAP-
quinase
- Quais efetores possuem maior contribuição para
virulência? *Permitirá identificar os melhores genes R a serem
utilizados.
Questões a serem elucidadas

32. 32
• Introdução de novos receptores PAMPs (expansão do
sistema imune basal) - plantas com maior resistência
* defesas ativadas por PAMPs são freqüentemente suprimidas por
efetores.
Combinações inatingíveis em curto espaço de tempo,
além de evitar introdução de alelos indesejáveis
Perspectivas
• Piramidização de genes - melhoramento convencional
- transgenia
*alguns genes R não funcionam em sistemas heterólogos
(sem correspondência), possivelmente porque a proteína que é
monitorada por estes não está presente,
se atingiria uma resistência suficiente?

33. 33
Perspectivas
• Converter patógenos adaptados em “não-patógenos”
*Uma vez que efetores se ligam à alvos no hospedeiro, pode-se
hipotetizar a inserção destes alvos e das proteínas R que os monitoram
em espécies heterólogas
O conhecimento de elicitores, efetores e proteínas R
poderá ser traduzido em formas de controle que
confiram resistência durável?

34. 34
Entender as complexas interações que ocorrem entre as
múltiplas rotas expressas na interação
patógeno-hospedeiro e as bases moleculares que levam
à resistência
Plantas com novas combinações de rotas
Reconhecendo amplo espectro de patógenos
Resistência durável

35. RESUMO

36. 40
PRINCIPAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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