Propriedades antibacterianas de NPs de ZnO

ARTIGO ORIGINAL / RESEARCH
Propriedades antibacterianas de nanopartículas de óxido de zinco sintetizado por
rota hidrotérmica
Anderson Wilbur Lopes Andrade*1
, Emerson Fablo Bezerra Lima2
& Giancarlo da Silva Sousa3
1 - Mestrando em Ciências Farmacêuticas pela Universidade Federal do Piauí; 2 - Bacharel em
Farmácia pela Faculdade Santo Agostinho; 3 - Docente do curso de Farmácia da Faculdade Santo
Agostinho.
*Autor correspondente:
Anderson Wilbur Lopes Andrade – Universidade Federal do Piauí
Campus Universitário Ministro Petrônio Portella, s/n, CEP 64048-901, Teresina-PI; Tel: +558632341219; Fax:
+55862155526; e-mail: andersonwilbur@outlook.com.

RESUMO
Em decorrência do aumento da resistência aos antimicrobianos, as doenças infecciosas são as
principais causas de mortes no mundo. Devido ao crescimento da resistência bacteriana, pesquisadores
tem buscado a maior eficiência de fármacos, através de modificações físico-químicas desses, e a
sintetize e formulação de novos compostos. Dessa forma, o presente estudo avaliou a atividade
antimicrobiana, in vitro, das nanopartículas de oxido de zinco sintetizadas por rota hidrotérmica contra
bactéria gram-negativa (Escherichia coli) e bactéria gram-positiva (Staphylococcus aureus). As
nanoestruturas obtidas foram confirmadas e caracterizadas por meio de técnicas espectroscopias, a
partir das quais se verificou que as nanopartículas de óxido de zinco apresentaram estruturas cristalinas
do tipo wurtzita (hexagonal) e com bom grau de cristalinidade e pureza. As nanopartículas sintetizadas
demonstraram boa atividade antibacteriana, in vitro¸ contras as S. aureus e E. coli, com resultados de
inibição superiores a 75% em ambos os casos. Não foi constatada diferença estatística significativa (p ≥
0,05) entre os grupos testes. Com isto, conclui-se que método hidrotermal é uma técnica eficiente na
síntese das nanoestruturas de oxido de zinco e que estas nanopartículas obtidas apresentaram atividade
antibacteriana contra bactérias gram-positiva e gram-negativa, resultado este promissor para o seu uso
no setor farmacêutico.
Palavras-chaves: Antimicrobiano, Bactéria, Nanotecnologia, Nanopartícula de Óxido de Zinco.
1907
Andrade, A. W. L.; Lima, E. F. B.; Sousa, G. S. Rev. Bras. Farm. 98 (1): 1906 – 1918, 2017

ABSTRACT
As result of increased antimicrobial resistance, infectious diseases are the main causes of deaths in the
world. Because of the growth of bacterial resistance, researchers have sought drugs with greater
efficiency, through physical and chemical changes, and the synthesis and formulation of new
compounds. Therefore, the present study evaluated the in vitro antimicrobial activity of zinc oxide
nanoparticles synthesized by hydrothermal route against gram-negative bacteria (Escherichia coli) and
gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus). Nanostructures obtained were confirmed and
characterized by spectroscopic techniques, from which it was found that zinc oxide nanoparticles
showed crystalline structures of the type wurtzite (hexagonal) and with a good degree of crystallinity
and purity. The nanoparticles showed good antibacterial activity in vitro against S. aureus and E. coli,
with inhibition results superior to 75% in both cases. It was not found significant statistical difference
(p ≥ 0.05) between the control groups. It is concluded that the hydrothermal method is an efficient
technique to synthesis zinc oxide nanostructures and that these nanoparticles obtained showed
antibacterial activity against gram-positive and gram-negative bacteria, promising result for use in the
pharmaceutical industry.
Keywords: Antimicrobial, Bacterium, Nanotechnology, Zinc oxide nanoparticle.
1908

1 INTRODUÇÃO
As doenças infecciosas são as principais causas de mortes prematuras no mundo e um fator
importante na ocorrência destas mortes é o crescimento da resistência bacteriana. Ao longo dos anos,
os microrganismos desenvolveram modificações químicas e bioestruturais favoráveis a sua
sobrevivência, multiplicação em condições extremas e resistência às várias classes de drogas. Devido a
esta resistência, têm se buscado a maior eficiência de fármacos, através de modificações físico-
químicas destes, e a sintetize e formulação de novos compostos (Matai, 2014; Garcia, 2011; WHO,
2008).
Atualmente, a nanotecnologia destaca-se como uma arma extremamente poderosa e versátil no
combate à resistência bacteriana, onde os microrganismos apresentam dificuldade em adquirir
resistência às nanopartículas (NPs), sendo estas por tanto, de grande interesse científico devido às suas
propriedades físico-químicas específicas (tamanho diminuto, maior superfície de contato,
biodisponibilidade aumentada, dentre outras) que as diferem do material a granel (Serrano et al., 2013;
Zhang et al., 2010).
As NPs metálicas, particularmente seus óxidos, atraíram a atenção dos pesquisadores pelas suas
aplicações medicinais, onde a ação dos íons e metais reduzidos permite um efeito pronunciado contra
bactérias patológicas graças ao contato direto das NPs com as células vivas, melhorando assim, suas
propriedades antibacterianas (Serrano, 2013; Garcia, 2011; Zarbin, 2007).
As NPs de óxido de zinco (ZnO) possuem boa estabilidade química, alta atividade catalítica e
propriedades antibacterianas, antifúngicas e antitumorais, o que a torna um produto de grande interesse
as indústrias farmacêutica e alimentícias. É um dos agentes inorgânicos antimicrobianos mais seguros e
extremamente estáveis, no entanto, o seu mecanismo de ação para a inibição de microrganismos ainda
não foi claramente compreendido (Mishra et al., 2011; Amornpitoksuk et al., 2011).
Os modelos de mecanismo por trás da atividade antibacteriana de nanoestruturas do ZnO
incluem o a ação das espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas na superfície das bactérias pela
libertação das partículas de íons de Zn internalizadas na bactéria. Esta ação promove a formação de
radicais hidroxila (OH●-
) na superfície da membrana, conduzindo assim, a danos na membrana e
destruição das bactérias devido à desordem organizacional de sua estrutura celular (Tawale et al.,
2010).
Devido ao aumento da emergência e reemergência de patógenos resistentes a antimicrobianos e
a possibilidade de síntese e modificações (escala reduzida e perfis de liberação modificados) de
1909

fármacos por meio da nanociência, o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade
antimicrobiana de NPs de ZnO sintetizada por rota hidrotérmica em bactéria gram-negativa (E. coli) e
bactéria gram-positiva (S. aureus).
2 MATERIAIS E MÉTODOS
O produto analisado foi as NPs de ZnO, obtidas pelo método hidrotermal, com a finalidade de
verificar sua ação antimicrobiana em bactéria gram-negativa e bactéria gram-positiva. As etapas abaixo
foram realizadas atendendo-se rigorosamente o controle de qualidade. Para síntese das nanoestruturas
de ZnO, utilizaram-se reatores de aço inoxidável.
Para isto, utilizou-se o acetato de zinco, do qual se pesou 1, 3 e 6g em uma balança analítica.
Posteriormente, transferiu-se as amostras pesadas para um béquer de 200mL e adicionou-se 70mL de
água destilada. Em seguida, sob constante agitação, adicionou-se gota a gota 20mL de hidróxido de
sódio (2M). Transferiu-se a solução ao reator, mantendo-o aquecido a 120°C por 24h. Após a reação
estar completa, os produtos resultantes foram lavados com água destilada e etanol, e centrifugados por
7 minutos. O processo de lavagem foi repetido por quatro vezes. Por fim, o material foi secado em
estufa a 60°C (Zhang et al., 2004).
A formação de nanopartículas de ZnO foram confirmadas e caracterizados através da técnica
espectroscopia RAMAN, Infravermelho (IV), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Difração
de Raio X (DRX) no Laboratório de Matérias Avançados da Universidade Federal do Piauí (LIMAV-
UFPI).
O S. aureus (ATCC 25923) foi escolhido como sistema modelo para bactérias gram-positiva e
E. coli (ATCC 25922) para as bactérias gram-negativas. A atividade antibacteriana das NPs de ZnO
sintetizadas, foi avaliada conforme o método de contagem de colônias.
Para tal avaliação foi preparada solução com 2mg/mL do agente (NPs de ZnO) em caldo
Mueller-Hinton, totalizando um volume de solução de 1mL em um tubo Ependoff (em triplicata). A
seguir foram adicionados 5µL de uma suspensão bacteriana (E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC
25923) contendo 108
UFC/mL, resultando em inóculo aproximado de 5×105
UFC/mL. Um controle
negativo foi feito apenas com o meio de cultura inoculado (representaria 0% de inibição bacteriana).
Os tubos foram então fixados sob placa agitadora para se evitar a precipitação dos agentes, e levados à
estufa bacteriológica a 37°C, sob condições aeróbicas por um tempo de 1,5h (Zheng & Zhu, 2003).
1910

Após uma hora e meia (1,5h) de contato entre o agente e o inóculo bacteriano, o conteúdo dos
tubos passou diluições (10-1
, 10-2
, 10-3
e 10-4
) sendo, de cada uma destas, retiradas alíquotas de 100µL
para serem semeadas em ágar Mueller-Hinton. As placas de ágar foram incubadas por 24h nas mesmas
condições supracitadas. Terminado às 24h, procedeu-se a contagem de colônias nas placas e
determinou-se o conteúdo microbiano dos tubos após o contato com o agente quantitativamente, em
UFC/mL.
Em seguida as porcentagens de inibição bacteriana promovidas pelos agentes em relação ao
controle negativo foram calculadas. Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da
média. A análise estatística foi realizada utilizando Teste t de student e ANOVA seguido pelo teste de
Newman-Keuls como teste post hoc. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos
quando p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 6 (San
Diego, CA, EUA).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As nanoestruturas de ZnO foram confirmadas e caracterizadas por IV, DRX, RAMAN e MEV.
O espectro de IV (Figura 1A) mostra bandas de absorção entre 3400 e 2900cm-1
, que se referem a
vibrações O–H e C–H. Os modos próximos a 1400 e 1600 cm-1
são de estiramentos assimétricos e
simétricos de C=O, respectivamente, e, podem estar associados a resíduos do material de partida
(Zn(CH3COO)2.2H2O) ainda presentes no produto final (Maensiria, Laokula & Promarakb, 2006).
1911

Figura 1. Padrões das NPs de ZnO obtidos pela espectroscopia no IV (a), RAMAN (b) e DRX (c).
No entanto, destaca-se a sobreposição de bandas em torno de 500cm-1
, referente à frequência de
estiramento Zn–O que aparece em todas as amostras analisadas por IV e são indicativas de elevada
orientação da estrutura cristalina wurtzita do ZnO (Sangari & Devi, 2013). Achados estes semelhantes
à de estudos anteriores sobre a síntese e caracterização de NPs de ZNO.
Os picos encontrados na espectroscopia RAMAN (Figura 1B), mostram que as NPs de ZnO
obtidas apresentaram estrutura cristalina do tipo wurtzita (hexagonal) com bom grau de cristalinidade.
Não se observou fases cristalinas intermediárias, indicando a alta pureza destes materiais após o
processamento hidrotérmico. Além disto, não foi constatado mudanças notáveis em todos os picos de
difração e nem a presença de outros picos e isto implica que, não ocorreu colapso das estruturas de
cristalinas das nanoestruturas do ZnO e sugere pureza das amostras sintetizadas (Hasanpoor et al.,
2015; Zhang et al., 2014; Ma et al., 2013).
Na figura 1B, a banda E2 (low), próximo a 100 cm-1
, é atribuída às vibrações de Zn na estrutura do
ZnO. As bandas próximas a 330 e 380cm-1
são atribuídas aos modos E2 (high) - E2 (low) o que indica
excelente cristalinidade. A rede estrutural da fase wurtzita do ZnO consiste de uma unidade básica de
quatro átomos por célula unitária (Jothilakshmi et al., 2009). A representação irredutível é:
Γ(Raman) = 1A1 + 2B1 + 1E1 + 2E2 Eq 1
1912

O difratograma padrão de Raios X das NPs de ZnO está exposto na Figura 1C. O padrão
encontrado confirma que a estrutura cristalina das amostras é do tipo hexagonal (wurtzita),
apresentando grupo espacial pertencente ao grupo C64 ou P63mc e classe cristalográfica 6mm, de
acordo com o respectivo cartão cristalográfico ICSD Nº 34477 (ICSD = Inorganic Crystal Structure
Database) (Schulz & Thiemann, 1997). Nas imagens obtidas por DRX, não houve constatação de
mudanças nos picos de difração e nem a presença de outros picos sugerindo que as nanoestruturas do
ZnO produzidas neste estudo apresentaram um ótimo grau de pureza (Jin et al., 2014; Jain et al., 2013).
As nanoestruturas de ZnO obtidas nas investigações de Zhang et al. (2014), Jin et al. (2014),
Akbar & Anal (2014), Ma et al. (2013) e Jain et al. (2013), assim como o composto sintetizado no
presente estudo, demonstraram picos de difração dentro do comprimento médio característicos de ZnO
do tipo hexagonal estruturada (wurtzita), que é de 10,6mm de diâmetro.
Os resultados deste estudo, mostram que os picos de difração estavam de acordo com o
comprimento característico de ZnO tipo wurtzita, não apresentando divergência entre os picos
encontrados nas investigações supracitadas. Este dado implica que não ocorreu colapso da estrutura de
cristalina das nanoestruturas de ZnO obtidas.
A Figura 2 apresenta as imagens obtidas pela microscopia eletrônica/MEV das nanoestruturas
de ZnO. O exame das imagens MEV mostram um extensivo aglomerados de partículas de ZnO, na
escala nanométrica, do tipo hexagonal estruturado. Estes dados assemelham-se aos encontrados por
Reda (2010) e Karunakaran; Rajeswari & Gomathisankar (2011), os quais obtiveram NPs de ZnO por
meio de uma solução gel ácido catalisada formada em uma matriz sílica.
Figura 2. Imagens coletadas pela microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos aglomerados de
nanoestruturas de ZnO.
1913

Em relação ao número de colônias, tanto de E. coli ATCC 25922, quanto de S. aureus ATCC
25923, o seu valor inicial foi de 5x105
UFC/mL. Nas diluições 10-4
a média do número de UFC/mL nos
meio contendo as cepas gram-positivas e gram-negativas foi de 50UFC/mL (Figura 3). Ao final das
24h após aplicação das nanoestruturas de ZnO, verificou-se que nos meios de cultura contendo E. coli
ATCC 25922 e de S. aureus ATCC 25923, a média dos valores dos unidades formadoras de por mL foi
de 9 e 12, respectivamente (Figura 3).
6 0
C/mL
5 0
UF
4
em
-
1
0
4 0
ias
õe
s
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3 0
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C
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2 0
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ero
1 0
****
Núm
0
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
E . c o l i S . a u r e u s
E . c o li ( s e m N P s d e Z n O )
E . c o li ( c o m N P s d e Z n O )
S . a u r e u s ( s e mN P s d e Z n O )
S . a u r e u s ( c o mN P s d e Z n O )
Figura 3. Número de colônias nas culturas de E. coli e S. aureus na presença e ausência de NPs de
ZnO. Valores da média ± erro padrão médio do número de UFC/mL das culturas de E. coli e S.
aureus.****
p < 0,0001 média do grupo E. coli com as NPs de ZnO (2 mg/mL) versus à média do grupo
E. coli sem as NPs de ZnO (2 mg/mL). ****
p < 0,0001 média do grupo S. aureus com as NPs de ZnO
(2 mg/mL) versus à média do grupo do S. aureus sem as NPs de ZnO ( 2mg/mL).
Por meio do ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls constatou-se que os números de
UFC/mL, tanto nas gram-negativas quanto nas gram-positivas, diminuíram significativamente após a
adição de 2mg/mL da NPs de ZnO ( p < 0,0001) (Figura 3). Estes resultados implicam que as NPs de
ZnO obtidos neste estudo, demonstraram ação antibacteriana contras as cepas de bactérias gram-
negativa e gram-positiva.
Esta constatação assemelha-se aos dados encontrados nas investigações feitas por Tayel et al.
(2011) e Franklin et al. (2007), nas quais as NPs de ZnO sintetizada pelos autores apresentam ação
antimicrobiana, in vitro, contra um largo espectro de bactérias, incluindo de S. auerus (gram-positiva) e
E. coli (gram-negativa).
Quanto a porcentagem de inibição bacteriana nas diferentes cepas (gram-positiva e gram-
negativa) verificou-se que as nanoestruturas de ZnO inibiu o crescimento da E. coli na média de
82,67% e do S. aures houve uma inibição média de 76% (Figura 4).
1914

bacteriano%Inibi
çãodocrescimento
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0
5 0
4 0
3 0
2 0
1 0
0
E . c o l i
N P s d e Z n O ( 2 m g / m L )
S . a u r e u s
N P s d e Z n O ( 2 m g / m L )
Figura 4. Porcentagem de inibição das NPs de ZnO sobre a E. coli e S. aureus. Valores da média ± erro
padrão médio da porcentagem de inibição do crescimento bacteriano.
Através da análise estatística teste t de student, constatou-se que a taxa de inibição promovida
pelas nanoestruturas de ZnO na E. coli e S. aureus não apresentaram diferença estatisticamente
significante. Este achado diverge com os encontrados em outras pesquisas, os quais demostraram que
taxa de inibição das células de bactérias gram-positivas é maior do que as células bacterianas gram-
negativas.
Jain e seus colaboradores (2013) pesquisaram a mesma propriedade biológica das NPs de ZnO
inoculadas em quatro estirpes bacterianas, duas gram-positiva (S. aureus e Bacillus subtilis) e duas
gram-negativas (E. coli e Enterobacter aerogenes), cultivadas em caldo nutriente. Os resultados
evidenciaram que as NPs de ZnO inibem o crescimento bacteriano havendo maior zona de inibição
perto da camada de ZnO nas bactérias gram-positivas do que nas bactérias gram-negativa. Os autores
explicam que esta diferença pode ser atribuída à presença da camada de lipopolissacarídeo (LPS) na
membrana celular das bacterianas gram-negativas.
O LPS é mais espesso do que peptoglicano das células de bactérias gram-positivas, com isso, as
bactérias gram-negativas podem se proteger dos danos à membrana celular a partir da ação de
moléculas tóxicas, tornando-se mais resistente as nanopartículas de ZnO (Ma et al., 2013).
Esta propriedade antibacteriana de diferentes compostos é melhorada com a diminuição do tamanho
destes. Isto se deve porque, com o peso e tamanho reduzidos, as partículas do ZnO conseguem difundir-se e
aderir-se à superfície da célula bacteriana mais facilmente, o que levaria a de desnaturação das proteínas da
membrana e alteração da permeabilidade desta, permitindo a permeação de Zn ao interior da célula
bacteriana, o qual combina-se com as moléculas de DNA e RNA intracelulares para bloquear a replicação
do genoma (Ma et al., 2013; Amornpitoksuk et al., 2011; Zhang et al., 2010).
1915

A habilidade do ZnO em induzir a geração de EROs no interior da célula, tais como peróxido de
hidrogénio e os radicais hidroxila, ocasiona à morte desta por meio de apoptose. Os portadores de carga
fotoinduzidos interagem com as moléculas de oxigênio e água, são absorvidos na superfície de NPs de
ZnO, produzindo os EROs. Estas podem desencadear a peroxidação lipídica da membrana e promover
o efeito antibacteriano (Dutta et al., 2013; Rasmsen et al., 2010).
Além disso, a adesão das NPs de ZnO leva ao aumento da permeabilidade e rompimento da
parede celular das bactérias, ocorrendo o extravasamento de conteúdo celular e internalização das
nanoestruturas no interior dos microrganismos, com dissolução de íons de Zn a partir do ZnO, íon este
tóxico as células bacterianas (Dutta et al., 2013).
4 CONCLUSÃO
Materiais nanoestruturados oferecem oportunidades promissoras para propriedades melhoradas,
devido às suas propriedades físico-químicas únicas, causadas por suas dimensões nanométricas,
incluindo vários nanomateriais naturais.
O método hidrotermal, mostrou-se eficiente na síntese das nanoestruturas de ZnO confirmado
pelas análises espectroscópicas e, neste estudo, as NPs de ZnO apresentaram atividade antibacteriana
contra S. aureus (gram-positiva) e E. coli (gram-negativa), resultado este promissor quanto ao seu uso
no setor farmacêutico. Tais dados possibilitam e estimulam investigações mais aprofundadas sobre as
atividades biológicas das nanoestruturas de ZnO, não só contra bactérias, como também a outros
microrganismo patogénicos.
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