Curso Extensão Nanotoxicologia

Curso de Extensão Universitária

Módulo:
Nanotoxicologia
Responsáveis:
Prof. Dr. José María Monserrat
Prof. Dra. Juliane Ventura-Lima
Prof. Dra. Laura Alicia Geracitano
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal do Rio Grande

Aspectos gerais
.
A Constituição Federal de 1988
reconhece no artigo 225 o direito
fundamental ao meio ambiente:
“Todos tem o direito a um meio ambiente
ecológicamente equilibrado, bem de uso comum
do povo e essencial para uma qualidade de vida
saudável, se impondo ao Poder Público e a
coletividade o dever de sua defesa e
preservação para as gerações presentes
e futuras.”
Atualmente, no Brasil, não existe nenhuma legislação específica para assuntos relacionados
com nanotecnologias, mesmo que se apresenta como uma nova tecnologia que está
produzindo uma revolução comparável com a revolução industrial.

Aspectos gerais
Entrevista realizada ao Dr. José María
Monserrat publicada na Revista Info (Editorial
Abril) em Maio de 2010.

Aspectos gerais
Entre os poluentes menos estudados estão os
nanomateriais que compõem diversos produtos
da indústria. Algumas experiências mostram
que compostos como os dióxidos de titânio,
presentes em corantes e protetores solares,
podem causar danos ao comportamento
natatório e à freqüência cardíaca de crustáceos,
além de matar algas.
No Brasil, há estudos sobre o potencial tóxico
das partículas microscópicas. Nosso grupo de
pesquisa comprovou recentemente que o
excesso de fulereno, um composto nanométrico,
é capaz de causar danos cerebrais às carpas de
laboratório. Quando chega ao órgão, ele altera
seu potencial antioxidante, essencial para
preservar os neurônios. O composto é usado
pela indústria automobilística e está em pilhas,
plásticos e óculos.

Aspectos gerais
“Nenhum artigo mostra claramente a presença
do fulereno no ambiente, mas investigações já
são feitas de forma preventiva”, diz Monserrat.
A idéia de nosso grupo é estabelecer limites
referenciais desses compostos, para o momento
em que sua presença na água atingir índices
elevados.
Monserrat suspeita também de que os
nanotubos de carbono tenham efeitos parecidos
aos do fulereno. Esses materiais são uma
tendência promissora para aperfeiçoar produtos
eletrônicos, tais como chips e baterias. O uso
deles deve aumentar exponencialmente nos
próximos anos. O problema de estabelecer
referenciais de segurança para os nanomateriais
está na dificuldade de realizar pesquisas com
eles.

Aspectos gerais
“A principal problemática é determinar a
diferença entre resultados de laboratório e
os reais danos ao meio ambiente”, diz
Monserrat. Como as partículas são muito
pequenas elas podem se juntar. Com isso,
apresentariam em laboratório reações
diferentes das que teriam no ambiente.
Além disso, elas têm diversas configurações
quando estão na natureza e podem reagir
com outros compostos. Estudos
dinamarqueses conseguiram demonstrar
que o contato do fulereno com outros
compostos também produz reações tóxicas.

O grande problema atual é a falta de técnicas analíticas com a
sensibilidade suficiente que permitam detectar nanomateriais no
ambiente. Este problema é uma das necessidades prioritárias no campo
da nanotoxicolgia
Fonte: Simonet e Valcárcel (2008). Anal. Bioanal.
Chem., 393: 17-21.
Aspectos ambientais
Não existem quase dados
que quantifiquem as
concentrações de
nanomateriais no ambiente,
se bem que existem
modelos estatísticos para
predizer riscos ambientais
potenciais
Fonte: Gottschalk et al. (2009). Environ.
Sci. Technol.., 43: 9216-9222.

Aspectos ambientais: exemplos
Utilização de
nanoprata
em meias,
com a
finalidade de
diminuir
odores (efeito
bactericida)
Fonte: Benn e Westerhof f (2008). Environ. Sci. Technol.., 42: 4133-4139.

Aspectos ambientais
Esta figura mostra a liberação de nanopartículas de prata após lavagens sucessivas de meias
(de 24 h cada uma)
Fonte: Benn e Westerhof f (2008). Environ. Sci. Technol.., 42: 4133-4139.

Aspectos ambientais
Uma área carente de informação a Medicina no trabalho:
Nesta área no existe informação, por este motivo, não existe legislação.
Manuseio de nanotubos
de carbono de parede
simples

Aspectos toxicológicos : existe a mesma quantidade de informação em áreas
como a Nanotecnologia e nanotoxicologia?
Nanotecnologia vs nanotoxicologia
DOCUMENTOS nanotechnology nanotoxicology
Artigos 20.376 54
Reviews 3.331 28
Artigos de Conferencias 7.408 14
Artigos Editoriais 637 6
Cartas ao Editor 123 4
Artigos em prensa 92 3
Notas 565 1
Peritajes 650 1
Review em Conferencias 355
Erratum 31
Artigos de negocios (8) 8
Patente 1
Report 1
TOTAL 33.578 111
Documentos publicados e indexados na base SCOPUS utilizando as palavras chave
“nanotechnology” e “nanotoxicology” em 28 de julho de 2008.
Observe a desproporção
de publicações
publicadas.
Nesse momento somente
0,33% das publicações
tinham a palavra chave
“nanotoxicologia”, hoje em
dia (novembro 2012) a
proporção melhorou mas
continua no mesmo
patamar com um 0,52%.

Asimetría em los grupos de organismos estudiados en nanotoxicologia. Búsqueda en SCOPUS
(mayo de 2012) utilizando las palabras clave: “nanoparticles+toxicity+grupo de organismo”
Aspectos toxicológicos : existe a mesma quantidade de informação em áreas
como a Nanotecnologia e nanotoxicologia?

Padrão de relações de palavras chave gerado pelo Programa Citespace .
A base de dados original foi montada a partir das palavras Nanotechnology e Nanoscience, utilizadas em
artigos científicos e revisões publicadas em jornais indexados no Web of Science
(www.isiknowledge.com ) desde o ano 1985 até hoje .
Aspectos toxicológicos
Neste padrão a palavra chave
nanotechnology aparece no ano
1990 com uma freqüência
acumulada de 1877.
A palavra chave In-vivo aparece
no ano 2006 e desde esse ano
tem uma freqüência acumulada de
101.
A palavra chave toxicity aparece
em 2009 com uma freqüência de
53, sendo 35 vezes menos
freqüente que nanotechnology

NANOTOXICOLOGIA
Ciência que estuda os efeitos dos
nanodispositivos e nanoestruturas em
organismos vivos.
Frente a este fato, surge uma nova ciência:
• Na atualidade, existe um crescente número
de evidências de toxicidade das
nanopartículas
Aspectos toxicológicos
Necessidades:
O desenvolvimento da avaliação toxicológica, modelos animais e respostas
biológicas que apresentam sensibilidade e confiabilidade quando são
avaliados materiais utilizados em processos nanotecnologicos.

Aspectos toxicológicos: alguns exemplos
Microcrustáceos (Dafnias) expostas experimentalmente ao fulereno mostram
a incorporação deste nanomaterial e suas persistência no tubo digestivo do
organismo após de 48 h de depuração em água sem fulereno.
Fonte: Baun et al. (2008). Aquat. Toxicol, 86: 379-386.

Fonte: Ma et al. (2009).
Environ. Toxicol. Chem.,
28: 1324-1330.
C. elegans
Avaliação da toxicidade
em termos reprodutivos no
nematode C. elegans
exposto a ao zinco na
forma de sais (ZnCl2) ou
na forma de
nanopartículas de óxido de
zinco (ZnO-NP)

La revisión de Kahru e Dubourguier (2010)
cita valores de toxicidad (LC50) del fulereno
para organismos aquáticos que variam de
100 a 1.000 µg/L

Especie Efecto observado [C60] Condiciones
experimentais
Pez (Carassius auratus)  [GSH] en diferentes órganos 1,00 mg/L In vivo, 32 d de exp.
Crustáceo (Daphnia  actividad de la GST 0,50 mg/L In vivo, 24 h de exp.
pulex)
Crustáceo (Daphnia  capacidade reproductiva 2,50 mg/L In vivo, 21 d de exp.
magna)
Crustáceo (Daphnia  frec. cardíaca 0,25 mg/L In vivo, 1 h de exp.
magna)
Bacteria  crecimiento 0,50 mg/L In vivo
(Bacilus subtilis)
Altamente tóxico: 0,1 – 1 mg/L (100 a 1.000 µg/L)

Especie Efecto observado [C60] Condiciones
experimentales
Pez (Cyprinus carpio)  [GSSG] en cerebro 1,00 mg/L In vitro, 1 h de exp.
Pez (Cyprinus carpio)  [TBARS] en cerebro 1,00 mg/L In vitro, 2 h de exp.
y branquias
Hepatocitos de  acúmulo de arsénico 1,00 mg/L In vitro, 4 h de exp.
Danio rerio
Bactéria  crecimiento 0,10 mg/L In vitro, 3 h de exp.
(género Aeromonas)
Altamente tóxico: 0,1 – 1 mg/L (100 a 1.000 µg/L)
Resultados obtenidos por nuestro grupo de investigación: suspensiones de
fulereno acuosas

Fulereno (C60)
• Kroto et al. (1985)
• 60 carbonos em forma de bola
• apolar - solubilidade em água < 10
-9
mg/L
• facilidade de funcionalização
Formação de suspensões em meio
aquoso:
• Andrievsky et al.
(2002)
aplicação em biomedicina
Nanopartículas que geram estresse oxidativo

Queda da
viabilidade
celular, numa
relação
concentração
dependente
com o óxido
de titânio
Fonte: Park et al.
(2008). Toxicol. Lett.,
180: 222-229.

0 2 4 6 8 10 12
0
1.0×108
2.0×108
3.0×108
Cólonias reativas
Cólonias
não reativas
R
2
= 0.99 (p<0.05)
R
2
= 0.60 (p>0.05)
[C60] (mg/L)
ROS(Area)
Fulereno: bacteriostático ou bactericidade, segundo diferentes
estudos. Parte da sua toxicidade associada a estresse oxidativo
O fulereno induz aumento da concentração de espécies reativas de oxigênio
em algumas colônias do muco da carpa MAIS NÃO EM OUTRAS

A funcionalização pode alterar as propriedades pro-oxidantes de
um composto e transformar o nanomaterial numa molécula com
características antioxidantes
Fulereno Fulerol
Grupos hidroxila
Funcionalização

A funcionalização de uma nanopartícula pode
transformar uma molécula com características
pro-oxidantes numa molécula com

Fatores que influenciam a toxicidade de nanopartículas
A mortalidade de
embriões de
zebrafish foi
aumentada
quando a
exposição ao
fulereno foi em
condições de
iluminação
Fonte: Usenko et al. (2008). Toxicol.. Appl. Pharmacol., 229: 44-55.

A mortalidade de
embriões de
zebrafish em
condições de
iluminação foi
diminuida quando
foi administrado
N-acetil-cisteína
(NAC), um
precursor para a
síntese de
glutationa

As propiedades tóxicas de geração de estresse oxidativo pelo
fulereno estão em parte relacionadas com sua capacidade de foto-
excitação
Carpa
(Cyprinus carpio)
1h 2h 4h
0.0
2.5
5.0
7.5 Controle
C60
Fe3+
a
ababc abcabc abc
abc
c
bc
*
Tempo de exposição
nmolesMDA/mgdetecido

O aumento transitório da concentração de GSSG no cérebro da
carpa indica uma situação pró-oxidante induzida pelo fulereno
1h 2h 4h
0
50
100
150
200 Controle
C60
H2O2
bc
a
abc
ab
abc
abc
abc
abc
a
Tempo de exposição
nmolesGSSG/gdetecido
Fatores que influenciam a toxicidade

Conceito de “Cavalo de Troia: a associação de alguns tóxicos com
nanocompostos, facilitando seu ingresso às células e
compartimentos celulares (Limbach et al., 2007)
Contaminante
qualquer substância que
ocorra em níveis mais
elevados no meio ambiente
sem causar efeitos danosos
aos recursos ambientais
Poluente
qualquer substância que
ocorra em níveis mais
elevados no meio ambiente,
podendo afetar aos recursos
ambientais
Efeitos de Cavalo de Troia

 Nanocompostos facilitam o ingresso de poluentes ambientais? Conceito de
“Cavalo de Troia”
Os resultados indicam que algum compostos podem ter
aumentada sua toxicidade na presencia de nanocompostos
como o fulereno
Fonte: Baun et al. (2008). Aquat. Toxicol, 86: 379-386.

Fonte: Sun et al. (2009). Environ. Pollut., 157: 1165-1170.
 Nanocompostos facilitam o ingresso de poluentes ambientais? Conceito de
“Cavalo de Troia”

Hepatócitos de
zebrafish
BaP + C60
C
D
0.01
0.1
1
C
D
0.01
0.1
1
0
1.0×10 5
2.0×10 5
3.0×10 5
4.0×10 5
5.0×10 5
6.0×10 5
+C60
-C60
[BaP] (mg/L)[BaP] (mg/L)
a
b
a a aa a a
a
b
AcumualaçãodeBaP
(unidadesdefluorescência)
Um aumento da fluorescência intracelular está associada
a uma acumulação de BaP e /ou metabolitos não foi
influenciado pela exposição ao fulereno

C
D
0.01
0.1
1
C
D
0.01
0.1
1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
abc
+C60-C60
[BaP] (mg/L)[BaP](mg/L)
a
a
bc
b b
ac
a a
abc
ReduçãodoMTT
(ABS630nm)
Menor redução de MTT está associado a uma
menor atividade de desidrogenases mitocondriais
Hepatócitos de
zebrafish
BaP + C60

C
D
0.01
0.1
1
C
D
0.01
0.1
1
0
9
18
27
36
45
+C 60
-C 60
[BaP] (mg/L)[BaP] (mg/L)
a
a
ab
b
d
c
ab
ab
abab
AtividadeGST
(nmol/min/mgprot)
O aumento da atividade da GST após exposição com o BaP é
abolido quando é efetuada uma co-exposição com fulereno.
Hepatócitos de
zebrafish
BaP + C60

Hepatócitos de
zebrafish
AsIII + C60
Arsênio
0
30
60
90
120
150
180
CT_1 CT As 2,5_1 CT As 100_1 Ct C60_1 As2,5 + C60_1 As100 +
C60_1
Viabilidade(%)
Controle As 2,5 µM As 100 µM C60 As 2,5 µM As 100 µM
+ C60 + C60
a
a
a
a a
a
A redução do MTT não foi influenciada nem pelo
arsênio nem pelo fulereno (C60)

O aumento da [GSH] na menor concentração de AsIII é anulada
quando o metalóide foi co-administrado com o fulereno (C60)
0
5
10
15
20
25
30
Controle As 2,5 uM As 100 uM C60 As 2,5 uM +
C60
As 100 uM +
C60
a
a
b
a
a
a
Controle As 2,5 µM As 100µM C60 As 2,5 µM As 100µM
+ C60 + C60
nmolGSH/mgdeproteínas
Hepatócitos de
zebrafish
AsIII + C60
Arsênio

Hepatócitos de
zebrafish
AsIII + C60
Arsênio
O aumento da [TBARS] na menor concentração de
AsIII é anulado quando o metalóide foi co-
administrado com o fulereno (C60)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Ctrole H2O AsIII_2_5 AsIII_100 C60 As25 + C60 As100 + C60
P<0,05
Controle As 2,5 µM As 100 µM C60 As 2,5 µM As 100 µM
+ C60 + C60
nmolesTMP/mgdetecido

Hepatocitos de
zebrafish
Fuente: Azevedo Costa et al.
(2012). Comp. Biochem.
Physiol., C155: 206-212.
Maior acumulação de arsênico (As) após 4 h quando co-
exposto com fulereno.
Arsênico adsorvido ao fulereno?
Dinâmica de liberação dol arsênico dentro das células?

Hepatocitos de
zebrafish
Fuente: Azevedo Costa et al.
(2012). Comp. Biochem.
Physiol., C155: 206-212.
O aumento da concentração de GSH na menor
concentração de As foi eliminado quando co-expuesto
com fulereno. As adsorvido ao fulereno?

Efeitos a diferentes níveis de organização
Fonte: Usenko et al. (2008).
Toxicol.. Appl. Pharmacol., 229: 44-
55.
O fulereno
aumentou a
expressão da
subunidade
catalitica da GCL e
de uma forma da
glutationa-S-
transferase em
embriões de
zebrafish
Efeitos a
nível de
expressão
gênica

Efeitos a
nível de
expressão
gênica
Fonte: Chae et al.
(2009). Aquat.
Toxicol., 94: 320-327.
Diferenças
entre a nano
prata e iônica
na expressão
da
metalotioneína
no peixe
Oryzias latipes

Efeitos a
nível de
expressão
gênica
Diferenças na expressão
de diferentes tipos de
genes que codificam para
enzimas antioxidantes no
fígado do zebrafish
Fonte: Choi
et al.
(2010).
Aquat.
Toxicol.,
100: 151-
159.

Efeitos a nível bioquímico
Inibidores da
GCL (BSO e
DEM)
aumentaram a
toxicidade do
fulereno, indican-
do a necessidade
de uma resposta
antioxidante
mediada pela
glutationa (GSH)

Efeitos a nível
bioquímico
O tratamento com nanoprata levou a um aumento do dano oxidativo lipídico ainda que tivesse se
registrado um aumento significativo na concentração do antioxidante glutationa (GSH) no fígado
de zebrafish Fonte: Choi et al. (2010). Aquat. Toxicol., 100: 151-159.

Aumento da freqüência cardíaca no crustáceo Daphnia magna após exposição a fulereno,
mais sem efeito com outros nanocompostos
Controle
Fulereno
Fonte: Lovern et al. (2007).
Environ. Sci. Technol., 41:
4165-4170.
Efeitos a nível fisiológico

Efeitos a nível comportamental
Sem efeito no tempo necessário para fazer a toca no poliqueto Arenicola marina exposta à
nanotubos de carbono de parede simples ou nanopartículas de óxido de titânio
Fonte: Galloway et al.
(2010). Environ.
Pollut., 158: 1748-
1755.

Efeitos a nível populacional
O fulereno induziu uma queda na produção de
crias em Daphnia magna, sugerindo um eventual
efeito a nível populacional
Fonte: Oberdörster et al. (2006). Carbon, 44: 1112-1120.
Daphnia magna

Fonte: Navarro et al. (2008).
Ecotoxicology, 17: 372-386.
NP: nanopartículas
OM: matéria orgânica
SI: íons
Tox A/Tox B: moléculas tóxicas presentes no ambiente

Alterações redox induzidas
por nanomateriais

Foi registrado um aumento
de 362% da fluorescencia
num sistema que continha
C60 (10 mg/L) e DCFH-DA
em relação a um grupo
control que continha
somente DCFH-DA.
Importante: el DCFH –DA
somente deberia fluorecer
após da de-acetilação
Fuente: Lyon et al. (2008). Nano Lett.., 8: 1539-1543.
Alterações redox induzidas por nanomateriais

BSA
Control
BSA +
C60
BSA +
t-BOOH
Fuente: Lyon et al. (2008). Nano Lett.., 8:
1539-1543.
O fulereno apresenta um potencial de óxido-redução
dose-dependente e possue capacidade de reduzir a
concedntração de grupos –SH na albumina de soro
bovino (BSA)
Fuente: Lyon et al. (2008). Environ. Sci. Technol., 42: 8127-8132.
Mesmo assim

5 min 15 min 60 min
Dienos conjugados 6,99±0,16 19,69±1,10 35,73±0,89
LOOH 3,82±0,70 16,30±1,15 18,70±1,10
TBARS 0,44±0,08 4,22±0,08 8,22±0,18
Tempo de iluminação
Fuente: Kamat et al. (2000). Toxicology., 155: 55-61.
Aumento da peroxidação lipídica em microsomas hepáticos de
rata em condicões de iluminacão UV e visibilidade

Agua dulce
ROS
UV/Vis
Animais transparentes quando
internalizam nanomateriais foto-
exitaveis podem aumentar a
concentração endogena de ROS

Sol.Fisiológica
Sol.Fisiológica
UVA
Escuro

Cyprinus carpio
Peroxidación lipídica: efeito pro-oxidante do fulereno (exacerbado con UV). A azida
de sódio reverte o efeito induzido após da exposição ao fulereno
Fuente: Britto et al. (2012). Aquat. Toxicol., 114-115: 80-87

Quais efeitos ou
interaçãoes podem
acontecer entre
ROS normalmente
produzidos dentro
de células com
nanomateriais?
ROS?
Oxígeno singlet?

A funcionalização pode alterar as propiedades pro-oxidantes de um
composto e transformar o nanomaterial numa molécula com
Fulereno Fulerol
Grupos hidroxilo
Funcionalização

Nrf2
Nrf2
ARE
 Expresión de
genes asociados
con respuestas
antioxidantes y de
detoxificación
{P
Um estado pro-oxidante pode promover a migração nuclear do fator transcricional Nrf2, que irá
a interatuar com regiões ARE, aumentando a expressão de genes importantes na defesa
antioxidante (incluindo o proprio Nrf2)

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