1. UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
UNISUL
CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL
VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA
CINARINA
ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES
ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS
JUNHO, 2012

2. INTRODUÇÃO
Originada do Norte da África e do Mediterrâneo, a cinarina é citada
desde o século 4 a.C. como alimento e medicamento. Foi muito apreciada
pelos antigos romanos como um vegetal com efeitos benéficos para a digestão.
(MARTIN BAUER GROUP).
As folhas da alcachofra se caracterizam pela sua composição em ácidos
fenólicos (até 2%), como ácido caféico, ácido clorogênico e cinarina;
flavonoides (0,1 a 1%), e óleos voláteis. (CARVALHO, 2004).

3. JUSTIFICATIVA
O grande objetivo de uma indústria farmacêutica é produzir produtos de
confiança e qualidade já que este tem o objetivo curativo ou preventivo de
doenças em seres humanos.
A Cinarina, princípio-ativo do extrato Alcachofra, é usado no produto
Alcagest, produzido pela empresa Airela Indústria Farmacêutica Ltda., o
mesmo não possui método validado para determinação do teor.
Sendo assim, viu-se a necessidade de desenvolver um método capaz de
determinar o teor de Cinarina, tanto na matéria – prima como no produto final,
um método eficiente e preciso, um método validado para o princípio-ativo
presente na Alcachofra.

4. OBJETIVOS
 OBJETIVO GERAL:
Desenvolver um método eficaz para análise de teor da Cinarina,
avaliando-se a sensibilidade, através de um espectrofotômetro UV-VIS.

5.  OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Realizar um levantamento bibliográfico com base na Resolução nº 899
da ANVISA e determinar quais parâmetros deverão ser avaliados na
validação do método analítico do princípio – ativo Cinarina.
• Desenvolver o Protocolo e o Relatório de Validação do Teor de
Cinarina, contendo todos os procedimentos detalhados a serem seguidos.
• Certificar através da seletividade que o método é capaz de determinar o
princípio ativo em presença de outros componentes.
• Construir uma curva de calibração avaliando a relação
CONCENTRAÇÃO X ABSORVÂNCIA.

6.  OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Demonstrar com a linearidade que os resultados encontrados são
diretamente proporcionais às concentrações da substância ativa no
extrato, dentro de um intervalo especificado.
• Estimar a partir da precisão a concordância entre os resultados obtidos.
• Demonstrar através da exatidão que os resultados encontrados com o
método desenvolvido têm proximidade em relação ao valor verdadeiro.
• Certificar com a robustez a confiabilidade do método em estudo.
• Implantar o método validado para a determinação da cinarina, tanto para
matéria – prima como para o produto final.

7. CINARINA
Conhecida popularmente como Alcachofra, foi trazida para o Brasil
pelos imigrantes europeus.
O extrato de alcachofra é utilizado para tratar problemas como:
• Gastrite;
• Meteorismo;
• Flatulência;
• Doença do trato biliar funcional.

8. CINARINA
Figura 1. Estrutura química da cinarina. (1,5- dicafeoilquínico )
Fonte: http:www.scielo.br

9. ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS
A espectrofotometria é uma das técnicas analíticas mais utilizadas devido
a robustez, custo baixo e grande número de aplicações desenvolvidas.
Figura 2. Esquema espectrofotômetro UV-VIS.
Fonte: http:www.infoescola.com.br

10. METODOLOGIA VALIDADA
Quadro 1. Classificação dos testes, segundo sua finalidade.
Categoria Finalidade do teste
Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em produtos
I
farmacêuticos ou matérias–primas
Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas
II
e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e matérias-primas
III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo)
IV Testes de identificação
Fonte: Resolução nº 899, ANVISA.

11. PLANO DE VALIDAÇÃO
Quadro 2. Plano de validação segundo a classificação do analito.
CATEGORIA II
CATEGORIA CATEGO CATEGORIA
PARÂMETRO QUANTITATI ENSAIO
I RIA III IV
VO LIMITE
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Repetibilid
Sim Sim Não Sim Não
ade
Precisão
Intermediár ** ** Não ** Não
ia
Limite de detecção Não Não Sim * Não
Limite de quantificação Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
Fonte: Resolução nº 899, ANVISA.

12. METODOLOGIA
PREPARO DA SOLUÇÃO PADRÃO:
Pesar 2,5 mg de padrão referência de cinarina em uma balão de 25 mL, adicionar
15 mL de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10
minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.
PREPARO DA SOLUÇÃO AMOSTRA:
Pesar 500,0 mg do extrato de alcachofra em um balão de 25 mL, adicionar 15 mL
de uma solução 1:1 de metanol e água. Agitar a solução em ultrasson por 10
minutos, completar o volume com o mesmo solvente e filtrar a solução por papel filtro.

13. PROCEDIMENTO
Quadro 3. Preparo das amostras.
TUBOS TESTE TUBOS CONTROLE
REAGENTE BRANCO
1 2 3 C1 C2 C3
Solução amostra 0,9 1,0 1,1 0,9 1,0 1,1 -
(mL)
Água purificada 4,1 4,0 3,9 4,35 4,25 4,15 10,0
(mL)
Tampão Acetato 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5
(mL)
NaNO2 40% 0,25 0,25 0,25 - - - 0,5
(mL)*
Deixar em repouso durante 3 minutos.
NaOH 10% (mL)* 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5
Fonte: Acervo próprio.

14. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 SELETIVIDADE
Quadro 4. Preparo das amostras para o ensaio de seletividade.
EXTRATO
AMIDO PADRÃO CONCENTRAÇÃO
AMOSTRAS ALCAHOFRA
(mg) CINARINA (mg) CINARINA (mg/mL)
(mg)
Extrato - 500,30 - 0,0949
Extrato + Amido 50,20 501,07 - 0,0971
Branco - - - -
Padrão Cinarina - - 2,7 0,1132
Fonte: Acervo próprio, 2012.

15. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 SELETIVIDADE
Figura 3. Varreduras das amostras.
Fonte: Acervo próprio, 2012.

16. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 LINEARIDADE
Quadro 5: Concentrações dos padrões de cinarina.
CONC. ABSORBÂNC ABSORBÂNCI ABSTUBON-
CURVA AMOSTRA CONTROLE
(mg/mL) IA A ABSCN
Tubo 1 – 80% 0,0144 0,396 C1 0,067 0,329
Tubo 2 – 90% 0,0162 0,454 C2 0,065 0,389
1ª CURVA Tubo 3 – 100% 0,0179 0,514 C3 0,071 0,443
Tubo 4 – 110% 0,0197 0,569 C4 0,072 0,497
Tubo 5 – 120% 0,0215 0,628 C5 0,077 0,551
Tubo 1 – 80% 0,0144 0,399 C1 0,065 0,334
Tubo 2 – 90% 0,0162 0,463 C2 0,069 0,394
2ª CURVA Tubo 3 – 100% 0,0179 0,516 C3 0,071 0,445
Tubo 4 – 110% 0,0197 0,553 C4 0,076 0,477
Tubo 5 – 120% 0,0215 0,615 C5 0,08 0,535
Fonte: Acervo próprio, 2012.

17. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 LINEARIDADE
Figura 4. Curva de Calibração
Fonte: Acervo próprio, 2012.

18. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 PRECISÃO
• REPETIBILIDADE
Quadro 6. Resultados do ensaio de repetibilidade no período da manhã.
CONC. NA
ABSOR CONTRO ABSTUBON- QUANTIDADE TEOR
AMOSTRA ABSORBÂNCIA AMOSTRA
BÂNCIA LE ABSCN (mg) (%)
(mg/mL)
Tubo 1 0,528 C1 0,119 0,409 0,0971 0,4856 0,486
Tubo 2 0,523 C2 0,121 0,402 0,0957 0,4786 0,479
Tubo 3 0,522 C3 0,121 0,401 0,0955 0,4776 0,478
Tubo 4 0,519 C4 0,121 0,398 0,0949 0,4746 0,475
Tubo 5 0,515 C5 0,120 0,395 0,0943 0,4716 0,472
Tubo 6 0,529 C6 0,120 0,409 0,0971 0,4856 0,489
Fonte: Acervo próprio, 2012.

19. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 PRECISÃO
• REPETIBILIDADE
Quadro 7. Resultados para o ensaio de repetibilidade no período da tarde.
CONC. NA
ABSOR CONTRO ABSTUBON- QUANTIDADE TEOR
AMOSTRA ABSORBÂNCIA AMOSTRA
BÂNCIA LE ABSCN (mg) (%)
(mg/mL)
Tubo 1 0,520 C1 0,127 0,393 0,0939 2,3487 0,470
Tubo 2 0,522 C2 0,123 0,399 0,0951 2,3785 0,476
Tubo 3 0,527 C3 0,123 0,404 0,0961 2,4034 0,481
Tubo 4 0,521 C4 0,122 0,399 0,0951 2,3785 0,476
Tubo 5 0,517 C5 0,122 0,395 0,0943 2,3586 0,472
Tubo 6 0,523 C6 0,121 0,402 0,0957 2,3934 0,479
Fonte: Acervo próprio, 2012.

20. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 PRECISÃO
Quadro 8. Comparação dos resultados no período da manhã e tarde para o
ensaio de repetibilidade.
PERÍODO AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR
Tubo 1 0,486
Tubo 2 0,479
Tubo 3 0,478
MANHÃ
Tubo 4 0,475
Tubo 5 0,472
Tubo 6 0,489
0,477 1,023
Tubo 1 0,470
Tubo 2 0,476
Tubo 3 0,481
TARDE
Tubo 4 0,476
Tubo 5 0,472
Tubo 6 0,479
Fonte: Acervo próprio, 2012.

21. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 PRECISÃO
• INTERMEDIÁRIA
Quadro 9. Resultados para o ensaio de precisão intermediária.
ANALISTA AMOSTRA TEOR (%) MÉDIA DPR
Tubo 1 0,486
Tubo 2 0,479
Tubo 3 0,478
ANALISTA 1
Tubo 4 0,475
Tubo 5 0,472
Tubo 6 0,486
0,483 2,069
Tubo 1 0,461
Tubo 2 0,491
Tubo 3 0,496
ANALISTA 2
Tubo 4 0,492
Tubo 5 0,494
Tubo 6 0,490
Fonte: Acervo próprio, 2012.

22. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 EXATIDÃO
Quadro 10. Concentração das soluções para o ensaio de exatidão.
CONCENTRAÇÃO
PADRÃO CINARINA
CINARINA (mg/mL)
AMOSTRA
CONC.
PESADO PUREZA PESO
SOL. MÃE 80% 100% 120%
(mg) (%) CORRIGIDO
(mg/mL)
Sol. Mãe Padrão
2,75 99,49 2,74 0,10944 0,01523 0,01903 0,02284
de Cinarina
Fonte: Acervo próprio, 2012.

23. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 EXATIDÃO
Quadro 11. Resultados obtidos no ensaio de exatidão.
MÉDIA
ABSORBÂN CONTRO ABSTUBON- CONC. MÉDIA
AMOSTRA ABSORBÂNCIA CORRIGIDA
CIA LE ABSCN (mg/mL) (mg/mL)
(mg/mL)
Placebo- 1 0,006 C1 0,003 0,003 0,0028
Placebo - 2 0,006 C2 0,003 0,003 0,0028 0,0028 0,0001
Placebo - 3 0,006 C3 0,003 0,003 0,0028
80% - 1 0,41 C1 0,067 0,343 0,0146
80% - 2 0,42 C2 0,067 0,353 0,0150 0,0149 0,0148
80% - 3 0,426 C3 0,067 0,359 0,0152
100% - 1 0,506 C1 0,074 0,432 0,0177
100% - 2 0,52 C2 0,074 0,446 0,0182 0,0180 0,0179
100% - 3 0,518 C3 0,074 0,444 0,0181
120% - 1 0,63 C1 0,067 0,563 0,0222
120% - 2 0,622 C2 0,067 0,555 0,0219 0,0220 0,0219
120% - 3 0,622 C3 0,067 0,555 0,0219
Fonte: Acervo próprio, 2012.

24. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 EXATIDÃO
Quadro 12. : Recuperações obtidas no ensaio de exatidão para os 3 níveis
avaliados.
CONC. TEÓRICA CONC. PRÁTICA RECUPERAÇÃO RECUPERAÇÃO
AMOSTRA
(mg/mL) (mg/mL) (%) MÉDIA (%)
80% - 1 0,01523 0,01450 95,26
80% - 2 0,01523 0,01485 97,53 97,23
80% - 3 0,01523 0,01506 98,89
100% - 1 0,01903 0,01758 92,65
94,23
100% - 2 0,01903 0,01801 95,20
100% - 3 0,01903 0,01800 94,84
120% - 1 0,02284 0,02212 100,50
99,66
120% - 2 0,02284 0,02184 99,24
120% - 3 0,02284 0,02184 99,24
Fonte: Acervo próprio, 2012.

25. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 ROBUSTEZ
Quadro 13. Resultados obtidos no ensaio de robustez.
MÉDIA ABS. MÉDIA ABS.
PARÂMETRO MODIFICADO TEOR (%) DPR
TESTE CONTROLE
8 0,518 0,124 0,52 0,00
Tempo de extração
10 0,512 0,119 0,52 -
(min)
12 0,505 0,110 0,52 0,00
Tempo de reação do 2 0,505 0,115 0,52 1,30
nitrito de sódio 3 0,523 0,120 0,53 -
(min) 4 0,532 0,121 0,54 1,30
Imediatamente 0,523 0,120 0,53 -
Tempo de leitura no
5 0,56 0,121 0,57 5,10
uv-vis (min)
10 0,55 0,109 0,58 6,40
Marca do nitrito de Fmaia 0,523 0,120 0,53 -
sódio Synth 0,524 0,126 0,52 1,30
Marca do hidróxido Vetec 0,523 0,120 0,53 -
de sódio Synth 0,530 0,125 0,53 00
Temperatura das 23 0,512 0,119 0,52 -
soluções (ºc) 15 0,520 0,120 0,53 1,30
Fonte: Acervo próprio, 2012.

26. RESULTADOS E DISCUSSÕES
 ADEQUABILIDADE DO SISTEMA
Quadro 14. Resultados conforme o dia de análise.
CONC. NA
REAGEN CONTRO TEOR
AMOSTRA ABSORBÂNCIA ABSORBÂNCIA AMOSTRA DPR
TES LE (%)
(mg/mL)
Soluções Tubo 1 0,489 C1 0,116 0,0900
preparadas Tubo 2 0,517 C2 0,122 0,0943 0,477
no dia Tubo 3 0,56 C3 0,127 0,1019
Tubo 1 0,485 C1 0,112 0,0900 0,562
Soluções Tubo 2 0,511 C2 0,118 0,0939
após 24 h 0,471
do preparo Tubo 3 0,543 C3 0,124 0,0991
Fonte: Acervo próprio, 2012.

27. CONCLUSÃO
Segundo a RE nº 899 da ANVISA uma validação analítica tem como
objetivo demonstrar que o método é apropriado para a finalidade pretendida,
ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de
fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos
Com os resultados aqui demonstrados é possível afirmar que o método
desenvolvido utilizando espectrofotômetro UV-VIS, é confiável na
determinação do teor. O método desenvolvido e validado mostrou resultados
positivos na seletividade, linearidade, precisão exatidão e robustez, que são
critérios para que um método possa ser validado.

28. AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por toda força e determinação para realizar este
trabalho.
Aos meus pais, pelo apoio e confiança à mim depositada durante todos
estes anos.
À orientadora de estágio, Professora Maria Ana Pignatel, pela dedicação
durante a realização deste trabalho.
À supervisora de campo, Letícia Rechia, pela dedicação e ajuda durante o
período de estágio.
À empresa Airela Indústria Farmacêutica por me proporcionar a realização
desta pesquisa e por fim, a elaboração deste método .
À todos meus colegas, de trabalho e do próprio curso, que me apoiaram e
me ajudaram nesta etapa.

29. REFERÊNCIAS
• ANVISA. Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos.
Resolução No 899 de 29 de maio de 2003.
• CALIXTO; J.B. Medicamentos Fitoterápicos. In: YUNES, R. A. &
CALIXTO, J. B. (Orgs.). Plantas medicinais sob a ótica da química
medicinal moderna.
Chapecó: Argos, 2001. p.297-315
• CARVALHO, J.C.T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E.P. Compostos
fenólicos simples e heterosídicos. In: Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 5 ed. rev. ampl., primeira reimpressão. Porto
Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2004. p. 371-
400.
• MIGUEL, M.D.; MIGUEL, O.G. Desenvolvimento de fitoterápicos.
Ribeirão Preto: Tecmedd, 2004. 115p.
• NOLDIN, F.V.; CECHINEL, V. et al. Composição química e atividades
biológicas das folhas de Cynara scolymus L. (alcachofra) cultivada no
Brasil. Química Nova: vol.26 no.3 São Paulo May/June 2003. Disponível
em:http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-
40422003000300008&script=sci_arttext. Acesso em: 11 jun, 2012.

30. REFERÊNCIAS
• PINTO, A.C.; SILVA, D.H.S.; BOLZANI, V.S. et al. Produtos naturais:
atualidade, desafios e perspectivas. Quím. Nova, São Paulo, v. 25, supl. 1,
p.45-61, 2002.
• VEIGA JUNIOR, V.F.; PINTO, A.C.; MACIEL, M.A.M. Plantas
medicinais: cura
segura ? Quím. Nova, São Paulo, v. 28, n. 3, p.519-528, 2005.
• SIANI, A.C. (Coord.). Desenvolvimento tecnológico de fitoterápicos:
plataforma metodológica. Rio de Janeiro: Scriptorio, 2003. 97p.
• RIBEIRO, C.A.F. Justifica-se o uso de extractos de plantas medicinais na
terapêutica da ansiedade e da depressão? Revista Saúde Mental, v. II, n.4,
p. 9- 14, 2000.
• MARTIN BAUER GROUP: Encarte de apresentação
• MARTINEZ, Marina. Materiais de Laboratório. Espectrofotômetro.
Publicado em: 21/07/2010. Disponível
em:http://www.infoescola.com/materiais-delaboratorio/espectrofotometr
Acesso em: 11 jun, 2012.

31. UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
UNISUL
CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL
VALIDAÇÃO ANALÍTICA DA
CINARINA
ACADÊMICA: SILVIA DOS SANTOS NEVES
ORIENTADORA.:Dra MARIA ANA PIGNATEL MARCON MARTINS
JUNHO, 2012