1) O documento descreve o desenvolvimento e validação de metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos. 2) Foram analisados 10 medicamentos obtidos no comércio e desenvolvidos métodos de extração e cromatografia para identificar furanocumarinas. 3) Os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com parâmetros internacionais e forneceram resultados precisos e recuperações adequadas para as amostras analisadas.

1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso Campo Grande - MS UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA - MESTRADO

2. INTRODUÇÃO MEDICAMENTO FITOTERÁPICO Medicamento farmacêutico obtido por processos tecnologicamente adequados, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico 73 .

6. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO Especificidade Limite de Quantificação Limite de Detecção Linearidade e Faixa de aplicação Sensibilidade Exatidão Precisão Estabilidade Robustez INTRODUÇÃO Diferenciar compostos na presença de outros. Menor quantidade determinada com precisão/ exatidão. Menor quantidade detectada. Produzir resultados lineares numa dada faixa de variação. Distinguir quantidades próximas. Concordância entre os valores encontrados e o verdadeiro. Inalteração dos resultados apesar de pequenas modificações do método. Constância do analito nas amostras. Proximidade entre os resultados.

8. FURANOCUMARINAS OU PSORALENOS Famílias Apiaceae, Rutaceae e Moraceae . INTRODUÇÃO * 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona *

14. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 2 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 1 lote 3 lotes 2 lotes 3 lotes Campo Grande Seiva de Brosimum gaudichaudii e vitaminas J Coxim Produto natural I Campo Grande Produto natural H Comprimidos Rio de Janeiro Pó de Dorstenia brasiliensis G Campo Grande Extratos secos de Dorstenia multiformis , Plumeria lancifolia, Cereus jamacaru e Erythrina mulungu F Campo Grande Extratos secos de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia E Cápsulas Campo Grande Tintura de Dorstenia multiformis D Campo Grande Tinturas de Dorstenia multiformis , Cereus jamacaru, Plumeria lancifolia e Erythrina mulungu C São Paulo, Goiânia, Rio de Janeiro e Brasília Tinturas de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia B São Paulo, Brasília, Goiânia e Rio de Janeiro Tinturas de Dorstenia multiformis , Davilla rugosa e Plumeria lancifolia A Soluções orais

18. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA Modelo: Shimadzu LC-6AD Detector: UV-Vis de comprimento de onda fixo (Shimadzu) Coluna: fase reversa octadecyl Shim-pack (25cm x 4,6mm x 5 µm) e pré-coluna (2,5cm x 4,6 mm) de mesma fase CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS Eluente: água – acetonitrila Proporção 45: 55 (v/v) Fluxo: 1mL/min Comprimento de onda: 223 nm Injeção: 10 µL EQUIPAMENTO PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

19. Recuperação do método para soluções orais A, B e C (n=5 para cada amostra). RECUPERAÇÃO C adic, concentração adicionada. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 97,81 ± 1,15 96,86 ± 1,05 98,26 ± 0,93 98,37 ± 0,78 95,95 ± 0,87 96,83 ± 0,97 200 98,11 ± 1,03 98,43 ± 0,79 94,43 ± 0,53 98,98 ± 1,01 99,05 ± 0,74 93,76 ± 0,81 100 97,29 ± 0,67 99,97 ± 0,89 99,89 ± 0,87 97,19 ± 0,99 96,55 ± 1,14 92,35 ± 0,35 40 96,43 ± 1,11 98,34 ± 1,17 98,76 ± 0,74 96,13 ± 1,16 97,28 ± 0,91 95,99 ± 1,17 4 C B A C B A Bergapteno (%) (média ± DP) Psoraleno (%) (média ± DP) C adic ( µg ml -1 )

20. SOLUÇÃO ORAL A 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

21. SOLUÇÃO ORAL B 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

22. SOLUÇÃO ORAL C 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

26. MEDICAMENTO J – não se enquadrou no método. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES sustâncias mais polares Psoraleno Bergapteno

27. MEDICAMENTO F PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Psoraleno Bergapteno DT

30. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS CG-EM -> para método dos medicamentos E, F, G, H e I Modelo: Shimadzu 17 Coluna: LM-A (15m x 0,2mm x 0,2 µm) Injetor Split/Splitless : razão de Split 1:20 Temperatura da interface: 280ºC Detector seletivo de massa, modelo: Shimadzu QP 5000 Modo de ionização: impacto de elétrons ; Modo de aquisição: 55-550 u.m.a Gás de arraste: Hélio com fluxo de 0,6 mL/min PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 20 - 280 - 5 240 - 10 150 Tempo de isoterma (min) Velocidade de aquecimento (ºC/min) Temperatura (ºC) O tempo de análise total no CG foi de 37 minutos. Programação de temperatura utilizada em CG-EM E CG-DIC(no forno da coluna)

31. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS Estudo inter-equipamento 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno 3 - DT PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES CG-DIC, solução oral B CG-EM, medicamento F

36. ACURÁCIA E PRECISÃO -> Soluções orais A, B e C C., concentração. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adicionada ( µg mL –1 ) 1,50 1,5 203,0 ± 3,05 1,18 1,0 202,0 ± 2,39 200 2,69 5,0 42,0 ± 1,13 2,02 2,5 41,0 ± 0,83 40 4,73 5,0 3,8 ± 0,18 4,35 -2,5 3,9 ± 0,17 4 BERGAPTENO PSORALENO Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=4 para cada amostra) 3,85 2,5 3,9 ± 0,15 4,10 2,5 3,9 ± 0,16 4 4,26 5,0 42,0 ±1,79 4,93 5,0 42,0 ± 2,07 40 1,93 1,5 203,0 ± 3,91 1,58 2,0 204,0 ± 3,23 200 CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adicionada ( µg mL –1 ) BERGAPTENO PSORALENO Acurácia e precisão intrerdia em CLAE (n=5 para cada amostra)

37. ACURÁCIA E PRECISÃO -> Medicamentos E, F, G, H e I C., concentração; adic., adicionada; deter., determinada, Ac., acurácia PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES DT BERGAPTENO PSORALENO CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adic. ( µg mL –1 ) 2,51 0,14 39,43 ± 0,99 2,15 1,23 39,51 ± 0,85 2,31 1,70 39,32 ± 0,91 40 2,84 0,40 20,08 ±0,57 2,35 0,10 20,02 ± 0,47 2,72 2,45 19,51 ± 0,53 20 3,96 3,00 1,03 ± 0,05 3,96 1,00 1,01 ± 0,04 4,85 3,00 1,03 ± 0,05 1 Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=5 para cada amostra) DT BERGAPTENO PSORALENO CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adic. ( µg mL –1 ) 2,20 1,25 39,50 ± 0,87 1,99 0,93 39,63 ± 0,79 2,08 1,25 39,50 ± 0,82 40 4,20 0,50 20,10 ± 0,42 2,54 0,30 20,06 ± 0,51 3,01 1,10 19,78 ± 0,59 20 3,96 3,00 1,03 ± 0,05 4,90 2,00 1,02 ± 0,05 4,76 5,00 1,05 ± 0,05 1 Acurácia e precisão interdia em CLAE (n=5 para cada amostra)

43. OUTROS ESTUDOS REALIZADOS PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

44. NOVAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS Proposta para determinação das demais substâncias presentes nos medicamentos. CONDIÇÕES ISOCRÁTICAS e em GRADIENTE para CLAE Amostra inteira Solução oral A Amostra inteira Solução oral C Amostra inteira Solução oral B

45. CONDIÇÃO EM GRADIENTE CONDIÇÃO EM GRADIENTE

46. A B C

47. ESTUDOS PRELIMINARES COM PLANTAS Extração com etanol absoluto e reextrações com clorofórmio . Brosimum gaudichaudii 1 mamica de cadela Dorstenia brasiliensis carapiá 2 carapiá 1 Amostra raiz raiz rizoma rizoma rizoma Parte 1,07 0,36 0,48 <0,01 0,17 0,69 0,10 0,40 0,11 0,62 Bergapteno(%) Psoraleno (%) 1,02 0,04 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 3 0,16 1,10 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 2 3,49 2,09 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 1

48. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA D, D.brasiliensis ; B2, B. gaudichaudii 2 ; B3, B.gaudichaudii 3 ; H, amostra hidrolisada. B 3 B 2 D

51. Dedico a presente dissertação aos meus pais Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires. Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos. As minhas irmãs Claudia e Fernanda. A toda a minha família e amigos sempre presentes. A Deus. DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA Dedico a presente dissertação aos meus pais Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires. Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos. As minhas irmãs Claudia e Fernanda. A toda a minha família e amigos sempre presentes.

53. YUNES, R, A.; PEDROSA, R. C; FILHO, V. C. Fármacos e fitoterápicos: a necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Química Nova, v.24, n.1, p.147-152, 2001. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J.; SNADER, K. M. Natural products in drug discovery and development. Journal of Natural Products, v.60, p.52-60, 1997. HOSTETTMAN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: UFSCar, 2003. VILEGAS, J. H. Y. Tese de Livre Docência – USP, São Carlos. 2001. BACCHI, E. M. Controle de qualidade de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.). Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996. Cap. 12. OKIGANI, H. Fitoterápicos: Uma viagem em extratos testados clinicamente. Science News, v.1, n.1,2000. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Furanocoumarins from Brasilian Dorstenia ssp . Rev. Latinoam.Quim., v.23, p.78-80, 1994. MURRAY, R. D. H. Coumarins. Nat. Prod. Rep., v.6, p.477-505, 1995. CHIMICHI, S. et al. A convenient synthesis of psoralens. Tetrahedron, v.58, p.4859-4863, 2002. CHAUDARY, S. K. et al. Increased furocoumarin content of celery during storage. J. Agric. Food Chem., v.33, p.1153-1157, 1985. ABDEL-KADER, M. S. New ester and furocoumarins from the roots of Pituranthos tortuosus . J. Braz. Chem. Soc., v.14, n.1, p.1-7, 2003. DIAWARA, M. M.; TRUMBLE, J. T. Linear furanocoumarins. In: D’MELLO, J. P. F. (Ed.). Handbook of plant and fungal toxicants. New York: CRC Press, 1997. p.175-189. LEVEQUE, N. et al. Validation fo a microdialysis-gas chromatographic-mass spectrometric method to asses 8-methoxypsoralen in psoriatic patient dermis. J. Chromatogr, B. n. 780, p.119-127, 2002. FAPERJ 2000. Quando os linfócitos passam para o time adversário. Rio de Janeiro, ano III, n. 18, p.6-7, jun.jul 2001. Disponível em: http://www.faperj.br/interna.phtml?obj_id=301 . Acesso em: 11 dez. 2003. ZARABSKA, Z. et al. PUVA (psoralen+UVA) photochemotherapy: proceses triggered in the cells. II Farmaco, v.55, p.515-520, 2000. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

54. TEREGUN, M., OZTURK, S., SELMAN-PAKOGLU, N. An unusual cause of burn injury: unsupervised use of drugs that contain psoralens. J. Burn. Care Rehabil., v.20, p.2-5, 1999. ROELANDTS, R. Photo(chemo)therapy for vitiligo. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., v.19, p.1-4, 2003. SCOTT, B.R.; PATHAK, M. A.; MOHN, G. R. Molecular and genetic basis of furocoumarin reactions. Mutat. Res., v.39, p.29-74, 1976. DIAWARA, M. M. et al. Toxicity of linear furanocoumarins to spodopteraexigua-evidence for antagonistic interactions. J. Chem. Ecol., v.19, p.2473-2484, 1993. TRUMBLE, J. T. et al. Seasonal patterns and pesticidal effects on the phototoxic linear furanocoumarins in celery, Apium graveolens L. J. Agric. Food Chem., v.40, p.1501-1506, 1992. OJALA, T. et al. A bioassay using Artemia salina for detecting phototoxicity of plant coumarins. Planta Med., v.65, p.715-718, 1999. CARDOSO, C. A. L. et al. Simultaneous determination of furanocoumarins in infusions and decoctions from “carapiá” ( Dorstenia species) by high-performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem., v.50, p.1465-1469, 2002. NATTA, R. et al. Narrowband ultraviolet B radiation therapy for recalcitrant vitiligo in Asians. J. Am. Acad. Dermatol., v.49, n.3, p.473-476. NIJSTEN T. E. C.; STERN, R. S. The increased risk of skin cancer is persistent after discontinuation of Psoralen plus Ultraviolet A: A cohort study. J. Invest. Dermatol., v.121, n2, p.252-258, 2003. AL-QATTAN, M. M. Pediatric burns induced by psoralens in Saudi Arabia. Burns, v.26, p.653-655, 2000. NETTELBLAD, H. et al. Psoralens used for cosmetic sun tanning: an unusual cause of extensive burn injury. Burns, v.22, n.8, p.633-635, 1996. WANG, L. TSO, M. Determination of 5-methoxypsoralen in human serum. J. Pharm. Biomed. Anal., v.30, p.539-600, 2002. KADDU, S.; KERL, H.; WOLF, P. Accidental bullous phototoxic reactions to bergamot aromatherapy oil. Journal of the American Academy of Dermatology, v.45, n.3, p.458-461, 2001. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Rapid determination of furanocoumarins in creams and pomades using SPE and CG. J. Pharm. Biomed. Anal., v. 22, p.203-214, 2000. CARDOSO, C. A. L.; HONDA, N. K.; BARISON, A. Simple and rapid determination of psoralens in topic solutions using liquid chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal., v27, p.217-224, 2002. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determination of furocoumarins in samples of “carapiá” by capillary gas chromatography. Chromatographia. v.50, n.1/2, p.11-14, 1999. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determinations of furanocoumarins and identification of other chemicals constituints of rhizomes and leaves from Dorstenia tubicina and commercial samples. South. Bras. J. Chem., v.7, p.51-60, 1999.

55. CARAUTA, J. P. P. Moráceas do estado do Rio de Janeiro. Albertoa, v.4, n.13, p.196, 1996. FRANKE, K. et al. Furanocoumarins from Dorstenia gigas . Phytochemistry, v.56, p.611-621, 2001. ABEGAZ, B. M. et al. Chalcones and other constituents of Dorstenia prorepens and Dorstenia zenkeri . Phytochemistry, v.59, p.877-883, 2002. CARAUTA, J.P.P. Dorstenia L. (Moraceae) do Brasil e países limítrofes. Dissertação (Mestrado em Botânica) – UFRJ, Rio de Janeiro. 1976. VILEGAS, J. H. Y. et al. Further triterpenes, steroids and furocoumarins from Brazilian medicinal plants of Dorstenia genus (Moraceae). J. Braz. Chem. Soc., v.8, p.529-535, 1997. ABEGAZ, B. M. et al. Chemistry of the genus Dorstenia . Curr. Org. Chem., v.4, p.1079-1090, 2000. TERREAUX, C. et al. Structure revision of a furanocoumarin from Dorstenia contrajerva . Phytochemistry, v.39, n.3, p.645-647, 1995. MIRANDA, T.R. et al. Isolation, total synthesis, and relative stereochemistry of a dihydrofurocoumarin from Dorstenia contrajerva . J. Nat. Prod., v.61, p.1216-1220, 1998. KUSTER, R. M. et al. Furocoumarins from the rhizomes of Dorstenia brasiliensis . Phytochemistry, v.36, n.1, p.221-223, 1994. POZETTI, G. L. Estudo químico de Dorstenia bryoniifolia MART EX MIQ. (MORACEAE). Ecl. Quím., v.13, p.41-51, 1988. ROJAS-LIMA, S. et al. Furocoumarins of three species of the genus Dorstenia . Phytochemistry. v.50, p.863-868, 1999. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Cromatografia de permeação em gel das furanocumarinas de Dorstenia heringeri CAR & VAL. Rev. Ciênc. Farm., v.14, p.133-138, 1992. NAGDJUI, B. T. et al. Prenylated flavones and phenylpropanoid derivates from rotos Dorstenia psilurus . Phytochemistry, v.48, n.4, p.733-737, 1998. WOLDU, Y. et al. Styrenes from Dorstenia barnimiana . Phytochemistry, v.27, n.4, p.1227-1228, 1988. TSOPMO, A. et al. Geranylated flavonoids from Dorstenia poinsettifolia . Phytochemistry, v.48, n.2, p.345-348, 1998. CASAGRANDE, C. RONCHIETTI, F. RUSSO, G. The structure of syriogenin. Tetrahedron, v.30, p.3587-3559, 1974. NGADJUI, B.T. et al. Geranylated and prenylated flavonoids from the twigs of Dorstenia manni . Phytochemistry, v.48, n.2, p.349-354, 1998. NAGDJUI, B. T. et al. Dorsilurins C, D and E, three prenylated flavonoids from the roots of Dorstenia psilurus . Phytochemistry, v.52, p.731-735, 1999. SILVA, R. A .D. Pharmacopéia dos Estados Unidos do Brasil. São Paulo: Nacional, 1929. CORRÊA, M. P. Dicionário de Plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura, 1931. 6v. v.2.

56. CONCEIÇÃO, M. As plantas medicinais do ano 2000. Brasília: Tao. Brasília,1980. p.41-88. SEPLANTEC. Inventário de plantas medicinais do estado da Bahia. Salvador: Subsecretaria de ciência e tecnologia, 1979. ALZUGARAY, D.; ALZUGARAY, C. Plantas que curam. São Paulo: Companhia Lithográphica Ypiranga, 1983. UCHIYAMA. T. et al. seco -Adianane-type triterpenoides from Dorstenia brasiliensis (Moraceae). Phytochemistry, v.60, p.761-764, 2002. ALMEIDA, E. R.; Plantas medicinais brasileiras: conhecimentos populares e científicos. São Paulo: Hemus, 1993. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1992. VILEGAS, J. H. Y. et al. Off-line supercritical fluid extraction-high resolution gas chromatography applied to the study of Moraceae species. Phytochemistry, v.4, n.5, p.230-234, 1993. MARTINS, M. V. Brosimum gaudichaudii Tréc. a brasilian medicinal plant. Newsletter-G-15 Gene Bank for medicinal plants, v.7-8, p.9, 1995. MONTEIRO, V. F. F. et al. Prenylated coumarins, chalcone and new cinnamic acid and dihydrocinnamic acid derivates from Brosimum gaudichaudii . J. Braz. Chem. Soc., v.13, n.2, p.281-287, 2002. VIEIRA, I. J. C. et al. A new coumarin from Brosimum gaudichaudii Trecul. Nat. Prod. Lett., v.13,n.1, p.47-52, 1999. VARANDA, E. A. et al. Genotoxicity of Brosimum gaudichaudii measured by the Salmonella / microsome assay and chromosomal aberrations in CHO cells. Journal of Ethnopharmacology, v.81, p.257-264, 2002. GUARALDO, L.; SERTIÈ, J. A. A.; BACCHI, E. M. Antiulcer action of the hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret in the rat. Journal of Ethnopharmacology, v.76, p.191-195, 2001. GUARALDO, L. et al. Hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret: effects on spontaneous motor activity and elevated plus-maze behavior. Journal of Ethnopharmacology, v.72, p. 61-67, 2000. SIDDIQUI, B. S. et al. Minor iridoids from the leaves of Plumeria obtusa . Phytochemistry, v.37, n.3, p.769-771, 1994. FRANÇA, O. O.; BROWN, R. T.; SANTOS, C. A. M. Uleine and demethoxyaspidospermine from the bark of Plumeria lancifolia . Fitoterapia, v.71, p.208-210, 2000. VASCONCELOS, S. M. M. et al. Antinociceptive activities of the hydroalcoholic extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu in mice. Biol. Pharm. Bull., v.26, n.7, p.946-949, 2003. SARRAGIOTTO, M. H.; LEITAO, H.; MARSAIOLI, A. J. Erysotrine-n-oxide and erythrartine-n-oxide, 2 novel alkaloids from Erythrina mulungu . Canadian Journal of chemistry-revue canadienne de chimie, v.59, n.18, p.2771-2775,1981. CRUZ, G. L. Dicionário das plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Civilização Brasileira S. A., 1979.

57. MARQUES, L. C. Normatização da produção e comercialização de fitoterápicos no Brasil. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L.A. & Petrovick, P.R. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 14. BRITO, A. R. M. S. Legislação de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.). Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996. Cap. 13. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 17 de 24 de fevereiro de 2000. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da União, 25 fev. 2000. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Consultas públicas n. 59, 61, 84, 87 e 88. Disponível em: < http ://www. anvisa . gov . br / scriptsweb /consulta_publica/consultas_paginado. asp ? page =6&ano=2002 >. Acesso em 09/12/03. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Consulta pública n. 94. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da União, 07 nov. 2003. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T.A. Princípios de análise instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. p.597-677. LANCAS, F. M. Cromatografia em fase gasosa. São Carlos: Acta, 1993. MELO, L. F. C. Emprego das cromatografias como técnica de “screening” na análise de fármacos. Exame de Qualificação Geral de Doutorado (Doutorado em Química) – UNICAMP, São Paulo. 1999. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003. Dispõe sobre validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, 01 mar. 2003. SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis Understating the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. J. of Chromatog. A, v.987, p. 57-66, 2003. CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. São Carlos: UFSCar, 2001. BARROS, C. B.;.HIRATA, Y. S; SATO, N. M. N. Validação de métodos analíticos. Taboão da Serra: ISOLAB Consultoria e Cursos, 03 e 04 dez. 1997. REQUIREMENTS for initial assay validation and publication in J. Chromatography B. J.of Chromatogr B, v.707, p.1-2, 1998. BRITTAIN, H. G. Validação de métodos analíticos não cromatográficos. Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p.4-9. De BARROS, C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, v.64, n.2, p.175-177, 2002. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug administration. Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. Rockville, 1994.

58. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry: Analytical Procedures and Methods Validation, Rockville, 2000. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry . Bioanalytical method validation. Rockville, 2001. UNITED States Pharmacopeia 23, Rockville, 1995. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite Guideline: Validation of analytical procedures: methodology Q2B, nov.1994. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite Guideline: Text on validation of analytical procedures Q2A, oct.1994. BIBLIOTECA on-line. Disponível em: <http://isi3.isiknowledge.com/portal.cgi?DestApp=WOS&Func=Frame http://www.isi3newisiknowledge.com >. Acesso em: 12 dez. 2003. LEITE, F. Validação em análise química. 3. ed. Átomo: Campinas, 1996. CHASIN, A. A. M. et al. Validação de métodos em analyses toxicológicas: uma abordagem geral. Rev. Brasileira de Toxicologia, v. 11, n.1, p.1-6, 1998. SWARTZ, M. E.; KRULL, I. S. Validação de métodos cromatográficos. Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p. 12-19. JENKE, D.R. Chromatographic method validation: a review of current practices and procedures. Part I and II. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., v. 19, n.5, p.719-757, 1996. TAYLOR, J. K.; Quality assurance of chemical measurements. 2.ed. Chelsea: Lewis, 1987. GYMENEZ, W. E. M. Avaliação de método analítico para a análise de resíduos de pesticidas. In: GARP (Associação grupo de analistas de resíduos de pesticidas) . Manual de resíduos de pesticidas em alimentos, 1989, p. 66-73. JAMALI, B.; NIELSEN, H. M.; Development and validation of a capillary electrophoresis-indirect photometric detection method for the determination of the non-UV-absorbing 1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol in active pharmaceutical ingredients, solutions and tables using an internal standard. J. Chromatogr. A , v. 996, p. 213-223, 2003. PRADOS-ROSALES, R. C.; GARCÍA, J. L. L.; De CASTRO, M. D. L. Rapid analytical method for the determination of pesticide residues in sunflower seeds based on focused microwave-assisted soxhlet extraction prior to gas chromatography–tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, v. 993, p.121-129, 2003. LAMPINEN, M. et al. Validation of a meted for quantifiation of ketobemidone in human plasma with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, v. 789, p. 347-354, 2003. AGÊNCIA Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em: < http://www.anvisa.com.br >. Acesso em 25 nov. 2003.

59. FARMACOPÉIA dos Estados Unidos do Brasil, 2. ed. São Paulo: Siqueira, 1959. INNOCENTI, G. et al. Quantitative recovery of furanocoumarins from Psoralea bituminosa . Phytochem. Anal., v.8, p.84-86, 1997. SALDAÑA, L. S. et al. Dermatología Peruana, v. 12, n.1, jan/jun. 2002. Di STASI, C. L. Química de produtos naturais: principais constituintes ativos. In: Di STASI, L. C. (Org.). Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996. Cap. 9. KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, cromonas e xantonas. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C . P.; Mentz, L.A. & Petrovick, P.R. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 21.