1) O documento descreve o desenvolvimento e validação de metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos. 2) Foram analisados 10 medicamentos obtidos no comércio e desenvolvidos métodos de extração e cromatografia para identificar furanocumarinas. 3) Os métodos desenvolvidos foram validados de acordo com parâmetros internacionais e forneceram resultados precisos e recuperações adequadas para as amostras analisadas.

1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso Campo Grande - MS UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA - MESTRADO

2. INTRODUÇÃO MEDICAMENTO FITOTERÁPICO Medicamento farmacêutico obtido por processos tecnologicamente adequados, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico 73 .

3. “ Fitoterápicos não têm efeitos colaterais...” “ Pode ser usado pelo tempo que você quiser...” “ Se não fizer bem, mal não há de fazer...” Grande parte das espécies vegetais utilizadas não tem ação farmacológica comprovada, estudo químico realizado, nem estudos toxicológicos. Fraudes e problemas na qualidade dos fitoterápicos. Resolução da ANVISA – RDC nº17 de 24 de janeiro de 2000 . Consultas públicas - nº 94 de 6 de novembro de 2003. MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS - Brasil INTRODUÇÃO

4. Alternativa menos agressiva ao organismo; Rigor da legislação e da vigilância sanitária; Exigência de qualidade: autenticidade; da presença do teor correto de princípios ativos; de boas condições de conservação; e outros. INTRODUÇÃO PAÍSES COM TRADIÇÃO NO USO DE FITOTERÁPICOS Como Alemanha, França e Bélgica

5. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS Desenvolvimento de metodologias: Seleciona-se a substância de interesse na matriz; Otimiza-se um método de extração; Procede-se a determinação. Processo de Validação: Garante confiabilidade às medidas obtidas; Normas nacionais e internacionais: INTRODUÇÃO ► ANVISA -> Agência Nacional de Vigilância Sanitária ► FDA -> US Food and Drug Administration ► USP -> United States Pharmacopeia ► ICH -> International Conference of Harmonization

6. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO Especificidade Limite de Quantificação Limite de Detecção Linearidade e Faixa de aplicação Sensibilidade Exatidão Precisão Estabilidade Robustez INTRODUÇÃO Diferenciar compostos na presença de outros. Menor quantidade determinada com precisão/ exatidão. Menor quantidade detectada. Produzir resultados lineares numa dada faixa de variação. Distinguir quantidades próximas. Concordância entre os valores encontrados e o verdadeiro. Inalteração dos resultados apesar de pequenas modificações do método. Constância do analito nas amostras. Proximidade entre os resultados.

7. FURANOCUMARINAS Classe das cumarinas INTRODUÇÃO Fotoreatividade (luz UV entre 200 e 300 nm) Furanocumarinas ativadas DNA, RNA, proteínas e lipídios Morte ou replicação da célula, síntese, mutação ou reparo do DNA Uso desde 2000 a.C. em doenças de pele como: vitiligo micose Psoríase

8. FURANOCUMARINAS OU PSORALENOS Famílias Apiaceae, Rutaceae e Moraceae . INTRODUÇÃO * 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona *

9. Efeitos colaterais: eritema, formação de bolhas, náuseas, prurido, dor de cabeça e depressão, genotoxicidade (alteram o conteúdo informacional dos genes). Uso continuado é questionado: Efeito carcinogênico, envelhecimento precoce, tendência ao aparecimento de cataratas. TERAPIA PUVA (PSORALENOS + UV A) INTRODUÇÃO TRATAMENTO DE DOENÇAS DE PELE

10. OBJETIVOS PRINCIPAIS Desenvolver metodologias de extração de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos escolhidos no comércio. Validar as metodologias desenvolvidas através de parâmetros de validação da ICH.

11. MEDICAMENTOS ANALISADOS -> total= 10 Aquisição em farmácias de manipulação, drogarias e ervanários. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 7 Medicamentos contendo espécies do gênero Dorstenia : Indicados para tratamento de distúrbios menstruais e sintomas da menopausa . Não tinham informação sobre presença de furanocumarinas. 3 Medicamentos indicados para vitiligo: 2 eram identificados apenas como “ produto natural ” 1 informava sobre presença de furanocumarinas na seiva de Brosimum gaudichaudii .

12. Gênero Dorstenia Habilidade em sintetizar furanocumarinas ; Antiofídico, anti-reumático, infecções e doenças de pele ; Carapiá ou figueirilha; Cardenolídeos, triterpenos, ácidos graxos, esteróides e vários flavonóides. Dorstenia brasiliensis

13. Utilizada no tratamento de doenças de pele; Mamica-de-cadela ; Nativa do cerrado brasileiro, ampla distribuição por todo o Brasil; Cumarinas, chalcona, esteróides e triterpeno. Espécie Brosimum gaudichaudii Brosimum gaudichaudii

14. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 2 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 3 lotes 1 lote 3 lotes 2 lotes 3 lotes Campo Grande Seiva de Brosimum gaudichaudii e vitaminas J Coxim Produto natural I Campo Grande Produto natural H Comprimidos Rio de Janeiro Pó de Dorstenia brasiliensis G Campo Grande Extratos secos de Dorstenia multiformis , Plumeria lancifolia, Cereus jamacaru e Erythrina mulungu F Campo Grande Extratos secos de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia E Cápsulas Campo Grande Tintura de Dorstenia multiformis D Campo Grande Tinturas de Dorstenia multiformis , Cereus jamacaru, Plumeria lancifolia e Erythrina mulungu C São Paulo, Goiânia, Rio de Janeiro e Brasília Tinturas de Dorstenia multiformis e Plumeria lancifolia B São Paulo, Brasília, Goiânia e Rio de Janeiro Tinturas de Dorstenia multiformis , Davilla rugosa e Plumeria lancifolia A Soluções orais

15. SOLUÇÕES ORAIS – A, B, C e D Análises preliminares em CCD -> presença de furanocumarinas Análise direta: Adquiridas de junho de 2002 à novembro de 2003. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Solução oral A Solução oral A Psoraleno sustâncias mais polares Bergapteno • Excluísse da solução de análise a maior parte das substâncias mais polares; • Abrangente; • Não oneroso; • Solução de análise capaz de ser analisada em CLAE e CG.

16. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO Soluções Orais A, B, C e D PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Extração líquido - líquido Solvente extrator – diclorometano, éter etílico, clorofórmio Tempo em ultra-som – 10, 20, 30, 40, 50 min Tempo em centrifugação – 5, 10, 15 min Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3). Necessidade de reextração da fase inferior.

17. MÉTODO OTIMIZADO PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Solução Oral (5 mL) 7 mL de clorofórmio 10 min em ultra-som 10 min em centrifugação 1ª Fração superior 1ª Fração inferior 5 mL de clorofórmio 10 min em ultra-som 10 min em centrifugação 2ª Fração superior 2ª Fração inferior Solução de análise 1 (MeOH) Solução de análise 2

18. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA Modelo: Shimadzu LC-6AD Detector: UV-Vis de comprimento de onda fixo (Shimadzu) Coluna: fase reversa octadecyl Shim-pack (25cm x 4,6mm x 5 µm) e pré-coluna (2,5cm x 4,6 mm) de mesma fase CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS Eluente: água – acetonitrila Proporção 45: 55 (v/v) Fluxo: 1mL/min Comprimento de onda: 223 nm Injeção: 10 µL EQUIPAMENTO PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

19. Recuperação do método para soluções orais A, B e C (n=5 para cada amostra). RECUPERAÇÃO C adic, concentração adicionada. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 97,81 ± 1,15 96,86 ± 1,05 98,26 ± 0,93 98,37 ± 0,78 95,95 ± 0,87 96,83 ± 0,97 200 98,11 ± 1,03 98,43 ± 0,79 94,43 ± 0,53 98,98 ± 1,01 99,05 ± 0,74 93,76 ± 0,81 100 97,29 ± 0,67 99,97 ± 0,89 99,89 ± 0,87 97,19 ± 0,99 96,55 ± 1,14 92,35 ± 0,35 40 96,43 ± 1,11 98,34 ± 1,17 98,76 ± 0,74 96,13 ± 1,16 97,28 ± 0,91 95,99 ± 1,17 4 C B A C B A Bergapteno (%) (média ± DP) Psoraleno (%) (média ± DP) C adic ( µg ml -1 )

20. SOLUÇÃO ORAL A 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

21. SOLUÇÃO ORAL B 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

22. SOLUÇÃO ORAL C 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Amostra inteira Solução de análise 1 Solução de análise 2

23. Metodologia de extração dos medicamentos E, G, H e I já havia sido determinada em nosso laboratório -> metanol-clorofórmio 7:3, tempo em ultra-som 15 min e tempo em centrifugação de 10 min. MEDICAMENTOS EM CÁPSULAS E COMPRIMIDOS Estudar a aplicabilidade do método a: Medicamento em cápsula F : maior complexibilidade de composição: (mistura de extratos secos de 5 plantas). Medicamento J : adição de substâncias ativas isoladas (não-fitoterápico): seiva concentrada de uma planta medicinal + vitaminas. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Foram mantidos os mesmos tempo de ultra-som e centrifugação. Vários solventes e misturas de solventes testados. Todos os experimentos foram realizados em triplicata (n=3).

24. MÉTODO OTIMIZADO – F , E, G, H e I PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Medicamento (100 mg) 10 mL de metanol-clorofórmio 7:3 15 min em ultra-som 10 min em centrifugação 1º Resíduo 1º Extrato 10 mL de metanol-clorofórmio 7:3 15 min em ultra-som 10 min em centrifugação 2º Resíduo 2º Extrato Solução de análise (MeOH)

25. Recuperação do método para E, F, G, H e I (n=5 para cada amostra). RECUPERAÇÃO -> Eficiência da extração C adic, concentração adicionada. O medicamento em comprimidos J não se enquadrou no método. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 99,55 ± 0,82 99,36 ± 1,27 98,00 ± 1,22 99,13 ± 0,97 99,14 ± 1,02 40 99,50 ± 1,19 98,76 ± 0,89 99,01 ± 1,13 99,35 ± 1,27 98,99 ± 0,73 20 98,68 ± 1,03 97,74 ± 1,25 97,67 ± 0,87 97,88 ± 0,99 97,45 ± 1,28 1 I H G F E C adic ( µg mL -1 ) DT (%) (MÉDIA ± DP) 99,33 ± 0,76 99,44 ± 0,93 98,11 ± 1,03 99,39 ± 0,80 99,01 ± 0,67 40 99,29 ± 1,11 99,02 ± 0,86 99,26 ± 0,73 99,46 ± 0,91 99,43 ± 0,71 20 98,67 ± 0,83 97,89 ± 1,10 98,01 ± 1,19 98,87 ± 1,12 98,13 ± 0,81 1 I H G F E C adic ( µg mL -1 ) BERGAPTENO (%) (MÉDIA ± DP) 99,27 ± 0,80 99,29 ± 0,91 99,47 ± 1,27 99,05 ± 0,77 99,03 ± 0,97 40 99,44 ± 1,11 98,96 ± 0,78 98,98 ± 0,96 99,14 ± 1,37 98,79 ± 0,85 20 97,89 ± 0,87 97,45 ± 1,16 97,34 ± 0,99 97,99 ± 0,94 97,33 ± 1,36 1 I H G F E C adic ( µg mL -1 ) PSORALENO (%) (MÉDIA ± DP)

26. MEDICAMENTO J – não se enquadrou no método. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES sustâncias mais polares Psoraleno Bergapteno

27. MEDICAMENTO F PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES Psoraleno Bergapteno DT

28. MEDICAMENTOS E, G, H e I Utilizando-se as mesmas condições para CLAE descrita em soluções orais. 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno 3 - DT PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES E G H I

29. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS Estudo interequipamento Confirmar valores encontrados -> não havia parâmetros de referência de quantidade; Precisão interequipamento; Possibilidade da utilização de CLAE e CG nos métodos. CG-DIC -> para método de soluções orais A, B e C. Modelo: Varian Coluna: LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 µm) Detector: DIC, temperatura 280º C Injetor: 280ºC Split: 1:20 Gás de arraste: Hidrogênio com fluxo de 0,8 mL/min PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

30. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS CG-EM -> para método dos medicamentos E, F, G, H e I Modelo: Shimadzu 17 Coluna: LM-A (15m x 0,2mm x 0,2 µm) Injetor Split/Splitless : razão de Split 1:20 Temperatura da interface: 280ºC Detector seletivo de massa, modelo: Shimadzu QP 5000 Modo de ionização: impacto de elétrons ; Modo de aquisição: 55-550 u.m.a Gás de arraste: Hélio com fluxo de 0,6 mL/min PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 20 - 280 - 5 240 - 10 150 Tempo de isoterma (min) Velocidade de aquecimento (ºC/min) Temperatura (ºC) O tempo de análise total no CG foi de 37 minutos. Programação de temperatura utilizada em CG-EM E CG-DIC(no forno da coluna)

31. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS Estudo inter-equipamento 1 – Psoraleno 2 - Bergapteno 3 - DT PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES CG-DIC, solução oral B CG-EM, medicamento F

32. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros Especificidade Os métodos demonstraram boa separação dos picos de interesse em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM sem interferentes. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 16,5 ± 0,05 16,55 ± 0,03 11,4 ± 0,03 DT 6,3 ± 0,04 6,35 ± 0,01 7,4 ± 0,03 Bergapteno 4,3 ± 0,05 4,25 ± 0,03 6,1 ± 0,04 Psoraleno CG-EM CG-DIC CLAE-UV Substâncias 0,80 0,24 0,30 0,09 0,33 0,10 CG-EM 5,0 1,5 2,0 0,6 4,3 1,3 CG-DIC 0,80 0,24 0,23 0,07 0,10 0,03 CLAE-UV LQ LD LQ LD LQ LD DT Bergapteno Psoraleno Limites de detecção e quantificação LD, limite de detecção; LQ, limite de quantificação.

33. Estabilidade Soluções-padrão e soluções de análise. Curva de calibração – padrão externo MÉTODO PARA SOLUÇÕES ORAIS MÉTODO PARA CÁPSULAS E COMPRIMIDOS VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 10 10 9 9 n 0,9997 0,9998 0,9998 0,9998 r 5-90 10-100 1-400 1-600 FL ( µg mL -1 ) Bergapteno Psoraleno Bergapteno Psoraleno Substâncias CG-DIC CLAE-UV 10 10 10 10 10 10 n 0,9997 0,9998 0,9998 0,9997 0,9999 0,9998 r 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50 FL ( µg mL -1 ) DT Bergapteno Psoraleno DT Bergapteno Psoraleno Substâncias CG-EM CLAE-UV

34. VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES As quantidades determinadas de analitos nos medicamentos pela extrapolação da reta no eixo x das curvas de linearidade dos métodos foram semelhantes às encontradas empregando-se padrão externo. Linearidade – Métodos de soluções orais e de cápsulas e comprimidos. r 2 = 0,9998 (n=5) nas matrizes dentro do intervalo das curvas de calibração.

35. Acurácia Precisão 1 - REPETITIVIDADE -> Análises intradia 2 - PRECISÃO INTERMEDIÁRIA -> Análises interdia 3 - ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO -> CG-DIC ou CG-EM 3 repetições (n=5 para cada concentração trabalhada) Período de 1 dia 3 repetições (n=5 para cada concentração trabalhada) 1 repetição por dia -> 3 dias VALIDAÇÃO DAS METODOLOGIAS - Parâmetros PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES % Inexatidão= concentração obtida – concentração esperada concentração esperada % CV = desvio padrão das medidas concentração média determinada

36. ACURÁCIA E PRECISÃO -> Soluções orais A, B e C C., concentração. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adicionada ( µg mL –1 ) 1,50 1,5 203,0 ± 3,05 1,18 1,0 202,0 ± 2,39 200 2,69 5,0 42,0 ± 1,13 2,02 2,5 41,0 ± 0,83 40 4,73 5,0 3,8 ± 0,18 4,35 -2,5 3,9 ± 0,17 4 BERGAPTENO PSORALENO Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=4 para cada amostra) 3,85 2,5 3,9 ± 0,15 4,10 2,5 3,9 ± 0,16 4 4,26 5,0 42,0 ±1,79 4,93 5,0 42,0 ± 2,07 40 1,93 1,5 203,0 ± 3,91 1,58 2,0 204,0 ± 3,23 200 CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Acurácia (%) C. determinada ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adicionada ( µg mL –1 ) BERGAPTENO PSORALENO Acurácia e precisão intrerdia em CLAE (n=5 para cada amostra)

37. ACURÁCIA E PRECISÃO -> Medicamentos E, F, G, H e I C., concentração; adic., adicionada; deter., determinada, Ac., acurácia PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES DT BERGAPTENO PSORALENO CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adic. ( µg mL –1 ) 2,51 0,14 39,43 ± 0,99 2,15 1,23 39,51 ± 0,85 2,31 1,70 39,32 ± 0,91 40 2,84 0,40 20,08 ±0,57 2,35 0,10 20,02 ± 0,47 2,72 2,45 19,51 ± 0,53 20 3,96 3,00 1,03 ± 0,05 3,96 1,00 1,01 ± 0,04 4,85 3,00 1,03 ± 0,05 1 Acurácia e precisão intradia em CLAE (n=5 para cada amostra) DT BERGAPTENO PSORALENO CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) CV (%) Ac. (%) C. deter. ( µg mL –1 ) (média ± DP) C. adic. ( µg mL –1 ) 2,20 1,25 39,50 ± 0,87 1,99 0,93 39,63 ± 0,79 2,08 1,25 39,50 ± 0,82 40 4,20 0,50 20,10 ± 0,42 2,54 0,30 20,06 ± 0,51 3,01 1,10 19,78 ± 0,59 20 3,96 3,00 1,03 ± 0,05 4,90 2,00 1,02 ± 0,05 4,76 5,00 1,05 ± 0,05 1 Acurácia e precisão interdia em CLAE (n=5 para cada amostra)

38. DETERMINAÇÃO DAS FURANOCUMARINAS – Soluções orais A hidrólise enzimática realizada em triplicata (resíduo das soluções orais + β-glucosidase em tampão acetato 0,1mol/L, 37ºC por dois dias) com as soluções orais A, B e C não indicou presença de glicosídios furanocumarínicos nas amostras. Não houve discrepâncias entre os lotes dos medicamentos A e B. C -> 20% diferença para as furanocumarinas. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES 90 ± 2,1 325 ± 7,3 C3 84 ± 3,4 314 ± 6,7 C2 72 ± 2,8 265 ± 4,9 C1 128 ± 3,2 522 ± 5,9 B2 134 ± 3,6 530 ± 3,1 B1 66 ± 2,0 260 ± 4,9 A3 63 ± 2,1 272 ± 4,1 A2 65 ± 2,9 274 ± 4,3 A1 Bergapteno ( µg mL -1 ) Psoraleno ( µg mL -1 ) Soluções orais 483 1052 D

39. Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL -1 ) de psoraleno e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-UV e CG-DIC. ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO – Soluções orais Não houve diferenças significativas entre os dois aparelhos. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

40. DETERMINAÇÃO DAS FURANOCUMARINAS – cáp e cpd PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES - - - I3 - - - I2 - - - I1 12 ± 0,4 53 ± 1,4 222 ± 2,0 H3 13 ± 0,3 56 ± 2,1 232 ± 2,2 H2 11 ± 0,2 55 ± 1,7 225 ± 2,2 H1 - 94 ± 3,3 237 ± 2,4 G3 - 72 ± 2,5 70 ± 1,1 G2 - 75 ± 1,9 172 ± 2,6 G1 14 ± 0,4 67 ± 1,4 210 ± 2,0 F3 12 ± 0,3 63 ± 2,1 213 ± 2,2 F2 10 ± 0,3 60 ± 1,7 210 ± 2,2 F1 - 80 ± 1,2 250 ± 1,4 E3 - 85 ± 0,9 249 ± 1,3 E2 - 83 ± 1,3 250 ± 1,4 E1 DT ( µg mL -1 ) Bergapteno ( µg mL -1 ) Psoraleno ( µg mL -1 ) Medicamentos Não houve discrepâncias entre os lotes analisados dos medicamentos E, F e H. 150 – 240% 4 - 30%

41. Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL -1 ) de psoraleno, bergapteno e DT nos diferentes lotes de medicamentos E, F, G, H e I por análise em CLAE-UV e CG-EM. ANÁLISE INTEREQUIPAMENTO – cáp e cpd Não houve diferenças significativas entre os dois apartelhos. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

42. CORRELAÇÕES SOLUÇÕES ORAIS A, B e C (15 mL/dia): UMA SEMANA: 53,38 mg de furanocumarinas. SOLUÇÃO ORAL D : 160,65 mg de furanocumarinas / semana. MEDICAMENTOS E, F, G e H (3 cáp ou cpd / dia): UMA SEMANA: 25,76 mg de furanocumarinas. DOENÇAS DE PELE ( pessoa de 60kg ) -> 144 mg de bergapteno, 36 mg de xantotoxina ou 84 mg de trimetilpsoraleno / semana. PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

43. OUTROS ESTUDOS REALIZADOS PARTE EXPERIMENTAL, RESULTADOS E DISCUSSÕES

44. NOVAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS Proposta para determinação das demais substâncias presentes nos medicamentos. CONDIÇÕES ISOCRÁTICAS e em GRADIENTE para CLAE Amostra inteira Solução oral A Amostra inteira Solução oral C Amostra inteira Solução oral B

45. CONDIÇÃO EM GRADIENTE CONDIÇÃO EM GRADIENTE

46. A B C

47. ESTUDOS PRELIMINARES COM PLANTAS Extração com etanol absoluto e reextrações com clorofórmio . Brosimum gaudichaudii 1 mamica de cadela Dorstenia brasiliensis carapiá 2 carapiá 1 Amostra raiz raiz rizoma rizoma rizoma Parte 1,07 0,36 0,48 <0,01 0,17 0,69 0,10 0,40 0,11 0,62 Bergapteno(%) Psoraleno (%) 1,02 0,04 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 3 0,16 1,10 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 2 3,49 2,09 casca da raiz Brosimum gaudichaudii 1

48. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA D, D.brasiliensis ; B2, B. gaudichaudii 2 ; B3, B.gaudichaudii 3 ; H, amostra hidrolisada. B 3 B 2 D

49. CONCLUSÃO Dois métodos para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos foram desenvolvidos e validados para CLAE e CG (segundo os parâmetros da ICH): Ambos os equipamentos poderão ser utilizados; Os métodos podem ser aplicados a outras formulações do mercado. Foram encontradas furanocumarinas nos medicamentos A, B, C, D, E, F, G e H, sem que a informação estivesse presente nas bulas ou folhetos explicativos. As quantidades de furanocumarinas encontradas nos medicamentos analisados sugerem que o uso destes fitoterápicos no tratamento de distúrbios menstruais e menopausa é considerado de alto risco devido os efeitos colaterais e a alta incidência de câncer provocados pelo uso das substâncias.

50. CONCLUSÃO Como não foi detectada a presença de furanocumarinas no látex de 3 espécimes de B.gaudichaudii , sugere-se que o medicamento J seja formulado com outra parte da planta. As amostras de carapiá e mamica de cadela adquiridas no mercado assemelharam-se às amostras de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii respectivamente, quanto à presença de furanocumarinas. Uma nova condição cromatogrática para CLAE foi proposta para estudo das outras substâncias presentes nos medicamentos A, B e C. Os espécimes de B. gaudichaudii analisados apresentaram grandes diferenças quanto às quantidades de furanocumarinas presentes.

51. Dedico a presente dissertação aos meus pais Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires. Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos. As minhas irmãs Claudia e Fernanda. A toda a minha família e amigos sempre presentes. A Deus. DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA Dedico a presente dissertação aos meus pais Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires. Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos Santos. As minhas irmãs Claudia e Fernanda. A toda a minha família e amigos sempre presentes.

52. À prof. Dra. Cláudia A. L. Cardoso, pela preciosa orientação deste trabalho, apoio e amizade. Às prof. Dra. Neli K. Honda e Dra. Rosenei L. Brum, pelos ensinamentos, amizade e pelo laboratório onde foi realizado este trabalho. Ao Leonardo Viana pela colaboração e pelos grandes ensinamentos de cromatografia líquida. À mestra Roberta da INEP, pela realização de análises em cromatografia gasosa. À prof. Dra. Conceição E. dos Santos Silveira e ao mestrando em Botânica Dario Palhares, da UnB, pelas coletas e identificação de amostras de Brosimum gaudichaudii . Aos secretários do mestrado Celestino G. de Oliveira e Maria Otávia P. V. de Toledo pela colaboração. À CAPES pela bolsa concedida.

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