Espero que este artigo. possa ajudar aos estudantes da área da saúde.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO: BIOMEDICINA
PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL E DO PERFIL DE
BIODISPONIBILIDADE DE NANOCÁPSULAS, CONTENDO O ÁCIDO
FUMARPROTOCETRÁRICO EXTRAÍDO DE Cladonia verticillaris (Raddi) Fr.
MILENA SALES FERRAZ
Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
Recife-PE/2003

2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO: BIOMEDICINA
PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL E DO PERFIL DE
BIODISPONIBILIDADE DE NANOCÁPSULAS, CONTENDO O ÁCIDO
FUMARPROTOCETRÁRICO EXTRAÍDO DE Cladonia verticillaris (Raddi) Fr.
MILENA SALES FERRAZ
Projeto de iniciação científica
apresentado ao Curso de Biomedicina,
do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE), como cumprimento das
exigências impostas por essa
instituição .
Orientadora: Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães.
Recife-PE/2003

3. I) INTRODUÇÃO
O câncer é causado em todos (ou quase todos) os casos por mutação ou por ativação
anormal de genes celulares que controlam o crescimento e a mitose celular. Esses genes
anormais são chamados de oncogenes [1]. Carcinogênese ou oncogênese são termos que
designam o processo de desenvolvimento de uma neoplasia, desde as alterações mais
precoces no DNA, que supostamente ocorrem em uma só célula ou em um pequeno grupo
delas, até a formação de um tumor que pode destruir o organismo hospedeiro. Este processo
neoplásico é um processo dinâmico, que evolui em muitas etapas [2].
Devido à importância epidemiológica dos processos neoplásicos, inúmeras abordagens
terapêuticas vêm sendo propostas. As categorias básicas para o tratamento são: cirurgia,
radioterapia e quimioterapia. Esta última apresenta desfavorável aspecto, devido à
inespecificidade da droga e à dificuldade em se estabelecer uma dose efetiva para destruir o
máximo de células com o mínimo de efeitos colaterais para as células normais [3].
A maioria das drogas utilizadas atualmente no tratamento de câncer ou danificam o
DNA ou inibem a sua replicação [4]. As células cancerosas, por crescerem mais
rapidamente que as células normais da maioria dos tecidos, têm necessidades maiores de
nucleotídeos como precursores na síntese de DNA e RNA, assim são, em geral, mais
sensíveis aos inibidores da biossíntese de nucleotídeos do que as células normais [5].
A eficácia da presente quimioterapia do câncer está principalmente limitada pela
toxicidade associada com as drogas anticancerígenas nos tecidos normais [6]. Uma
estratégia pode ser a associação de drogas antitumorais com nanopartículas coloidais
visando sobrepor os mecanismos de resistência celular e não-celular e aumentar a
seletividade de drogas em células cancerosas enquanto reduz a sua toxicidade em tecidos
normais [7]. Uma estratégia alternativa para a realização mais seletiva de tratamento de
câncer é o desenvolvimento de drogas direcionadas especificamente contra os oncogenes
que conduzem o crescimento do tumor [4]
As nanopartículas podem agir como um veículo de droga capaz de atingir tecidos
tumorais ou células, em uma certa extensão, enquanto protege a inativação prematura da
droga durante o seu transporte [7]. A encapsulação permite uma melhora da estabilidade da
droga, em decorrência da sua proteção (condições de estocagem) e redução dos efeitos
tóxicos ou adversos. O principal interesse desses vetores coloidais baseia-se na melhora do

4. efeito terapêutico pelo direcionamento das moléculas ativas em seus sítios de ação e pelo
ocasionamento de uma elevada concentração local [8].
II) OBJETIVOS
O objetivo principal desde projeto baseia-se na determinação das atividades
citotóxica e antitumoral e do perfil de biodisponibilidade de um sistema carreador de
fármaco, nanocápsulas de um polímero biodegradável (PLGA), contendo o ácido
fumarprotocetrárico. O estudo desses parâmetros permitirá a melhor compreensão dos
padrões ideais de funcionamento desses carreadores, como sistemas de liberação controlada
de fármacos, visando a sua futura e possível erradicação das células neoplásicas, assim
como a observação do mecanismo de biodistribuição da droga, ao ser administrada in vivo.
III) JUSTIFICATIVA
O fundamento desse projeto consiste na aplicação de uma nova tecnologia de
vetorização de fármacos, nanoencapsulação, a fim de utilizar substâncias liquênicas,
extraídas da flora do nordeste brasileiro, com potencial atividade antineoplásica. A
constatação das atividades citotóxica e antitumoral permitirá a continuidade de estudos de
biodisponibilidade desses carreadores coloidais.
III) PLANO DE TRABALHO
Parte I: Determinação da atividade citotóxica
Etapa 1: Análise citotóxica segundo protocolo do National Cancer Institute [9]
Parte II: Estudo da Atividade Antitumoral
Etapa 1: Determinação da atividade antitumoral in vivo do ácido
fumarprotocetrárico, livre e encapsulado, frente ao Sarcoma 180, em camundongos;
Etapa 2: Estudos histopatológicos dos tumores e órgãos dos animais tratados com
o ácido fumarprotocetrárico, livre e encapsulado.
Parte III: Determinação do perfil de biodisponibilidade
A biodistribuição do ácido fumarprotocetrárico será determinada, in vivo, em suas
formas livre e encapsulada.

5. IV) METODOLOGIA
O presente projeto é constituído de três partes fundamentais, tais como: o estudo das
atividades citotóxica e antitumoral das formulações e avaliação do perfil de biodistribuição
das nanocápsulas, constituídas de ácido fumarprotocetrárico.
As nanocápsulas de copolímero de ácido lático e glicólico (PLGA), contendo o
ácido fumarprotocetrárico, obtidas segundo o método de deposição interfacial do polímero
pré-formado[10], serão analisadas da seguinte maneira:
A) Determinação da atividade citotóxica:
O estudo da citotoxicidade será realizado pelo método de cultura de tecidos com
células da linhagens contínuas KB (carcinoma nasofaríngeo), Hep-2 (carcinoma
epedermóide de laringe), Hela (adenocarcinoma de útero), P815 (mastocitoma- leucemia
murina) camundongo DBS/2, U-937 (linfoma leucemia humana), todas em fase
exponencial de crescimento, e desenvolvidas em meio mínimo essencial (MME),
suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de glutamina e 1% de antibióticos
(penicilina, estreptomicina e carnamicina) [11].
As células serão repicadas rotineiramente para manutenção, em dias alternados e
6
semeadas em 10 células por frasco. As utilizadas para teste serão repicadas 24h antes do
experimento em monoestrato, removidos com 0,25% de tripsina [12], e diluídas no meio a
30.000 células /ml.
As amostras purificadas serão utilizadas nos ensaios de citotoxidade de acordo com
o protocolo para triagem de agentes químicos e produtos naturais (Protocol for Screening
Agents and Natural Products-NCI) [9]. As amostras testes serão acrescentadas ao meio
contendo células, a concentrações variadas. Em seguida, as placas serão incubadas por 72h
em atmosfera de 5% de CO2.
A atividade citotóxica será medida através da percentagem de inibição do
crescimento da amostra em relação ao grupo controle. Nestes ensaios serão utilizados os
testes: método calorimétrico de MTT (brometo 3-4,5 dimetiltiazol-2,5 difeniltetrazólio ou
sal tetrazólio) [13]; ensaio de vermelho neutro (NRU) [14]; e também será determinado o
conteúdo de DNA [15].

6. B) Estudo da atividade antitumoral das formulações:
Este estudo será realizado com o objetivo de avaliar a atividade antitumoral in vivo
frente ao tumor sarcoma-180. Células do tumor ascítico (5,0 x 106 células ml –1
) serão
inoculadas via subcutânea (s.c) na região dorsal direita do camundongo.
O tratamento será iniciado, 24 h após inoculação por 7 dias consecutivos. Após uma
semana de tratamento os animais serão sacrificados, tumores removidos, mensurados e
pesados. Os órgãos (fígado, rins e baço) serão dessecados e submetidos a estudos
histopatológicos. A inibição tumoral será determinada a partir do peso médio dos grupos de
animais tratados em relação ao grupo controle não tratado.
C) Determinação do perfil de biodisponibilidade do ácido fumarprotocetrárico, in
vivo, livre e encapsulado:
O estudo da biodisponibilidade será realizado para observação das etapas de
absorção, metabolismo e eliminação do fármaco, como também sua fixação em
determinados tecidos do organismo. A distribuição dos sistemas nanoparticulados contendo
a substância liquênica, ácido fumarprotocetrárico, previamente marcada com fluoresceína
isotiocianeto dextran (FITC-Dx) será determinada após sua administração por via
intravenosa. Este marcador fluorescente será adicionado à fase orgânica do processo de
preparação das nanocápsulas anteriormente relatado. Em intervalos de tempo pré-
determinado serão coletadas amostras de sangue e, consecutivamente, os animais serão
sacrificados e os órgãos (fígado, baço, rins, pulmão e coração) removidos. A fluorescência
será determinada em espectrofluorímetro e o resultado será expresso em percentagem de
fluorescência presente no sangue e no sobrenadante, resultante da centrifugação de cada um
dos respectivos órgãos, nos determinados intervalos de tempo [16].

7. VI) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. GUYTON, A.C. & HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica, 10a ed. Ed.Guanabara
Koogan S/A, Rio de Janeiro-RJ, cap.03, p.: 34, 2002.
2. MONTENEGRO, M.R. & FRANCO, M. Patologia Processos Gerais, 4a ed., Ed.
Atheneu, São Paulo-SP, 1999.
3. SANTOS, N. P. Nanocápsulas de PLGA contendo ácido úsnico de Cladonia
substellata com potencial ação antitumoral., 2003. 124 p. Tese (Doutorado em Ciências
Biológicas), Universidade Federal de Pernambuco, Pernambuco, Brasil.
4. COOPER, G. M. A célula: uma abordagem celular, 2a ed. Ed. Artmed, Porto Alegre-RS,
cap.15, p.: 633-674, 2001.
5. NELSON, D. L. & COX, M. M. Lehninger. Princípios da Bioquímica, 3a ed. Ed. Sarvier,
São Paulo-SP, cap.15, p.: 417-418, 2000.
6. MITRA, S., GAUR, U., GHOSH, P.C. & MAITRA, A.N. Tumor targeted delivery of
encapsulated dextran-doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier.
Journal Controled Release.v. 74: 317-323, 2001.
7. BRIGGER, I., DUBERNET, C. & COUVREUR, P. Nanoparticles in cancer therapy and
diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 54: 631-651, 2002.
8.GUINEBRETIÈRE, S., BRIANON, S., FESSI, H., TEODORESCU, V.S. &
BLANCHIN, M.G. Nanocapsules of biodegradable polymers: preparation and
characterizatin by direct high resolution electron microscopy. Materials Science &
Engineering.v. 21: 137-142, 2002.
9. GERAN, R. I., GREENBERG, N. H., MACDONALD, M. M., SCHUMACHER, A. M.
& ABBOT, B. J. Protocols for screening chemical agents and natural products against
animal and other biological systems, 3a ed. Cancer Chemotherapy Reports. v. 3, Part III,
2, 1972.
10. FESSI, H. PUISIEUX, F. DEVISSAGUET, J. AMMOURY, N. e BENITA, S. Int. J.
Pharm. v. 55: pR1-R4, 1989.
11. EAGLE, H. Biology and Medicine, Baltimore. v: 9: 362-364, 1959.
12. EDWARD S. G.; FOGH, J. Cancer Reash, Pliladelphia. v. 9: 362-364, 1959.

8. 13. DENIZOT, F., LANG, R. J. Immunol. Methods.v. 89: 271-277, 1986.
14. BOREFREUND, E., PUERNER, J.A. J. TISS. Cult. Methods.v. 9: 7-9, 1984.
15. CINGI, M. R. DE ANGELIS, I. FORTUNATI, E. E., REGGIANI, D., BIANCHI, V.,
TIOZZO, R., ZUCCO, F., Toxicol. In vitro. v. 5 : 19-125, 1991.
16. GAUR, U., SAHOO, S. K., DE, T.K., GHOSH, P.C., MAITRA, A. & GHOSH, P. K.
Biodistribuiton of fluoresceinated dextran using novel nanoparticles evading
reticuloendothelial system. International Journal of Pharmaceutics. v. 202: 1-10, 2000.
VII) CRONOGRAMA: NOVEMBRO (2003) - AGOSTO (2004)
TRIMESTRES
1 2 3 4
Pesquisa bibliográfica X X X
Determinação da atividade citotóxica X X
Determinação da atividade antitumoral X X
Estudo da biodisponibilidade X X
Redação e defesa da monografia X