Este trabalho apresenta o desenvolvimento e validação de metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por UV. Foram desenvolvidas metodologias para soluções orais, cápsulas e comprimidos, validadas por parâmetros como recuperação, especificidade, limites de detecção e quantificação, estabilidade, curva de calibração e precisão. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos foram realizados para identificação

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS
PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM
MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS
ADRIANA ELIAS PIRES
Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso
Campo Grande, MS
2004

2. UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS
PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM
MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS
ADRIANA ELIAS PIRES
Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Química –
Curso de Mestrado em Química, da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul,
como parte dos requisitos para obtenção do
Título de Mestre em Química, área de
concentração: Química Orgânica.
Campo Grande, MS
2004

3. "O Mestre na arte da vida
faz pouca distinção entre
o seu trabalho e o seu lazer,
entre a sua mente e o seu corpo, ...
entre o seu amor e a sua religião.
Ele simplesmente
persegue sua visão de excelência
em tudo que faz,
deixando para os outros
a decisão de saber se
está trabalhando ou
se divertindo."
Texto Budista

4. DEDICATÓRIA
Dedico a presente dissertação aos meus pais
Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires,
presentes, dedicados, amorosos, sem os quais
nada seria possível.
Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos
Santos, prestativo e amoroso, companheiro de
todas as horas.
As minhas queridas irmãs Claudia e Fernanda.
A Deus por conceder a vida, a oportunidade de
compartilhá-la com pessoas tão maravilhosas, o
discernimento e o equilíbrio que me fizeram
completar mais esta etapa da vida.

5. AGRADECIMENTOS
A Deus.
À Professora Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso, pela preciosa e
incessante orientação deste trabalho, apoio, amizade e compreensão.
Às professoras Dra. Neli K. Honda e Dra. Rosenei L. Brum, pelos
ensinamentos, colaboração e por oferecerem o laboratório para realização deste
trabalho.
Aos professores Dra. Fernanda R. Garcez, Dr. Walmir S. Garcez, Dra.
Neuza M. Mazzaro Somera, Dra. Rozanna M. Muzzi, Dra. Nilva R. Poppi, Dra.
Márcia R. da Matta, que me proporcionaram novos conhecimentos.
Ao Luís Leonardo Viana pela colaboração e pelos grandes ensinamentos
na arte da cromatografia líquida.
À Mestre Roberta do laboratório de análises instrumentais da INEP, pela
realização de análises em cromatografia gasosa.
À Professora Dra. Conceição Eneida dos Santos Silveira e ao mestrando
em Botânica Dario Palhares da Universidade de Brasília pelas coletas e
identificação de Brosimum gaudichaudii.
Aos colegas do curso de Mestrado em Química da UFMS e todos os
demais colegas.
Aos secretários do Mestrado do DQI/UFMS Celestino G. de Oliveira e
Maria Otávia P. V. de Toledo pela colaboração.
A todos os funcionários e técnicos do Departamento de Química da
UFMS, em especial a Dona Rosa pela prestimosa organização do laboratório.
À CAPES pela bolsa concedida.

6. SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. v
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ ix
ABREVIATURAS ....................................................................................................... xi
RESUMO .................................................................................................................. xii
ABSTRACT .............................................................................................................. xiii
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
1.1. Introdução Geral .......................................................................................................... 1
1.2. Furanocumarinas......................................................................................................... 3
1.3. Plantas contendo furanocumarinas .......................................................................... 7
1.3.1. Dorstenia .............................................................................................................. 7
1.3.1.1. Dorstenia multiformes ................................................................................. 9
1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis ................................................................................. 9
1.3.2. Brosimum gaudichaudii .................................................................................... 10
1.4. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 11
1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados........................... 12
1.4.1.1. Davilla rugosa ............................................................................................ 12
1.4.1.2. Plumeria lancifolia ..................................................................................... 13
1.4.1.3. Erythrina mulungu ..................................................................................... 13
1.4.1.4. Cereus jamacaru ....................................................................................... 13
1.5. Legislação de Fitoterápicos ..................................................................................... 14
1.6. Técnicas Instrumentais de Análise ......................................................................... 17
1.7. Validação de Métodos Analíticos ............................................................................ 18
1.7.1. Desenvolvimento do método ........................................................................... 19
1.7.2. Parâmetros de validação ................................................................................. 20
1.7.2.1. Especificidade / seletividade ................................................................... 20
1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ) ................................................................... 21
1.7.2.3. Limite de detecção (LD) ........................................................................... 23
1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação ............................................................ 23
i

7. 1.7.2.5. Sensibilidade .............................................................................................. 26
1.7.2.6. Exatidão ...................................................................................................... 27
1.7.2.7. Precisão ...................................................................................................... 28
1.7.2.8. Estabilidade ................................................................................................ 30
1.7.2.9. Robustez..................................................................................................... 30
1.7.3. Parâmetros de validação requeridos ............................................................. 31
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 32
3. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................ 33
3.1. Materiais e Equipamentos Utilizados ..................................................................... 33
3.1.1. Materiais utilizados............................................................................................ 33
3.1.2. Solventes utilizados .......................................................................................... 33
3.1.3. Equipamentos utilizados .................................................................................. 33
3.2. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 35
3.3. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 38
3.3.1. Soluções orais ................................................................................................... 38
3.3.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 39
3.4. Validação das Metodologias .................................................................................... 40
3.4.1. Recuperação ...................................................................................................... 40
3.4.2. Limites de detecção e quantificação. ............................................................. 41
3.4.3. Curva de calibração .......................................................................................... 41
3.4.4. Linearidade ......................................................................................................... 42
3.4.5. Acurácia e precisão .......................................................................................... 42
3.4.6. Estabilidade ........................................................................................................ 43
3.4.7. Especificidade .................................................................................................... 43
3.5. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 44
3.5.1. Novas condições cromatográficas.................................................................. 44
3.5.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C. ........................................................... 44
3.5.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos
fitoterápicos............................................................................................................................. 45
3.5.3.1. Material vegetal ......................................................................................... 45
3.5.3.2. Preparação das amostras ........................................................................ 47
ii

8. 3.5.3.2.1. Preparação de amostras para determinação do comprimento de
onda ......................................................................................................................................... 47
3.5.3.2.2. Preparação de extratos de agoniada ............................................. 47
3.5.3.2.3. Preparação de extratos de Brosimum gaudichaudii.................... 47
3.5.3.2.4. Preparação de extratos de carapiá, mamica de cadela,
Dorstenia multiformes e Brosimum gaudichaudii ............................................................. 48
3.5.3.2.5. Preparação de tinturas por maceração e por percolação de
Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 49
3.5.3.2.6. Hidrólise de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii ... 49
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 50
4.1. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 51
4.1.1. Soluções orais ................................................................................................... 51
4.1.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 59
4.2. Validação das Metodologias .................................................................................... 63
4.2.1. Recuperação ...................................................................................................... 64
4.2.2. Especificidade .................................................................................................... 67
4.2.3. Limites de detecção e quantificação .............................................................. 69
4.2.4. Estabilidade ........................................................................................................ 70
4.2.5. Curva de calibração .......................................................................................... 70
4.2.6. Linearidade do método ..................................................................................... 72
4.2.7. Acurácia e precisão .......................................................................................... 72
4.3. Avaliação das Quantidades Obtidas nos Medicamentos Analisados ............... 75
4.4. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 82
4.4.1. Novas condições cromatográficas.................................................................. 82
4.4.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C ............................................................ 90
4.4.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos
fitoterápicos............................................................................................................................. 90
4.4.3.1. Determinação do comprimento de onda ............................................... 90
4.4.3.2. Comparação de perfis cromatográficos dos extratos de agoniada... 92
4.4.3.3. Teores de furanocumarinas em Brosimum gaudichaudii ................... 94
4.4.3.4. Comparação entre amostras de carapiá, mamica de cadela,
Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 97
iii

9. 4.4.3.5. Maceração e percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum
gaudichaudii .......................................................................................................................... 101
4.4.3.6 - Hidrólise de Dortenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .......... 105
5. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 107
6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 109
iv

10. LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas. ................................................................ 3
Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas. .................................................................. 5
Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis. ....... 8
Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii. ......... 11
Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1.......... 22
Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo. ................................................. 24
Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito . 25
Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno. ................................ 25
Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal
estimada por regressão linear. .................................................................................. 26
Figura 10 - Estrutura das substâncias analisadas ..................................................... 50
Figura 11 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento A
(amostra bruta). ......................................................................................................... 52
Figura 12 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento B
(amostra bruta). ......................................................................................................... 53
Figura 13 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento C
(amostra bruta). ......................................................................................................... 53
Figura 14 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ............................................. 55
Figura 15 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ............................................. 56
Figura 16 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 56
Figura 17 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento A. ................................................................................. 57
Figura 18 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento B. ................................................................................. 57
Figura 19 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento C.................................................................................. 58
v

11. Figura 20 – Cromatograma obtido da análise por CG-EM da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 59
Figura 21 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento E. ........................................................................................................ 61
Figura 22 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento F.......................................................................................................... 61
Figura 23 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento G. ........................................................................................................ 62
Figura 24 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento H. ........................................................................................................ 62
Figura 25 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento I. .......................................................................................................... 63
Figura 26 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de
análises de soluções orais. ....................................................................................... 67
Figura 27 –Cromatograma obtido por CG-DIC representativo de análises de
soluções orais. .......................................................................................................... 68
Figura 28 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de
análises de cápsulas e comprimidos. ........................................................................ 68
Figura 29 –. Cromatograma obtido por CG-EM representativo de análises de
cápsulas e comprimidos. ........................................................................................... 69
Figura 30 – Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno
e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-
UV e CG-DIC............................................................................................................. 77
Figura 31 - Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno,
bergapteno e DT nos diferentes lotes de medicamentos E, F, G, H e I por análise em
CLAE-UV e CG-EM. .................................................................................................. 78
Figura 32 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da extração do
comprimido J. ............................................................................................................ 80
Figura 33 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento A (amostra bruta). ................ 83
Figura 34 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento B (amostra bruta). ................ 83
vi

12. Figura 35 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento C (amostra bruta). ................ 84
Figura 36 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento A (amostra bruta). ............................................................................... 85
Figura 37 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento B (amostra bruta). ............................................................................... 86
Figura 38 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento C (amostra bruta). ............................................................................... 86
Figura 39 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ....................... 87
Figura 40 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ....................... 87
Figura 41 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ....................... 88
Figura 42 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento A. .............................................. 88
Figura 43 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento B. .............................................. 89
Figura 44 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento C. .............................................. 89
Figura 45 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição para
quantificação de furanocumarinas, de extrato etanólico de carapiáx......................... 91
Figura 46 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico, de extrato etanólico de carapiá x. .................... 92
Figura 47 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada x. .................. 93
Figura 48 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada y. .................. 93
Figura 49 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada z. .................. 94
Figura 50 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV de extrato etanólico de
raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................... 95
vii

13. Figura 51 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
caule de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................ 95
Figura 52 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
folhas de Brosimum gaudichaudiix. ........................................................................... 96
Figura 53 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (10 µL da solução final
de 10 mL) do extrato etanólico de lenho da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .......... 96
Figura 54 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (5 µL solução final de 25
mL) do extrato etanólico de casca da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .................... 97
Figura 55 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
carapiáx. .................................................................................................................... 98
Figura 56 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
carapiáy. .................................................................................................................... 98
Figura 57 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
rizoma de Dorstenia brasiliensisx. ............................................................................. 99
Figura 58 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
mamica de cadelax. ................................................................................................... 99
Figura 59 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................. 100
Figura 60 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
tintura produzida por percolação de Dorstenia brasiliensisx. ................................... 103
Figura 61 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
tintura produzida por percolação de Brosimum gaudichaudiiy. ................................ 103
Figura 62 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento D (amostra bruta). ............................................................................. 104
Figura 63 - Quantidades de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) nas amostras de D.brasiliensisx, B.gaudichaudiiy e B.gaudichaudiiz
hidrolisadas e não hidrolisadas. .............................................................................. 106
viii

14. LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Programação de temperatura utilizada em CG-DIC e CG-EM29 .............. 35
Tabela 2 - Informações sobre denominações, lotes, data de fabricação, data de
validade e cidade de aquisição dos medicamentos. ................................................. 37
Tabela 3 - Amostras de plantas adquiridas no comércio de Campo Grande. ........... 46
Tabela 4 - Tempo de retenção (minutos  DP) das furanocumarinas em diferentes
equipamentos, empregando as condições de quantificação. .................................... 51
Tabela 5 – Porcentagens de recuperação de psoraleno e bergapteno nas soluções
orais A, B e C (n=15). ................................................................................................ 65
Tabela 6 – Porcentagens de recuperação de psoraleno, bergapteno e DT nas
cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15). .......................................................... 66
Tabela 7 - Limite de detecção e quantificação (μg mL-1) para psoraleno, bergapteno
e DT em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM. .................................................................... 69
Tabela 8 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação
quantitativa de psoraleno e bergapteno por CLAE-UV e CG-DIC para soluções orais.
.................................................................................................................................. 71
Tabela 9 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação
quantitativa de psoraleno, bergapteno e DT por CLAE-UV e CG-DIC para cápsulas e
comprimidos. ............................................................................................................. 71
Tabela 10 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg
ml-1)(média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e
C (n=12). ................................................................................................................... 73
Tabela 11 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg
ml-1) (média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B
e C (n=15). ................................................................................................................ 73
Tabela 12 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg
mL-1) (média  DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e
comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74
ix

15. Tabela 13 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg
mL-1) (média  DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e
comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74
Tabela 14 - Quantidade (μg mL-1) (média  DP) de furanocumarinas nas soluções
orais empregando o método com CLAE-UV (n=15). ................................................. 75
Tabela 15 - Quantidade (μg/100 mg de cápsula ou comprimido) (média  DP) de
furanocumarinas empregando o método com CLAE-UV (n=15). .............................. 76
Tabela 16 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) extraídos pelo procedimento com álcool etílico absoluto e reextrações com
clorofórmio............................................................................................................... 100
Tabela 17 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) nas tinturas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy obtidas por maceração e
percolação. .............................................................................................................. 102
Tabela 18 – Comparação entre as quantidades (μg mL-1) de furanocumarinas
presentes nas tinturas de D.multiformes presentes nas soluções orais A, B, C e D e
as quantidades determinadas nas tinturas de D.brasiliensisX obtidas por maceração
e percolação. ........................................................................................................... 105
x

16. LISTA DE ABREVIATURAS
PUVA - Psoralen plus UVA
P.A. - Pureza analítica
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-UV - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta
CLAE-DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de
fotodiodos.
CG - Cromatografia em fase gasosa
CG-DIC – Cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama
CG-EM - Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas
UV - Ultravioleta
UVA - Ultravioleta A
RNA - Ácido ribonucleico
DNA – Ácido desoxirribonucleico
m – massa
v – volume
xi

17. RESUMO
A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que tem crescido notadamente
nestes últimos anos, criando a necessidade de garantir a eficácia, segurança e
qualidade dos medicamentos fitoterápicos. O presente estudo desenvolveu
metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos
empregando CLAE-UV. Foram analisados medicamentos fitoterápicos na forma de
soluções orais, cápsulas e comprimidos, os quais foram formulados, empregando
espécies de Dorstenia ou Brosimum entre outras associações. Sete deles são
indicados para tratamento de distúrbios menstruais ou menopausa. Três deles são
utilizados para tratamento do vitiligo. Apenas um dos medicamentos possui
informação sobre a presença de uma furanocumarina em sua composição nas bulas
ou folhetos. Os métodos otimizados foram validados segundo as normas da
International Conference on Harmonization, mostrando boa especificidade, acurácia,
precisão e linearidade. O estudo interequipamento utilizando CG-DIC para soluções
orais e CG-EM para cápsulas e comprimidos, não revelou diferenças estatísticas
significativas. Devido a grande variedade das formulações dos medicamentos
utilizados no desenvolvimento e validação dos métodos, sugere-se que estes
possam ser utilizados para análise de psoraleno, bergapteno e 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-
dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona em outras
formulações de fitoterápicos presentes no mercado. O estudo do perfil
cromatográfico dos medicamentos foi realizado em condições isocráticas e em
gradiente por CLAE-UV. Foram determinadas furanocumarinas em nove
medicamentos analisados, o que oferece riscos à saúde pública devido ao
desconhecimento da presença destas substâncias, na maioria destes produtos.
Além disso, a furanocumarina encontrada em maior quantidade nos medicamentos
estudados foi o psoraleno, considerado mais tóxico que a xantotoxina, normalmente
prescrita pelos médicos para tratamento de doenças de pele. O uso de fitoterápicos
contendo furanocumarinas no tratamento de distúrbios menstruais pode ser
considerado de alto risco se for considerada a relação risco-benefício, pois se
acredita que sejam indicados pelas propriedades anticoagulantes das cumarinas
presentes nas plantas da formulação. Realizou-se também o estudo do perfil
cromatográfico e dosagem de furanocumarinas em plantas presentes nas
formulações dos medicamentos, utilizando tanto amostras adquiridas no comércio
como amostras identificadas.
xii

18. ABSTRACT
The phytoterapy constitutes a form of medical therapy that notably have
been growing in the last years, creating the necessity to guarantee the effectiveness,
security and quality of phytomedicines. The present study has the development of
methodologies for the determination HPLC of furanocoumarins in phytomedicines.
Four oral solutions, three capsules and three tablets, all formulated using species of
Dorstenia or Brosimum among others associations, were analyzed. Seven of them
are indicated for the treatment of menstrual irregularities and disturbances related to
menopause. The other three are used for the treatment of vitiligo. Only one of the
medicines showed the information on the presence of furanocoumarin in its
composition. The optimized methods were validated according to the International
Conference of Harmonization, showing good specificity, accuracy, the inter- and
intra-day precision and linearity. The inter-equipment study was performed using GC-
FID for oral solutions and GC-MS for capsules and tablets. They did not displayed
significant statistic differences. Due to the great variety in the formulations of the
medicines used in the development and validation of the methods, it is suggested
that they can be used for analysis of psoralen, bergapten and 5-[3-(4,5-Dihydro-5,5-
dimethyl-4-oxo-2-furanyl)-butoxy]-7H-furo[3-2-g][1] benzopyran-7-one in the
formulation of other phytomedicines found at commerce. The study of the
chromatographic profile of medicines was evaluated in isocratic and gradient runs by
HPLC-UV. Furanocoumarins were detected in nine of the medicines analyzed. The
lack of knowledge of the presence of these substances in most of the analyzed
products offers risks to the public health. Moreover, psoralen was the furanocoumarin
found in the largest amount. Psoralen is considered more toxic than xanthotoxin,
which is normally prescribed by doctors on the treatment of skin illnesses. If we
consider the relation risk-benefit on the treatment of menstrual riots, the use of
phytomedicines containing furanocoumarins can be of high risk, since it is believed
that they are indicated because of the anticoagulation properties of coumarins found
on the plant’s formulation. The study of the chromatographic profile and dosage of
furanocoumarins in the plants found at the medicines’ formulation was also made,
using identified samples and samples acquired at commerce.
xiii

19. Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1. Introdução Geral
A fitoterapia, uma forma de terapia medicinal, tem crescido notadamente
nestes últimos anos, ao ponto que, atualmente, o mercado mundial de fitoterápicos
gira em torno de aproximadamente 22 bilhões de dólares1.
As plantas medicinais representaram, durante séculos, a única fonte de
agentes terapêuticos para o homem. No início do século XIX, com o
desenvolvimento da química farmacêutica, as plantas passaram a representar a
primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos.
Atualmente, 25% dos medicamentos prescritos nos países industrializados são
originários de plantas e 120 substâncias de origem natural são obtidas a partir de
cerca de 90 espécies de plantas utilizadas na terapia moderna. De fato, os produtos
naturais estão envolvidos no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas 2.
A partir de 2001, houve um ressurgimento do interesse nas plantas como
fonte de novos agentes terapêuticos. Grandes companhias farmacêuticas
aumentaram suas pesquisas com extratos de plantas para descobrir novas
substâncias ativas. Existem na Terra aproximadamente 350.000 espécies de
plantas, mas apenas uma pequena porcentagem foi investigada do ponto de vista
fitoquímico, e um número ainda menor de frações derivadas dessas plantas foi
analisada do ponto de vista farmacológico3.
Na União Européia (sobretudo na Alemanha, França e Bélgica, países
com maior tradição de consumo de fitoterápicos), o rigor da legislação e vigilância
sanitária sobre os fitoterápicos é praticamente similar à exercida sobre os demais
medicamentos. Os consumidores vêem os fitoterápicos como uma alternativa
terapêutica menos agressiva ao organismo que um similar sintético, mas exigem de
um fitoterápico a mesma qualidade (garantia de autenticidade, da presença do teor
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 1
Medicamentos Fitoterápicos.

20. Introdução
correto de princípios ativos, de boas condições de conservação e outros) buscada
nos medicamentos sintéticos4.
No Brasil, as plantas medicinais são consideradas “remédios de baixo
custo”, o que no país é encarado como sinônimo de má-qualidade4. Grande parte
das espécies vegetais utilizadas pela população do Brasil não possui ação
farmacológica comprovada, estudo químico realizado e nem mesmo estudos
toxicológicos5.
As plantas medicinais estão sujeitas a variações de sua composição
química como alteração do teor de princípios ativos ou surgimento de novas
substâncias devido a diversas variáveis a que estão dispostas durante seu
crescimento (fatores genéticos, climáticos, ecológicos etc.), sua coleta (época, etc.),
secagem (temperatura, tempo, etc.), armazenamento e processo de extração.
Devido à grande variabilidade na composição química das plantas medicinais, há a
necessidade de padronização dos fitoterápicos4.
Um fitoterápico padronizado é o que apresenta teor conhecido dos
princípios ativos e se enquadra dentro de critérios estabelecidos para a planta
medicinal em questão. Apresenta substâncias “marcadoras” características, mas
também não apresentam substâncias estranhas3,4 O ideal para elaboração de um
fitoterápico é o uso de, no máximo, uma ou duas drogas ou extratos vegetais, tendo
estes ação farmacológica e toxicidade conhecidas5.
As principais fraudes e/ou problemas na qualidade dos fitoterápicos são:
substituição de uma determinada espécie por outra semelhante, que pode não ter
efeitos farmacológicos similares; adulteração de parte ou do todo da planta por outra
espécie ou com outro material; desconsideração do prazo de validade do
fitoterápico; contaminação exógena com micotoxinas, metais pesados ou
pesticidas4. O uso de análises cromatográficas, utilizando o cromatograma como a
“impressão digital” de uma determinada amostra, pode ajudar na identificação de
amostras autênticas e auxiliar na identificação de possíveis compostos utilizados em
uma adulteração da mesma3.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 2
Medicamentos Fitoterápicos.

21. Introdução
1.2. Furanocumarinas
As cumarinas (Figura 1) são metabólitos secundários muito comuns
presentes em plantas, sendo encontradas também em fungos e bactérias,
totalizando 800 diferentes estruturas determinadas. Estruturalmente, são lactonas do
ácido о-hidroxi-cinâmico (2H-1-benzopiran-2-onas), sendo o representante mais
simples a cumarina (1,2-benzopiranona)7.
Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas.
Dentro da classe de cumarinas, encontram-se as furanocumarinas. Estas
substâncias são formadas pela condensação de um anel furânico com um núcleo
cumarínico8 e podem ser de ocorrência natural ou sintéticos9. Estes metabólitos
podem ser também fitoalexinas, já que sua formação é muitas vezes induzida na
planta em resposta a um estímulo, particularmente pela infecção por fungos 10.
Furanocumarinas têm várias atividades biológicas importantes como:
analgésica, antiinflamatória, antibacteriana, antiviral, anticoagulante, além dos bem
conhecidos efeitos fotosensibilizantes11. São também interessantes porque são
usadas como um probe em biologia molecular e química dos ácidos nucléicos9.
As furanocumarinas têm sido usadas desde tempos remotos no
tratamento de doenças de pele como a psoríase, micoses fúngicas, dermatites e
eczema. Embora a utilização de plantas contendo furanocumarinas para propósitos
medicinais datem de 2000 a.C., atualmente o aumento no uso destas substâncias na
medicina tem sido ligado à alta incidência de câncer de pele e outras desordens,
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 3
Medicamentos Fitoterápicos.

22. Introdução
assim como trocas entre cromátides irmãs, mutação gênica e aberrações
cromossômicas em humanos12.
As furanocumarinas, como a maioria das cumarinas, são substâncias que
absorvem fortemente energia na região do ultravioleta (UV) e, por isso, são
altamente reativas sob incidência de luz. A faixa de comprimento de onda para essa
fotorreatividade situa-se entre 300 e 400 nm (UVA). Após a absorção do fóton, as
furanocumarinas formam um estado tripleto excitado, que pode reagir com
moléculas, tais como as bases nitrogenadas do DNA ou com o oxigênio no estado
fundamental. Disso resulta a formação de oxigênio singlete ou radicais tóxicos, como
os radicais superóxido ou hidróxi. Essas moléculas podem reagir com DNA, RNA,
proteínas e lipídios, ocasionando lesões nas células que os contêm. As
furanocumarinas têm especial habilidade em se ligar à bases pirimídicas do DNA
causando mutações12.
Furanocumarinas lineares, são compostos fotosensibilizantes comumente
empregados em dermatologia (oral ou topicamente), que associadas com irradiação
ultravioleta A (UVA) são usadas no tratamento de doenças de pele 13. Psoraleno,
bergapteno (também denominado 5-metoxipsoraleno ou 5-MOP), e xantotoxina
(também denominado 8-metoxipsoraleno ou 8-MOP) são exemplos de
furanocumarinas (Figura 2).
Os distúrbios cutâneos de maior importância tratados com psoralenos
são: o vitiligo (um distúrbio de pigmentação devido à perda de melanócitos da
epiderme) e a psoríase (caracterizada pela proliferação aumentada das células
epidérmicas)14.
A combinação dos elementos: psoralenos + UVA é conhecida como
terapia PUVA13. Dependendo da dose, esta ligação pode levar tanto à morte da
célula como à replicação, síntese e reparo do DNA 15,16. O fotosensibilizador
geralmente mais usado é xantotoxina (8-MOP)17.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 4
Medicamentos Fitoterápicos.

23. Introdução
Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas.
A xantotoxina pode também interagir com o DNA na presença de UVA,
formando fotoprodutos que causam a inibição da síntese de DNA celular. Acredita-se
que este mecanismo pode explicar o efeito benéfico do PUVA nas desordens
proliferativas como psoríase13. Na terapia PUVA, várias células são afetadas,
inclusive linfócitos circulantes no sangue periférico, promovendo alívio de muitas
doenças que são associadas a desordens imunológicas15.
Além das furanocumarinas já citadas, a isopimpinelina (5,8-
dimetoxipsoraleno) e o 4,5,8-trimetilpsoraleno também podem intercalar-se com o
DNA na presença de luz UV18.
Dentre as furanocumarinas, o 4,5,8-trimetilpsoraleno é considerado o
mais fototóxico19,20, seguido por psoraleno, bergapteno e xantotoxina 21, enquanto
isopimpinelina não é considerada uma furanocumarina fototóxica e também é
considerada muito menos reativa22.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 5
Medicamentos Fitoterápicos.

24. Introdução
Apesar do tratamento com a utilização de psoralenos (fotoquimioterapia
ou PUVA) ter importante atividade terapêutica, os pacientes estão sujeitos a
indesejáveis efeitos colaterais, tanto a curto prazo (eritema, hiperpigmentação,
genotoxicidade) como a longo prazo (catarata, risco de câncer de pele) 9, o que têm
feito médicos e pacientes relutantes ao seu uso 23. Mesmo 15 anos após a
interrupção do tratamento não há significante decréscimo do risco de
desenvolvimento de câncer de pele24.
A exposição à luz ultravioleta deve ser atentamente supervisionada, pois
existem relatos de casos de queimaduras de 6-40% do corpo em crianças com
vitiligo que estavam em tratamento com óleo meladinina (mistura de 8-MOP e 8-
isoamileno-oxi-psoraleno) devido à exposição não supervisionada ao Sol enquanto
brincavam ao ar livre25. Outros casos de queimaduras de 90-95% do corpo de jovens
pelo uso indiscriminado de furanocumarinas no intuito de adquirir um rápido
bronzeamento26. Foram relatados também, casos de desenvolvimento de lesões
bolhosas na pele após a exposição de um indivíduo ao óleo aromaterapêutico de
bergamota (que contém bergapteno)27 em sauna, seguida de exposição à radiação
UVA em salão de bronzeamento28.
Quantidades baixas de furanocumarinas, como 18 ppm, podem causar
lesões, dependendo das condições de exposição à luz UV 22. Por esta razão, é muito
importante conhecer precisamente os níveis de furanocumarinas em medicamentos
fitoterápicos e plantas utilizadas pelo ser humano.
Na literatura podemos encontrar métodos de dosagem de
furanocumarinas no plasma27 e na derme de pacientes que utilizam a
fotoquimioterapia13. Também já estão descritos métodos validados de quantificação
de furanocumarinas em pomadas, cremes29, soluções tópicas30 e alguns métodos
não validados de dosagem em plantas31,32 e seus decoctos22.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 6
Medicamentos Fitoterápicos.

25. Introdução
1.3. Plantas contendo furanocumarinas
Várias famílias de plantas são conhecidas como produtoras de
furanocumarinas, dentre as quais podemos citar: membros da família Apiaceae
(aipo, por exemplo), Rutaceae (plantas cítricas, por exemplo) e Moraceae 11. Os
gêneros da família Moraceae são Sorocea, Clarisia, Maclura, Pseudolmedia,
Helicostylis, Naucleopsis, Brosimum, Dorstenia, Ficus, Coussapoa, Pourouma e
Cecropia 33. Os medicamentos fitoterápicos estudados neste trabalho apresentam os
gêneros Dorstenia e Brosimum em suas composições.
1.3.1. Dorstenia
O gênero Dorstenia Linne (Moraceae) é representado por 170 espécies
em todo o mundo34,35, sendo 37 espécies brasileiras. Quase todas as espécies do
gênero Dorstenia são herbáceas e campestres, geralmente crescendo em locais
sombreados33. Há espécies que se destacam pela beleza ornamental e outras pelos
rizomas aromáticos. A maioria se concentra no Brasil-sudeste à beira dos riachos e
grotões rochosos36.
A maior parte é conhecida pela medicina popular como “carapiá” ou
“figueirilha”31. Estas plantas estão distribuídas nas regiões subtropicais do mundo e
são conhecidas pela habilidade de sintetizar psoraleno, bergapteno, isobergapteno,
pimpinelina e isopimpinelina37.
O gênero Dorstenia é usado em terapia de plantas medicinais em muitos
países na África e América do Sul e Central como antiofídico e anti-reumático, além
do uso em infecções e doenças de pele30,38. O estudo das toxinas fotoativadas
revelou a ocorrência de fototoxinas em todas as espécies de Dorstenia investigadas.
Furanocumarinas foram isoladas em trabalhos com rizomas/raízes ou plantas brutas
de Dorstenia da América Latina como: Dorstenia contrajerva39,40, D. brasiliensis41, D.
asaroides31, D. brynoniifolia37,42, D. lindeniana43,34, D. vitifolia, D. tubicina41,32,
D.cayapiaa7, D. heringeri44, D.excentria, D.drakena e D. lindeniana43 assim como
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 7
Medicamentos Fitoterápicos.

26. Introdução
das espécies africanas D.psilurus45 e D.barnimiana46 e D. poinsettifolia47.
Furanocumarinas também foram encontradas em galhos de D. prorepens35 e D.
gigas34 e em folhas de D. gigas34.
Estruturalmente, as furanocumarinas em Dorstenia apresentam-se pouco
diversificadas, havendo predomínio de furanocumarinas angulares ou lineares
simples tais como bergapteno, psoraleno, isopimpinelina, pimpinelina, isobergapteno
etc. As exceções são três furanocumarinas preniladas encontradas em D. cayapiaa -
5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona,
D.brasiliensis – 5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2-
g][1]benzopiran-7-ona (Figura 3, estrutura a) e o análogo insaturado 5-[[3-(4,5-diidro-
5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil) 2-butenil-]oxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona (Figura
3, estrutura b)41 e D.contrajerva – 4-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-
butil]oxi]-7H-furo[3,2-g][1]benzopiran-7-ona43.
Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis.
Estudos fitoquímicos do gênero relatam ainda a ocorrência de
cardenolídios48, triterpenos37, ácidos graxos42, esteróides41, diferentes
benzofuranos46 e vários flavonóides geranilados e prenilados49,50.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 8
Medicamentos Fitoterápicos.

27. Introdução
1.3.1.1. Dorstenia multiformes
Dorstenia multiformes é a espécie descrita na Farmacopéia Brasileira51
com os nomes de carapiá, caapiá e contra-herva. Segundo esta, a parte usada é o
rizoma, para produção de extrato fluído de carapiá.
Na literatura52 podemos encontrar também a denominação de cayapiá-
preto para a espécie. Possui caule curto, rasteiro e em parte subterrâneo,
densamente estipulado, folhas longo-pecioladas, muito variáveis na forma, flores
pequeninas e frutos castanhos. Encontrada da Bahia até o Rio Grande do Sul e
Minas Gerais.
Possui variedades, como D.multiformes var. arifolia, ceratosanthes,
ficifolia, pinnatifida e ramosa36. Não há trabalhos na literatura sobre a composição
química da espécie D. multiformes. A espécie pode ser encontrada53,54 como
sinonímia científica de Dorstenia brasiliensis.
1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis
É uma planta herbácea perene, nativa do Brasil, encontrada em São
Paulo, Goiás, Mato Grosso, Bahia, Pernambuco e, principalmente, em Minas Gerais
e Rio Grande do Sul. Conhecida como cayapiá verdadeiro, é a mais importante do
gênero, sob o ponto de vista terapêutico e a única admitida na farmacopéia de vários
países52. Tem folhas compridas e de bordas arredondadas, nascendo bem próximas
ao solo, e flores pequenas, divididas em masculinas e femininas, dispostas em forma
de pendão55. Rizoma cilíndrico, ovóide, curto, aromático, fibriloso, amarelado 52.
Possui variedades, como D. brasiliensis var. mayor, palustris, tomentosa e typica36.
D. brasiliensis é conhecida no Brasil como carapiá, caiapiá ou contra-erva
e as cascas de sua raiz têm sido usadas na medicina popular para o tratamento de
doenças do sistema digestivo, febre tifóide56,55, como antiofídico, nas leucorréias, em
enfermidades na pele, em irregularidades menstruais como dismenorréia e
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 9
Medicamentos Fitoterápicos.

28. Introdução
amenorréia55,57 e na solidificação de ossos fraturados52, em mistura com a taiuiá
(Trianosperma tayuya)55.
Há apenas dois trabalhos sobre o isolamento de furanocumarinas da
espécie41,56 que identificaram psoraleno, bergapteno, 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-
oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona, 5-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-
4-oxo-2-furanil)-2-butenil-]oxi]-7h-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona), (2’S,3’R)-3’-
hydroximarmesina 4’-O-β-D-glucopiranosida, (2’S)-marmesin 4’-O-α-L-
rhamnopiranosil (1→6)-O-β-D-glucopiranosida, (2’S,3’R)-3’-hydroximarmesina, 2’-(1”-
hidroxi-1”-metiletil)-psoraleno, 7-hydroxicumarina, 3-O-β-glucosilsitosterol, sucrose,
esteróides, diterpenóides e triterpenóides das raízes/rizomas da espécie. Os
triterpenóides (ácidos dorstênicos A e B) isolados de D. brasiliensis, apresentaram
moderada citoxicidade sobre células da leucemia (L-1210 e HL-60)56.
O nome popular “carapiá” também é encontrado referindo-se a outras
duas espécies: Cordia superba Cham.58 da família Boraginaceae, encontrada no Rio
de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo e Sida macrodon52, da família das Malváceas.
A primeira espécie também pode ser encontrada com os nomes de árvore de ranho
e grão de galo e a segunda, como malva do campo.
1.3.2. Brosimum gaudichaudii
Brosimum gaudichaudii é uma espécie conhecida como “mamica de
cadela”. Utilizada em doenças de pele devido às furanocumarinas59. É nativa do
cerrado brasileiro, com uma ampla distribuição por todo o Brasil central 60. Análises
da casca da raiz de B. gaudichaudii identificaram derivados dos ácidos cinâmicos e
diidrocinâmico, dez cumarinas (dentre elas psoraleno, bergapteno, xantiletina,
luvangetina e (+)-(2’S,3’R)-1’-hidroximarmesina) (Figura 4), uma chalcona, os
esteróides: β-sitosterol e 3-β-O-β-D-glicopiranosil- β-sitosterol e o triterpeno β-
amirina61,62.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 10
Medicamentos Fitoterápicos.

29. Introdução
Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii.
Extratos da casca do caule de B.gaudichaudii mostraram atividade
mutagênica no teste com Salmonella typhimurium e em células do ovário de hamster
chinês (CHO)63.
O nome popular “mamica de cadela” também é encontrado referindo-se
às espécies Zanthoxylum rhoifolium Lam. e Zanthoxylum riedelianum Eng. da família
Rutaceae. Ambas são também conhecidas como mamica-de-porca e tembetari58.
1.4. Medicamentos Fitoterápicos
Os medicamentos presentes no mercado contendo plantas do gênero
Dorstenia são quase que exclusivamente compostos pela espécie Dorstenia
multiformes. As indicações são diversas, devido os vários usos populares da espécie
e as diversas indicações descritas nos medicamentos que a contêm:
 os diversos usos populares do carapiá: antiofídico, tratamento de
irregularidades menstruais, ossificação de ossos fraturados etc;
 a associação da espécie a diversas outras na constituição dos
medicamentos: D. multiformes está presente em soluções orais para inibição do
crescimento de pêlos (associada à Foeniculum vulgaris, Trigonella foenum-graecum
e Plumeria lancifolia), em soluções orais antitussígenas (associada à Passiflora
alata), em formulações homeopáticas reguladoras do sistema nervoso (associada a
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 11
Medicamentos Fitoterápicos.

30. Introdução
Carica pagaya, Acanthus volubilis e Mimosa virginalis), para tratamento das
irregularidades menstruais, tensão pré-menstrual e inflamação do útero e ovários,
(associada à Plumeria lancifolia), e em soluções orais e cápsulas para tratamento
das irregularidades menstruais e corrimentos vaginais (associada à Plumeria
lancifolia e Davilla rugosa) e contra os efeitos da menopausa (associada à Plumeria
lancifolia, Erythrina mulungu, Cereus grandiflorus).
Nenhum dos medicamentos fitoterápicos pesquisados, que contêm
Dorstenia, informava sobre a presença de furanocumarinas ou mesmo a
possibilidade de fotosensibilização pela exposição ao Sol durante o uso do
medicamento ou de seus efeitos tardios pelo uso prolongado. A maior parte deles
informava apenas as partes de cada planta utilizada e algumas classes de
substâncias presentes tais como flavonóides, saponinas, taninos etc. Apenas alguns
dos medicamentos informavam a presença de cumarinas em algumas das plantas
presentes e sua ação anticoagulante, sem se referir, como já dito, a
furanocumarinas.
1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados
1.4.1.1. Davilla rugosa
Davilla rugosa Poiret (Dilleniaceae) é conhecida no Brasil como cipó-
caboclo. Cresce em zonas tropicais e subtropicais no Brasil, Cuba, Nicarágua, Peru
e Chile. A espécie é mundialmente empregada como antiinflamatório, anti-úlcera,
purgativo, estimulante, afrodisíaco e droga tônica64. Segundo a medicina popular,
suas folhas possuem propriedades adstringentes, diuréticas e colagogas, a raiz
purgativa e drástica, os ramos excelente diurético e as sementes, violento efeito
emético-catártico55.
Flavonóides tais como miricetina, quercetina, miricetina-3-O-β-D-
ramnosideo, quercetina-3-O-β-D-ramnosideo e canferol foram isolados das folhas e
o alcalóide cafeína foi isolado das sementes. Estudos dos efeitos das frações do
extrato hidroalcoólico do caule de D.rugosa em lesões gástricas em ratos sugerem a
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 12
Medicamentos Fitoterápicos.

31. Introdução
atividade antiúlcera64. As frações mais polares do extrato da planta sugerem efeito
estimulante na atividade motora65. Um efeito ansiolítico foi observado com o extrato
hidroalcoólico inteiro65.
O Doliscarpus pubens, uma espécie das Dileniáces, é chamada de cipó-
caboclo-venenoso ou cipó-vermelho sendo seus frutos tóxicos e sua casca útil
contra febres palustres55.
1.4.1.2. Plumeria lancifolia
O gênero Plumeria originou-se da América Central e suas espécies são
mundialmente distribuídas em países tropicais66. Plumeria lancifolia Müll
(Apocynaceae) é conhecida na medicina popular como “agoniada” sendo
empregada como febrífuga, emenagoga, purgativa 67, auxiliar da concepção e
regularizador da menstruação55. O extrato mostrou possuir atividade antiúlcera.
Desta espécie foram isolados iridóides, uleína e dimetoxiaspidospermina 67.
1.4.1.3. Erythrina mulungu
Erythrina mulungu Mart., vulgarmente conhecida como mulungu,
mulungu-coral, tiricero, capa-homem e suína-suinã, é uma planta espinhenta
encontrada em Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo e na floresta
latifoliada semidecídua da bacia do Paraná58. Na medicina popular, o extrato da
casca é usado em banhos para acalmar a excitação do sistema nervoso e também
para combater insônias. O cozimento das cascas é utilizado em bronquites
asmáticas e nas inflamações do fígado e do baço 57. Extrato hidroalcoólico de
Erythrina mulungu apresentou efeitos antinociceptivos em ratos68. Foram isolados
alcalóides69.
1.4.1.4. Cereus jamacaru
Cereus jamacaru, da família das Cactáceas, é um arbusto que vegeta em
Pernambuco e outros Estados do norte do Brasil. É vulgarmente conhecida como
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 13
Medicamentos Fitoterápicos.

32. Introdução
jamacaru, urumbeva e cumbela. É utilizada pela medicina popular em tratamento de
problemas nas vias respiratórias, como bronquites, afecções pulmonares e tosses
persistentes. Usa-se também contra o escorbuto e febres gástricas. Externamente,
em cataplasmas, é utilizada no tratamento de úlceras e tumores70.
1.5. Legislação de Fitoterápicos
O primeiro ato normativo de expressão referente às plantas medicinais no
Brasil, foi a publicação da primeira edição da Farmacopéia Brasileira 51, que refletia
as características da terapêutica da época, fundamentada em fitoterápicos e
produtos biológicos, oficializando a utilização de plantas medicinais como matéria-
prima farmacêutica71.
A profissão farmacêutica e seu exercício foram normatizados através do
Decreto nº 19606 de 19 de janeiro de 1931. Este decreto foi regulamentado pelo
Decreto nº 20377 de 08 de setembro do mesmo ano, que marca o início formal das
atividades de vigilância sanitária no país71.
Com relação aos procedimentos de registro de medicamentos, o Decreto
nº 19606 estabeleceu exigência de licença, que corresponde hoje ao registro, no
órgão nacional de saúde antes de serem entregues ao consumo; estabeleceu ainda
uma classificação dos medicamentos em oficiais e especialidades farmacêuticas,
liberando os primeiros da necessidade de licença, sem definir o que seriam tais
produtos, quais os limites dessa liberalização e os critérios ao controle administrativo
e de qualidade. Determinava também, a apreensão e inutilização de plantas
medicinais sob classificação botânica falsa ou desprovidas de ação terapêutica.
Esses decretos estabeleciam o comércio direto de plantas medicinais de aplicações
terapêuticas com o consumidor, como privativo de farmácias e ervarias71.
No Brasil, houve então a constituição do Grupo de Estudos de Produtos
Fitoterápicos (GEPFITO) em 1994, posteriormente alterada pela CONAFIT em 1998.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 14
Medicamentos Fitoterápicos.

33. Introdução
O primeiro trabalho do GEPFITO foi a publicação de normatização de registro de
produtos fitoterápicos por meio de uma proposta aberta de consulta pública em
1994, que resultou na Portaria SVS nº 6 de 31 de janeiro de 1995 71.
A Portaria SVS nº 6 conceituou os fitoterápicos como medicamentos
preparados exclusivamente por matérias ativas oriundas de plantas medicinais,
obedecendo integralmente aos requisitos técnicos para a preparação farmacêutica e
o uso terapêutico; padronizou os conceitos e termos técnicos próprios da área;
estabeleceu padronização para qualquer fitoterápico, a cerca dos critérios de
segurança e eficácia baseado em modelos farmacológicos adequados; fixou normas
de qualidade para a matéria-prima, processamento e para o produto final. No pedido
de registro, a empresa deveria apresentar as técnicas desenvolvidas para o controle
de qualidade72.
A Portaria SVS nº 6 foi aprimorada em alguns de seus itens pela SVS nº
1.029/98, cuja maior finalidade é o procedimento diferenciado ao registro de
produtos fitoterápicos tradicionais71.
A norma vigente, durante o desenvolvimento deste trabalho, sobre o
registro de medicamentos fitoterápicos, foi a RDC nº 17 de 25 de fevereiro de
200073, que dispõe sobre registro de medicamentos fitoterápicos, não só nacionais,
mas também importados. Regulariza o conceito de medicamento fitoterápico e
define como devem ser industrializados, embalados e comercializados em nosso
país. Apresenta o regulamento técnico que trata de medicamentos fitoterápicos
novo, tradicional e com base na similaridade; da isenção de registro; da revalidação
do registro de fitoterápicos registrados até 31 de janeiro de 1995; da embalagem e
bula dos medicamentos. Para os medicamentos fitoterápicos importados, estabelece
que devem cumprir os mesmos requisitos previstos neste regulamento e na
legislação específica em vigor.
O ano de 2002 apresentou várias consultas públicas74 que sugeriam
mudanças no que se refere à legislação brasileira de medicamentos fitoterápicos. Na
Consulta Pública nº 59 de 12 de agosto, sugeriu-se alterações na Resolução nº
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 15
Medicamentos Fitoterápicos.

34. Introdução
17/2000. As seguintes Consultas Públicas: nº 61/2002 e nº 84/2002 sugeriam
atualização da normatização de registro de medicamentos fitoterápicos junto ao
Sistema de Vigilância Sanitária. A Consulta Pública nº 84/2002 é por sua vez,
complementada pelas Consultas Públicas nº 87/2002 e nº 88/2002 que trazem guias
para a realização de alterações, inclusões e notificações pós-registro de
medicamentos fitoterápicos e um guia para notificação de Lotes-Piloto de
medicamentos. Estas consultas públicas, publicadas em outubro de 2002, não se
transformaram em legislações em função das grandes controvérsias ainda
existentes sobre o assunto. A Consulta Pública nº 94 de 6 de novembro de 2003
resultou na Resolução RDC nº48 de 16 de março de 2004 74.
A Resolução RDC nº 4875 visa atualizar a normatização do registro de
medicamentos fitoterápicos. Este regulamento abrange medicamentos cujos
princípios ativos são exclusivamente derivados de drogas vegetais. Segundo a
resolução, não é objeto de registro ou cadastro planta medicinal ou suas partes,
após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada,
triturada ou pulverizada.
Segundo a nova resolução, a partir de 360 dias contados de sua
publicação, todos os testes referentes a controle de qualidade (quando
terceirizados), deverão ser executados em instituições credenciadas no sistema
REBLAS - Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde ou por empresas fabricantes
de medicamentos que tenham certificado de BPFC (Certificado de Boas Práticas de
Fabricação e Controle emitido pela ANVISA) atualizado e satisfatório. A partir desta
data, a apresentação dos resultados destes testes será exigida pela ANVISA no
registro e na renovação do registro.
Estabelece também um regulamento técnico mais criterioso para os
fitoterápicos quanto a medidas antecedentes ao registro, ao pedido de registro e
medidas pós-registro. Em relação à legislação anterior, a nova resolução em
demonstra mais detalhamento nas exigências sobre controle de qualidade química,
estudos de toxicidade, eficácia e indicações terapêuticas dos medicamentos
fitoterápicos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 16
Medicamentos Fitoterápicos.

35. Introdução
1.6. Técnicas Instrumentais de Análise
As aplicações da cromatografia cresceram de modo explosivo nos últimos
cinqüenta anos e isto se deve não somente ao desenvolvimento de novos tipos de
técnicas cromatográficas, mas também à necessidade crescente dos cientistas de
melhores métodos para caracterizar misturas complexas76.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é a mais usada de todas
as técnicas analíticas de separação devido a sua sensibilidade, fácil adaptação para
determinações quantitativas acuradas, sua adequação à separação de espécies
não-voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a
substâncias de grande interesse para indústria, para muitos campos da ciência e
para o público. Exemplos desses materiais incluem: aminoácidos, ácidos nucléicos,
pesticidas, drogas e muitas substâncias inorgânicas76.
Na última década, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi
uma das técnicas mais utilizadas para análise e isolamento de produtos naturais a
partir de matrizes complexas, por exemplo, extratos de plantas. A CLAE tem sido
utilizada de maneira rotineira como “piloto” para o isolamento em escala preparativa
de produtos naturais pela otimização das condições experimentais, pelo controle de
diferentes frações obtidas durante o isolamento e pelo controle da pureza final dos
compostos isolados3.
Detectores baseados em absorção de luz ultravioleta (UV), fluorescência,
índice de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam boa detecção e
sensibilidade. Uma desvantagem, apesar do custo menor desses detectores em
relação aos detectores de espectrometria de massas (EM) e ressonância magnética
nuclear (RMN), é a pouca ou nenhuma informação estrutural fornecida 3.
A introdução das técnicas de acoplamento, tais como CLAE-UV equipada
com detector com arranjo de fotodiodos (CLAE/UV-DAD) e o acoplamento com a
espectrometria de massa (CLAE-EM) e ressonância magnética nuclear (CLAE-RMN)
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 17
Medicamentos Fitoterápicos.

36. Introdução
proporcionou um real avanço na identificação estrutural, em linha, de produtos
naturais3.
A cromatografia em fase gasosa (CG) é muito utilizada na realização de
separações com relação a sistemas bioquímicos, complexos orgânico-metálicos ou
orgânicos, constituídos de espécies voláteis ou de espécies que podem reagir e
formar produtos voláteis76. Dentre os detectores mais usados estão o de
condutividade térmica, ionização por chama e captura de elétrons. O detector de
ionização por chama é excelente na análise destes compostos orgânicos em nível
de traços devido à seletividade por esses compostos77.
A cromatografia em fase gasosa (CG) possui detectores universalmente
aplicáveis como detectores de ionização por chama e de condutividade térmica 78. Os
detectores da CLAE não possuem esta característica.
Uma tendência importante é o acoplamento com a espectrometria de massa
(CG-EM)76, apesar de seu alto custo se comparado com outros detectores
empregados nesta técnica.
1.7. Validação de Métodos Analíticos
A validação de um método analítico é realizada para garantir que uma
metodologia analítica seja exata, específica, reproduzível e robusta dentro de uma
faixa de aplicação em que o analito será analisado 79,80. Assegura credibilidade às
medidas obtidas80,81,82. Tem se tornado requisito indispensável para publicação de
novas metodologias, tendo alguns periódicos83 publicado os parâmetros mínimos de
validação.
A validação permite que a transferência de um método entre laboratórios
ocorra da forma mais satisfatória82, pois avalia a influência de parâmetros como
mudança de temperatura, pH, analistas, equipamentos, entre outros parâmetros no
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 18
Medicamentos Fitoterápicos.

37. Introdução
resultado final de uma análise. Os mesmos princípios gerais podem ser aplicados
com sucesso em métodos cromatográficos e não cromatográficos84.
As normas internacionais, nacionais e sistemas de qualidade destacam a
importância da validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de
validação para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso
pretendido85.
Para validação de métodos analíticos, guias da US Food and Drug
Administration (FDA)86,87,88, United States Pharmacopeia (USP)89 e Internacional
Conference on Harmonization (ICH)90,91 entre outros, fornecem a descrição dos
parâmetros principais.
O uso da validação no desenvolvimento de novas metodologias tem
aumentado consideravelmente em todo o mundo. No Brasil, o aumento do interesse
pela validação gerou a necessidade da formulação pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária –ANVISA- da Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003 79,
que descreve os parâmetros a serem avaliados para a validação de métodos
analíticos e bioanalíticos para determinação de fármacos e suas impurezas,
podendo ser aplicado também a métodos imunológicos e microbiológicos.
1.7.1. Desenvolvimento do método
Um protocolo de validação inicia-se com a definição do objetivo do
80
método : quais os resultados pretendidos (identificação, quantificação, etc.); qual
matriz será utilizada (comprimido, ar, plasma, etc.); possíveis interferentes e quais os
níveis de exatidão, precisão, sensibilidade, limite de detecção requeridos.
Durante o desenvolvimento do método, identifica-se a (s) substância (s)
de interesse na matriz e otimiza-se um método de extração. No processo de
otimização, várias substâncias extratoras, formas e tempos de extração são
testados. Após obtenção do método otimizado, realiza-se o procedimento de
recuperação que avalia a eficiência do processo de extração. A recuperação
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 19
Medicamentos Fitoterápicos.

38. Introdução
consiste em submeter a amostra com adição de diferentes concentrações da
substância de interesse (analito) ao método otimizado para avaliar a porcentagem de
recuperação. Uma boa recuperação do método garante que o analito seja analisado
na totalidade de sua massa presente na amostra79,93,94.
Para o monitoramento dos testes é necessário qualificar um equipamento
analítico que seja compatível com a avaliação do analito (absorção atômica,
cromatógrafo líquido, entre outros). Após a escolha do equipamento, realiza-se o
teste de adequação do sistema que estabelece se os dados obtidos terão qualidade
aceitável. No caso da cromatografia líquida de alta performance, por exemplo, o fator
de capacidade, repetitividade de injeção, retenção relativa, resolução, fator de cauda
e pratos teóricos devem ser avaliados80.
Para a avaliação da estabilidade das soluções analíticas são testadas
soluções de amostras e padrões durante 24 horas em condições de estocagem. A
concentração das soluções de amostras e padrões não deve variar mais que 2% em
relação a amostras frescas e seus cromatogramas devem ser equivalentes 80.
1.7.2. Parâmetros de validação
Os principais parâmetros de validação são: especificidade, exatidão,
precisão, linearidade, faixa de aplicação, sensibilidade, limite de detecção, limite de
quantificação e robustez. A seguir são descritos os parâmetros de validação de
metodologias, segundo as principais referências citadas em artigos científicos.
1.7.2.1. Especificidade / seletividade
Especificidade/seletividade é a capacidade de um método diferenciar um
composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas,
intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da
matriz)93,94,95,96. Na literatura podemos encontrar uma diferenciação dos dois termos:
especificidade refere-se a um método que produz resposta somente para um único
analito, e seletividade diz respeito a um método que produz resposta para um
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 20
Medicamentos Fitoterápicos.

39. Introdução
determinado número de substâncias químicas que podem ou não ser
82,94 79,86
distinguíveis . Algumas normas trazem os dois termos juntos ou optaram por
um deles88,89,90.
A seletividade / especificidade pode ser dividida em duas categorias:
análises qualitativas e análises quantitativas. Para análise qualitativa é necessário
demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas
relacionadas que podem estar presentes79,90. Para análise quantitativa e análise de
impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados
obtidos de amostras fortificadas com quantidades apropriadas de impurezas ou
excipientes e amostras não fortificadas, para demonstrar que o resultado do teste
não é afetado por esses materiais. Estas comparações devem incluir amostras
armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor, umidade, hidrólise
ácida/básica, oxidação) 79,90,95.
A determinação da especificidade é extremamente importante durante a
validação de um método não cromatográfico, porque este não contém uma fase de
separação que garanta a não interferência dos excipientes. Os métodos não
cromatográficos contam com diferenças intrínsecas às propriedades físicas ou
químicas, para garantir sua capacidade de determinar a concentração da substância
em exame, mesmo em amostras contendo misturas complexas84.
Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias
para garantir a separação dos picos cromatográficos. A utilização de testes de
pureza de pico (por exemplo, com auxílio de detector de arranjo de fotodiodos ou
espectrometria de massas) é interessante para demonstrar que o pico
cromatográfico é atribuído a um só componente79,90,95.
1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ)
Limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra
que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições
experimentais estabelecidas79,81,82,88,93,94,95. É um parâmetro determinado
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 21
Medicamentos Fitoterápicos.

40. Introdução
principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas e produtos de degradação,
sendo expresso em concentração do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/v,
partes por milhão) na amostra79.
Várias metodologias para a determinação do LQ são possíveis,
dependendo do procedimento ser instrumental ou não. Os modos atuais mais
aceitáveis são descritos a seguir:
a) baseado na avaliação visual: é determinado pela análise de várias
amostras com quantidades conhecidas de analito, estabelecendo-se o nível mínimo
em que pode ser quantificado com aceitável exatidão e precisão. É utilizado
principalmente para métodos não instrumentais90.
b) baseado na relação sinal-ruído (Figura 5): pode ser aplicado somente
em procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. É determinado pela
comparação da medida dos sinais de amostras com baixas quantidades conhecidas
de analito, estabelecendo-se a mínima concentração em que o analito pode ser
quantificado com confiabilidade. A relação sinal-ruído típica é 10:1 (concentração do
analito que produz sinal 10 vezes superior ao ruído da linha de base) 79,90,95.
Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1.
c) baseado no desvio padrão da resposta e no coeficiente angular da
curva de calibração: o LQ pode ser expresso como LQ = 10 (DP/S), onde S é a
inclinação da curva de calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode
ser determinado com base no DP do branco79,82,90,95, no DP da análise de amostras
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 22
Medicamentos Fitoterápicos.

41. Introdução
com baixas quantidades de analito84, no DP do residual da linha de regressão90,95 ou
no DP da intersecção do y das linhas de regressão79,90,95. Para este último cálculo do
DP, são necessárias, no mínimo, três curvas de calibração contendo concentrações
do analito próximas ao suposto limite de quantificação79. A relação 10 DP é
associada a um erro de 30% com 99% de probabilidade97.
O termo limite observado de quantificação (LOQ) pode ser encontrado em
análises de resíduos98. Um outro termo encontrado na literatura é o limite inferior de
quantificação (LIQ) utilizado em análises de matrizes biológicas79,88.
1.7.2.3. Limite de detecção (LD)
Limite de detecção é a menor quantidade do analito em uma amostra que
pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada, sob as condições
experimentais estabelecidas.
Pode ser determinado com base na avaliação visual 79,90, na relação sinal-
ruído, cuja relação sinal-ruído típica é 2:188,89,90 ou 3:179,89,90 ou ainda, pode ser
expresso como LD = 3,3 (DP/S)90, onde S é o coeficiente angular da curva de
calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode ser determinado pelos
mesmos métodos descritos para LQ. A relação LD = 3 (DP/S) também é encontrada
na literatura79. Na determinação pela relação 3,3 ou 3 DP/S, o resultado será um
verdadeiro reflexo do limite de detecção se S for bem definido e a intersecção for
essencialmente zero82.
1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação
Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente
proporcionais à concentração do analito num dado intervalo de variação 81,90,94,95,96.
Intervalo é a faixa de variação entre o maior e o menor nível de analito
que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o
método descrito79.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 23
Medicamentos Fitoterápicos.

42. Introdução
Para análise da linearidade do método, recomenda-se o número de cinco
79,90
concentrações em replicata (n>2) nas seguintes faixas mínimas de variação:
para doseamento, 80 a 120% da concentração do teste 79,86,90; para teste de
impurezas, do nível esperado até 120% do limite máximo especificado; em análises
de resíduos, de ½ a 5 LOQ98; em testes de uniformidade de conteúdo: 70 a
130%79,90 e em ensaios de dissolução: ± 20% em relação à faixa de variação do
teste79,90. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem
controladas79,86,90.
A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico (Figura
6) que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito 79,88. A
equação da reta é definida por: y = ax + b 93, onde y= resposta do analito, x=
concentração, a= coeficiente angular e b= coeficiente linear.
Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo.
A avaliação da linearidade pode ser realizada de diversas formas
dependendo da natureza da análise:
a) pela construção de curva de calibração a partir de soluções-padrão
(padrão externo) de analito em diferentes concentrações81 (Figura 6). Relaciona a
resposta do aparelho com a massa do analito 81,94 sem levar em conta a interferência
da matriz94.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 24
Medicamentos Fitoterápicos.

43. Introdução
b) pela construção da curva de calibração com adição do analito à matriz,
a qual elimina a interferência da matriz e de outras etapas do método 94. O analito
pode ser adicionado na etapa inicial do método ou na fase final, imediatamente
antes da realização da medida pelo equipamento. Geralmente é utilizada quando há
impossibilidade de se obter uma matriz branca (sem a presença do analito) (Figura
7)81,94. Neste caso, o intercepto da curva no eixo y (coeficiente linear) corresponde
ao sinal do analito presente na matriz sem adição81.
Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito
c) pela construção da curva de calibração com adição de padrão interno.
A curva é construída a partir de soluções-padrão de analito em diferentes
concentrações, nas quais é adicionada uma concentração fixa de padrão interno 81,94
(Figura 8), cuja medida permite comparação relativa com o analito. O padrão interno
é uma substância de tempo de retenção próximo e boa resolução em relação ao
analito, alta pureza e estabilidade81,94.
Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 25
Medicamentos Fitoterápicos.

44. Introdução
Havendo relação linear aparente, os resultados deverão ser tratados por
métodos estatísticos apropriados para determinação da soma residual dos
quadrados mínimos da regressão linear, do coeficiente de correlação, da intersecção
com o eixo y, do coeficiente angular e desvio padrão relativo79,90.
Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal
estimada por regressão linear.
A regressão linear (método dos mínimos quadrados) (Figura 9) é uma
forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos
experimentalmente93, geralmente realizada por programas computacionais.
O coeficiente de correlação (r) expressa a relação de x e y na curva, em
que os valores ideais esperados são 1 e –1 , ou seja, quanto mais próximo da
unidade maior a relação, maior a probabilidade de existir uma relação linear definida.
Caso os valores tendam a zero, indica que não há relação linear 15. Alguns critérios
mínimos aceitáveis são r= 0,9979 e  0,99986. A maioria dos artigos avalia a
linearidade pelo coeficiente de determinação: o quadrado do coeficiente de
correlação (r2)99,100,101.
1.7.2.5. Sensibilidade
Pode-se definir sensibilidade como sendo a capacidade de um método
distinguir, com determinado nível de confiança, duas concentrações próximas 81,86,94.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 26
Medicamentos Fitoterápicos.

45. Introdução
Na literatura há uma divergência sobre o conceito de sensibilidade que
pode ser definido pela determinação dos limites de quantificação e detecção 81,96 ou
pela coeficiente angular da curva de calibração 82,94,95. Segundo os defensores do
segundo conceito, sensibilidade não é uma referência ao conceito atual de limite de
detecção e quantificação.
Pode ser utilizada como parâmetro comparativo entre dois métodos.
Quanto maior for o coeficiente angular da curva de calibração, maior a sensibilidade
do método82,94.
1.7.2.6. Exatidão
Exatidão é o grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio
dos resultados e o valor de referência aceito79,81,82,86,93,94,95,96. O cálculo é realizado
pela fórmula79:
%Exatidão = Concentração média experimental 100%
Concentração de referência aceita
ou em termos de inexatidão94:
%Inexatidão = Concentração obtida – Concentração esperada 100%
Concentração esperada
Os termos exatidão e acurácia são utilizados como sinônimos, sendo o
termo exatidão mais comum na literatura brasileira. Apenas uma das literaturas
consultadas designa acurácia como a medida que combina precisão e exatidão82.
Várias formas de avaliação da exatidão estão disponíveis: análise de
amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos
dados com o valor verdadeiro79,90,95; comparação dos dados do método novo com os
de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida 79,90,95; recuperação
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 27
Medicamentos Fitoterápicos.

46. Introdução
de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes brancas 79,90,95 e
recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes com o
analito79,90. Este último é mais utilizado quando há impossibilidade de obter matriz
branca, como por exemplo, em medicamentos fitoterápicos.
%Recuperação = Concentração obtida 100%
Concentração adicionada
Recomenda-se que a análise da exatidão seja realizada com nove
determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3
concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada79,90,96. Na literatura
podemos encontrar os níveis de concentração baixo, médio e alto indicados como
80, 100 e 120% da concentração usual da amostra 86. A concentração recomendada
para avaliação da exatidão varia de acordo com as matrizes ou quantidade de
analito na amostra.
Na avaliação de recuperação de resíduos de pesticidas por exemplo,
recomenda-se que as três concentrações sejam: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ 98. Valores
de exatidão de 98 a 102% são recomendados para métodos de doseamento,
inclusive de produtos farmacêuticos96. No caso de dosagem de impurezas: 0,1%
absoluto ou 10% relativo80. Para resíduos: 70 a 120% de exatidão98. Em análises
bioanalíticas considera-se valores  15%, ou  20% no LQ79,88.
1.7.2.7. Precisão
Precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma
série de medidas do método79,82,93. É calculada pelo coeficiente de variação (CV):
%CV = desvio padrão das medidas 100%
concentração média determinada
Pode ser avaliada em três níveis: repetitividade, precisão intermediária e
reprodutividade.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 28
Medicamentos Fitoterápicos.

47. Introdução
 Repetitividade: expressa a precisão entre os resultados de medidas do
mesmo método para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo
operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de
tempo79,82,86,90,93,94,95. Deve ser avaliada pela análise de amostras em 3
concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a
100% da concentração teórica da amostra79,80,90,95. Amostras autênticas são
utilizadas para evitar diferenças devido à interação entre o analito e a matriz 94. Em
análises bioanalíticas utiliza-se 3 concentrações em quintuplicata79,80,90. A
repetitividade do instrumento também deve ser avaliada através de 10 injeções de
uma mesma amostra86.
Para doseamento recomenda-se que a variação seja  2% e a precisão
do instrumento  1%80. No caso de impurezas,  5% no LQ e a precisão do
instrumento 10%80. Em análise de resíduos valores até 20% são aceitos98.
 Precisão intermediária expressa a precisão dos resultados obtidos
usando o mesmo laboratório, mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou
equipamentos diferentes79,81,82,86,90,95,96. Para a determinação da precisão
intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas
diferentes79,94. O uso de amostras autênticas também é indicado90.
 A reprodutividade expressa a precisão dos resultados obtidos pelo
mesmo método e mesma amostra, por diferentes operadores, usando diferentes
equipamentos em diferentes laboratórios79,82,90,93,94,95. Geralmente avaliada em
estudos colaborativos, aplicados à padronização de metodologia analítica, por
exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias 79,90. O valor máximo
aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a
concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não
se admitindo valores superiores a 5%79. Em análises bioanalíticas, o valor limite é
15%, sendo no LIQ, valores menores ou iguais a 20%79,88.
Alguns aspectos da precisão, como precisão intermediária e
reprodutividade, estão intimamente associados à robustez do método 82.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 29
Medicamentos Fitoterápicos.

48. Introdução
1.7.2.8. Estabilidade
A estabilidade é um parâmetro de validação muito pouco descrito em
normas de validação de metodologias analíticas79,89,90. No entanto, a maior parte das
publicações nessa área avalia a estabilidade em seus métodos, sendo inclusive
solicitado para publicação de métodos de validação em alguns periódicos 83.
Nas normas para métodos bioanalíticos79,88, a estabilidade é de
fundamental importância para validação de um método. A estabilidade do analito em
líquidos biológicos depende de suas propriedades químicas, da matriz biológica e do
material de acondicionamento utilizado.
As condições de realização dos ensaios de estabilidade devem reproduzir
as reais condições de manuseio e análise das amostras: estabilidade após ciclos de
congelamento e descongelamento, estabilidade de curta duração, estabilidade de
longa duração, estabilidade pós-processamento e a estabilidade das soluções
estoque padrão79,88.
1.7.2.9. Robustez
Robustez é a capacidade de um método não ser afetado por uma
pequena e deliberada modificação em seus parâmetros. Se os resultados do método
ou outras medidas são sensíveis à variação dos parâmetros, estes devem ser
adequadamente controlados e algumas precauções devem ser incluídas na sua
documentação79,95. Quando as alterações estiverem dentro de limites que produzam
resultados aceitáveis, estas alterações devem ser incorporadas ao procedimento do
método, que é então, considerado robusto94.
Os principais parâmetros que podem resultar em variação na resposta do
método são: no preparo das amostras: estabilidade das soluções analíticas, tempo
de extração; em espectrofotometria: variação do pH da solução, temperatura,
diferentes fabricantes de solventes; em cromatografia líquida: variação do pH da
fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 30
Medicamentos Fitoterápicos.

49. Introdução
de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel; e em cromatografia gasosa: diferentes
lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, velocidade do gás de arraste.
1.7.3. Parâmetros de validação requeridos
O tipo de método e seu respectivo uso determinam quais parâmetros
devem ser investigados95. Para métodos de doseamento, cuja informação
quantitativa é desejada, não há necessidade de avaliar LQ ou LD, pois normalmente
o analito está presente em altos níveis na amostra. Em doseamento de impurezas, o
LQ é necessário devido à pequena quantidade destas substâncias nas amostras.
Para ensaios-limite, sendo a informação quantitativa desnecessária, requer-se
apenas o LD, e não o LQ. Em testes de identificação é necessário apenas avaliar se
o método é específico para o analito.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 31
Medicamentos Fitoterápicos.

50. Objetivos
2. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivos:
 o desenvolvimento de metodologias de extração de furanocumarinas para dez
medicamentos fitoterápicos comercializados em farmácias de manipulação,
drogarias e ervanários em forma de soluções orais, cápsulas e comprimidos;
 a validação das metodologias desenvolvidas segundo os parâmetros de
validação da International Conference on Harmonization (ICH)90,91; e
 a realização de estudos preliminares para análise dos demais constituintes dos
medicamentos fitoterápicos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 32
Medicamentos Fitoterápicos.

51. Parte Experimental
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Materiais e Equipamentos Utilizados
3.1.1. Materiais utilizados
Nas análises por cromatografia em camada delgada (CCD) foram
utilizadas placas de sílica gel 60 f 254 da Merck. Os padrões de psoraleno,
bergapteno, isopimpinelina, isobergapteno e 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-
furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona (denominado no trabalho como
DT) utilizados foram isolados e purificados por nosso grupo de pesquisa (psoraleno
98,89%, bergapteno 99,01% , DT 97,45% , pimpinelina 98,01% e isopimpinelina
97,34% de pureza) empregando técnicas cromatográficas e ressonância magnética
nuclear.
3.1.2. Solventes utilizados
Os solventes orgânicos utilizados nas extrações de plantas e como
eluentes nas análises em CCD foram solventes de grau P.A. Os solventes
empregados no desenvolvimento das metodologias para os medicamentos
fitoterápicos e aqueles empregados em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM foram grau
CLAE (Darmstadt, Germânia). A água utilizada foi tratada pelo sistema Milli-Q
(Millipore).
3.1.3. Equipamentos utilizados
 Ultra-som de mesa marca Thornton, tipo T14 modelo C/T;
 Luz UV de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm;
 Centrífuga: Excelsa Baby I modelo 206;
 Balança analítica: Scientech SA120 (precisão 0,001g).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 33
Medicamentos Fitoterápicos.

52. Parte Experimental
 Sistema Milli-Q MILLIPORE (CPNQ004D2)
 CLAE-UV
Modelo: Shimadzu LC-6AD.
Detector: UV-Vis de comprimento de onda fixo – Modelo SPD-6AV (Shimadzu)
Coluna: fase reversa octadecyl Shim-pack CLC-ODS (25cm x 4,6mm x 5 μm) e pré-
coluna (2,5 cm X 4,6 mm) de mesma fase da coluna
Eluente: água – acetonitrila 45:55 v/v; fluxo: 1mL / minuto
Comprimento de onda: 223 nm
 CG-DIC
Modelo: Varian
Coluna: 5% fenil dimetil polisiloxano LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 μm)
Detector: DIC, temperatura 280 C
Injetor: 280 C
Split: 1:20
Gás de arraste: Hidrogênio com fluxo de 0,8 mL / minuto
 CG-EM
Modelo: Shimadzu 17
Coluna: LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 μm)
Injetor Split/Splitless: razão de Split 1:20
Temperatura da interface: 280 C
Temperatura do injetor: 280ºC
Detector seletivo de massa, modelo: Shimadzu QP 5000
Modo de ionização: impacto de elétrons
Modo de aquisição de dados: Scan
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 34
Medicamentos Fitoterápicos.

53. Parte Experimental
Intervalo: 55-550 u
Gás de arraste: Hélio com fluxo de 0,6 mL / minuto
Tabela 1 - Programação de temperatura utilizada em CG-DIC e CG-EM29
Temperatura (C) Velocidade de aquecimento (C/min) Tempo de isoterma (min)
150,0 10,0 -
240,0 5,0 -
280,0 - 20,0
min, minutos.
3.2. Medicamentos Fitoterápicos
Dentre todos os medicamentos presentes no mercado que possuíam
Dorstenia em sua composição, foram selecionados para o estudo sete
medicamentos (denominados no trabalho como A, B, C, D, E, F e G). Estes
medicamentos são indicados para tratamento de distúrbios menstruais ou sintomas
da menopausa. Dentre eles, apenas os medicamentos A e B continham apenas uma
informação em suas bulas da presença de cumarinas em D. multiformes.
Foram também incluídos no estudo, três medicamentos indicados para
vitiligo (denominados no trabalho como H, I e J). Os medicamentos H e I não tinham
indicação das plantas de sua constituição, sendo apenas designados como produto
natural. O medicamento J constituído por Brosimum gaudichaudii e vitaminas foi o
único medicamento selecionado que apresentava informação sobre presença de
furanocumarinas, no caso o bergapteno, na bula. Dois deles apresentavam
indicação para vitiligo em folheto explicativo ou bula (H e J respectivamente) e o
outro fitoterápico (I) foi selecionado, pois estava sendo usado por um paciente com
vitiligo por indicação de leigos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 35
Medicamentos Fitoterápicos.

54. Parte Experimental
Dos medicamentos fitoterápicos (Tabela 2): quatro estavam na forma de
soluções orais hidroalcoólicas (A, B, C e D), três em cápsulas (E, F, G) e três em
comprimidos (H, I e J). Todos foram comprados em farmácias de manipulação,
drogarias e ervanários sem a necessidade de receita médica. Os medicamentos A e
B são de um mesmo fabricante, o mesmo ocorrendo para C e F. Os demais são de
diferentes fabricantes.
As soluções orais contêm as seguintes tinturas ou misturas de tinturas: A
(Dorstenia multiformis - Davilla rugosa - Plumeria lancifolia 1:2:1 v/v/v), B (Dorstenia
multiformis - Plumeria lancifolia 1:1 v/v), C (Dorstenia multiformis - Cereus jamacaru -
Plumeria lancifolia - Erythrina mulungu 2:5:1:2 v/v/v/v), D (Dorstenia multiformis).
As cápsulas e comprimidos contêm diversas composições: E (extratos
secos de Dorstenia multiformes - Plumeria lancifolia, 1:1 m/m). F (extratos secos de
Dorstenia multiformis - Plumeria lancifolia - Cereus jamacaru - Erythrina mulungu,
2:5:1:2 m/m/m/m), G (pó do rizoma de Dorstenia brasiliensis), H (produto natural) e I
(produto natural), J (seiva concentrada de Brosimum gaudichaudii - nicotinamida
(fator PP) - cloridrato de tiamina (vitamina B1) - cloridrato de piridoxina (vitamina B6),
400:20:3:3 m/m/m/m).
As soluções orais A e B têm registro regular na Agência Nacional de
Vigilância Sanitária102. A solução oral C e a cápsula F nunca receberam registro e
são comercializados apenas com o nº de protocolo. O fabricante solicitou o
arquivamento do processo em 2002, pois não tinha condições naquele momento de
responder às exigências formuladas, quanto à eficácia. A solução oral D saiu do
mercado durante o processo de validação do método e não possuía registro. O
comprimido J possui um registro no ano de 1980, mas não se pode informar se
continua ativo, sem uma consulta direta ao processo. Os demais fitoterápicos
discutidos no trabalho não possuem registro na ANVISA.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 36
Medicamentos Fitoterápicos.

55. Parte Experimental
Tabela 2 - Informações sobre denominações, lotes, data de fabricação, data de
validade e cidade de aquisição dos medicamentos.
Tintura Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição
A1 1015 10/2000 10/2003 São Paulo, Brasília
A2 0335 10/2000 10/2003 Goiânia
A3 1016 10/2000 10/2003 Rio de Janeiro
B1 1235 02/2001 02/2004 São Paulo, Goiânia, Rio de Janeiro
B2 1192 02/2001 02/2004 Brasília
C1 1751 10/2002 10/2005 Campo Grande
C2 0951 04/2001 04/2004 Campo Grande
C3 1442 01/2002 01/2005 Campo Grande
D 11281 04/1999 04/2002 Campo Grande
Cápsulas Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição
E1 3505 12/2001 12/2004 Campo Grande
E2 3402 04/2001 04/2004 Campo Grande.
E3 3234 07/2000 07/2003 Campo Grande
F1 1865 01/2002 01/2005 Campo Grande
F2 1971 02/2002 02/2005 Campo Grande
F3 1864 01/2002 02/2005 Campo Grande
G1 1068 DA: 08/2000 SI Rio de Janeiro
G2 1076 DA: 08/2000 SI Rio de Janeiro
G3 1436 DA: 08/2000 SI Rio de Janeiro
Comprimidos Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição
H1 SIL 02/2000 SI Campo Grande
H2 SIL 06/2000 SI Campo Grande
H3 SIL 08/2000 SI Campo Grande
I1 SIL DA: 032000 SI Coxim
I2 SIL DA: 04/2000 SI Coxim
I3 SIL DA: 07/2000 SI Coxim
J1 688 10/2001 10/2003 Campo Grande
J2 772 06/2002 06/2004 Campo Grande
SI, sem indicação de lote; DA, data de aquisição.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 37
Medicamentos Fitoterápicos.

56. Parte Experimental
Durante o desenvolvimento do trabalho foram utilizados três lotes de cada
medicamento. Apenas do medicamento B foram utilizados dois lotes, pois houve
dificuldades de obter novos lotes deste, mesmo em outros estados.
3.3. Desenvolvimento das Metodologias
3.3.1. Soluções orais
Uma avaliação inicial das tinturas por cromatografia em camada delgada
(CCD) foi empregada para avaliar presença de psoraleno, bergapteno, pimpinelina
ou isobergapteno. Para isso, as tinturas A, B, C e D foram diluídas na proporção de
proporção 1:2,5 v/v com álcool etílico absoluto e permaneceram por 5 minutos em
ultra-som para facilitar a solubilização de material em suspensão. Foram testados
eluentes com diversas capacidades de eluição: tolueno/álcool etílico, tolueno/acetato
de etila/ácido acético e tolueno/éter/ácido acético. Como revelador foram utilizadas
luz UV (254 e 336 nm) e p-anisaldeído com aquecimento a 80ºC por 3 minutos.
Realizou-se também uma análise direta preliminar das soluções orais por
CLAE-UV em condição cromatográfica otimizada30 para quantificação de
furanocumarinas (descrita no item 3.1.3.) após filtração das amostras em filtro Millex
de 0,45 μm.
A extração líquido – líquido foi avaliada por ser rápida e pelas amostras
serem matrizes líquidas. Para isso, várias amostras de 5 mL das soluções orais A, B,
C e D foram colocadas separadamente em tubos de ensaio de 13 mL e a cada um
destes tubos foram adicionados 7 mL de um dos seguintes solventes: clorofórmio,
diclorometano e éter etílico. As extrações foram realizadas em banho de ultra-som
durante 30 minutos. Houve formação de duas fases com os solventes clorofórmio e
diclorometano, que ficaram mais bem definidas com 10 minutos de centrifugação. As
fases superiores e as fases inferiores foram secas em capela ou sob atmosfera de
nitrogênio. Os resíduos foram solubilizados em metanol, filtrados em filtro Millex 0,45
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 38
Medicamentos Fitoterápicos.

57. Parte Experimental
μm e seus volumes completados para 10 mL em balão volumétrico para serem
analisados por CLAE-UV.
Para otimizar o tempo em banho de ultra-som realizou-se o mesmo
experimento com clorofórmio variando-se o tempo de ultra-som em: 0, 10, 30 e 50
minutos.
Para garantir a extração das furanocumarinas em sua totalidade, as fases
superiores foram transferidas para tubos de ensaio, onde foram adicionados 5 mL de
clorofórmio. A reextração foi realizada em banho de ultra-som por 10 minutos
formando duas fases, que foram separadas por 10 minutos de centrifugação. As
fases inferiores da primeira e segunda extração de cada amostra de solução oral
foram então reunidas para quantificação das furanocumarinas. As fases superiores
resultantes da segunda extração foram utilizadas para estudos posteriores. Todos os
procedimentos foram realizados em triplicata.
3.3.2. Cápsulas e comprimidos
Várias amostras de 100 mg dos medicamentos F e J foram colocadas
separadamente em tubos de ensaio de 13 mL e a cada um deles foram adicionados
10 mL de um dos seguintes solventes ou misturas de solventes: metanol,
clorofórmio, metanol-clorofórmio em proporções 7:3, 3:7, 9:1, 1:9, diclorometano,
metanol-diclorometano 7:3 e metanol -acetato de etila 7:3. As extrações foram
realizadas em banho de ultra-som durante 15 minutos e então o material foi
centrifugado por 10 minutos. O resíduo foi reextraído mantendo-se o mesmo
solvente, tempo em ultra-som e centrifugação. Os dois extratos foram reunidos e o
solvente evaporado até a secura em capela ou sob atmosfera de nitrogênio. Este
resíduo foi solubilizado em 2 mL de metanol, filtrado através de filtro Millex 0,45 m
e seu volume completado para 5 ou 10 mL em balão volumétrico para a
quantificação das furanocumarinas por CLAE-UV.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 39
Medicamentos Fitoterápicos.

58. Parte Experimental
3.4. Validação das Metodologias
Os parâmetros de validação do método para determinação de
furanocumarinas em soluções orais e do método em cápsulas e comprimidos foram
avaliados segundo o International Conference on Harmonisation90.
Para o preparo das soluções-padrão utilizadas nos procedimentos de
validação, cada padrão foi pesado em balança analítica e transferido para um balão
volumétrico com metanol para preparação das soluções-padrão.
O preparo das amostras com adição de padrão seguiu a técnica descrita a
seguir: foram adicionadas diferentes alíquotas da solução-padrão - dependendo da
concentração final de padrões desejada (item 3.4.1.) - a 5 mL das amostras de A, B
e C e a 100 mg de cada cápsula ou comprimido para avaliar a recuperação. Em
cápsulas e comprimidos, foi adicionado também, padrão de DT. As soluções orais
com adição de padrões permaneceram 10 minutos em ultra-som e as cápsulas e
comprimidos permaneceram 20 minutos em contato com as alíquotas para
homogeneização inicial antes do início da extração.
A avaliação dos parâmetros de validação foi realizada conforme descrito a
seguir:
3.4.1. Recuperação
A eficiência da extração (recuperação) foi determinada pela adição de
psoraleno, bergapteno e DT (padrões) em baixa, média e alta concentração nas
amostras analisadas.
A cada amostra de solução oral foi adicionada diferentes concentrações
do padrão, sendo que as concentrações finais de cada padrão nas amostras foram:
4, 40, 100 e 200 μg mL-1. Nas cápsulas e comprimidos as concentrações finais
foram: 1, 20 e 40 μg mL-1. Os experimentos foram realizados em quintuplicata (n= 5).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 40
Medicamentos Fitoterápicos.

59. Parte Experimental
3.4.2. Limites de detecção e quantificação.
Os limites de detecção foram determinados pela injeção (n=5) de
soluções-padrão das furanocumarinas (10 μL cada), reduzindo a concentração dos
padrões até detectar um pico com três vezes a relação sinal/ruído. A concentração
correspondente foi considerada como a mínima concentração detectável. Os limites
de quantificação foram determinados pela mesma metodologia, sendo considerado
como a concentração correspondente ao pico cromatográfico com dez vezes a
relação sinal/ruído.
3.4.3. Curva de calibração
A avaliação do conteúdo dos analitos nas soluções orais foi realizada por
calibração externa. As furanocumarinas em estudo foram dissolvidas separadamente
em metanol para obter soluções estoque adequadamente diluídas para
concentrações na faixa de 1-600 µg mL-1 de psoraleno e de 1-400 µg mL-1 de
bergapteno, para o método de soluções orais. Para o método de cápsulas e
comprimidos, as soluções estoque eram adequadamente diluídas para
-1
concentrações na faixa de 1-50 µg mL para psoraleno, bergapteno e DT. Alíquotas
de 10 diluições para cada padrão foram analisadas por CLAE, sendo que cada
determinação foi realizada cinco vezes.
Nas análises interequipamento das soluções orais por CG-DIC, a faixa de
concentrações empregada foi de 10-100 µg mL-1 de psoraleno e de 5-90 µg mL-1 de
bergapteno. Para as análises de cápsulas e comprimidos por CG-EM, a faixa de
concentrações foi a mesma utilizada em CLAE-UV para estas amostras.
Para cada solução-padrão foi obtido um cromatograma correspondente e
construído um gráfico relacionando os valores das áreas dos picos e as
concentrações das soluções. A regressão linear foi realizada para determinar os
coeficientes de correlação. Os parâmetros da equação (coeficiente angular e linear)
de cada curva de calibração foram usados para obter os valores de concentração
das amostras desconhecidas de soluções orais. Amostras com a concentração de
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 41
Medicamentos Fitoterápicos.

60. Parte Experimental
analito excedendo a curva de calibração foram reanalizadas após a apropriada
diluição.
3.4.4. Linearidade
A linearidade do método foi determinada para avaliar se a resposta do
método otimizado permanecia linear com concentrações diferentes de analitos nas
matrizes dentro do intervalo da curva de calibração. Foi determinada pela análise de
cada solução oral, cápsula e comprimido com adição de quantidade conhecida dos
padrões de interesse em quatro concentrações. Cada determinação foi realizada
cinco vezes (n= 5). Alíquotas (10l) foram analisadas por CLAE como descrito
anteriormente. Para cada amostra foi obtido um cromatograma correspondente e
construído um gráfico relacionando os valores das áreas dos picos e as
concentrações das amostras de solução oral com adição de padrão. A regressão
linear foi realizada para determinar os coeficientes de correlação.
3.4.5. Acurácia e precisão
A acurácia ou exatidão do método foi avaliada pela realização de análises
em cada solução, cápsula ou comprimido. O cálculo foi realizado pela fórmula da
inexatidão usando a fórmula descrita na página 27.
A precisão do método foi avaliada em níveis de repetitividade, precisão
intermediária e análise interequipamento. A precisão foi expressa como a
percentagem do coeficiente de variação (CV) das medidas usando a fórmula descrita
na página 28.
A repetitividade do método foi avaliada nas análises intradia das soluções
orais, cápsulas e comprimidos. Para precisão intermediária foram avaliadas as
análises interdia dos medicamentos.
A avaliação da acurácia e precisão intradia foi realizada em três
experimentos durante o período de um dia, cada um contendo a análise de cada
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 42
Medicamentos Fitoterápicos.

61. Parte Experimental
solução oral (n=4), cápsula e comprimido (n=5) com adição dos padrões em três
concentrações diferentes (4, 40 e 200μg/mL de solução oral e 1, 20 e 40 μg/mL para
cápsulas e comprimidos). A avaliação da acurácia interdia difere da anterior, pois é
realizado um experimento por dia, durante três dias diferentes, consecutivos ou não.
Foi cinco (n=5) o número de determinações neste experimento para todas as
amostras.
A análise interequipamento dos métodos foi realizada para avaliar os
resultados em diferentes equipamentos: CG-DIC para o método de soluções orais e
CG-EM para o método de cápsulas e comprimidos, empregando uma condição
cromatográfica otimizada29.
3.4.6. Estabilidade
A estabilidade das soluções-padrão e dos padrões nas soluções de
análise dos medicamentos (condição otimizada) foi testada a 22ºC (temperatura de
trabalho), 4ºC e –5ºC (temperatura de estocagem). Para o método para cápsulas e
comprimidos, as temperaturas empregadas foram 22ºC, 4ºC e –5ºC. As amostras
com adição de padrão foram analisadas imediatamente após a preparação e a
seguir foram estocadas.
A estabilidade foi definida como sendo menos que 5% de perda da
concentração da solução inicial dos analitos nas amostras analisadas.
3.4.7. Especificidade
Para avaliar a especificidade do método, duas outras diferentes
furanocumarinas (pimpinelina e isobergapteno), comumente encontrados no gênero
Dorstenia foram avaliadas pelo mesmo procedimento descrito para CLAE-UV e CG-
DIC e CG-EM, e os tempos de retenção foram comparados com os dos analitos de
interesse nas soluções orais, cápsulas e comprimidos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 43
Medicamentos Fitoterápicos.

62. Parte Experimental
3.5. Outros Estudos Realizados
3.5.1. Novas condições cromatográficas
Para a condição isocrática de estudo do perfil cromatográfico foram
testados os seguintes eluentes: água-metanol-acetonitrila 55:0:45; 30:0:70;
50:25:25; 50:30:20, 60:20:20; 70:15:15; 64:18:18; 64:22:14; 64:25:15; 64:20:16;
64:16:20; 90:0:10; 53:47:0; 60:40:0 v/v/v; variando-se o fluxo de 0,5 mL a 1 mL /
minuto em uma absorbância fixa em 223 nm. Após a determinação do eluente e
velocidade de fluxo apropriados, foram testados quatro comprimentos de onda: 223,
254, 287 e 362 nm.
Para determinação de uma condição gradiente, duas condições foram
testadas. A primeira (G1) provinha de um aumento gradiente da relação entre os
solventes acetonitrila – água de 10:90 v/v para 65:35 v/v em 25 minutos, seguido de
um aumento de 65:35 v/v para 100:0 v/v em 3 minutos, mantendo-se por 5 minutos,
voltando à condição inicial em 10 minutos, totalizando um tempo de 43 minutos com
fluxo de 1 mL / minuto, com aquisição de 50 minutos. A segunda (G2) provinha de
um aumento gradiente da relação entre os solventes acetonitrila – água de 5:95 v/v
para 100:0 v/v em 50 minutos, voltando à condição inicial em 20 minutos, com
aquisição dos primeiros 50 minutos com fluxo de 1,2 mL / minuto. As análises foram
conduzidas no comprimento de onda de 223 nm.
3.5.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C.
A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos nas
soluções orais, 5 mL de cada amostra foram secos em capela ou sob atmosfera de
nitrogênio. A quantidade de enzima adicionada (1 mg) foi calculada a partir da
proporção material vegetal – volume da tintura final 1:5 m/v104.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 44
Medicamentos Fitoterápicos.

63. Parte Experimental
Os extratos secos foram inicialmente homogeneizados com 1,5 mL de
tampão acetato 0,1 mol/L (pH 5,0; 5mL) por 1 minuto em ultra-som. Em seguida 1,25
mg de β-Glucosidase foi adicionado às suspensões, sendo incubadas a 37ºC por 72
horas104. Após este período, foram adicionados 3,5 mL de álcool etílico de cereais
96º GL. Após uma rápida homogeneização do tubo de ensaio contendo a
suspensão, realizou-se todo o processo otimizado de extração, descrito
anteriormente, para soluções orais. As tinturas foram então analisadas em CLAE-UV
e seus perfis cromatográficos comparados com os das tinturas não hidrolisadas. Os
procedimentos de hidrólise foram realizados em triplicata.
3.5.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos
fitoterápicos
3.5.3.1. Material vegetal
Três espécimes diferentes de Brosimum gaudichaudii Trécul de porte
arbustivo foram coletados pelo mestrando em Botânica Dario Palhares da
Universidade de Brasília (UnB), nas proximidades do Campus desta Universidade. O
material do primeiro espécimex foi coletado em dezembro de 2002, do segundo y em
abril de 2003 e do terceiroz em outubro do mesmo ano. A identificação foi realizada
pela Prof. Dra. Conceição Eneida dos Santos Silveira e por Dario Palhares, ambos
da UnB. As exsicatas dos dois primeiros materiais encontram-se catalogadas e
depositadas no Herbário da Universidade de Brasília sob referências UB 12050, UB
12052. A exsicata do terceiro espécime está em processo de tombamento.
O material dos três espécimes foi separado em folhas, caule, raiz e então
seco em estufa com circulação de ar a 37ºC e em seguida armazenado em frascos
bem vedados, protegidos da luz. Algumas das amostras foram separadas em casca
e lenho da raiz e casca e lenho do caule. O látex liberado pelos espécimes após a
retirada das folhas foi coletado em frasco âmbar e em seguida, vedado e
armazenado em freezer.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 45
Medicamentos Fitoterápicos.

64. Parte Experimental
Nas amostras de Dorstenia coletadas pela Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima
Cardoso da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul em Piraputanga,
Aquidauana, Miranda, Bonito, Jardim, Campo Grande, Coxim e Rio Negro, no
período de 1996 a 2001 não foram constatadas a presença de Dorstenia brasiliensis
e Dorstenia multiformes. Dentre estas amostras coletadas na região, D. tubicina, D.
asaroides, D. vitifolia foram identificadas pelo Botânico Prof. Dr. Jorge Pedro Pereira
Carauta, do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.
Amostras de Dorstenia brasiliensisx foram coletadas em São Paulo, em
Mogiguaçu, em fevereiro de 1998 e identificadas pelo Prof. Dr. Jorge Pedro Pereira
Carauta.
Além das amostras identificadas, foram adquiridas no comércio de Campo
Grande, amostras vendidas como agoniada, cipó caboclo, carapiá e mamica de
cadela (Tabela 3).
Tabela 3 - Amostras de plantas adquiridas no comércio de Campo Grande.
Amostra Parte Lote Fabricação Validade
Agoniadax casca SI 01/2000 01/2003
Agoniaday casca SI DA: 09/2002 SI
Agoniadaz casca SI DA: 10/2002 SI
Cipó caboclox cipó SI SI 02/2004
Carapiáx rizoma SI DA: 12/2002 SI
y
Carapiá rizoma SI DA:12/2002 SI
Mamica de cadelax raiz SI DA:12/2002 SI
SI, sem indicação; DA, data de aquisição.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 46
Medicamentos Fitoterápicos.

65. Parte Experimental
3.5.3.2. Preparação das amostras
3.5.3.2.1. Preparação de amostras para determinação do comprimento de onda
Análises preliminares com algumas das plantas presentes nas
formulações dos medicamentos foram iniciadas com a preparação de extratos a
partir das amostras adquiridas no mercado. As tinturas de cipó caboclox, agoniadax e
carapiáx foram preparadas a partir da extração das drogas vegetais, na qual as
amostras foram deixadas em contato com álcool etílico 96º e com álcool etílico 65º
por 7 dias.
Foi realizada também uma análise inicial das amostras de agoniada 1, cipó
caboclox, carapiáx e mamica de cadelax, em condição isocrática para estudo do perfil
cromatográfico, nos comprimentos de onda 223, 254, 287 e 365 nm.
3.5.3.2.2. Preparação de extratos de agoniada
Cascas de agoniada estão presentes nas formulações dos medicamentos
A, B, C, E e F. Uma análise preliminar para comparação dos perfis cromatográficos
de amostras vendidas no mercado foi realizada através de dois experimentos. No
primeiro realizou-se a extração de três agoniadasx,y,z na qual as amostras foram
deixadas em repouso em contato com álcool etílico 95% na proporção de material
vegetal - solvente 2:10 m/v por 6 dias. Em outro, as mesmas amostras foram
deixadas em contato com álcool etílico absoluto na proporção material vegetal -
solvente 1:10 (m/v) por 2 dias com 30 minutos de ultra-som a cada dia. As amostras
foram analisadas em CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil
cromatográfico.
3.5.3.2.3. Preparação de extratos de Brosimum gaudichaudii
Realizou-se a extração de raiz, caule e folhas de B. gaudichaudiix, na qual
as amostras foram deixadas em contato com álcool etílico absoluto na proporção de
material vegetal – solvente 1:20 (m/v) por 2 dias, sendo mantidas durante 30 minutos
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 47
Medicamentos Fitoterápicos.

66. Parte Experimental
em ultra-som a cada dia. As amostras foram reextraídas duas vezes com clorofórmio
na proporção 1:10 (m/v). As tinturas foram secas em capela, solubilizadas em álcool
etílico, filtradas e seus volumes completados para 5 ou 10 mL em balão volumétrico.
O mesmo procedimento foi repetido em análises posteriores para casca e lenho da
raiz.
Para análise do látex de B. gaudichaudiix,y,z, gotas do material foram
coletadas no ponto em que as folhas eram retiradas do espécime. 500 mg de cada
látex foram colocados em tubo de ensaio e extraídos com 10 mL de clorofórmio por
10 minutos em ultra-som e então centrifugados por 10 minutos havendo a separação
de duas fases. Ambas as fases foram secas em capela. A cada uma delas foi
adicionado metanol, sendo mantidas por 10 minutos em ultra-som, filtradas e seus
volumes completados para 5 mL em balão volumétrico. As duas fases foram
analisadas em CLAE-UV na condição utilizada para quantificação de
furanocumarinas.
3.5.3.2.4. Preparação de extratos de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia
multiformes e Brosimum gaudichaudii
Realizou-se a extração das amostras de carapiáx,y, mamica de cadelax,
rizomas de D. brasiliensisx, raiz inteira de B. gaudichaudii1 e cascas das raízes de B.
gaudichaudiix,y,z, na qual foram deixadas em contato com álcool etílico absoluto na
proporção de material vegetal - volume de solvente 1:20 m/v por 2 dias, sendo
mantidas por 30 minutos de ultra-som a cada dia. As amostras foram reextraídas
duas vezes com clorofórmio na proporção 1:10 m/v. As tinturas foram secas em
capela e solubilizadas em metanol, filtradas e seus volumes completados para 5 ou
10 mL em balão volumétrico.
As amostras foram analisadas e seus perfis cromatográficos foram
comparados por CLAE-UV na condição utilizada para quantificação das
furanocumarinas.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 48
Medicamentos Fitoterápicos.

67. Parte Experimental
3.5.3.2.5. Preparação de tinturas por maceração e por percolação de Dorstenia
brasiliensis e Brosimum gaudichaudii
Para a preparação das tinturas de D. brasiliensis e B. gaudichaudii
utilizou-se então, álcool etílico de cereais 70º com a relação 1:5 entre quantidade de
amostra e volume da tintura final (m/v), utilizando dois processos de extração
descritos na Farmacopéia Brasileira103.
Para a percolação, 1,00g de rizoma de D.brasiliensisx e 1,00g de casca
da raiz de B.gaudichaudiiy ficaram inicialmente em contato com 3 mL de álcool etílico
de cereais 70º por 6 horas. Em seguida, as misturas foram extraídas por álcool
etílico de cereais 70º em percolador (15 cm de comprimento por 1 cm de largura),
produzindo 5 mL de percolado com um gotejamento de 20 gotas por minuto.
Para a maceração, 1,00g de rizoma de D.brasiliensisx e 1,00g de casca
de raiz de B.gaudichaudiiy ficaram em contato com 7 mL de álcool etílico de cereais
70º por 7 dias ao abrigo da luz. Durante este período, as misturas foram levemente
homogeneizadas. Após a filtração, os volumes foram completados para 5 mL, se
necessário.
3.5.3.2.6. Hidrólise de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii
1 mg de β-Glucosidase foi adicionado a uma suspensão contendo 500 mg
de rizoma de D.brasiliensisx e raiz de B.gaudichaudiiy,z em tampão acetato 0,1 mol/L
(pH 5,0; 5mL). As misturas foram incubadas a 37ºC por 72 horas104. Após a filtração,
foram obtidos a fase aquosa e o resíduo. A extração do resíduo foi realizada com 10
mL de álcool etílico absoluto, na qual foi deixado em contato com o solvente por 2
dias, com 30 minutos de ultra-som a cada dia, sendo reextraído duas vezes com 5
mL de clorofórmio. Os extratos provenientes do resíduo foram reunidos e secos em
capela. A extração da fase aquosa foi realizada pelo mesmo volume de clorofórmio
por 3 vezes, sendo as extrações reunidas e secas em capela. Os extratos
provenientes do resíduo e da fase aquosa foram solubilizados em metanol, filtrados
e seus volumes completados para 10 mL e analisados em CLAE-UV.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 49
Medicamentos Fitoterápicos.

68. Resultados e Discussão
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os cromatogramas obtidos por CLAE-UV em todas as condições
cromatográficas, por CG-DIC e por CG-EM possuem os números 1, 2 e 3 indicando
psoraleno, bergapteno e DT (Figura 10), respectivamente, quando presentes nas
amostras.
*
Figura 10 - Estrutura das substâncias analisadas
A análise em CLAE-UV, na condição empregada para quantificação,
mostrou uma boa separação dos picos dos compostos de interesse na linha de base
que poderiam ser analisados num intervalo de tempo satisfatório, menor que doze
minutos para soluções orais, cápsulas e comprimidos (Tabela 4). A análise em GC-
FID e CG-EM também mostrou uma boa separação dos picos dos compostos de
interesse na linha de base que poderiam ser analisados num intervalo de tempo
satisfatório, menor que 17 minutos (Tabela 4). As amostras A, B, E, G e I, que não
continham DT, puderam ser analisadas em tempo menor que 8 minutos em todos os
equipamentos.
*
5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 50
Medicamentos Fitoterápicos.

69. Resultados e Discussão
Tabela 4 - Tempo de retenção (minutos  DP) das furanocumarinas em diferentes
equipamentos, empregando as condições de quantificação.
Substâncias CLAE-UV CG-DIC CG-EM
Psoraleno 6,14  0,04 4,25  0,03 4,30  0,05
Bergapteno 7,43 0,03 6,35  0,01 6,37 0,04
DT 11,41  0,03 16,55  0,03 16,57  0,05
DP, desvio padrão.
4.1. Desenvolvimento das Metodologias
4.1.1. Soluções orais
Dentre os primeiros sistemas testados para CCD, o mais adequado tem
como eluente a mistura de solventes: tolueno - acetato de etila - ácido acético 6:4:1,
revelado por luz UV no comprimento de onda de 365 nm, pois este sistema permitia
um melhor espaçamento entre as manchas dos padrões e a distinção de colorações
entre algumas furanocumarinas. O padrão de psoraleno adquiriu coloração azul; o
bergapteno, amarela; a pimpinelina e isopimpinelina, alaranjadas. Os três primeiros
com Fatores de Retenção (Rf) muito semelhantes (entre 0,51 e 0,53) e o último com
Rf um pouco maior (0,58). Quando psoraleno e bergapteno estão conjuntamente
presentes, tem-se uma única mancha azulada. Nas tinturas A, B, C e D foi
identificada a mancha relacionada às furanocumarinas bergapteno e/ou psoraleno
em análise comparativa com os padrões.
A análise preliminar das soluções orais A, B, C e D por CLAE-UV permitiu
a identificação das furanocumarinas psoraleno e bergapteno por tempo de retenção
em comparação com os padrões (Figuras 11 a 13). Uma terceira furanocumarina
com mesmo tempo de retenção da DT foi encontrada em quantidade bem menor
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 51
Medicamentos Fitoterápicos.

70. Resultados e Discussão
que psoraleno e bergapteno na solução oral C, com a integração do pico no
cromatograma de CLAE-UV prejudicada devido à grande quantidade de substâncias
polares presentes na amostra. Uma análise preliminar das soluções em CG-DIC não
foi possível devido à presença de água nas amostras e uma grande quantidade de
substâncias polares que prejudicariam a fase estacionária da coluna cromatográfica,
e com isso, a eficiência da mesma.
Figura 11 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento A
(amostra bruta**).
**
amostra sem aplicação da metodologia.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 52
Medicamentos Fitoterápicos.

71. Resultados e Discussão
Figura 12 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento B
(amostra bruta).
Figura 13 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento C
(amostra bruta).
Baseado nos resultados discutidos dos testes preliminares, foi necessário
desenvolver uma metodologia de extração das furanocumarinas que excluísse a
água e a maior parte das substâncias polares presentes nas amostras. A solução de
análise final deveria estar apta a ser analisada em CG-DIC sem o prejuízo à coluna
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 53
Medicamentos Fitoterápicos.

72. Resultados e Discussão
cromatográfica, além de permitir uma melhor integração das substâncias de
interesse em CLAE-UV.
A fim de se avaliar qual o melhor método de extração, verificou-se a
extração das furanocumarinas das soluções orais A, B, C e D por partição líquido-
líquido com éter etílico, clorofórmio e diclorometano. O primeiro solvente não formou
fase com a matriz líquida.
As análises por CCD das fases inferiores e superiores das extrações com
clorofórmio e diclorometano mostraram que a maior parte das furanocumarinas foi
extraída pelos solventes, estando na fase inferior das partições líquido-líquido após
a extração. Não houve diferença visível entre os dois solventes. A seleção do
clorofórmio como melhor solvente extrator foi realizada pela análise por CLAE-UV.
Foi determinada maior quantidade de furanocumarinas na fase inferior da extração
com este solvente. A análise das fases superiores das extrações com clorofórmio
determinou que ainda havia presença de furanocumarinas nesta fase, necessitando,
portanto, de uma otimização do método.
A otimização do tempo em banho de ultra-som mostrou que o rendimento
da extração foi maior com 10 minutos em relação ao método sem ultra-som, não
havendo aumento significativo até 50 minutos. Ainda assim, as fases superiores
mantinham pequena quantidade de furanocumarinas.
A reextração da fase superior com 5 mL de clorofórmio mostrou ser mais
segura e eficiente na extração das furanocumarinas presentes na fase superior, não
havendo formação de emulsão durante o processo. As análises por CLAE-UV
mostraram que a reextração foi eficiente, revelando uma quantidade menor que 1%
do total de psoraleno e bergapteno na fase superior da segunda extração.
O procedimento otimizado encontrado foi: 5 mL da solução oral são
extraídos por 7 mL de clorofórmio durante 10 minutos em banho de ultra-som e em
seguida, centrifugados por 10 minutos para a separação das fases. A fase superior é
reextraída por 5 mL de clorofórmio mantendo-se o mesmo tempo em ultra-som e em
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 54
Medicamentos Fitoterápicos.

73. Resultados e Discussão
centrifugação. As duas fases inferiores foram reunidas e o solvente evaporado até a
secura sob atmosfera de nitrogênio. Cada resíduo foi solubilizado em 5 mL de
metanol, filtrado em filtro Millex 0,45 m e o volume da solução completado para 10
mL com metanol em balão volumétrico (solução para quantificação de
furanocumarinas) para ser analisada em CLAE-UV. A fase superior resultante foi
nomeada: solução para estudos posteriores para ser também analisada em
CLAE-UV.
As furanocumarinas foram extraídas em sua totalidade dos medicamentos
A, B e C, estando presentes nas soluções de análise de furanocumarinas (Figuras
14 a 16), o que comprova eficiência do método para estas substâncias. Este fato
pode observado pela ausência de furanocumarinas nos cromatogramas das
soluções para estudos posteriores dos três medicamentos citados (Figuras 17 a 19).
Figura 14 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento A.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 55
Medicamentos Fitoterápicos.

74. Resultados e Discussão
Figura 15 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento B.
Figura 16 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento C.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 56
Medicamentos Fitoterápicos.

75. Resultados e Discussão
Figura 17 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento A.
Figura 18 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento B.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 57
Medicamentos Fitoterápicos.

76. Resultados e Discussão
Figura 19 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos
posteriores do medicamento C.
A avaliação mostrou que as soluções para análise de furanocumarinas
apresentaram uma grande redução nos teores (cerca de 90%) das substâncias que
eluem no intervalo de tempo 0 a 4 minutos, em relação às amostras brutas,
promovendo uma limpeza da amostra, que era pretendido pelo método. Isto permitiu
que a solução de análise passasse a ser constituída principalmente pelas
furanocumarinas de interesse, facilitando uma melhor visualização e integração
destas e ressaltando a presença de outras cumarinas que pudessem estar presentes
em menores quantidades.
Além de proporcionar melhores condições de análise, a solução mais
clara e límpida resultante da metodologia de extração, possibilitou a preservação da
coluna cromatográfica de CLAE-UV.
A maior parte das substâncias presentes nos medicamentos A, B, e C que
eluem no intervalo de tempo 0 a 4 minutos ficou nas soluções para análises
posteriores (Figuras 17 a 19). Como não temos padrões que apresentem picos com
os mesmos tempos de retenção, uma análise por CLAE-EM está sendo
disponibilizada para determinação destes constituintes nas amostras.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 58
Medicamentos Fitoterápicos.

77. Resultados e Discussão
A presença da DT na solução oral C foi confirmada após adição de
padrão e aumento do pico do cromatograma por CG-EM (Figura 20).
Figura 20 – Cromatograma obtido da análise por CG-EM da solução para
quantificação de furanocumarinas do medicamento C.
Pelo mesmo procedimento, não foi identificada DT nas demais soluções.
A avaliação da metodologia de extração para a DT deste medicamento fitoterápico
mostrou boa repetitividade dos resultados em análises preliminares. Como a solução
oral C foi a última a ser inserida no trabalho, experimentos de recuperação em
CLAE-UV e procedimentos de validação da metodologia para esta furanocumarina
deverão ser realizados.
4.1.2. Cápsulas e comprimidos
A metodologia de extração dos medicamentos fitoterápicos em cápsulas
E, G e comprimidos H, I já havia sido determinada em nosso laboratório. Várias
formas de extração de psoraleno, bergapteno e DT foram testadas, variando o tipo e
volume de solvente e os tempos de ultra-som e centrifugação. A preparação
otimizada das amostras utilizava a quantidade de 100 mg de cada amostra, 10 mL
de metanol-clorofórmio 7:3 como solvente extrator com 15 minutos em ultra-som e
10 minutos em centrifugação para extração das furanocumarinas.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 59
Medicamentos Fitoterápicos.

78. Resultados e Discussão
Um novo medicamento fitoterápico foi adicionado ao trabalho em
andamento no sentido de estudar a aplicabilidade do método a uma amostra com
maior complexibilidade de composição: a cápsula F que contém uma mistura de
extratos secos de 4 plantas medicinais.
Um outro medicamento contendo, segundo a bula, seiva concentrada de
uma planta medicinal e vitaminas também foi avaliado como parte complementar do
nosso trabalho. Este medicamento J não é um medicamento fitoterápico segundo a
legislação73 por possuir em sua formulação substâncias ativas isoladas, o que o
difere de todos os outros medicamentos já presentes no desenvolvimento da
metodologia.
Para avaliar o melhor solvente extrator para furanocumarinas nos
medicamentos F e J, foi empregado o mesmo tempo em ultra-som e centrifugação já
estipulados para as outras cápsulas e comprimidos estudados. A análise das
soluções metanólicas resultantes da extração destas novas amostras por CLAE-UV
e CG-EM selecionou a mistura de solventes: metanol-clorofórmio 7:3 v/v.
O procedimento de recuperação foi realizado para confirmar a eficiência
da extração para os medicamentos F e J. Como a recuperação foi eficiente apenas
para o medicamento em cápsulas F, este foi reunido às amostras já analisadas (E,
G, H, I), sendo o método otimizado descrito a seguir: cada amostra (100 mg) é
extraída com 10 mL de metanol - clorofórmio 7:3 v/v em ultra-som por 15 minutos e
então centrifugada por 10 minutos. O resíduo é reextraído mantendo-se o mesmo
solvente, tempo em ultra-som e centrifugação. Os dois extratos são reunidos e o
solvente evaporado até a secura sob atmosfera de nitrogênio. Este resíduo é
dissolvido em 2 mL de metanol, filtrado através de filtro Millex de 0,45 μm e a
solução completada para 5 ou 10 mL com metanol em balão volumétrico para ser
analisada por CLAE-UV (Figuras 21 a 25).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 60
Medicamentos Fitoterápicos.

79. Resultados e Discussão
Figura 21 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento E.
Figura 22 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento F.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 61
Medicamentos Fitoterápicos.

80. Resultados e Discussão
Figura 23 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento G.
Figura 24 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento H.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 62
Medicamentos Fitoterápicos.

81. Resultados e Discussão
Figura 25 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do
medicamento I.
4.2. Validação das Metodologias
Os cálculos de validação do método para cápsulas e comprimidos
anteriormente trabalhados (cápsulas E,G e comprimidos H, I) e os cálculos de
validação para a amostra que se enquadrou no método (cápsula F), estão reunidos,
para efeito deste trabalho, com um único método validado, apresentado nos
resultados.
Os resultados obtidos da avaliação dos parâmetros utilizados na
validação do método de determinação de furanocumarinas em soluções orais e para
o método de determinação furanocumarinas em cápsulas e comprimidos serão
apresentados a seguir:
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 63
Medicamentos Fitoterápicos.

82. Resultados e Discussão
4.2.1. Recuperação
A avaliação da recuperação das furanocumarinas (psoraleno e
bergapteno) das soluções orais A, B e C com adição de padrão confirmou a
eficiência do método para a extração destas substâncias. O mesmo pode ser
afirmado para a avaliação da recuperação das furanocumarinas (psoraleno,
bergapteno e DT) das cápsulas e comprimidos. Os resultados encontrados no
processo estão descritos nas Tabelas 5 e 6.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 64
Medicamentos Fitoterápicos.

83. Resultados e Discussão
Tabela 5 – Porcentagens de recuperação de psoraleno e bergapteno nas soluções orais A, B e C (n=15).
Psoraleno (%) (média  DP) Bergapteno (%) (média  DP)
Conc. adicionada A B C A B C
-1
(μg ml )
4 95,99  1,17 97,28  0,91 96,13  1,16 98,76  0,74 98,34  1,17 96,43  1,11
40 92,35  0,35 96,55  1,14 97,19  0,99 99,89  0,87 99,97  0,89 97,29  0,67
100 93,76  0,81 99,05  0,74 98,98  1,01 94,43  0,53 98,43  0,79 98,11  1,03
200 96,83  0,97 95,95  0,87 98,37  0,78 98,26  0,93 96,86  1,05 97,81  1,15
Conc., concentração; DP, desvio padrão.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos. 65

84. Resultados e Discussão
Tabela 6 – Porcentagens de recuperação de psoraleno, bergapteno e DT nas cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).
Psoraleno (%) (média  DP)
C adicionada E F G H I
(μg ml-1)
1 97,33  1,36 97,99  0,94 97,34  0,99 97,45  1,16 97,89  0,87
20 98,79  0,85 99,14  1,37 98,98  0,96 98,96  0,78 99,44  1,11
40 99,03  0,97 99,05  0,77 99,47  1,27 99,29  0,91 99,27  0,80
Bergapteno (%) (média  DP)
C adicionada E F G H I
(μg ml-1)
1 98,13  0,81 98,87  1,12 98,01  1,19 97,89  1,10 98,67  0,83
20 99,43  0,71 99,46  0,91 99,26  0,73 99,02  0,86 99,29  1,11
40 99,01  0,67 99,39  0,80 98,11  1,03 99,44  0,93 99,33  0,76
DT (%) (média  DP)
C adicionada E F G H I
(μg ml-1)
1 97,45  1,28 97,88  0,99 97,67  0,87 97,74  1,25 98,68  1,03
20 98,99  0,73 99,35  1,27 99,01  1,13 98,76  0,89 99,50  1,19
40 99,14  1,02 99,13  0,97 98,00  1,22 99,36  1,27 99,55  0,82
C, concentração; DP, desvio padrão.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos. 66

85. Resultados e Discussão
4.2.2. Especificidade
As análises das soluções orais, cápsulas e comprimidos não
apresentaram interferentes com tempos de retenção próximos aos das
furanocumarinas que prejudicassem a quantificação. São apresentados abaixo, dois
cromatogramas que podem ser representativos das análises de soluções orais
(Figuras 26 e 27) e dois outros representativos das análises de cápsulas e
comprimidos (Figuras 28 e 29) nos equipamentos utilizados para validação das
metodologias.
Figura 26 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de
análises de soluções orais.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 67
Medicamentos Fitoterápicos.

86. Resultados e Discussão
Figura 27 –Cromatograma obtido por CG-DIC representativo de análises de
soluções orais.
Figura 28 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de
análises de cápsulas e comprimidos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 68
Medicamentos Fitoterápicos.

87. Resultados e Discussão
Figura 29 –. Cromatograma obtido por CG-EM representativo de análises de
cápsulas e comprimidos.
4.2.3. Limites de detecção e quantificação
Os limites de detecção em ambos os métodos em CLAE-UV, CG-DIC e
CG-EM estão descritos na tabela 7.
Tabela 7 - Limite de detecção e quantificação (μg mL-1) para psoraleno, bergapteno
e DT em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM.
Psoraleno Bergapteno DT
LD LQ LD LQ LD LQ
CLAE-UV 0,03 0,10 0,07 0,23 0,24 0,80
CG-DIC 1,3 4,3 0,6 2,0 1,5 5,0
CG-EM 0,10 0,33 0,09 0,30 0,24 0,80
LD, limite de detecção, LQ, limite de quantificação.
O método em CG-DIC demonstrou maiores limites de detecção e
quantificação, enquanto os procedimentos em CLAE-UV e CG-EM apresentaram
limites de detecção e quantificação semelhantes para as substâncias de interesse
em soluções orais, cápsulas e comprimidos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 69
Medicamentos Fitoterápicos.

88. Resultados e Discussão
4.2.4. Estabilidade
Nenhuma mudança na concentração de psoraleno, bergapteno e DT foi
detectada nas soluções padrões de trabalho depois de 24 horas a 22 ºC, 2 meses a
4 oC e 6 meses de estocagem a -5 oC.
Psoraleno, bergapteno e DT foram estáveis nas soluções de análise dos
medicamentos (condição otimizada) após 24 h a 22ºC, um mês a 4º e 6 meses a -
5ºC. Os métodos validados para análise de furanocumarinas em soluções orais e em
cápsulas e comprimidos podem ser considerados como estáveis.
4.2.5. Curva de calibração
As curvas de calibração para análise de soluções orais foram lineares no
intervalo de 1,0-600,0 g mL-1 para psoraleno e 1,0-400,0 μg mL-1 para bergapteno
em CLAE-UV e no intervalo de 5,0-600,0 μg mL-1 para psoraleno e 5,0-400,0 μg mL-1
para bergapteno em CG-DIC (Tabela 8). O desvio padrão das áreas dos picos das
replicatas das injeções (n=5) foi menor que 2% mostrando boa repetitividade dos
equipamentos.
As curvas de calibração para análise de cápsulas e comprimidos foram
lineares no intervalo de 1,0-50,0 µg mL-1 para psoraleno, bergapteno e DT em CLAE-
UV e em CG-EM (Tabela 9). O desvio padrão das áreas dos picos das replicatas das
injeções (n=5) foram menores que 1% mostrando boa repetitividade dos
equipamentos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 70
Medicamentos Fitoterápicos.

89. Resultados e Discussão
Tabela 8 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação
quantitativa de psoraleno e bergapteno por CLAE-UV e CG-DIC para soluções orais.
CLAE-UV CG-DIC
Substâncias Psoraleno Bergapteno Psoraleno Bergapteno
FL (μg ml-1) 1-600 1-400 10-100 5-90
b 0,38437 0,36371 0,35642 0,35431
a 0,05459 0,02154 0,05357 0,02343
Pa 0,05008 0,04391 0,05176 0,04773
Pb 0,00169 0,00139 0,00161 0,00148
r 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997
n 9 9 10 10
FL: faixa de linearidade, b: inclinação da curva, a: intersecção no eixo y, Pb: desvio padrão da
inclinação da curva, Pa: desvio padrão do intersecção no eixo y, r: coeficiente de correlação, n:
número de dados. Fórmula da regressão linear: y= a + bx, onde y= área do pico, x= concentração (μg
-1
mL ).
Tabela 9 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação
quantitativa de psoraleno, bergapteno e DT por CLAE-UV e CG-DIC para cápsulas e
comprimidos.
CLAE-UV CG-EM
Substâncias Psoraleno Bergapteno DT Psoraleno Bergapteno DT
-1
FL (μg ml ) 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50
b 0,21645 0,23119 0,34576 0,35345 0,37781 0,49872
a 0,03337 0,02137 0,03236 0,04139 0,03901 0,04789
Pa 0,02345 0,02101 0,02905 0,02678 0,02341 0,02659
Pb 0,00132 0,00129 0,00157 0,00229 0,00237 0,00217
r 0,9998 0,9999 0,9997 0,9998 0,9998 0,9997
n 10 10 10 10 10 10
FL: faixa de linearidade, b: inclinação da curva, a: intersecção no eixo y, Pb: desvio padrão da
inclinação da curva, Pa: desvio padrão da intersecção no eixo y, r: coeficiente de correlação, n:
número de dados. Fórmula da regressão linear: y= a + bx, onde y= área do pico, x= concentração (μg
-1
mL ).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 71
Medicamentos Fitoterápicos.

90. Resultados e Discussão
4.2.6. Linearidade do método
A linearidade dos métodos foi determinada por regressão linear. As
análises das amostras com adição de quantidades conhecidas de padrões
demonstraram que a resposta do método foi proporcional às concentrações das
amostras, com um coeficiente de determinação r2: 0,9998 no intervalo linear da
curva de calibração para as amostras de A, B, C, E, F, G, H e I em ambos
equipamentos. Os valores de furanocumarinas para as amostras analisadas pela
extrapolação da reta no eixo x da curva da linearidade do método foram
semelhantes aos encontrados pela curva de calibração empregando padrão externo.
4.2.7. Acurácia e precisão
Os valores de acurácia foram menores que 6% (Tabelas 10 e 11) para
análises de soluções orais e menores que 5% para análise de cápsulas e
comprimidos (Tabelas 12 e 13). Em relação à precisão do método, os coeficientes
de variação (CVs) intradia e interdia foram menores que 6% (Tabelas 10 e 11) para
soluções orais e menores que 5% para cápsulas e comprimidos (Tabelas 12 e 13).
Estes dados indicam que os métodos são precisos dentro do mesmo dia e em três
diferentes dias. A análise da repetitividade de injeção foi discutida na curva de
calibração. A avaliação da variabilidade do método por diferentes analistas mostrou
um CV menor que 2%.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 72
Medicamentos Fitoterápicos.

91. Resultados e Discussão
Tabela 10 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg
ml-1)(média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e
C (n=12).
Psoraleno Bergapteno
C adicionada C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV
(μg mL-1) (%) (%) (%) (%)
4 3,9  0,17 -2,5 4,35 3,8  0,18 5,0 4,73
40 41,0  0,83 2,5 2,02 42,0  1,13 5,0 2,69
200 202,0  2,39 1,0 1,18 203,0  3,05 1,5 1,50
C, concentração; CV, coeficiente de variação; DP, desvio padrão.
Tabela 11 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg
ml-1) (média  DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B
e C (n=15).
Psoraleno Bergapteno
C adicionada C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV
(μg mL-1) (%) (%) (%) (%)
4 3,9  0,16 2,5 4,10 3,9  0,15 2,5 3,85
40 42,0  2,07 5,0 4,93 42,0  1,79 5,0 4,26
200 204,0  3,23 2,0 1,58 203,0  3,91 1,5 1,93
C, concentração; CV, coeficiente de variação; DP, desvio padrão.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 73
Medicamentos Fitoterápicos.

92. Resultados e Discussão
Tabela 12 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg mL -1) (média  DP) de psoraleno,
bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).
Psoraleno Bergapteno DT
C adicionada C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV
-1
(μg mL ) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
1 1,03  0,05 3,00 4,85 1,01  0,04 1,00 3,96 1,03 0,05 3,00 3,96
20 19,51  0,53 2,45 2,72 20,02  0,47 0,10 2,35 20,08  0,57 0,40 2,84
40 39,32  0,91 1,70 2,31 39,51 0,85 1,23 2,15 39,43 0,99 0,14 2,51
C, concentração; CV, coeficiente de variação; DP, desvio padrão.
Tabela 13 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg mL-1) (média  DP) de psoraleno,
bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).
Psoraleno Bergapteno DT
C adicionada C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV C determinada Acurácia CV
(μg mL-1) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
1 1,05  0,05 5,00 4,76 1,02  0,05 2,00 4,90 1,03 0,05 3,00 3,96
20 19,78  0,59 1,10 3,01 20,06  0,51 0,30 2,54 20,10  0,42 0,50 4,20
40 39,50  0,82 1,25 2,08 39,63 0,79 0,93 1,99 39,50 0,87 1,25 2,20
C, concentração; CV, coeficiente de variação; DP, desvio padrão.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos. 74

93. Resultados e Discussão
4.3. Avaliação das Quantidades Obtidas nos Medicamentos Analisados
As soluções orais A, B e C, os medicamentos em cápsulas E e F e o
medicamento em comprimido H não mostraram discrepâncias na quantidade de
furanocumarinas na comparação dos lotes analisados (Tabelas 14 e 15). A solução
oral C mostrou discrepâncias na quantidade de psoraleno entre os lotes atingindo
20% (Tabela 14). O medicamento G mostrou discrepâncias de 150 a 240% na
quantidade de psoraleno e de 4 a 30% na quantidade de bergapteno (Tabela 15).
Tabela 14 - Quantidade (μg mL-1) (média  DP) de furanocumarinas nas soluções
orais empregando o método com CLAE-UV (n=15).
Soluções orais Psoraleno Bergapteno
A1 274  4,3 65  2,9
A2 272  4,1 63  2,1
A3 260  4,9 66  2,0
B1 530  3,1 134  3,6
B2 522  5,9 128  3,2
C1 265  4,9 72  2,8
C2 314  6,7 84  3,4
C3 325 7,3 90  2,1
DP, desvio padrão.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 75
Medicamentos Fitoterápicos.

94. Resultados e Discussão
Tabela 15 - Quantidade (μg/100 mg de cápsula ou comprimido) (média  DP) de
furanocumarinas empregando o método com CLAE-UV (n=15).
Medicamentos Psoraleno Bergapteno DT
E1 250  1,4 83  1,3 -
E2 249  1,3 85  0,9 -
E3 250  1,4 80  1,2 -
F1 210  2,2 60  1,7 10  0,3
F2 213  2,2 63  2,1 12  0,3
F3 210  2,0 67  1,4 14  0,4
G1 172  2,6 75  1,9 -
G2 70  1,1 72  2,5 -
G3 237  2,4 94  3,3 -
H1 225  2,2 55  1,7 11  0,2
H2 232  2,2 56  2,1 13  0,3
H3 222  2,0 53  1,4 12  0,4
I1 - - -
I2 - - -
I3 - - -
DP, desvio padrão.
A presença de DT foi somente detectada na solução oral C (Figura 20), no
medicamento em cápsula F, e no medicamento em comprimidos H. Não foi
detectada a presença de furanocumarinas no medicamento em comprimido I (Tabela
15 e Figuras 21 a 25).
Os resultados da avaliação interequipamento dos métodos estão listados
nas Figuras 30 e 31.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 76
Medicamentos Fitoterápicos.

95. Resultados e Discussão
600 Psoraleno: CLAE-UV
Concentração (μg mL-1)
Psoraleno: CG-DIC
500 Bergapeno: CLAE-UV
400 Bergapteno: CG-EM
300
200
100
0
A1 A2 A3 B1 B2 C1 C2 C3
Figura 30 – Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno
e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-
UV e CG-DIC.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 77
Medicamentos Fitoterápicos.

96. Resultados e Discussão
Psoraleno: CLAE-UV
Psoraleno: CG-EM
Bergapteno: CLAE-UV
Bergapteno: CG-EM
300 DT: CLAE-UV
DT: CG-EM
250
Concentração (µg mL )
-1
200
150
100
50
0
E1 E2 E3 F1 F2 F3 G1 G2 G3 H1 H2 H3
Figura 31 - Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno, bergapteno e DT nos diferentes lotes de
medicamentos E, F, G, H e I por análise em CLAE-UV e CG-EM.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos. 78

97. Resultados e Discussão
As análises não revelaram diferenças estatísticas significativas dentre os
dados obtidos pelos dois aparelhos seguindo o mesmo método otimizado, para um
nível de significância de 95%, o que garante uma boa reprodutividade de
equipamento.
Além dos dados de precisão interequipamento, a análise em CG-DIC e
CG-EM foi necessária para confirmar com maior segurança os valores (μg mL -1)
encontrados de furanocumarinas nas amostras, dada a inexistência de matrizes
brancas tanto para o método de soluções orais, como para o de cápsulas e
comprimidos. Além disso, um dos objetivos do trabalho era avaliar a possibilidade do
método desenvolvido em CLAE-UV ser convertido em método por CG-DIC. Para
isso, todas as análises realizadas em CLAE-UV foram refeitas em CG-DIC, no caso
do método de soluções orais. Para o método de cápsulas e comprimidos foi utilizado
CG-EM.
O comprimido J apresentou quantidades pequenas de furanocumarinas
que variaram de 0,015 a 0,030 mg de psoraleno e 0,010 a 0,035 mg de bergapteno /
comprimido nas triplicatas realizadas. Além disso, a grande quantidade de
substâncias polares (vitaminas) presentes na amostra resultou em picos muito
grandes no cromatograma de CLAE-UV (Figura 32) dificultando a integração dos
picos das furanocumarinas. Não foi possível estimar a quantidade de
furanocumarinas pela adição de padrão, uma vez que o método não apresentou
repetitividade.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 79
Medicamentos Fitoterápicos.

98. Resultados e Discussão
Figura 32 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da extração do
comprimido J.
Algumas tentativas de separação em fase sólida destas vitaminas foram
testadas, porém sem sucesso.
Utilizando os dados obtidos por CLAE-UV, as soluções orais analisadas
apresentaram psoraleno em concentrações entre 0,26 mg mL -1 – 0,53 mg mL-1 e
bergapteno entre 0,06 mg mL-1 – 0,13 mg mL-1 (Tabela 14). Segundo a bula, a dose
recomendada pelos fabricantes das soluções orais A, B e C é de 15 mL/dia (em
média 5,92 mg de psoraleno e 1,42 mg de bergapteno). Ao final de uma semana, a
quantidade total ingerida seria de 53,38 mg de furanocumarinas.
Os medicamentos em cápsulas e comprimidos analisados apresentaram
concentrações entre 0,35 – 1,25 mg de psoraleno; 0,265-0,47 mg de bergapteno e
0,05-0,07mg de DT (Tabela 15). A dose recomendada pelos fabricantes é de três
cápsulas ou comprimidos / dia (em média 2,40 mg de psoraleno, 1,10 mg de
bergapteno e 0,18 mg de DT). Ao final de uma semana, a quantidade total ingerida
seria de 25,76 mg de furanocumarinas utilizando os dados de CLAE-UV.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 80
Medicamentos Fitoterápicos.

99. Resultados e Discussão
Os valores indicam que a dose de furanocumarinas nas soluções orais,
cápsulas e comprimidos, normalmente, são subterapêuticas para os tratamentos de
doenças de pele. Na medicação sistêmica para doenças de pele é indicada a
ingestão de 1,2 mg/kg de bergapteno (5-MOP); 0,2 a 0,4 mg/kg de xantotoxina (8-
MOP) ou 0,6 a 0,8 mg/kg de trimetilpsoraleno (TMP) duas vezes por semana, duas
horas antes da exposição à radiação UVA105. Considerando-se uma pessoa com
peso médio de 60 kg, esta deveria consumir em média, 144 mg de bergapteno, 36
mg de xantotoxina ou 84 mg de trimetilpsoraleno por semana.
Porém são dados que confirmam os riscos a que os consumidores estão
expostos pelo desconhecimento das substâncias que estão ingerindo e pela
desinformação sobre a potencialização dos efeitos carcinogênicos, mutagênicos e
fototóxicos das furanocumarinas pela exposição à luz do Sol. Em alguns países em
desenvolvimento, a fotoquimioterapia utiliza a luz natural do Sol como a fonte de
luz17. Além disso, o psoraleno é mais tóxico que a xantotoxina, a furanocumarina
normalmente prescrita pelos médicos21 e foi o psoraleno, a furanocumarina
encontrada em maior quantidade nos medicamentos estudados (Tabelas 14 e 15).
Segundo a literatura, as cumarinas reúnem um amplo espectro de ações
farmacológicas, como antiarrítmica, vasodilatadora, hipotensora, anticoagulante,
broncodilatadora, bloqueadora da junção neuro-muscular, espasmolítica,
simpatolítica entre outras106,107. As furanocumarinas, no entanto, têm o seu uso
terapêutico relacionado à incidência crescente de câncer. Por isso, sua utilização
necessita de uma avaliação risco-benefício rigorosa107. Acreditamos os
medicamentos A, B, C, D, E, F e G apresentem espécies de Dorstenia em suas
formulações devido às propriedades anticoagulantes das cumarinas. Portanto, o uso
de fitoterápicos contendo furanocumarinas no tratamento de distúrbios menstruais
pode ser considerado de alto risco, se considerarmos esta avaliação.
Como não há informação nas bulas ou informativos da presença de
furanocumarinas nestes medicamentos, há ainda a possibilidade dos medicamentos
serem ingeridos por longos períodos, dado suas indicações diversas como
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 81
Medicamentos Fitoterápicos.

100. Resultados e Discussão
tratamento dos sintomas da menopausa e de cólicas menstruais, aumentando
assim, o risco de desenvolver carcinomas.
4.4. Outros Estudos Realizados
4.4.1. Novas condições cromatográficas
Para determinar o perfil cromatográfico dos medicamentos A, B e C, foi
necessário obter uma melhor resolução dos picos das substâncias que eluem no
intervalo de tempo 0 a 4 minutos na condição utilizada para quantificação de
furanocumarinas (Figuras 11 a 13). Foram testadas outras condições
cromatográficas isocráticas e em fluxo de gradiente para CLAE utilizando misturas
binárias e ternárias dos solventes: água, metanol e acetonitrila.
O eluente que proporcionou melhor separação dos picos das substâncias
mais polares que as furanocumarinas foi: metanol-água-acetonitrila 16:64:20 v/v/v,
com fluxo de 1 mL / minuto (condição isocrática para estudo do perfil
cromatográfico). Nesta nova condição cromatográfica, os picos de psoraleno e
bergapteno eluíram com tempo inferior a 50 minutos. Apenas a solução oral C
apresentou substâncias em menor quantidade com tempo de retenção superior a 50
minutos. Para análises desta última, a aquisição dos dados foi realizada em 50
minutos, seguidos de mais 50 minutos para eluição de todas as substâncias.
As análises das soluções orais na condição isocrática para estudo do
perfil cromatográfico nos comprimentos de onda 223, 254, 287 e 362 nm
apresentaram maior número e área de picos para as soluções B, C e D em 223 nm e
equivalência em 223 e 254 nm para solução A. Por este motivo, a absorbância
utilizada foi 223 nm (Figuras 33 a 35).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 82
Medicamentos Fitoterápicos.

101. Resultados e Discussão
Figura 33 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento A (amostra bruta).
Figura 34 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento B (amostra bruta).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 83
Medicamentos Fitoterápicos.

102. Resultados e Discussão
Figura 35 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do medicamento C (amostra bruta).
A melhor condição isocrática determinada para análise das soluções orais
ainda apresentava muitos picos coeluindo, não sendo ainda, a ideal para a
comparação de perfis cromatográficos. Foram testadas então, condições
cromatográficas em gradiente.
A condição gradiente G1 com fluxo de 1,2 mL / minuto promoveu uma
pressão que foi além de 250 kgf, não permitida pela programação do aparelho.
Mesmo padronizando o fluxo de 1 mL / minuto para as duas condições (G1 e G2), a
melhor condição gradiente foi a obtida em G2, que permitiu uma boa separação dos
picos das amostras dos medicamentos sendo a mais indicada para o estudo de perfil
cromatográfico destes.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 84
Medicamentos Fitoterápicos.

103. Resultados e Discussão
A análise do perfil cromatográfico das soluções orais A, B e C em CLAE-
UV na condição G2 permitiu uma melhor comparação dos perfis cromatográficos das
amostras brutas (Figuras 36 a 38) e das respectivas soluções resultantes da
metodologia de extração (Figuras 39 a 44). A comparação entre os cromatogramas
das amostras brutas (Figuras 36 a 38) e das soluções para quantificação das
furanocumarinas (Figuras 39 a 41) mostra que a metodologia de extração exclui uma
série de picos conjuntos com tempos de retenção próximos aos tempos de retenção
das furanocumarinas na condição gradiente, o que veio a facilitar mais o processo
de análise. Como exemplo, os interferentes presentes na amostra bruta do
medicamento A (Figura 36) foram eliminados pelo método, estando presente na
solução para estudos posteriores (Figura 42). Apenas um pico com tempo de
retenção 14,9 minutos no cromatograma da solução oral B (Figura 37) foi encontrado
em grande quantidade tanto na solução para quantificação de furanocumarinas
como na solução para estudos posteriores (Figuras 40 e 43).
Figura 36 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento A (amostra bruta).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 85
Medicamentos Fitoterápicos.

104. Resultados e Discussão
Figura 37 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento B (amostra bruta).
Figura 38 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento C (amostra bruta).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 86
Medicamentos Fitoterápicos.

105. Resultados e Discussão
Figura 39 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A.
Figura 40 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 87
Medicamentos Fitoterápicos.

106. Resultados e Discussão
Figura 41 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C.
Figura 42 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento A.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 88
Medicamentos Fitoterápicos.

107. Resultados e Discussão
Figura 43 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento B.
Figura 44 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
solução para estudos posteriores do medicamento C.
Os perfis cromatográficos dos lotes analisados para cada solução oral
foram muito semelhantes, tanto na condição isocrática como na condição gradiente
selecionadas para estudo de perfil.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 89
Medicamentos Fitoterápicos.

108. Resultados e Discussão
4.4.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C
A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos nas
soluções orais A, B e C, foram realizadas hidrólises enzimáticas das amostras.
Para a solução oral hidrolisada ter características semelhantes às das
soluções não hidrolisadas, as amostras foram reconstituídas com álcool etílico de
cereais para aproximar-se da graduação alcoólica de 70º geralmente presente na
maioria das formulações de tinturas.
As tinturas hidrolisadas foram analisadas em CLAE-UV, não
demonstrando nenhuma mudança significativa nos valores de psoraleno e
bergapteno, além de não haver aparecimento de novos picos no cromatograma.
Os cromatogramas, em condição gradiente, das amostras hidrolisadas
não apresentaram mudanças no perfil cromatográfico se comparado com os das não
hidrolisadas.
4.4.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos
fitoterápicos
4.4.3.1. Determinação do comprimento de onda
As análises preliminares por cromatografia líquida das tinturas de cipó
caboclox, agoniadax e carapiáx preparadas com álcool etílico 96º e com álcool etílico
65º, mostraram as presenças de psoraleno e bergapteno somente nas duas tinturas
de carapiá. A maioria das tinturas de álcool 65º apresentou contaminação por fungos
durante o processo de secagem, devido ao maior teor de água e o longo tempo
(aproximadamente 48 horas) requerido para levá-las à secura em capela.
A análise por CLAE-UV, na condição isocrática para estudo do perfil
cromatográfico, das amostras de agoniadax, cipó caboclox, carapiáx e mamica de
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 90
Medicamentos Fitoterápicos.

109. Resultados e Discussão
cadelax adquiridas no mercado, mostrou que o comprimento de onda de 223 nm,
escolhido para as soluções orais, cápsulas e comprimidos, também foi o mais
apropriado para a análise dos constituintes destas plantas. Os cromatogramas
indicaram melhor separação dos picos das substâncias mais polares que as
furanocumarinas, em comparação à condição utilizada para a quantificação das
furanocumarinas. Como exemplo, estão a seguir os cromatogramas de carapiáx nas
duas condições (Figuras 45 e 46).
Figura 45 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição para
quantificação de furanocumarinas, de extrato etanólico de carapiá x.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 91
Medicamentos Fitoterápicos.

110. Resultados e Discussão
Figura 46 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico, de extrato etanólico de carapiá x.
Para as amostras de agoniada e cipó caboclo, os tempos necessários
para eluição foram de 10 minutos, para o carapiá, de 47 minutos (devido à presença
de furanocumarinas). Esta condição cromatográfica não foi adequada apenas para a
mamica de cadela, pois a amostra possui picos cromatográficos com maiores
tempos de retenção que eluem após os 50 minutos.
4.4.3.2. Comparação de perfis cromatográficos dos extratos de agoniada
A análise dos perfis cromatográficos por CLAE-UV dos extratos de
agoniadax,y,z apresentaram muitas semelhanças nos tempos de retenção dos picos,
porém a proporção entre as alturas dos picos variou muito, inclusive com a presença
de um pico em tempo de retenção de 10,7 minutos no cromatograma do extrato de
uma amostray, resquícios deste em outrox e ausência do mesmo no terceiroz
(Figuras 47 a 49). Na comparação entre os métodos de extração, houve muita
semelhança nos perfis cromatográficos tanto no tempo de retenção dos picos quanto
na proporção entre as áreas dos mesmos.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 92
Medicamentos Fitoterápicos.

111. Resultados e Discussão
Figura 47 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada x.
Figura 48 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada y.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 93
Medicamentos Fitoterápicos.

112. Resultados e Discussão
Figura 49 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática
para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniada z.
4.4.3.3. Teores de furanocumarinas em Brosimum gaudichaudii
A extração de raiz, caule e folhas de B.gaudichaudiix mostrou que a maior
parte das furanocumarinas, cerca de 99% do psoraleno e do bergapteno presente na
planta encontrava-se em suas raízes. Foram verificados valores menores que
0,003% destas substâncias no caule e ausência nas suas folhas (Figuras 50 a 52).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 94
Medicamentos Fitoterápicos.

113. Resultados e Discussão
Figura 50 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV de extrato etanólico de
raiz de Brosimum gaudichaudiix.
Figura 51 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
caule de Brosimum gaudichaudiix.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 95
Medicamentos Fitoterápicos.

114. Resultados e Discussão
Figura 52 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
folhas de Brosimum gaudichaudiix.
Uma análise posterior com amostras da mesma coleta mostrou que cerca
de 95% do psoraleno e 94% do bergapteno da raiz encontravam-se na casca
(Figuras 53 e 54).
Figura 53 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (10 µL da solução final
de 10 mL) do extrato etanólico de lenho da raiz de Brosimum gaudichaudiix.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 96
Medicamentos Fitoterápicos.

115. Resultados e Discussão
Figura 54 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (5 µL solução final de 25
mL) do extrato etanólico de casca da raiz de Brosimum gaudichaudiix.
4.4.3.4. Comparação entre amostras de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia
brasiliensis e Brosimum gaudichaudii
Tanto as amostras de carapiáx,y e Dorstenia multiformesx comercializadas
em Campo Grande, como as amostras de mamica de cadela x e Brosimum
gaudichaudiix mostraram perfis cromatográficos semelhantes em CLAE-UV na
condição utilizada para quantificação de furanocumarinas, quanto aos tempos de
retenção e quanto à presença de furanocumarinas. No entanto, os cromatogramas
das amostras de carapiáx,y apresentavam maior quantidade de substâncias mais
polares que as furanocumarinas em relação aos de D. brasiliensisx (Figuras 55 a
57). O inverso pode-se dizer para os cromatogramas de mamica de cadela em
relação aos da raiz de Brosimum gaudichaudiix (Figuras 58 e 59).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 97
Medicamentos Fitoterápicos.

116. Resultados e Discussão
Figura 55 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
carapiáx.
Figura 56 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
carapiáy.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 98
Medicamentos Fitoterápicos.

117. Resultados e Discussão
Figura 57 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
rizoma de Dorstenia brasiliensisx.
Figura 58 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
mamica de cadelax.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 99
Medicamentos Fitoterápicos.

118. Resultados e Discussão
Figura 59 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de
raiz de Brosimum gaudichaudiix.
Quanto à proporção entre psoraleno e bergapteno, as amostras de
x,y
carapiá e D. brasiliensisx contiveram sempre maior proporção de psoraleno
(Figuras 55 a 57 e Tabela 16), enquanto que nas amostras de mamica de cadela x e
B .gaudichaudiix,y,z, foi verificada uma maior variação entre as proporções destas
substâncias (Figuras 58 e 59 e Tabela 16).
Tabela 16 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) extraídos pelo procedimento com álcool etílico absoluto e reextrações com
clorofórmio.
Amostra Psoraleno (%) Bergapteno (%)
Carapiáx 0,62 0,11
Carapiáy 0,40 0,10
D.brasiliensisx (rizoma) 0,69 0,17
Mamica de cadelax <0,01 0,48
x
B.gaudichaudii (raiz bruta) 0,36 1,07
B.gaudichaudiix (casca da raiz) 2,09 3,49
B.gaudichaudiiy (casca da raiz) 1,10 0,16
B.gaudichaudiiz (casca da raiz) 0,04 1,02
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 100
Medicamentos Fitoterápicos.

119. Resultados e Discussão
Acreditamos que a variação das porcentagens de psoraleno e bergapteno
e as diferentes proporções entre as duas furanocumarinas presentes nas cascas das
raízes das amostras identificadas de B. gaudichaudiix,y,z provenham de uma possível
variabilidade intrínseca ou sazonal da espécie. Na literatura existem relatos de
variação sazonal do teor de bergapteno, xantotoxina e psoraleno em Apium
graveolens110. Além disso, não se conhece a idade dos espécimes de B.
gaudichaudii, cada um se desenvolve em um microambiente diferente e cada um
deles foi coletado num período do ano diferente. O segundo espécime
(B.gaudichaudiiy) estava fortemente parasitado por insetos xilófagos, ou seja, a raiz
estava toda carcomida, mas a planta persistia vigorosa o que aumentou o número de
variáveis envolvidas no processo. Como a comparação entre os espécimes não foi
realizada em replicata, necessita-se de mais estudos para que se possam obter
conclusões definitivas.
A análise das soluções metanólicas para análise do látex de Brosimum
gaudichaudiix,y,z, não revelou a presença das furanocumarinas monitoradas na
amostra.
A análise do látex foi importante, pois o medicamento J possui em sua
formulação, segundo a bula, cerca de 400 mg de seiva concentrada da espécie por
comprimido. Porém, geralmente há um equívoco no termo “seiva” utilizado nos
medicamentos fitoterápicos, pois o que realmente se coleta são o látex, resinas ou
gomas, produtos de tecidos secretores vegetais. Como Brosimum gaudichaudii
possui látex, a análise foi realizada com este material.
4.4.3.5. Maceração e percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum
gaudichaudii
Tinturas são produzidas geralmente com álcool etílico 65º ou 70º 103. Na
formulação de produtos farmacêuticos hidroalcoólicos de uso oral, utiliza-se álcool
etílico de cereais, como é de consenso da maioria das farmácias de manipulação.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 101
Medicamentos Fitoterápicos.

120. Resultados e Discussão
A proporção material vegetal – volume da tintura final 1:5 m/v foi utilizada
porque o objetivo seria obter tinturas utilizando método semelhante aos utilizados
pelos fabricantes das soluções orais. As soluções orais A e B não forneciam esta
informação, mas a solução oral C indicava, em sua bula, a proporção 1:5.
As tinturas produzidas por percolação e maceração, baseado nos
resultados da quantificação das furanocumarinas utilizando CLAE-UV, mostraram
que as técnicas podem ser consideradas equivalentes quanto à extração das
furanocumarinas psoraleno e bergapteno em D. brasiliensisx. A percolação mostrou-
se mais eficiente para B. gaudichaudiiy (Tabela 17).
Tabela 17 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) nas tinturas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy obtidas por maceração e
percolação.
Amostras Método Psoraleno (%) Bergapteno (%)
D.brasiliensisx Percolação 0,85 0,19
D.brasiliensisx Maceração 0,75 0,17
B.gaudichaudiiy Percolação 1,18 0,20
B.gaudichaudiiy Maceração 0,61 0,10
A comparação dos perfis cromatográficos das tinturas de D.brasiliensisx
por CLAE-UV em condições G2 mostrou muita semelhança entre as duplicatas
realizadas e entre os dois processos de extração. O mesmo foi verificado para as
tinturas de B.gaudichaudiiy. Como os perfis cromatográficos foram muito
semelhantes são apresentados abaixo os cromatogramas representativos para cada
espécie (Figuras 60 e 61).
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 102
Medicamentos Fitoterápicos.

121. Resultados e Discussão
Figura 60 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
tintura produzida por percolação de Dorstenia brasiliensisx.
Figura 61 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da
tintura produzida por percolação de Brosimum gaudichaudiiy.
A comparação dos perfis cromatográficos em condições G2 das tinturas
farmacopéicas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy (Figuras 60 e 61) e das tinturas
produzidas pelo método com álcool etílico absoluto com reextrações com clorofórmio
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 103
Medicamentos Fitoterápicos.

122. Resultados e Discussão
(Figuras 54 e 57), mostrou semelhanças nos tempos de retenção das substâncias e
proporções de furanocumarinas em ambas as espécies. Uma diferença encontrada
foi a maior área dos picos na região inicial dos cromatogramas das tinturas
farmacopéicas, relacionada às substâncias mais polares. Isto se deve
provavelmente à maior polaridade do solvente extrator utilizado – álcool etílico de
cereais 70º, se comparado com o álcool etílico absoluto e clorofórmio utilizados no
outro processo.
Como a solução oral D é formulada somente por tintura de carapiá (no
caso, D. multiformes), foi realizada uma comparação de perfil cromatográfico desta
com as tinturas farmacopéicas de D.brasiliensisx em condições G2. Os
cromatogramas apresentaram-se muito semelhantes (Figuras 60 e 62), inclusive na
presença de maior área dos picos na região mais polar, o que indica que a solução
D também foi preparada com solvente hidroalcoólico.
Figura 62 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do
medicamento D (amostra bruta).
As quantidades de psoraleno e bergapteno (µg mL-1) determinadas nas
soluções orais A, B e C serviram como dados para estimativa destas substâncias
nas tinturas de Dorstenia multiformes presentes na formulação destas soluções. A
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 104
Medicamentos Fitoterápicos.

123. Resultados e Discussão
solução oral D não participou da validação, mas a metodologia validada foi aplicada
a esta solução. A comparação entre as quantidades estimadas de furanocumarinas
nas tinturas de D. multiformes para cada solução oral, considerando todos os lotes, e
as médias destas mesmas furanocumarinas determinadas nas tinturas de D.
brasiliensisx obtidas por percolação e maceração estão apresentadas na Tabela 18.
Tabela 18 – Comparação entre as quantidades (μg mL-1) de furanocumarinas
presentes nas tinturas de D.multiformes presentes nas soluções orais A, B, C e D e
as quantidades determinadas nas tinturas de D.brasiliensisX obtidas por maceração
e percolação.
Tinturas Psoraleno Bergapteno
Tintura de D. multiformes na solução oral A 1074 259
Tintura de D. multifomes na solução oral B 1052 262
Tintura de D. multiformes na solução oral C 1506 410
Tintura de D. multiformes na solução oral D 1052 483
Tintura de D. brasiliensisx por maceração 1703 352
Tintura de D. brasiliensisx por percolação 1507 311
As tinturas de D. multiformes presentes nas formulações das soluções A e
B apresentam praticamente os mesmos valores de psoraleno e bergapteno, o que
sugere que sejam formuladas a partir da mesma tintura de partida. A tintura presente
na solução oral C apresenta furanocumarinas em quantidades maiores que as
presentes nas soluções A e B, mas em quantidades mais próximas às presentes nas
tinturas produzidas por maceração e percolação, em que se utilizou a proporção de
material vegetal - volume da tintura final de 1:5 m/v. Se considerarmos que D.
multiformes seja realmente sinonímia de D. brasiliensis ou que contenham
quantidades semelhantes de furanocumarinas, pode-se supor que as tinturas
presentes nas soluções orais A e B são extraídas com a proporção de material
vegetal – volume da tintura final 1:10 m/v.
4.4.3.6 - Hidrólise de Dortenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 105
Medicamentos Fitoterápicos.

124. Resultados e Discussão
A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos em
D. brasiliensisx e B. gaudichaudiiy,z, foram realizadas hidrólises enzimáticas das
amostras.
A hidrólise da amostra de D.brasiliensisx e B. gaudichaudiiy promoveu
pequena variação no conteúdo de furanocumarinas em relação às amostras não
hidrolisadas. Para as amostras de B.gaudichaudiz, foi verificado um aumento
significativo do teor de furanocumarinas. A variação obtida foi de 50% para o
psoraleno e de 126% para o bergapteno (Figura 63).
2,5 Psoraleno
Psoraleno H
2
% por peso seco
Bergapteno
1,5 Bergapteno H
1
0,5
0
Dx By Bz
x y z
Dx, D.brasiliensis ; By, B. gaudichaudii ; Bz, B.gaudichaudii ; H, amostra hidrolisada.
Figura 63 - Quantidades de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de
amostra) nas amostras de D.brasiliensisx, B.gaudichaudiiy e B.gaudichaudiiz
hidrolisadas e não hidrolisadas.
Novos experimentos em replicata devem ser realizados para confirmar se
há aumento do teor de furanocumarinas apenas na amostra de B.gaudichaudiiz.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 106
Medicamentos Fitoterápicos.

125. Conclusões
5. CONCLUSÕES
As análises das soluções orais por CLAE-UV e CG-DIC e das cápsulas e
comprimidos por CLAE-UV e CG-EM segundo os métodos otimizados foram
validados segundo as normas da ICH, mostrando boa especificidade, acurácia,
precisão e linearidade. Portanto, cada um dos instrumentos pode ser usado em
análises de psoraleno e bergapteno em soluções orais e de psoraleno, bergapteno e
DT nas cápsulas e comprimidos.
Devido à grande variedade de formulações dos medicamentos utilizados
no desenvolvimento dos métodos, os métodos validados podem ser utilizados para
análise de furanocumarinas em outras formulações de fitoterápicos presentes no
mercado.
Foram encontradas furanocumarinas nos medicamentos A, B, C, D, E, F e
G e H sem que a informação estivesse presente nas bulas. Como a maioria destes
medicamentos é utilizada para tratamento de distúrbios menstruais e de sintomas da
menopausa, sem a devida orientação dos consumidores da presença das
furanocumarinas, é possível que casos de câncer sejam desenvolvidos com o uso
continuado desses medicamentos fitoterápicos.
As amostras de carapiá presentes no mercado assemelharam-se à
amostra identificada de Dorstenia brasiliensis quanto à proporção de psoraleno e
bergapteno. As amostras identificadas de Brosimum gaudichaudii apresentaram
muita variação quanto às proporções e quantidades de furanocumarinas, sendo
material de estudo de novos experimentos.
Percolação e maceração, métodos farmacopéicos de extração
mostraram-se muito eficientes na extração de furanocumarinas. Mostraram-se
praticamente equivalentes para Dorstenia multiformes. A percolação mostrou-se
mais eficiente para Brosimum gaudichaudii.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 107
Medicamentos Fitoterápicos.

126. Conclusões
O látex foi avaliado nos 3 espécimes de Brosimum gaudichaudii
analisados. Como não foi detectada a presença de furanocumarinas, sugere-se que
o medicamento seja formulado com outra parte da planta.
Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 108
Medicamentos Fitoterápicos.

127. Referências
6. REFERÊNCIAS
1. YUNES, R, A.; PEDROSA, R. C; FILHO, V. C. Fármacos e fitoterápicos: a
necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no
Brasil. Química Nova, v.24, n.1, p.147-152, 2001.
2. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J.; SNADER, K. M. Natural products in drug
discovery and development. Journal of Natural Products, v.60, p.52-60, 1997.
3. HOSTETTMAN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas
superiores. São Carlos: UFSCar, 2003.
4. VILEGAS, J. H. Y. Tese de Livre Docência – USP, São Carlos. 2001.
5. BACCHI, E. M. Controle de qualidade de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.).
Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São
Paulo: UNESP, 1996. Cap. 12.
6. OKIGANI, H. Fitoterápicos: Uma viagem em extratos testados clinicamente.
Science News, v.1, n.1,2000.
7. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Furanocoumarins from
Brasilian Dorstenia ssp. Rev. Latinoam.Quim., v.23, p.78-80, 1994.
8. MURRAY, R. D. H. Coumarins. Nat. Prod. Rep., v.6, p.477-505, 1995.
9. CHIMICHI, S. et al. A convenient synthesis of psoralens. Tetrahedron, v.58,
p.4859-4863, 2002.
10. CHAUDARY, S. K. et al. Increased furocoumarin content of celery during storage.
J. Agric. Food Chem., v.33, p.1153-1157, 1985.
11. ABDEL-KADER, M. S. New ester and furocoumarins from the roots of Pituranthos
tortuosus. J. Braz. Chem. Soc., v.14, n.1, p.1-7, 2003.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 109
Medicamentos Fitoterápicos

128. Referências
12. DIAWARA, M. M.; TRUMBLE, J. T. Linear furanocoumarins. In: D’MELLO, J. P. F.
(Ed.). Handbook of plant and fungal toxicants. New York: CRC Press, 1997.
p.175-189.
13. LEVEQUE, N. et al. Validation fo a microdialysis-gas chromatographic-mass
spectrometric method to asses 8-methoxypsoralen in psoriatic patient dermis. J.
Chromatogr, B. n. 780, p.119-127, 2002.
14. FAPERJ 2000. Quando os linfócitos passam para o time adversário. Rio de
Janeiro, ano III, n. 18, p.6-7, jun.jul 2001. Disponível em:
http://www.faperj.br/interna.phtml?obj_id=301. Acesso em: 11 dez. 2003.
15. ZARABSKA, Z. et al. PUVA (psoralen+UVA) photochemotherapy: proceses
triggered in the cells. II Farmaco, v.55, p.515-520, 2000.
16. TEREGUN, M., OZTURK, S., SELMAN-PAKOGLU, N. An unusual cause of burn
injury: unsupervised use of drugs that contain psoralens. J. Burn. Care Rehabil.,
v.20, p.2-5, 1999.
17. ROELANDTS, R. Photo(chemo)therapy for vitiligo. Photodermatol.
Photoimmunol. Photomed., v.19, p.1-4, 2003.
18. SCOTT, B.R.; PATHAK, M. A.; MOHN, G. R. Molecular and genetic basis of
furocoumarin reactions. Mutat. Res., v.39, p.29-74, 1976.
19. DIAWARA, M. M. et al. Toxicity of linear furanocoumarins to spodopteraexigua-
evidence for antagonistic interactions. J. Chem. Ecol., v.19, p.2473-2484, 1993.
20. TRUMBLE, J. T. et al. Seasonal patterns and pesticidal effects on the phototoxic
linear furanocoumarins in celery, Apium graveolens L. J. Agric. Food Chem.,
v.40, p.1501-1506, 1992.
21. OJALA, T. et al. A bioassay using Artemia salina for detecting phototoxicity of
plant coumarins. Planta Med., v.65, p.715-718, 1999.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 110
Medicamentos Fitoterápicos

129. Referências
22. CARDOSO, C. A. L. et al. Simultaneous determination of furanocoumarins in
infusions and decoctions from “carapiá” (Dorstenia species) by high-performance
liquid chromatography. J. Agric. Food Chem., v.50, p.1465-1469, 2002.
23. NATTA, R. et al. Narrowband ultraviolet B radiation therapy for recalcitrant vitiligo
in Asians. J. Am. Acad. Dermatol., v.49, n.3, p.473-476.
24. NIJSTEN T. E. C.; STERN, R. S. The increased risk of skin cancer is persistent
after discontinuation of Psoralen plus Ultraviolet A: A cohort study. J. Invest.
Dermatol., v.121, n2, p.252-258, 2003.
25. AL-QATTAN, M. M. Pediatric burns induced by psoralens in Saudi Arabia. Burns,
v.26, p.653-655, 2000.
26. NETTELBLAD, H. et al. Psoralens used for cosmetic sun tanning: an unusual
cause of extensive burn injury. Burns, v.22, n.8, p.633-635, 1996.
27. WANG, L. TSO, M. Determination of 5-methoxypsoralen in human serum. J.
Pharm. Biomed. Anal., v.30, p.539-600, 2002.
28. KADDU, S.; KERL, H.; WOLF, P. Accidental bullous phototoxic reactions to
bergamot aromatherapy oil. Journal of the American Academy of Dermatology,
v.45, n.3, p.458-461, 2001.
29. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Rapid determination of
furanocoumarins in creams and pomades using SPE and CG. J. Pharm. Biomed.
Anal., v. 22, p.203-214, 2000.
30. CARDOSO, C. A. L.; HONDA, N. K.; BARISON, A. Simple and rapid determination
of psoralens in topic solutions using liquid chromatography. J. Pharm. Biomed.
Anal., v27, p.217-224, 2002.
31. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determination of
furocoumarins in samples of “carapiá” by capillary gas chromatography.
Chromatographia. v.50, n.1/2, p.11-14, 1999.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 111
Medicamentos Fitoterápicos

130. Referências
32. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determinations of
furanocoumarins and identification of other chemicals constituints of rhizomes and
leaves from Dorstenia tubicina and commercial samples. South. Bras. J. Chem.,
v.7, p.51-60, 1999.
33. CARAUTA, J. P. P. Moráceas do estado do Rio de Janeiro. Albertoa, v.4, n.13,
p.196, 1996.
34. FRANKE, K. et al. Furanocoumarins from Dorstenia gigas. Phytochemistry, v.56,
p.611-621, 2001.
35. ABEGAZ, B. M. et al. Chalcones and other constituents of Dorstenia prorepens
and Dorstenia zenkeri. Phytochemistry, v.59, p.877-883, 2002.
36. CARAUTA, J.P.P. Dorstenia L. (Moraceae) do Brasil e países limítrofes.
Dissertação (Mestrado em Botânica) – UFRJ, Rio de Janeiro. 1976.
37. VILEGAS, J. H. Y. et al. Further triterpenes, steroids and furocoumarins from
Brazilian medicinal plants of Dorstenia genus (Moraceae). J. Braz. Chem. Soc.,
v.8, p.529-535, 1997.
38. ABEGAZ, B. M. et al. Chemistry of the genus Dorstenia. Curr. Org. Chem., v.4,
p.1079-1090, 2000.
39. TERREAUX, C. et al. Structure revision of a furanocoumarin from Dorstenia
contrajerva. Phytochemistry, v.39, n.3, p.645-647, 1995.
40. MIRANDA, T.R. et al. Isolation, total synthesis, and relative stereochemistry of a
dihydrofurocoumarin from Dorstenia contrajerva. J. Nat. Prod., v.61, p.1216-1220,
1998.
41. KUSTER, R. M. et al. Furocoumarins from the rhizomes of Dorstenia brasiliensis.
Phytochemistry, v.36, n.1, p.221-223, 1994.
42. POZETTI, G. L. Estudo químico de Dorstenia bryoniifolia MART EX MIQ.
(MORACEAE). Ecl. Quím., v.13, p.41-51, 1988.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 112
Medicamentos Fitoterápicos

131. Referências
43. ROJAS-LIMA, S. et al. Furocoumarins of three species of the genus Dorstenia.
Phytochemistry. v.50, p.863-868, 1999.
44. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Cromatografia de permeação
em gel das furanocumarinas de Dorstenia heringeri CAR & VAL. Rev. Ciênc.
Farm., v.14, p.133-138, 1992.
45. NAGDJUI, B. T. et al. Prenylated flavones and phenylpropanoid derivates from
rotos Dorstenia psilurus. Phytochemistry, v.48, n.4, p.733-737, 1998.
46. WOLDU, Y. et al. Styrenes from Dorstenia barnimiana. Phytochemistry, v.27,
n.4, p.1227-1228, 1988.
47. TSOPMO, A. et al. Geranylated flavonoids from Dorstenia poinsettifolia.
Phytochemistry, v.48, n.2, p.345-348, 1998.
48. CASAGRANDE, C. RONCHIETTI, F. RUSSO, G. The structure of syriogenin.
Tetrahedron, v.30, p.3587-3559, 1974.
49. NGADJUI, B.T. et al. Geranylated and prenylated flavonoids from the twigs of
Dorstenia manni. Phytochemistry, v.48, n.2, p.349-354, 1998.
50. NAGDJUI, B. T. et al. Dorsilurins C, D and E, three prenylated flavonoids from the
roots of Dorstenia psilurus. Phytochemistry, v.52, p.731-735, 1999.
51. SILVA, R. A .D. Pharmacopéia dos Estados Unidos do Brasil. São Paulo:
Nacional, 1929.
52. CORRÊA, M. P. Dicionário de Plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro:
Ministério da Agricultura, 1931. 6v. v.2.
53. CONCEIÇÃO, M. As plantas medicinais do ano 2000. Brasília: Tao.
Brasília,1980. p.41-88.
54. SEPLANTEC. Inventário de plantas medicinais do estado da Bahia. Salvador:
Subsecretaria de ciência e tecnologia, 1979.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 113
Medicamentos Fitoterápicos

132. Referências
55. ALZUGARAY, D.; ALZUGARAY, C. Plantas que curam. São Paulo: Companhia
Lithográphica Ypiranga, 1983.
56. UCHIYAMA. T. et al. seco-Adianane-type triterpenoides from Dorstenia
brasiliensis (Moraceae). Phytochemistry, v.60, p.761-764, 2002.
57. ALMEIDA, E. R.; Plantas medicinais brasileiras: conhecimentos populares e
científicos. São Paulo: Hemus, 1993.
58. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de
plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1992.
59. VILEGAS, J. H. Y. et al. Off-line supercritical fluid extraction-high resolution gas
chromatography applied to the study of Moraceae species. Phytochemistry, v.4,
n.5, p.230-234, 1993.
60. MARTINS, M. V. Brosimum gaudichaudii Tréc. a brasilian medicinal plant.
Newsletter-G-15 Gene Bank for medicinal plants, v.7-8, p.9, 1995.
61. MONTEIRO, V. F. F. et al. Prenylated coumarins, chalcone and new cinnamic acid
and dihydrocinnamic acid derivates from Brosimum gaudichaudii. J. Braz. Chem.
Soc., v.13, n.2, p.281-287, 2002.
62. VIEIRA, I. J. C. et al. A new coumarin from Brosimum gaudichaudii Trecul. Nat.
Prod. Lett., v.13,n.1, p.47-52, 1999.
63. VARANDA, E. A. et al. Genotoxicity of Brosimum gaudichaudii measured by the
Salmonella / microsome assay and chromosomal aberrations in CHO cells.
Journal of Ethnopharmacology, v.81, p.257-264, 2002.
64. GUARALDO, L.; SERTIÈ, J. A. A.; BACCHI, E. M. Antiulcer action of the
hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret in the rat. Journal of
Ethnopharmacology, v.76, p.191-195, 2001.
65. GUARALDO, L. et al. Hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret:
effects on spontaneous motor activity and elevated plus-maze behavior. Journal
of Ethnopharmacology, v.72, p. 61-67, 2000.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 114
Medicamentos Fitoterápicos

133. Referências
66. SIDDIQUI, B. S. et al. Minor iridoids from the leaves of Plumeria obtusa.
Phytochemistry, v.37, n.3, p.769-771, 1994.
67. FRANÇA, O. O.; BROWN, R. T.; SANTOS, C. A. M. Uleine and
demethoxyaspidospermine from the bark of Plumeria lancifolia. Fitoterapia, v.71,
p.208-210, 2000.
68. VASCONCELOS, S. M. M. et al. Antinociceptive activities of the hydroalcoholic
extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu in mice. Biol. Pharm.
Bull., v.26, n.7, p.946-949, 2003.
69. SARRAGIOTTO, M. H.; LEITAO, H.; MARSAIOLI, A. J. Erysotrine-n-oxide and
erythrartine-n-oxide, 2 novel alkaloids from Erythrina mulungu. Canadian Journal
of chemistry-revue canadienne de chimie, v.59, n.18, p.2771-2775,1981.
70. CRUZ, G. L. Dicionário das plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Civilização
Brasileira S. A., 1979.
71. MARQUES, L. C. Normatização da produção e comercialização de fitoterápicos
no Brasil. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.;
Mentz, L.A. & Petrovick, P.R. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 2. ed. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 14.
72. BRITO, A. R. M. S. Legislação de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.). Plantas
Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo:
UNESP, 1996. Cap. 13.
73. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RDC
nº 17 de 24 de fevereiro de 2000. Dispõe sobre o registro de medicamentos
fitoterápicos. Diário Oficial da União, 25 fev. 2000.
74. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Consultas
públicas n. 59, 61, 84, 87, 88 e 94. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/consulta_publica/consultas_paginado.asp?p
age=6&ano=2002>. Acesso em 25/03/04.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 115
Medicamentos Fitoterápicos

134. Referências
75. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RDC
n. 48. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da
União, 16 mar. 2004.
76. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T.A. Princípios de análise
instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. p.597-677.
77. LANCAS, F. M. Cromatografia em fase gasosa. São Carlos: Acta, 1993.
78. MELO, L. F. C. Emprego das cromatografias como técnica de “screening” na
análise de fármacos. Exame de Qualificação Geral de Doutorado (Doutorado em
Química) – UNICAMP, São Paulo. 1999.
79. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº
899 de 29 de maio de 2003. Dispõe sobre validação de métodos analíticos e
bioanalíticos. Diário Oficial da União, 01 mar. 2003.
80. SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for
pharmaceutical analysis Understating the differences and similarities between
validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US
Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. J. of
Chromatog. A, v.987, p. 57-66, 2003.
81. CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. Desenvolvimento de métodos por HPLC:
fundamentos, estratégias e validação. São Carlos: UFSCar, 2001.
82. BARROS, C. B.;.HIRATA, Y. S; SATO, N. M. N. Validação de métodos analíticos.
Taboão da Serra: ISOLAB Consultoria e Cursos, 03 e 04 dez. 1997.
83. REQUIREMENTS for initial assay validation and publication in J. Chromatography
B. J.of Chromatogr B, v.707, p.1-2, 1998.
84. BRITTAIN, H. G. Validação de métodos analíticos não cromatográficos.
Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p.4-9.
85. De BARROS, C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, v.64, n.2, p.175-
177, 2002.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 116
Medicamentos Fitoterápicos

135. Referências
86. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug
administration. Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer Guidance.
Validation of Chromatographic Methods. Rockville, 1994.
87. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug
administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry:
Analytical Procedures and Methods Validation, Rockville, 2000.
88. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug
administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry.
Bioanalytical method validation. Rockville, 2001.
89. UNITED States Pharmacopeia 23, Rockville, 1995.
90. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for
registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite
Guideline: Validation of analytical procedures: methodology Q2B, nov.1994.
91. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for
registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite
Guideline: Text on validation of analytical procedures Q2A, oct.1994.
92. BIBLIOTECA on-line. Disponível em:
<http://isi3.isiknowledge.com/portal.cgi?DestApp=WOS&Func=Framehttp://www.is
i3newisiknowledge.com>. Acesso em: 12 dez. 2003.
93. LEITE, F. Validação em análise química. 3. ed. Átomo: Campinas, 1996.
94. CHASIN, A. A. M. et al. Validação de métodos em analyses toxicológicas: uma
abordagem geral. Rev. Brasileira de Toxicologia, v. 11, n.1, p.1-6, 1998.
95. SWARTZ, M. E.; KRULL, I. S. Validação de métodos cromatográficos.
Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p. 12-19.
96. JENKE, D.R. Chromatographic method validation: a review of current practices
and procedures. Part I and II. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., v. 19, n.5, p.719-
757, 1996.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 117
Medicamentos Fitoterápicos

136. Referências
97. TAYLOR, J. K.; Quality assurance of chemical measurements. 2.ed. Chelsea:
Lewis, 1987.
98. GYMENEZ, W. E. M. Avaliação de método analítico para a análise de resíduos de
pesticidas. In: GARP (Associação grupo de analistas de resíduos de pesticidas).
Manual de resíduos de pesticidas em alimentos, 1989, p. 66-73.
99. JAMALI, B.; NIELSEN, H. M.; Development and validation of a capillary
electrophoresis-indirect photometric detection method for the determination of the
non-UV-absorbing 1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol in active pharmaceutical
ingredients, solutions and tables using an internal standard. J. Chromatogr. A, v.
996, p. 213-223, 2003.
100. PRADOS-ROSALES, R. C.; GARCÍA, J. L. L.; De CASTRO, M. D. L. Rapid
analytical method for the determination of pesticide residues in sunflower seeds
based on focused microwave-assisted soxhlet extraction prior to gas
chromatography–tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, v. 993, p.121-
129, 2003.
101. LAMPINEN, M. et al. Validation of a meted for quantifiation of ketobemidone in
human plasma with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J.
Chromatogr. A, v. 789, p. 347-354, 2003.
102. AGÊNCIA Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em:
<http://www.anvisa.com.br>. Acesso em 25 nov. 2003.
103. FARMACOPÉIA dos Estados Unidos do Brasil, 2. ed. São Paulo: Siqueira, 1959.
104. INNOCENTI, G. et al. Quantitative recovery of furanocoumarins from Psoralea
bituminosa. Phytochem. Anal., v.8, p.84-86, 1997.
105. SALDAÑA, L. S. et al. Dermatología Peruana, v. 12, n.1, jan/jun. 2002.
106. Di STASI, C. L. Química de produtos naturais: principais constituintes ativos. In: Di
STASI, L. C. (Org.). Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo
interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996. Cap. 9.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 118
Medicamentos Fitoterápicos

137. Referências
107. KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, cromonas e xantonas. In: Simões, C.
M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L.A. & Petrovick, P.R.
(Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto
Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 21.
Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em 119
Medicamentos Fitoterápicos