1) O documento discute a identificação e diversidade genética de populações da lagarta-do-cartucho (Helicoverpa armigera) no Brasil usando DNA barcoding. 2) Foram analisadas amostras de sete estados brasileiros e identificados onze haplótipos no gene COI, indicando alta diversidade genética e fluxo gênico entre as populações. 3) Os resultados sugerem que as amostras pertencem a H. armigera, mas estudos adicionais com marcadores nucleares são necess

1. Universidade Estadual de Campinas
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética
Identificação e Diversidade Genética de Populações
de Helicoverpa armigera do Brasil
Rogério Martins Gonçalves
Mestrando em Genética e Biologia Molecular
rogerio.goncalves@cbmeg.unicamp.br

2. Sumário
1. Introdução
– Crise Fitossanitária
– Identificação Morfológica de Helicoverpa armigera
– Novas incursões da praga no Brasil
– DNA barcoding
2. Material e Métodos
– Extração de DNA Total
– Amplificação por PCR
– Purificação e Sequenciamento
3. Resultados
– DNA barcodes
– Análises Filogenéticas
– Rede de Haplótipos baseada no gene COI
– Diversidade Genética e Distribuição dos Haplótipos no Brasil
– Rede de Haplótipos baseada no gene Cyt b
4. Conclusões

3. 1. Introdução

4. 1. H. armigera x Crise Fitossanitária
• Praga de importância econômica no mundo:
- Mundo: custos anuais (controle + perda na produção) ~US$ 5 bilhões (Lammers & MacLeod, 2007).
- China (1992): perdas de US$ 1.3 bilhões na cultura do algodão, Norte da China (Sheng, 1993).
- India + China: 50% dos pesticidas usados para controlar H. armigera (Lammers & MacLeod, 2007).
- USA: 4.431 interceptações de H. armigera + Helicoverpa spp. desde 1985 em frutas, legumes e
plantas ornamentais (Venette et al., 2003).
- USA: 1.400 interceptações nos portos entre 2.000 e 2.004 (Passoa, 2004).

5. (Pogue, 2004)
1.2. Identificação Morfológica

8. 1.3. Novas incursões da praga

9. Centro de Biologia Molecular e
Engenharia Genética
Laboratório de Genética e Evolução Animal

10. (Caterino et al. 2000; Hebert et al. 2003)
DNA barcoding
Sistema de identificação de espécies
empregando um segmento curto padronizado
do genoma (Hebert et al., 2003).

11. 1. CATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCGAATAAACTGGGTGG
GTTGTTGCTGTCCCTCTCGGGGGAACTGTGCACGCCTTACCTTTTTTGTTTTTCCA………….. Helicoverpa assulta
2. CATTATTGAATAAACTTGGTTAGGTTGCTGCTGGCTCCTTGGAGCATGTGCACACCTAGCACCNTTTTTACCACCTGTGC
ACCCTTTGTAGACCTGGATACCTCTCGAGGAAACTCGGTTTGAGGACTTTTTTCCA………….. Helicoverpa armigera
OU
1. …………………………………..……………………………………………………Helicoverpa assulta
2. ….…………………………………………………………………………………... Helicoverpa armigera

12. Detection and Genetic Diversity of a Heliothine Invader from North
and Northeast of Brazil (Mastrangelo et al., 2014, no prelo)
Journal of Economic Entomology

13. 2. Material e Métodos

14. 2.1 Extração de DNA Total
Método Fenol:Clorofórmio (Lyra et al. , 2009)
133 amostras de 7 Estados (RO = 15; PI = 39 ;
BA = 13; SP = 38; RR = 14 ; MT = 7; TO = 7)

15. 2.1 Extração de DNA Total
Ressuspendidos em 100 μL de TE buffer Armazenados a -80 ºC

16. 2.2 Amplificação por PCR

17. 2.2 Amplificação por PCR
• Primers:
- COIF e COIR (Li et al., 2011)
- Cytb-F02 e Cytb-R02 (Behere et al., 2008)
• Mix para PCR:
- 25 ng de DNA total
- 2,5 mM de MgCl2
- 0,25 mg/mL de BSA
- 100 μM de dNTPs
- 0,5 mM de cada primer (direto
e reverso)
- 1,5 U de TaqDNA polymerase
- 10 x TaqBuffer
- Volume final: 25 μL
GeneAmp®PCR System
9700 thermal cycler
Condições
94oC 3’
94oC 30”
35 Ciclos
45 oC – COI
50 oC – Cyt b 30”
70 oC – COI
72 oC – Cyt b
90”
60”
70 oC – COI
72 oC – Cyt b
7’
10’
10oC forever
2 μL
Gel agarose 1% em 1 x TAE

18. 2.3 Purificação e Sequenciamento
IllustraTMGFXTM kit
ABI3730xl DNA Analyzer sequencer

19. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov
Basic Local Alignment Search Tool
http://www.boldsystems.org/

20. 3. Resultados

21. 3.1 DNA barcodes DNASP.V5 software
(Mastrangelo et al., 2014, no prelo)

22. 3.2 Análises Filogenéticas – COI (658 pb)

23. 3.3 Rede de Haplótipos – 150 sequências COI
software TCS versão 1.21
(Li et al., 2011)
17 sequências de Li et al., (2011) + 133
sequências brasileiras = 23 haplótipos

24. 3.4 Diversidade Genética das Populações e Distribuição dos Haplótipos – COI
‒ 11 haplótipos
‒ Alta diversidade de haplótipo (Ĥ) e baixa
diversidade nucleotídica (π)
‒ Sem estrutura genética.
‒ Fluxo Gênico

25. Grande Capacidade de Dispersão
• Esse padrão de variação genética é comum em
pragas capazes de se dispersar por longas
distâncias, como H. armigera (Daly & Gregg, 1985;
Zhou et al., 2000; Endersby et al., 2007) .
- Experimentos de marcação e recaptura 
Mariposas de H. armigera podem voar 200-
300 km em uma única noite (Armes & Cooter,
1991).
- Barreiras como o deserto do Sahara não impediram a migração
à longa distância de H. armigera (Nibouche et al., 1998).
(Pedgley, 1985)

26. 3. Compatibilidade Reprodutiva entre H. armigera e H. zea

27. Próximas etapas
• Genes mitocondriais são informativos apenas quanto à herança maternal.
- Os 133 espécimes podem pertencer à linhagem original introduzida ou um híbrido
proveniente do cruzamento entre uma fêmea de H. armigera e um macho de H. zea.
-Nucleares: EF-1α, IDH, RpS5 (Wahlberg & Wheat, 2008).

28. (Pogue, 2004)
1.2. Identificação Morfológica

29. Cooperação Internacional
Austrália, China, Índia, Paquistão, Burkina Faso, Uganda
USA + Brasil

30. H. armigera
H. zea
6 indivíduos de Mato Grosso

31. 3.3 Rede de Haplótipos – sequências Cyt b
26 haplótipos de Tay et al., (2013) + 38
amostras do Brasil (RO, RR, MT, PI, BA e SP)
software TCS versão 1.21

32. 4. Conclusões
1) Há fortes evidências genéticas de que as lagartas e adultos analisados dos sete
Estados brasileiros são Helicoverpa armigera.
2) Estudos combinando mtDNA e novos marcadores nucleares com linhagens puras e
híbridos de H. armigera e H. zea são necessários para a elaboração de protocolos de
identificação para essas duas espécies.
3) Sistemas de identificação baseados em mtDNA tem sido eficientes no diagnóstico e
análises geográficas complementando os dados morfológicos.
4) Há evidência de fluxo gênico entre as populações do Brasil.

33. Muito Obrigado !
rogerio.goncalves@cbmeg.unicamp.br