O documento descreve um método para montar genomas bacterianos a partir de dados de sequenciamento de célula única. O método combina a correção de erros do EULER-SR com a montagem do Velvet-SC para lidar com a cobertura altamente não uniforme. Isso permitiu a montagem de genomas de referência de E. coli e S. aureus, bem como um genoma desconhecido de uma Deltaproteobacteria.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Edson Silva
BELÉM-PA
2014

2. Efficient de novo assembly of single-cell
bacterial genomes from short-read data sets
Chitsaz H. et al (2011)

3. INTRODUÇÃO

4. Introdução
● Metagenômica
● MDA (Multiple Displacement Amplification)
● Amplificação de viés e formação de Chimeras
● Cobertura do sequenciamento ajuda aliviar o
problema

5. Introdução
● O total potencial de montagens single-cell ainda
não foi alcançado
● Desafios são mais computacionais do que
experimentais

6. Introdução
● Cobertura não uniformes
● Necessidade de adaptar as ferramentas de
montagens
Velvet Velvet-SC

7. Introdução
● Aplicado à 2 genomas conhecidos e 1
desconhecido
● Identificando a maioria dos genes com nenhum
esforço no fechamento de gaps e resolução de
repeats
SILVA[2012]

8. RESULTADOS

9. Velvet-SC improves assembly of
short reads with highly nonuniform
coverage
● Velvet poda regiões de baixa cobertura
● Velvet-SC
● EULER+Velvet-SC

10. Characteristics of single-cell
sequences
● DNA amplificado: Escherichia coli (lane 1 e lane
6) e Staphylococcus aureus
● Chimeras: 2% E. coli read pairs e 5% S. aureus
read pairs

11. Characteristics of single-cell
sequences
● Alta não uniformidade de cobertura
● Blackout
● As regiões de blackout podem ser eliminadas por
combinação de reads de múltiplas single-cell

12. Characteristics of single-cell
sequences
Data sets ~600x
(Blackout)
0x ou 1x
(kbp)
~2,300x
(Blackout)
0x ou 1x
(bases)
E. coli lane 1 94 ~116 - -
E. coli lane 6 50 ~13 - -
S. aureus - - 2 143

13. De novo single-cell assembly of E.
coli and S. aureus
● Velvet, Velvet-SC e EULER+Velvet-SC foram
comparados
● Fração selecionada aleatoriamente de reads de
entrada variando de 0.1 à 0.9 do total e montado
com EULER+Velvet-SC e Velvet

14. De novo single-cell assembly of E.
coli and S. aureus
● Aumento da cobertura gerou os melhores resultados
● EULER+Velvet-SC superou o Velvet para o total
de pb montadas em todas as coberturas

15. CHITSAZ[2011, p.917]

16. Single-cell assembly of an
uncultured Deltaproteobacterium
● La Jolla, California
● Análise filogenética de sequencias (16S) revelou
que esse organismo é membro da não cultivável
Deltaproteobacteria, chamada SAR324

17. Single-cell assembly of an
uncultured Deltaproteobacterium
● SAR324_MDA reads
● 57,816,790 de 67,995,232 reads passaram pelo
filtro de pureza do Illumina

18. Assembly statistic
CHITSAZ[2011, p.919]

19. Assembly statistic
● MetaGene
● Rendeu ao EULER+Velvet-SC um conjunto mais
robusto para a anotação

20. Assembly purity
● A contaminação no SAR324_MDA foi analisada
pelo conteúdo GC, frequências de nucleotídeos das
reads e contigs comparando com as referências de
genomas bacteriabacteriano e o BLAST

21. Assembly purity
● Árvore filogenética para cada ORF (Open Reading
Frame) usando o APIS (Automated Phylogenetic
Inference System)

22. Assembly purity
● APIS pode ser usado para a identificação de
contigs contaminantes
● SAR324 possui dados filogenéticos inconsistentes

23. Insights from the SAR324_MDA
Deltaproteobacterium genome
● Características mais marcantes da montagem
SAR324 é a presença de 18 Phytanoyl
Dioxygenase
● Catalisam a degradação da cadeia lipídica em
clorofila

24. Insights from the SAR324_MDA
Deltaproteobacterium genome
● Características metabólicas de SAR324 sugerem
que elas rastreiam e degradam afundando
biomassa fotossintética
● Deixa a superfície do oceano iluminado pelo sol

25. Insights from the SAR324_MDA
Deltaproteobacterium genome
● SAR324
– Cosmopolita
– Aeróbico – ATP através de O2 e C6H12O6
– Móvel – utiliza flagelos
– Quimiotáxico – processo de locomoção de células em
direção a um gradiente químico

26. DISCUSSÃO

27. Discussão
● Não uniformidade da cobertura
● Validação do EULER-SR + Velvet-SC com
genomas de referência
● Método apresentou sucesso

28. Discussão
● O rápido desenvolvimento de tecnologias de
sequenciamento e a redução dos custos também
prometem acelerar o processo

29. Discussão
● Maior meta da genômica única célula é
complementar o seu largo volume da dados
metagenômicos com montagens de genomas de
organismos não cultiváveis que suportam a
anotação da maioria dos genes

30. Discussão
● Essa tecnologia guiará estudos de organismos não
cultiváveis para o microbioma humano e para o
marinho e ambientes de solo

31. Discussão
● O custo-benefício da abordagem contribui para
exploração da taxonomia microbiana, evolução e
extração de organismos ambientais
● Biotecnologia e biomedicina

32. Discussão
● Prever um maior desenvolvimento de EULER +
Velvet-SC
● Metagenômica e transcriptoma, que também são
caracterizadas por uma cobertura altamente não
uniforme

33. MÉTODOS

34. Velvet-SC: modifications to Velvet
assembly algorithm
● Sequências mescladas em um contig maior
● Normalmente funde regiões de baixa cobertura com
as de altas coberturas, resgatando assim, regiões de
baixa cobertura da eliminação

35. EULER+Velvet-SC is EULER-SR's
error correction combined with
Velvet-SC
● Geradas reads de MDAs feitas nas células (E. coli e
S. aureus)
● 600x e 2,300x de cobertura
● 100-bp
● Executando no Illumina Genome Analyzer IIx

36. Single-cell isolation
● E. coli e S. aureus foram isoladas por
micromanipulação
● Amostra de célula marinha (La Jolla, Califórnia) foi
filtrada, rapidamente congeladas e armazenadas a
-80 ° C em 30% de glicerol

37. MDA and selection of candidate
marine amplified DNA
● Reagente GenomiPhi HY
● O gene rRNA 16S foi amplificado e sequenciado e
MDA marinho de interesse foi selecionado por
análises BLAST de suas sequências 16S

38. Library generation and sequencing
● Illumina Genome Analyzer IIx usando reagentes
padrões
Data sets Library
E. coli lane 1 Paired-end
E. coli lane 6 Paired-end
S. aureus PCR-free paired-end
Deltaproteobacteria PCR-free paired-end

39. Analysis and annotation of the
single-cell assembly
● Contigs analizadas pelo BLAST contra um banco
de dados de sequência de nucleotídeos com entrada
de GenBank e RefSeq
● Anotação de genes ORFs, tRNAs, rRNA foi
realizado usando o pipeline de anotação
metagenômica JCVI ( J. Craig Venter Institute)

40. Analysis and annotation of the
single-cell assembly
● Análises filogenéticas de seleção de proteínas
foram conduzidas no Bosque (Integrated
phylogenetic analysis software)
● Identificadores de genes utilizados em KEGG
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
Automatic Annotation Server (KAAS)

42. OBRIGADO!

43. Referência
● CHITSAZ, Hamidreza. et al. Efficient de novo assembly of single-cell
bacterial genomes from short-read data sets. Nature
Biotechnology, Volume 29, Number 10, October 2011.
● SILVA, Artur. et al. Next-Generation Sequencing and Assembly
of Bacterial Genomes. 2012.
● MetaGene <http://metagene.cb.k.u-tokyo.
ac.jp/metagene/metagene.html>. Acessado em: 16/09/2014.
● SAR324 cluster bacterium JCVI-SC AAA005, whole genome
shotgun sequencing project
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AGAU00000000.1>.
Acessado em: 16/09/2014.

44. SLIDES RESERVAS

46. CHITSAZ[2011, p.919]