Este documento descreve um estudo que analisou a resposta de biofilmes fluviais a produtos farmacêuticos usando microarrays de DNA anônimos. Os resultados mostraram que antibióticos como eritromicina e sulfonamidas, bem como o gemfibrozil, induziram alterações na expressão gênica relacionadas a processos como produção de energia, parede celular e metabolismo lipídico. Alguns genes apresentaram respostas semelhantes em biofilmes de dois rios diferentes.

1. ESCOLA SUPERIOR DE BIOTECNOLOGIA - UNIVERSIDADE CATÓLICA PORTUGUESAMESTRADO EM MICROBIOLOGIA APLICADAMICROBIOLOGIA MOLECULARMetatranscriptomic Analysis of the Response of River Biofilms to Pharmaceutical Products, Using AnonymousDNA MicroarraysApplied and Environmental Microbiology – Agosto 2010Ana FigueiredoJoão PereiraLeonardo DantasPorto, 04 de Janeiro de 2011.

2. IntroduçãoA contaminação de efluentes de esgotos tratados, leva muitas vezes productos de cuidado pessoal e fármacos cada vez mais utilizados a serem disseminados no meio ambiente. Razões do interesse nestes productos:Muitas drogas interagem com alvos biológicos partilhados entre humanos, outros animais e mesmo plantas e microrganismos;

3. Muitas actuam a concentrações relativamente baixas;

4. Fármacos necessitam de tempo para atingir o efeito desejado e logo, são produzidos especificamente para resistir à degradação dentro do corpo;

5. A taxa de adição ao meio excede a sua transformação ou degradação;

6. A sua exposição crónica tem vindo a ser associada ao desenvolvimento de bactérias resistentes a antibióticos.IntroduçãoOs biofilmes tanto pelo seu efeito basal nas redes de comida aquática e a sua importância em processos fundamentais como na biodegradação e em ciclos bioquímicos, são candidatos ideais para a monitorização de efeitos ecológicos de poluição por fármacos em ambientes aquáticos. Anonymous DNA microarraysFrequentemente utilizados para estudos transcriptómicos de organismos cujo genoma ainda não foi sequenciado.

7. Anonymous DNA microarray poderá ser uma alternativa interessante para análises metatranscriptómicas comparativas pois não requer conhecimento prévio da genómica ambiental e permite um grande número de amostras sem que seja necessário o sequênciamento metatranscriptomico a cada amostra a analisar. IntroduçãoObjectivos do presente estudo:Demonstrar a utilidade de anonymous microarrays em estudos do metatranscriptoma em larga escala.

8. Identificar respostas transcripcionais de biofilmes fluviais para doses ambientalmente relavantes de diferentes tipos de productos farmacêuticos.Amostragem2) South Saskatchewan River (SSR)Biofilmes deSSR:Testeao microarray. ••Wascana Creek (WC)Para a observaçãodaresposta do biofilme a cada um dos fármacos.Misturas de Biofilmes deWCsujeitos a seistratamentosdiferentesforamusadospara aconstruçãodomicroarray (33 amostras).Eritromicina(EL) 1µgL-1, Clindamicina, Trimetroprim, Sulfametazina(SN) 0.5µgL-1,Norfloxacina, Sulfametoxazol(SL) 0.5µgL-1,Gemfibrozil(GM) 1µgL-1,Nothing was added to the control reactors (CO).

9. Construção da plataforma de microarrayanónimo48 sub-arrays impressosemlâminas de vidrorevestidas de AminosilanoTotal Genomic DNASonicationGenomic Fragments(400-600bp)VersArray Colony Picker (Bio-Rad) 6,351 “bons” (66.2%)917 “fracos” (9.6%)End repair (End-It kit)Taq DNA polymerase+dATPVerificação em gelQuantificação de DNA por UVAmplificação (primers para vector)UA Ligation into pDrive vectorVersArray Chip Writer Pro Printer (Bio-Rad)Extracção de DNA dos 9 600 clonesTransformação de célulasXL1-Blue

10. Hibridização e análise do Microarray250-500mg de Biofilme(amostracomposta)ÁcidosnucleicosRNAseDNAsemRNAOmRNA foi enriquecido, amplificado para cDNA, e marcado com Cy3.50µL de RNAcDNA50µL deDNAUsam-se primers aleatórios e uma forma mutada do fragmento Klenow da DNA polimerase I, para a incorporação de nucleotidos fluorescentes, Cy5.

11. Sequenciação e qRT-PCRApósa análiseestatísticaas sondasqueobtiverammaioresvalorespara com o primeiro e segundoeixoforamrecuperadas dos clonesusadospara a construção do microarrray esequenciadas.

12. Para algumas das sondasidentificadascomomaisreactivasaostratamentos,construiram-se primersqueforamusadosemreacções de qRT-PCR, para a verificação das tendênciasobservadas no microarray.ResultadosPadrões normalizados de hibridação foram usados com 2 propósitos:Providenciar a impressão do metatranscriptoma de cada amostraIdentificar as sondas mais fortemente ligadas com os tratamentos experimentais.fingerprint de alta definição da comunidade microbiana e para identificar genes que fossem expressos mais diferenciadamente entre tratamentos. ResultadosAnálise do microarray para WascanaCreek (WC)As associações das sondas, relativas aos tratamentos, foram determinadas positivamente ou negativamente (por vezes ambas) baseando-se na comparação da intensidade média para um dado tratamento, com os restantes.

13. Os 96 valores positivos e negativos de maior valor para cada eixo foram seleccionados para sequenciação.Fig 1a.

14. ResultadosAnálise do microarray para SouthSaskatchewanRiver (SSR)Este rio foi escolhido por diferir do WC em um parâmetro ambiental importante (por ex: disponibilidade de nutrientes ou trofismo).

15. As posições relativas dos tratamentos não foram exactamente as mesmas que para WC, mas observou-se alguma similaridade Fig1b.

16. ResultadosSondas mais reactivas aos tratamentos dos biofilmes de WCSulfamethoxazole (SL)

17. sondas > parede celular e membrana externa (COG M)ou envolvidas na transducção de sinal (COG T) - resposta positiva.

18. Sondas > genes que codificam as DNA e RNA polimerases - resposta negativa.

19. Gemfibrozil (GM)

20. 3 sondas > Chitinophagapinensis – resposta negativa ao GM, que pode indicar que este microrganismo pode ser inibido pelo gemfibrozil.

21. 3 sondas > transporte e metabolismo lipídico (COG I) e uma relacionada com regulação da síntese flagelar – resposta positiva.ResultadosEritromicina (ER)

22. 1 sonda >guanosinatetrafosfato (ppGpp) sintetase – resposta positiva.

23. Resposta mais positiva para a sonda ligada à proteína chaperonaDnaK (proteína de choque térmico 70).

24. Sondas potencialmente relacionadas com genes de resposta a stress - respostas positivas ou negativa.

25. Sondas > producção e conversão de energia (COG C), transporte de hidratos de carbono e metabolismo (COG G), e Haliangiumochraeum – resposta negativa.ResultadosSulfametazina (SN)

26. 5 genes relacionados com producção e conversão de energia (COG C) – resposta positiva.