Nutrigenómica e nitratos no metabolismo do óxido nítrico na hipertensão arterial

1. 17º Congresso
Sociedade Portuguesa para o Estudo da Obesidade
Porto, 2013
NUTRIGENÓMICA E NITRATOS NO
METABOLISMO DO ÓXIDO NÍTRICO NA
HIPERTENSÃO ARTERIAL
Sara Lopes Pereira1, Carlos Moreira2, José Braz Nogueira2, Manuel Bicho1
1 Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa
2 Hospital de Santa Maria, Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE
1

2. Óxido nítrico, NO
• Radical livre gasoso lipofílico
• Síntese ubíqua (endotélio, músculo liso, plaquetas, leucócitos, macrófagos, neurónios)
• Mensageiro químico com ações benéficas e deletérias
2
VASCULARES
•Vasodilatação
• Pressão arterial
• Agregação plaquetária
IMUNIDADE
•Agente anti-inflamatório
•Agente pro-inflamatório
• Imunotoxina
Schechter A, Gladwin M. N Engl J Med. 2003;348(15):1483–5.
Hord N, Tang Y, Bryan N. Am J Clin Nut. 2008;90:1–10.
Lee K, Kang D, Park S, et al. Carcinogenesis. 2009;30(4):621–5.
EQUILÍBRIO REDOX
•Neutralização de ROS
• Promotor de ROS e RNS

3. Óxido nítrico, NO
eNOS
iNOS
nNOS
L-ARGININA + O2 NO + L-CITRULINA
3
Hord N, Tang Y, Bryan N. Am J Clin Nut. 2008;90:1–10.
Genética
Dieta
NOS3: 4b/a
NOS2A: +14C>T, +88T>G, +524G>A
Nitratos, nitritos, nitrosaminas;
Antioxidantes, lípidos, aminas
Reações de nitração e de nitrosação

4. Determinar se uma dieta rica em nitratos/nitritos de origem vegetal
(dieta nitratos) modifica a influência dos polimorfismos da NOS3 e da
NOS2A na resposta metabólica e cardiovascular de indivíduos
com HTA
4

5. Amostra
Indivíduos com HTA, idade ≥45 anos, IMC≥25 kg/m2 ambos os sexos, não
relacionados entre si, recrutados a partir da consulta de Hipertensão do
Hospital de Santa Maria (CHLN)
5

6. Dieta
Padrão
Dieta
Nitratos
Dieta
Padrão
Dieta
Nitratos
Dieta
Padrão
Dieta
Nitratos
Elegibilidade
R
Tempo
(meses)
Baseline
Período 1
Período 2
0
3
6
Desenho do estudo
Dieta nitratos (≥185 mg/d)
Dieta padrão (<185 mg/d)
Ajustamento calórico
(1500 kcal/d; 1800 kcal/d)
6

7. VARIÁVEIS/CARACTERÍSTICAS MÉTODO
DADOS PESSOAIS Género, idade, altura, medicação, hábitos
tabágicos e etanólicos, nível atividade física
Questionário (entrevista), IPAQ-curto
ANTROPOMETRIA Peso, massa gorda, perímetro abdominal Tanita BC-545; fita métrica
CONSUMO
Macronutrientes, micronutrientes, NO3, NO2,
ALIMENTAR
nitrosaminas, flavonóides
Diário alimentar 3 dias; Food Processor
(ESHA) adaptado
REOLOGIA Pressão arterial, rigidez arterial Omron® Intellisense 705it; Sphygmocor
BIOQUÍMICA Glicemia, HbA1C, colesterol, LDL, HDL, TG, PCR;
Hemoglobina; Fosfatase ácida; Redutase da
methemoglobina
Colheita no HSM-CHLN; Mét.
cianomethemoglobina; Mét. Dissing;
Mét. Board modificado
ANÁLISE
GENOTÍPICA
Seleção dos polimorfismos; Extração DNA;
Genotipagem; Frequências alélicas; Equilíbrio
Hardy-Weinberg
FAMC>5%; Salting-out (Miller); PCR, PCR-RFLP;
Eletroforese horizontal
Contagem de genes; Teste c2
ANÁLISE
ESTATÍSTICA
Normalidade; Estatística descritiva; Dif.
variáveis nominais; Dif. dietas de acordo como
genótipo; Tamanho do efeito; Correlações;
Efeito período
Shapiro-Wilk ou transformação; ANOVA;
Teste exato de Fisher; Repeated measures-
ANOVA; Eta2 generalizado ; Pearson (r);
Repeated measures-ANOVA
DADOS OMISSOS Dados nutricionais; Dados clínicos e
bioquímicos
Média, retenção nutricional; Algoritmo de
maximização de expectativa (E.M.)
Senn S. 2.a ed. Inglaterra: John Wiley & Sons; 2002; Bakeman R. Behav Res Methods. 2005;37(3):379–84; He Y. Circulation: Cardiovascular Quality7
and Outcomes. 2010;3(1):98–105.

8. Fluxo do estudo
2 Não preencheram os critérios de inclusão
1 Recusou participar
DP
n = 4
(3 4b4b;3CC;
2GG; 3AG/GG)
DN
n = 8
(7 4b4b; 7CC;
6GG; 5AG/GG)
DP
n = 8
DN
n = 4
DP
n = 9
DN
n = 7
Elegibilidade
n = 19
R
Tempo
(meses)
3 Desistências 1 Desistência
Baseline
Período 1
Período 2
0
3
6
0 Desistências 0 Desistências
8

9. Características da amostra
Clínicas Amostra (n=12)
Peso (kg) 89,2±16,0
IMC (kg/m2) 30,9±4,8
Massa gorda (%) H 27,6±2,2
M 42,0±6,7
Per. Abdominal (cm) H 105,8±8,6
M 105,7±14,8
PAS (mmHg) 139±33
PAD (mmHg) 80±13
FC (bpm) 57±25
VOP (m/s) 11,5±4,6
Glicemia (mg/dL) 104,5±13,2
HbA1C (%) 5,8±0,5
Colesterol (mg/dL) 189,8±43,4
HDL-c (mg/dL) 44,9±12,8
LDL-c (mg/dL) 118,6±40,4
Não HDL (mg/dL) 145,0±34,9
Triglicéridos (mg/dL) 186,9±120,1
MHbR (UI/L) 0,022±0,005
FA (mmol/g Hb/L) 109,9±68,0
9
Nutricionais Amostra (n=12)
Nitratos (mg) 90,5 ± 49,5
Nitritos (mg) 3,2 ± 1,8
Nitrosaminas (mg) 1,4 ± 0,9
Flavonóides (mg) 135,6 ± 99,8
Energia (kcal) 2230 ± 107
Proteína (g) 112,6 ± 59,7
Glícidos (g) 241,9 ± 140,3
Lípidos (g) 81,6 ± 33,1
Saturados (g) 26,7 ± 11,1
MUFA (g) 32,1 ± 12,5
PUFA (g) 13,3 ± 7,5
w6:w3 6 ± 9
Colesterol (mg) 306,4 ± 212,4
Vitamina E (mg) 7,9 ± 5,8

10. Resultados globais
10
• Consumo de nitratos: 155,7±20,2 mg/d (objetivo: >185 mg/d)
• Diferença entre dietas valor-p=NS; efeito prático h2
G=0,02
• Outros fatores de variação:
• > Flavonóides (+5,7±16,6 mg/d; p=0,011; h2
G=0,13)
• < Lípidos totais (2,9±4,0 g/d; p=0,012; h2
G=0,06),
• < MUFA (1,3± 1,4 g/d; p=0,001; h2
G=0,09)
• < Vitamina E (0,2±0,9 mg/d; =0,035; h2
G=0,14)
• Redução da massa gorda corporal (1,7±1,2%; p=0,044; h2
G=0,04)
• < Vitamina E (r=0,814; p=0,001).
• Sem diferenças significativas nos restantes marcadores

11. 4b/a, NOS3 +14C>T, NOS2
11
PD*G=0,044
CC Nitratos (r=0,711; p=0,021)
Sem resultados estatisticamente significativos

12. +88T>G, NOS2
12
PD*G=0,049 PD*G=0,020
GT/TT Flavonóides (r= 0,978; p=0,004) GT/TT PAS (r= 0,938; p=0,018)
Folato (r= 0,959; p=0,010)

13. +524G>A, NOS2
13
PD*G=0,024
AG/GG Vitamina E (r= 0,764; p=0,027)
AA Proteína (r= 0,961; p=0,039)

14. Primeiro estudo que descreveu o efeito a médio prazo (90 dias) do consumo de
14
uma dieta ad libitum rica em nitratos
MOMENTO INICIAL
• Amostra de elevado risco CDV e características do síndroma metabólico
• Consumo de nitratos e de nitritos de acordo com as estatística europeias
• Dieta rica em gordura saturada e colesterol, e de efeito pró-inflamatório
RESULTADOS GLOBAIS
• Adesão 84%
• Alteração da ingestão de lípidos, MUFA e vitamina E
• Redução da massa gorda
• Sem efeito clínico relevante nos marcadores da dislipidemia , da inflamação e da
disfunção endotelial

15. 15
RESULTADOS GLOBAIS – Outros estudos
POPULAÇÃO INTERVENÇÃO RESULTADOS REFERÊNCIA
Ratos (-/-)
eNOS
0,1 mmol/kg nitrato de
sódio; administração
aguda e por 10 dias
< Gordura visceral, TG,
fenótipo de pré-diabetes,
pressão arterial
• Carlstrom M et al. PNAS.
2010;108(28):17716–20.
Indivíduos
saudáveis
Sumo de beterraba (500
mL); ingestão aguda
< Pressão arterial (-10,4/8
mmHg)
• Webb A et al. Hypertension.
2008;51(3):784 –790.
Indivíduos
saudáveis
200 g maçã e/ou 200 g
espinafres cozidos;
ingestão aguda
> Vasodilatação, < VOP e
PAS
• Bondonno C et al. Free Rad
Biol Med. 2012;52(1):95–
102.
Indivíduos
saudáveis
0,1 mmol/kg nitrato de
sódio; 3 dias
< Pressão arterial e PAS • Larsen F et al. N Engl J Med.
2006;355(26):2792–3.

16. 16
ANÁLISE DISCRIMINANTE – Polimorfismo +14C>T da NOS2
• Alelo de risco: C (wild-type)
• Variação inversa dos valores de HDL-c
• Redução nos portadores da variante alélica
• Aumento nos indivíduos com o alelo wild-type
 Aumento do consumo de nitratos
HIPÓTESE
Num contexto de baixa
disponibilidade de NO, os
nitratos favorecem a
melhoria dos fatores de
risco CDV

17. 17
ANÁLISE DISCRIMINANTE – +14C>T da NOS2 – Outros estudos
FATOR RESULTADOS REFERÊNCIA
Alelo de risco C: > Área de lesão durante o AVC, risco
pancreatite aguda, carcinoma da próstata
T: > atividade da iNOS, risco de pré-eclâmpsia,
DM1, linfoma não Hodgkin
Efeitos controversos: risco de carcinoma da
bexiga , melhor prognóstico (TT)
• Botsina A et al. Cerebrovasc
Dis. 2009;27(Supl 6):1–241.
• Ozhan G et al. Folia Biol
(Praha). 2012;58(6):256–60.
• Amaral L et al. J Hum
Hypertens. 2012;26(9):547–52.
• Ryk C et al. Scand J Urol
Nephrol. 2011;45(5):Epub
Suplemento
composto de ervas
rico em nitrato
Indivíduos risco CDV: <TG • Zand J et al. Nutr Res.
2011;31(4):262–9.

18. 18
ANÁLISE DISCRIMINANTE – Polimorfismo +88T>G da NOS2
• Alelo de risco: G (wild-type)
• Redução do IMC (grupo GT/TT)
 Aumento do consumo de flavonóides e folato
• Agravamento do fenótipo de risco CDV
 Redução da MHbR
• Aumento da PAS
HIPÓTESES
Flavonóides e folato reduzem
os níveis de stresse oxidativo,
a peroxidação lipídica e a
inflamação
<MHbR associada a
>consumo de nitritos e a
<defesas antioxidantes

19. 19
ANÁLISE DISCRIMINANTE – +88T>G da NOS2 – Outros estudos
FATOR RESULTADOS REFERÊNCIA
Alelo de risco T: carcinoma da próstata • Lee K et al. Carcinogenesis.
2009;30(4):621–5.
Flavonóides Indivíduos saudáveis: aumento da síntese de NO
no sistema vascular, redução da PAS e
vasodilatação
Alelo T: risco de carcinoma da próstata (inibição
da apoptose)
• Bondonno C et al. Free Rad Biol Med.
2012;52(1):95–102.
• Lee K et al. Carcinogenesis.
2009;30(4):621–5.
Folato Mulheres: < incidência de HTA e na prevenção da
disfunção endotelial
Adultos saudáveis: Associação inversa entre o
IMC e os níveis plasmáticos de folato
• Forman J et al. J Am Diet Ass 2005;
293(3): 320-329
• Nakaxato M etl al. Eur J Nutr 2011;
50(7): 581-585
Nitritos Década 70-80: risco methemoglobinemia infantil
Atual: efeito hipotensor e cardioprotetor (DASH);
relação de curva invertida em J com a atividade
da MHbR
• Greer F et al. Ped. 2005;116(3):784–6.
• McKnight G et al. Brit J Nut.
1999;81:349–58.
• Lidder S et al. Br J Clin Pharmacol.
2013;75(3):677–96.
• Milkowski A et al. Nitric Oxide.
2009;22:110–9.

20. 20
ANÁLISE DISCRIMINANTE – Polimorfismo +524G>A da NOS2
• Alelo de risco: A (variante alélica)
• Aumento da rigidez arterial
 Efeito mais notório nos indivíduos AA
 Redução do consumo de proteína (arginina)
 Redução do consumo de vitamina E
HIPÓTESE
Consumo de proteína
prejudicou a regeneração
da arginina e a
disponibilidade de NO
Vitamina E previne a
aterosclerose e a ocorrência
de reações de nitrosação

21. ANÁLISE DISCRIMINANTE – +524G>A da NOS2 – Outros estudos
21
FATOR RESULTADOS REFERÊNCIA
Alelo de risco A: carcinoma da próstata, tuberculose
pulmonar
• Lee K et al. Carcinogenesis.
2009;30(4):621–5.
Proteína Crianças com excesso de peso: aumento da
rigidez arterial (VOP)
• Amberg et al. J Nutr. 2012;
142(5): 878-85.
Arginina Insuficiência renal crónica: suplementação
reduziu a VOP e os marcadores da disfunção
endotelial
• Annavarajula S et al. Indian J
Nephrol. 2012;22(5):340–346.
Vitamina E HTA essencial: < VOP, > vasodilatação,
< marcadores de stresse oxidativo
In vitro (meio gástrico): > síntese de NO a
partir do nitrito, < nitrosação e lesão DNA
• Pryor W. Free Radic Biol Med.
2000;28(1):141–64.
• Rafighi Z et al. Glob J Health
Sci. 2013;5(3):183–7.

22. 22
O consumo de uma dieta rica em nitratos apresentou efeitos tanto benéficos como
deletérios na função vascular e na inflamação, e parece depender:
• Da gravidade do fenótipo de risco CDV
• Do contexto celular para a disponibilidade de NO (<síntese vs >neutralização ROS)
• Das defesas antioxidantes do organismo
• Das características globais da dieta (antioxidantes, lípidos, proteínas)
Futuramente:
• Realizar trabalhos de tamanho amostral superior
• Recomendações nutricionais para o consumo de nitratos, antioxidantes e lípidos
insaturados
• Aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo do NO (doseamento de nitratos,
nitritos; medição da atividade da arginase, mieloperoxidase e haptoglobina e
respetivos genótipos)

23. 23
Prof. Doutor Manuel Bicho
Lab. Genética, CME-FMUL
Prof. Doutor J Braz Nogueira
C. Cardiologia-UL. HSM-CHLN
Prof.ª Doutora Cláudia Marinho
Lab. Genética, CME-FMUL
Prof. Doutor Carlos Moreira
Serv. Medicina I, HSM-CHLN
Prof.ª Doutora Isabel do Carmo
FMUL
Todos os participantes