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  1. 1. 21Acromatografia é um métodofísico-químico de separação.Ela está fundamentada na mi-gração diferencial dos componentesde uma mistura, que ocorre devido adiferentes interações, entre duas fasesimiscíveis, a fase móvel e a faseestacionária. A grande variedade decombinações entre fases móveis eestacionárias a tornauma técnica extrema-mente versátil e degrande aplicação.O termo cromato-grafia foi primeira-mente empregado em1906 e sua utilização éatribuída a um botâ-nico russo ao descre-ver suas experiênciasna separação doscomponentes de ex-tratos de folhas. Nesseestudo, a passagemde éter de petróleo (fase móvel) atravésde uma coluna de vidro preenchidacom carbonato de cálcio (fase esta-cionária), à qual se adicionou o extrato,levou à separação dos componentesem faixas coloridas. Este é provavel-mente o motivo pelo qual a técnica éconhecida como cromatografia (chrom= cor e graphie = escrita), podendolevar à errônea idéia de que o processoseja dependente da cor.Apesar deste estudo e de outrosanteriores, que também poderiam serconsiderados precursores do usodessa técnica, a cro-matografia foi pratica-mente ignorada até adécada de 30, quan-do foi redescoberta. Apartir daí, diversostrabalhos na áreapossibilitaram seuaperfeiçoamento e,em conjunto com osavanços tecnológi-cos, levaram-na a umelevado grau de sofis-ticação, o qual resul-tou no seu grande po-tencial de aplicação em muitas áreas.A cromatografia pode ser utilizadapara a identificação de compostos, porcomparação com padrões previa-mente existentes, para a purificação decompostos, separando-se as subs-tâncias indesejáveis e para a separa-ção dos componentes de uma mistura.As diferentes formas de cromato-grafia podem ser classificadas consi-derando-se diversos critérios, sendoalguns deles listados abaixo:1. Classificação pela forma física dosistema cromatográficoEm relação à forma física do siste-ma, a cromatografia pode ser subdivi-dida em cromatografia em coluna ecromatografia planar. Enquanto a cro-matografia planar resume-se à croma-tografia em papel (CP), à cromatogra-fia por centrifugação (Chromatotron) eà cromatografia em camada delgada(CCD), são diversos os tipos de cro-matografia em coluna, os quais serãomais bem compreendidos quandoclassificados por outro critério.2. Classificação pela fase móvelempregadaEm se tratando da fase móvel, sãotrês os tipos de cromatografia: a cro-matografia gasosa, a cromatografia lí-quida e a cromatografia supercrítica(CSC), usando-se na última um vaporpressurizado, acima de sua tempera-tura crítica. A cromatografia líquidaapresenta uma importante subdivisão:a cromatografia líquida clássica (CLC),na qual a fase móvel é arrastadaatravés da coluna apenas pela forçada gravidade, e a cromatografia líquidade alta eficiência (CLAE), na qual seutilizam fases estacionárias de partí-culas menores, sendo necessário ouso de uma bomba de alta pressãopara a eluição da fase móvel. A CLAEfoi inicialmente denominada cromato-grafia líquida de alta pressão, mas suaatual designação mostra-se maisATUALIDADES EM QUÍMICAAna Luiza G. DeganiQuezia B. CassPaulo C. VieiraA cromatografia é ummétodo físico-químicode separação.Ela está fundamentadana migração diferencialdos componentes deuma mistura, queocorre devido a dife-rentes interações,entre duas fasesimiscíveis, a fasefasefasefasefasemóvelmóvelmóvelmóvelmóvel e a fasefasefasefasefaseestacionáriaestacionáriaestacionáriaestacionáriaestacionáriaA seção "Atualidades em química" procura apresentar assuntos quemostrem como a química é uma ciência viva, seja com relação anovas descobertas, seja no que diz respeito à sempre necessáriaredefinição de conceitos.Este artigo apresenta os conceitos básicos da cromatografia. Osdiferentes tipos de cromatografia são descritos e classificadosconsiderando-se a forma física do sistema cromatográficoempregado, a fase móvel/estacionária utilizada ou o modo deseparação. Especial ênfase é dada à cromatografia em camadadelgada, à cromatografia líquida clássica e de alta eficiência e àcromatografia gasosa de alta resolução.cromatografia, sílica, fase móvel, fase estacionáriaQUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998
  2. 2. 22adequada. No caso de fases móveisgasosas, separações podem serobtidas por cromatografia gasosa (CG)e por cromatografia gasosa de altaresolução (CGAR). A diferença entre osdois tipos está na coluna. Enquanto naCGAR são utilizadas colunas capilares,nas quais a fase estacionária é umfilme depositado na mesma, a CGutiliza colunas de maior diâmetroempacotadas com a fase estacionária.3. Classificação pela faseestacionária utilizadaQuanto à fase estacionária, distin-gue-se entre fases estacionárias sóli-das, líquidas e quimicamente ligadas.No caso da fase estacionária ser cons-tituída por um líquido, este pode estarsimplesmente adsorvido sobre um su-porte sólido ou imobilizado sobre ele.Suportes modificados são considera-dos separadamente, como fases qui-micamente ligadas, por normalmentediferirem dos outros dois em seusmecanismos de separação.4. Classificação pelo modo deseparaçãoPor este critério, separaçõescromatográficas se devem à adsorção,partição, troca iônica, exclusão ou mis-turas desses mecanismos.Para se ter uma visão mais amplados diferentes tipos de cromatografia,os mesmos estão dispostos no diagra-ma da Figura 1.Dentre os vários tipos de cromato-grafia, especial ênfase será dada àcromatografia em camada delgada(CCD), à cromatografia líquida clássicae de alta eficiência (CLAE) e à croma-tografia gasosa de alta reso-lução (CGAR).Cromatografia planarA cromatografia em papel(CP) é uma técnica de partiçãolíquido–líquido, estando umdeles fixado a um suportesólido. Baseia-se na diferençade solubilidade das substân-cias em questão entre duasfases imiscíveis, sendo geral-mente a água um dos líquidos.O solvente é saturado em águae a partição se dá devido àpresença de água em celulose(papel de filtro). Este método,embora menos eficiente que aCCD, é muito útil para a sepa-ração de compostos polares,sendo largamente usado embioquímica.A cromatografia em camada delga-da (CCD) é uma técnica de adsorçãolíquido–sólido. Nesse caso, a separa-ção se dá pela diferença de afinidadedos componentes de uma mistura pelafase estacionária.A Fig. 2 mostra um cromatogramaobtido por CCD no qual se podeobservar a diferença de afinidade dassubstâncias 1 e 2 pela fase estacioná-ria, sendo a substância 1 mais retidaque a 2. Por ser um método simples,rápido, visual e econômico, a CCD é atécnica predominantemente escolhidapara o acompanhamento de reaçõesorgânicas, sendo também muito utiliza-da para a purificação de substânciase para a identificação de frações cole-tadas em cromatografia líquida clássi-ca.O parâmetro mais importante a serconsiderado em CCD é o fator deretenção (Rf), o qual éa razão entre a distân-cia percorrida pelasubstância em questãoe a distância percorridapela fase móvel. Osvalores ideais para Rfestão entre 0,4 e 0,6.A CCD pode serusada tanto na escalaanalítica quanto na pre-parativa. Normalmenteas placas utilizadassão de vidro, com es-pessura de 3 a 4 mm. Placas analíticasusualmente têm 10 cm x 2,5 cm epreparativas 20 cm x 20 cm.A sílica gel é a fase estacionáriamais utilizada, sendo seguida pela alu-mina, pela terra diatomácea e pelacelulose. Para a preparação das pla-cas, faz-se uma suspensão do adsor-vente em água, sendo a mesma depo-sitada sobre a placa manualmente oucom o auxílio de um espalhador. Apósa deposição, deixa-se a placa secar aoar. A etapa final da preparação da placaé sua ativação. A sílica, por exemplo,é ativada a 105-110 °C por 30 a 60minutos. A espessura da camada desílica a ser depositada é de 0,25 mmpara placas analíticas e de 1,0 mmpara placas preparativas. Na prepara-ção de placas preparativas, costuma-se adicionar sulfato de cálcio paramelhorar a adesão à placa de vidro.No mercado existem placas analíticase preparativas pré-fabricadas, as quaisapresentam a fase estacionária deposi-tada sobre uma lâmina de materialplástico ou de alumínio, sendo estasde maior eficiência.As amostras a serem analisadaspor CCD devem ser aplicadas a apro-ximadamente 1 cm da base inferior daplaca, com a ajuda de um capilar.Após a aplicação da(s) amostra(s)sobre a placa, a mesma deve serintroduzida numa cuba contendo afase móvel adequada. Cubas cromato-Figura 1: Representação esquemática dos diferentes tiposde cromatografia.Figura 2: Esquematização de um cromatogramaobtido por CCD.QUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998
  3. 3. 23gráficas geralmente são de vidro, comfundo chato, e devem ter suas paredeslaterais internas recobertas com papelde filtro, para facilitar sua saturaçãocom os vapores do solvente.A escolha da fase móvel, quegeralmente é constituída por um oumais solventes, não é tarefa simples.No entanto, uma vez que as fasesestacionárias mais usadas são extre-mamente polares, não devem serutilizados solventes pouco polares, quenão removeriam os compostos doponto de aplicação, nem solventesmuito polares, capazes de arrastar oscomponentes da amostra até o topoda placa. Em vista disso, melhoresresultados são obtidos com misturasde solventes, de modo a se obter umapolaridade média em relação à polari-dade dos componentes da amostra.A placa é deixada na cuba, onde osolvente irá subir por capilaridade, atéque ele esteja a aproximadamente 2cm da extremidade superior. Ao ascen-der, o solvente irá arrastar mais os com-postos menos adsorvidos na faseestacionária, separando-os dos maisadsorvidos.A linha de chegada da fase móveldeve ser marcada e a placa deve estarseca. Como a maioria dos compostosorgânicos é incolor, faz-se necessáriaa utilização de um processo de revela-ção para que se possa analisar oresultado.Para a revelação de placas de CCD,existem processos destrutivos e nãodestrutivos. Os métodos não destruti-vos mais utilizados são a utilização de1) placas onde a fase estacionária éfluorescente ou 2) iodo. O primeirobaseia-se na utilização de substânciasfluorescentes misturadas à sílicaquando da preparação das placas,possibilitando a revelação dos com-postos em câmaras de luz ultravioleta.O segundo vale-se do fato de que oiodo complexa-se com compostosinsaturados, de modo que placas queos contenham, ao serem colocadasem uma câmara contendo cristais deiodo, apresentarão pontos amarron-zados.Os processos destrutivos consis-tem na oxidação dos compostos sobrea placa, pulverizando-os com soluçãoaquosa de um oxidante orgânico e/ouum ácido mineral, submetendo-se aplaca a altas temperaturas (~110 °C)por alguns minutos. Os compostosorgânicos oxidados serão revelados naforma de pontos escuros.Cromatografia em colunaCromatografia líquida clássicaEsta técnica é muito utilizada paraisolamento de produtos naturais epurificação de produtos de reaçõesquímicas. As fases estacionárias maisutilizadas são sílica e alumina, entre-tanto estes adsorventes podem servirsimplesmente como suporte para umafase estacionária líquida. Fases esta-cionárias sólidas levam à separaçãopor adsorção e fases estacionáriaslíquidas por partição. Suportes quimi-camente modificados também têmsido usados, sendo o processo de se-paração misto neste caso.Esses suportes são acondicio-nados em tubos cilíndricos geralmentede vidro, de diâmetros variados, osquais possuem uma torneira em suaextremidade inferior. A Fig. 3 é umailustração de uma coluna cromato-gráfica empacotada com sílica, sendomostrados seus demais constituintes.Os adsorventes possuem partí-culas na faixa de 60-230 mesh, demodo a possibilitar um fluxo razoáveldo solvente através da coluna.O uso de sílica de partícula menor(230-400 mesh) como adsorvente paraessas colunas requer a utilização deum sistema de bombeamento para oempacotamento e eluição, sendoconhecido como Cromatografia Flash.A principal etapa ao se utilizar essatécnica é o empacotamento, o qual,entre outros fatores, definirá a eficiên-cia da separação. Enquanto a aluminaé empacotada em sua forma original,a sílica deve sê-lo na forma de sus-pensão.À coluna adiciona-se uma pequenaquantidade de solvente e deposita-sena sua extremidade inferior um chu-maço de algodão com espessura deaproximadamente 0,5 cm para impedira passagem de partículas da faseestacionária. A adição de sílica deveser feita com a torneira semi-aberta.O adsorvente é adicionado lentamenteà coluna fixada na posição vertical,batendo-se continuamente ao longoda mesma para que todo o ar sejaexpulso, de modo a se obter umacompactação uniforme. A existênciade ar entre as partículas leva à forma-ção de canais na coluna, os quaisalargam as bandas eluídas.Nunca se deve permitir que o níveldo solvente desça abaixo do nível doadsorvente, o que poderia acarretarrachaduras, comprometendo a eficiên-cia da coluna.Após o empacotamento, é conve-niente que se passe uma certa quan-tidade do eluente (duas a três vezes ovolume da coluna) a ser utilizadoatravés da coluna antes da introduçãoda amostra. Esta é adicionada àcoluna com o auxílio de uma pipetano momento em que o nível do eluenteesteja o mais próximo possível doadsorvente. Esse procedimento ame-niza o alargamento das bandas aserem eluídas. Tendo a amostra pene-trado no adsorvente, o eluente é entãoadicionado cuidadosa e continua-mente.A escolha do eluente segue osprincípios discutidos em CCD, masneste caso ele pode ser mudado du-rante o processo cromatográfico. Se,por exemplo, a amostra é constituídapor duas substâncias, uma apolar eoutra polar, utiliza-se primeiramenteum eluente apolar e em seguida umeluente polar.O volume das frações a seremrecolhidas é função da quantidade deamostra e do grau de dificuldade daFigura 3: Ilustração de uma coluna croma-tográfica.QUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998
  4. 4. 24separação. Para análise das mesmas,recorre-se a alguma técnica auxiliar,usualmente CCD.Em vista de que geralmente algu-mas partículas da amostra perma-necem irreversivelmente adsorvidas àfase estacionária, a cada separação énecessário um tratamento para a recu-peração do adsorvente.Cromatografia líquida de altaeficiência (CLAE)O grande avanço na cromatografiaem coluna foi o desenvolvimento e autilização de suportes com partículasdiminutas responsáveis pela altaeficiência, as quais tornam necessárioo uso de bombas de alta pressão paraa eluição da fase móvel, devido a suabaixa permeabilidade. A Fig. 4 mostraum equipamento típico de CLAE.As fases móveis utilizadas em CLAEdevem possuir alto grau de pureza eestar livres de oxigênio ou outros gasesdissolvidos, sendo filtradas e desga-seificadas antes do uso.A bomba deve proporcionar aosistema vazão contínua sem pulsoscom alta reprodutibilidade, possibilitan-do a eluição da fase móvel a um fluxoadequado.As válvulas de injeção usadaspossuem uma alça de amostragempara a introdução da amostra com umaseringa e duas posições, uma para opreenchimento da alça e outra parasua liberação para a coluna. Existemalças de diversos volumes, sendoutilizadas geralmente alças na faixa de5-50 µL para injeções analíticas e 0,5-2 mL para preparativas.As colunas utilizadas em CLAE sãogeralmente de aço inoxidável, comdiâmetro interno de cerca de 0,45 cmpara separações analíticas e na faixade 2,2 cm para preparativas. O com-primento é variável, sendo comunscolunas analíticas de 10-25 cm e pre-parativas em torno de 25-30 cm. Essascolunas são reaproveitáveis, sendoempacotadas com suportes de altaresolução, não sendo necessária suaregeneração após cada separação.O detector mais utilizado paraseparações por CLAE é o detector deultravioleta,sendotambémempregadosdetectores de fluorescência, de indícede refração, e eletroquímicos, entreoutros. Detectores de polarimetria paraCLAE, recentemente desenvolvidos,diferenciam compostos quirais, atravésda rotação de seus estereoisômerosfrente à luz plano-polarizada.O registro de dados pode ser feitoatravés de um registrador, um integra-dor ou um microcomputador.A Fig. 5 ilustra uma separaçãoenantiomérica por CLAE.A versatilidade desta técnica resideno grande número de fases estacio-nárias existentes, as quais possibilitamanálises e separações de uma amplagama de compostos com alta eficiên-cia. Tem sido utilizada em várias áreasda ciência, no acompanhamento desínteses, em análises de pesticidas,feromônios, no isolamento de produtosnaturais e sintéticos e na produção econtrole de qualidade de medica-mentos, dentre tantas outras apli-cações.As separações em CLAE podem sedar por adsorção, partição ou ambos.O suporte mais comumente utilizadoé a sílica. O uso de fases estacionáriaslíquidas adsorvidas a um suporte nãotem grande aplicação devido à perdade fase estacionária, mas o uso desuportes modificados, os quais foramdesenvolvidos como conseqüência doproblema acima, possibilita a produ-ção de uma imensa variedade de colu-nas com diferentes propriedades etipos de seletividade. As fases assimobtidas são chamadas de quimica-mente ligadas.Essas fases, dependendo da modi-ficação feita ao suporte, podem atuarno modo normal, reverso ou ambos.Na cromatografia em fase normal, afase estacionária é mais polar que afase móvel, e em fase reversa, a fasemóvel é mais polar.Separações analíticas são predo-minantemente realizadas em fasereversa, sendo a fase C18 (octadecil-sílica) a mais usada, ao passo que sãopreferidas fases que atuem no modoFigura 4: Equipamento básico de CLAE. a) reservatório da fase móvel; b) bomba de altapressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.Figura 5: Cromatograma mostrando aseparação dos enantiômeros do tetramisol,princípio ativo de vários medicamentosusados para ascaridíase.QUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998
  5. 5. 25Para saber maisCOLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BO-NATO, P.S. Introdução a métodos croma-tográficos. 5ª ed. Campinas: Editora daUnicamp, 1993.LOUGH, W.J. e WAINER, I.W. High Per-formance liquid chromatography: fun-damental principles and practice. BlackieAcademic and Professional, 1995.CHAVES, M.H.; Análise de extratos deplantas por CCD: uma metodologia apli-cada à disciplina “Química Orgânica”.Química Nova, v. 20, n. 5, p. 560-562,1997.ANDRADE,J.B.;PINHEIRO,H.L.C.;LO-PES,W.A.;MARTINS,S.;AMORIM,A.M.M.eBRANDÃO,A.M.Determinaçãodecafeí-na em bebidas através de cromatografialíquida de alta eficiência (CLAE). QuímicaNova, v. 18, n. 4, p. 379-381, 1995.NETO, F.R.A.; CGAR em análise deresíduos. Química Nova, v. 18, n. 1, p.65-67, 1995.normal para fins preparativos, em vistade que separações no modo reversoutilizam fases móveis aquosas.Entre as fases quimicamente liga-das, merecido destaque deve ser dadoàs fases estacionárias quirais, as quaispossibilitam a separação direta deenantiômeros. Para tanto, é necessáriaa presença de um seletor quiral comoparte integrante da fase estacionária.Cromatografia gasosa de altaresolução (CGAR)Em contraste à CLAE, o principalmecanismo de separação da cromato-grafia gasosa está baseado na parti-ção dos componentes de uma amostraentre a fase móvel gasosa e a faseestacionária líquida. A utilização de fa-ses estacionárias sólidas, as quaislevariam à separação por adsorção,apresenta poucas aplicações.A cromatografia gasosa é uma dastécnicas analíticas mais utilizadas.Além de possuir um alto poder deresolução, é muito atrativa devido àpossibilidade de detecção em escalade nano a picogramas (10–9-10-12g). Agrande limitação deste método é anecessidade de que a amostra sejavolátil ou estável termicamente, embo-ra amostras não voláteis ou instáveispossam ser derivadas quimicamente.Pode ser utilizada para separaçõespreparativas apenas na faixa demicrogramas a miligramas, não sendomuito empregada para esse fim. A Fig.6 mostra os componentes básicos deum cromatógrafo gasoso.Como dito anteriormente, a diferen-ça entre CG e CGAR está na coluna.Colunas de CGAR são maiores emcomprimento, menores em diâmetro,possuem a fase líquida como um filmeaplicado diretamenteàs paredes do tubo dacoluna e são mais efi-cientes.Essas colunas sãotubos longos de me-tais como aço ou co-bre, vidro ou teflon.Colunas de CG têmdiâmetro de cerca de3 mm e comprimentoem torno de 3 m, aopasso que colunas de CGAR têmdiâmetro na faixa de 0,15-0,75 mm ecomprimentos variados, usualmenteentre 10 m e 100 m.Os gases utilizados como fasemóvel devem ter alta pureza e serinertes em relação à fase estacionária.Hidrogênio, nitrogênio e hélio são osmais usados.A injeção da amostra é feita atravésde microsseringas ou válvulas seme-lhantes às utilizadas em CLAE.Os detectores de maior aplicaçãosão o detector por ionização emchama e o detector de condutividadetérmica. Os dados podem ser obtidosatravés de um registrador po-tenciométrico, um integrador ou um mi-crocomputador, sen-do as amostrasidentificadas por seustempos de retenção.Nesses equipa-mentos é necessárioo controle da tempe-ratura do injetor, dacoluna e do detector,as quais são man-tidas por termostatos.Como a temperaturaé um fator extrema-mente importante,grande parte dasanálises por croma-tografia gasosa é feitacom programação detemperatura, obten-Figura 6: Componentes básicos de um cromatógrafo gasoso.a) cilindro do gás de arraste mantido sob alta pressão; b) injetor;c) coluna; d) detector e e) registrador.do-se melhor separação com picosmais simétricos em menor tempo.Para o empacotamento de colunasde CG, geralmente empregam-seterras diatomáceas como suporte. Aescolha da fase estacionária é de fun-damental importância, sendo ela ocomponente crítico dacoluna. As fases esta-cionárias podem serpolares, apolares ouquirais. Fases polaressão baseadas em po-lietileno glicol puro oumodificado e apolaresem metilsiloxano puroou modificado. As fa-ses quirais mais co-muns são compostasde ciclodextrinas.Atualmente, espectrômetros demassa têm sido acoplados a equipa-mentos de cromatografia gasosa,possibilitando a identificação imediatadas substâncias presentes na amostra.Ana Luiza G. Degani, mestre em químicaorgânica, é doutoranda na UFSCar. Quezia B.Quezia B.Quezia B.Quezia B.Quezia B.CassCassCassCassCass, bacharel em farmácia pela UFPE e Ph.D. emquímica pela City University, Londres, é docente doDepartamento de Química da UFSCar, em São Carlos– SP. PPPPPaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vaulo C. Vieiraieiraieiraieiraieira, licenciado pelo DQ-FFCL-USP, em Ribeirão Preto, doutor em ciências (químicaorgânica) pela USP, é docente do Departamento deQuímica da UFSCar, em São Carlos – SP.QUÍMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia N° 7, MAIO 1998A cromatografiagasosa é uma dastécnicas analíticasmais utilizadas. Alémde possuir um altopoder de resolução, émuito atrativa devido àpossibilidade dedetecção em escala denano a picogramas

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