Semin biotec ii crescimento tor tamboides

1
Qualis-CAPES B5
Thiago Andrade da Silva, CRMV-CE 0176 ZP
Zootecnista, Professor de Aquicultura
CENTEC/SEDUC, EEEP J. I. Nocrato - Guaiúba-CE
Bactéria probiótica nativa promove crescimento muscular hipertrófico e regula a
expressão
de genes relacionados ao crescimento no Mahseer Malaio Tor tambroides

2
Introdução
●
Malaysian mahseer - Tor tambroides
– Importante espécie de ciprinídeos
– Habitam
● Rios das montanhas no Sudeste Asiático
● Himalaia
● Conhecido localmente como kelah ou
empurau
– Valorizado como alimento e
ornamental

3
Reprodução do Tor tambroides
● Pescado de água doce mais caro na Malásia
– Rápido declínio das populações naturais
– Crescente interesse em realizar sua propagação artificial para
aquicultura e conservação
● Crescimento lento, em comparação a outros ciprinídeos
– Mas pode atingir mesmo tamanho:
● 500-600 g em um ano na natureza¹
● 800 g em 33 meses de cultivo em viveiros escavados²
1 - Ng, 2004
2 - Ingram et al., 2007
Muitos estudos foram feitos nos últimos anos
focando em desenvolvimento de dietas para
melhorar o crescimento de larvas e juvenis

4
Crescimento muscular
● Produto principal da piscicultura: músculo
● Células satélites
– Conjunto de células precursoras miogênicas quiescentes
– Influenciam diretamente o crescimento dos teleósteos: ativação e
proliferação
– Localizadas na periferia das fibras musculares¹
– Seus núcleos são absorvidos por fibas existentes que aumentam em
tamanho (hipertrofia) ou fundem-se formando miotubos
multinucleados e novas fibras (hiperplasia)
1 - Johnston et al., 2009

6
Células satélites
● Peixes nunca param de crescer
devido a mecanismos de hiperplasia
e hipertrofia
● Em espécies aquícolas, duas fases
de hiperplasia foram observadas:
I. Formação de novas fibras musculares
(restritas às zonas germinais)
II. Hiperplasia em mosaico: envolve
formação de novas fibras musculares
ao longo do miotomo¹
1 - Asaduzzaman et al., 2013

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Crescimento muscular
● Grandes espécies aquícolas
– Maior parte das fibras musculares
crescem por hiperplasia em mosaico¹
● Hipertrofia ocorre quando síntese
protéica é maior do que a degradação
– Ocorre incremento no tamanho da fibra
muscular crescimento do miotomo→
Johnston, 1999; Asaduzzaman et al., 2013

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Elementos bioquímicos do crescimento
muscular
● Cotrole da hiperplasia e hipertrofia¹:
– Hormônio do crescimento (GH)
– Fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs)
– Miostatina (MSTN)
Johnston et al., 2009

10
Síntese de
proteínas
Degradação de
proteínas
ANABOLISMO CATABOLISM
O
GH
IGF’s
MSTN

11
Elementos bioquímicos do crescimento
muscular
GH induz à proliferação de células miogênicas e
hiperplasia e/ou hipertrofia
Principal alvo (GH e IGF):
músculo esquelético, mas
podem afetar outros
músculos
MSTN: regulador negativo → limitar
hiperplasia do músculo
IGF’s são peptídeos. Incluem IGF-1 e IGF-2

Estimulam

proliferação de células musculares,
diferenciação e hipertrofia

Inibem

atrofia do músculo

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Suplementação com probióticos
● Também conhecidos como ‘bio-friendly
agents’
● Nova abordagem para
– Incremento do crescimento miotomal
– Bem-estar de animais aquáticos cultivados¹
● Espécies de bactérias já foram avaliadas
para:
– Melhorar parâmetros de crescimento
– Nutrição
– Resposta imune
– Resistência a doenças
1 - Andani et al., 2012; Talpur et al., 2012; Han et al., 2015

13
Busca por organismos probióticos
● Têm sido procurados outros organismos probióticos nos
próprios peixes
– Peculiaridades fisiológicas inatas dos hospedeiros
– Dificilmente um microrganismos terá aplicação universal
● Três potenciais probióticos foram avaliados nessa pesquisa:
– Bacillus sp. AHG22, Alcaligenes sp. AFG22, and Shewanella sp. AFG21
– Foram isolados do trato gastrointestinal de um adulto de T.
tambroides para avaliar os efeitos no crescimento do próprio mahseer

14
●
Bacillus spp
– Isolados do trato intestinal da truta arco-íris, Acanthopagrus
latus, garoupas e principais carpas indianas para usá-los
como probióticos nativos
●
Gênero Shewanella
– Um dos grupos mais frequentes de bactérias isoladas de
intestino de peixes
– Algumas cepas têm sido utilizadas como probióticos em
peixes cultivados

15
●
Alcaligenes spp.
– Há poucas informações sobre sua habilidade probiótica em aquicultura
embora seja encontrada em intestino de peixes
– É usada para:
● Produção de poli-hidroxibutirato (PHB)¹
● Remoção de amônia em águas descartadas² e lodo de esgoto³
●
Promotor de crescimento quiabo (Abelmoschus esculentus)4
1 - Wang et al., 2013
2 - Joo et al., 2006
3 - Shoda and Ishikawa, 2014
4 - Ray et al., 2016

16
Probióticos em ciprinídeos
● Vários estudos comprovaram o efeito positivo de probióticos
em ciprinídeos
– Poucos avaliaram microrganismos nativos
– Embora T. tambroides necessite de aprimoramentos em sua
nutrição, há poucos estudos sobre os efeitos dos probióticos no
crescimento dessa espécie

17
Ação do probiótico nativo em T. tambroides
O mecanismo de ação celular e molecular do probiótico gerando
incremento no crescimento não é bem documentado em peixes
Hipótese: administração via dieta de bactérias nativas pode incrementar o
crescimento de T. tambroides por promover crescimento muscuar e aumentando a
expressão gênica relacionada ao crescimento
Avaliação da performance de crescimento:
1.Nível celular: análise morfométrica das fibras musculares
2.Nível molecular: análise da expresssão relativa de mRNA dos principais
genes relacionados ao crescimento

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Materiais e Métodos
1) Os peixes e as condições de cultivo
2) Isolamento e critério de seleção de cepas probióticas potenciais
3) Formulação da dieta-base
4) Preparação da dieta experimental e alimentação
5) Estimação dos parâmetros de crescimento
6) Análise de composição centesimal
7) Análise morfométrica dos músculos
8) Análise da expressão de mRNA de genes de GH, IGF e MSTN
9) Análise estatística

20

21
Os peixes e as condições de cultivo
● 300 juvenis foram utilizados
● Aclimatação de 1 semana
– Ração 40% PB
● 240 indivíduos foram selecionados
– Peso inicial: 1.39 ± 0.05 g
– Distribuídos em 12 aquários de vidro retangulares (100 L)
– Densidade de estocagem: 20 peixes/aquário

22
Os peixes e as condições de cultivo
Cada aquário foi mantido em
sistema fechado para evitar
contaminação cruzada entre os
diferentes probióticos
● Temperatura: 26 ± 0.5 °C
● Aeração contínua (pedra porosa)
● Resto de alimento e fezes foram
recolhidas através de sifão
quando necessário
Os aquários foram limpos
semanalmente para reduzir o risco
de crescimento bacteriano e
saturação por amônia

23

24
Isolamento e critério de seleção de cepas probióticas
potenciais
Bactéria candidatas a probiótico foram
isoladas de intestino de T. tambroides
adultos
● Método: plaqueamento direto em TSB
● Placas incubadas por 24-48 h a 25 ºC
Ágar carboximetilcelulose
contendo 1% de vermelho congo:
Atividade celulolítica
TSA 1% tween 80 e 0,001%
CaCl2
2H2
O:
atividade lipolítica
TSA 1% de leite desnatado:
atividade proteolítica
Ágar-amido:
atividade amilolítica
Incubaçãoa25ºC
72-90h

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Isolamento e critério de seleção de cepas probióticas
potenciais
● Foram selecionadas as colônias com ampla zona de ação após
a incubação
● Os isolados foram identificados através do sequenciamento do
gene 16S rRNA
● Foram selecionados três diferentes probióticos de acordo com
suas atividades enzimáticas digestivas in vitro. :
– Bacillus sp. AHG22, Alcaligenes sp. AFG22, and Shewanella sp.
AFG21

26
Seleção de cepas probióticas potenciais
●
Bacillus sp. AHG22
– Isolado da região posterior do intestino
– Apenas atividade proteolítica
●
Shewanella sp. AFG21
– Isolada da região anterior do intestino
– Apresentou atividade lipolítica e proteolítica
●
Alcaligenes sp. AFG22
– Isolada do intestino anterior
– Apresentou atividade amilolítica, lipolítica e proteolítica
Tais bactérias foram não
são capazes de causar
doenças ao hospedeiro

27

28
Formulação da dieta-base
● Composição: 40% PB e 11% lipídeos
● Preparação
1. Todos os ingredientes secos foram pesados e peneirador (tela 150 μm) e
misturados durante 10 min
2. Mistura prévia de lecitina de soja e óleo de fígado de bacalhau
3. Juntam-se ambas as misturas e são novamente misturadas durante 10 min
4. Todos os ingredientes secos foram completamente misturados com 35-40%
de água e passados através de uma máquina de moer carne Pélete com→
1,2-2,2 de diâmetro
5. Secagem da ração em forno a 40 ºC por 7-8 h
6. Quebra dos agregados até tamanho desejado
7. Estocagem a – 20 ºC até preparação da dieta probiótica

29

30
Preparação da dieta experimental e
alimentação
● 4 dietas: uma controle e 3
probióticas utilizando-se a dieta
basal
● Cepas probióticas candidatas:
– Cresceram separadamente em
tubos com TSB por 18 h a 25 ºC
– Após cultivo, bactérias foram
coletadas através de centrifugação
– Foram lavadas três vezes com
solução salina tamponada com
fosfato estéril (PBS, pH 7,4)
– Suspensão em PBS
– Dieta controle foi preparada
imergindo-a em PBS sem probiótico
por 5 min
Imersão em PBS com probiótico por 5
min → para garantir uma concentração
final de 1,0 x 108
UFC g -1
Verificação da colonização:
contagem em TSA a 25 ºC por 24 h
Concentração de probiótico baseada
em recomendação de Bacilus sp.
suplementado para Catla catla

31
Preparação da dieta experimental e
alimentação
● Após a imersão
– Dieta experimental foi seca ao ar em sala com temperatura de 28-30 ºC
em condições estereis por 24 h e estocadas hermeticamente a 4 ºC por 7
dias
● Dieta foi preparada semanalmente para garantir a viabilidade do
probiótico em 97%
● Ajustes de alimentação:
– Duas vezes ao dia
– 3% PV
– 90 dias

32

33
6. Estimação dos parâmetros de
crescimento
Parâmetros observados
 Peso final
 Ganho de peso (%)
 Taxa de crescimento (% dia -1
)
 Taxa de conversão alimentar aparente

34

35
Composição centesimal
● Foi analizada a composição centesimal da alimentação e do
corpo inteiro de T. tambroides
– Matéria seca: segagem a 105 ºC até peso constante da amostra
– Matéria mineral: combustão de uma amostra a 550 ºC por 12 h
– Proteína bruta foi determinada pela mensuração do conteúdo de
nitrogênio: método Kjeldhal
– Lipídeos totais foram analizados pelo método Soxhlet

36

37
Análise morfométrica dos músculos
● Foram escolhidos
aleatoriamente 3 peixes de cada
tanque (9 peixes/tratamento)
após 90 dias de experimento
● Foram coletadas amostras de
músculo esquelético
– Cortes transversais próximos à
nadadeira dorsal de cada peixe
coletado

38
7. Análise morfométrica dos músculos
● Amostra
– Pelo menos 400 fibras
musculares brancas de cada
peixe por grupo
– Medição: software Sigma
Scan Pro5, SPSS INC
● As fibras foram distribuídas em
classes de acordo com o
diâmetro (d, μm):
– classe 10 = d 10≤
– classe 20 = 10 < d 20≤
– classe 30 = 20 < d 30≤
– classe 40 = 30 < d 40≤
– classe 50 = 40 < d 50≤
– classe 60 = 50 < d 60≤
– classe 70 = d > 60

39

41
Efeitos no crescimento e composição do
músculo
Peso médio final
e ganho de peso
(%)
Alcaligenes sp.
Bacillus sp. Shewanella sp.
Dieta controle
>> > –
Taxa de crescimento >> –
Redução na
conversão alimentar 26,7% 22,9% 15,4% –

42
Efeitos no crescimento e composição do
músculo
Administração de probióticos não teve nenhuma
influência na sobrevivência de juvenis de T.
tambroides
Os teores de proteína muscular, lipídios e cinzas não
foram afetados (P> 0,05)

43
Efeitos na morfometria das fibras
musculares

44
Seções transversais de músculo esquelético após
a alimentação experimental
Fibras musculares
distribuídas em padrão
mosaico caracterizado por
fibras de diferentes
diâmetros

45Todos as classes de diâmetros de fibras, exceto classe 10, foram
significativamente diferentes entre os tratamentos
Distribuição de fibras de músculo branco do T. tambroides alimentados com dietas conntendo
diferentes probióticos nativos em classes de diâmetros (d, μm)

46
Efeitos na morfometria das fibras
musculares
● Suplementação com probióticos nativos x Hiperplasia de fibras
musculares:
– Não influenciou fibras de pequeno diâmetro (classe 10)
– Suplementação com Alcaligenes sp. e Bacillus sp.
● Quantidade de fibras mais largas (Classes: 50, 60 e 70) foi
significativamente maior
● Quantidade de fibras intermediárias foi significativamente menores

47
Incremento na taxa de crescimento de T.
tambroides foi principalmente governada por
crescimento hipertrófico do que por crescimento
por hiperplasia

48
Efeitos na expressão gênica relacionada ao
crescimento
GH hipofisário e IGF1 hepático foram
sigficativamente regulados pela suplementação de
probióticos nativos
IGF2 hepático e expressão de MSTNb em todos os
tratamento probióticos não foi significativamente
diferente (P > 0,05) comparados ao controle
Quatro genes analizados:

49
Expressão de genes relacionados a GH e
IGF1

50
Expressão de genes relacionados a IGF2 e
MSTNb

52
Uso de probióticos nativos
● Têm ganhado popularidade em anos recentes como fonte de
micróbios benéficos à indústria habitualmente dependente do
uso de microrganismos terrestres
● Possuem benefícios semelhates aos demais
– Podem incrementar o crescimento e bem estar de animais
cultivados

53
Resultados de outras pesquisas:
● Ganhos de peso observados
nesse estudo:
– Shewanella sp.: 31,9%
– Bacillus sp.: 69,5%
– Alcaligenes sp.: 73,2%
● Outros estudos
demonstraram que a
suplementação dietética de
Shewanella putrefaciens
and Bacillus sp. melhoraram
o crescimento de diferentes
peixes¹ e camarões²
1 - Salinas et al., 2005; Aly et al., 2008;
Bagheri et al., 2008; Merrifield et al., 2010;
De la Banda et al., 2012; Tapia-Paniagua et
al., 2012
2 - Zokaeifar et al., 2012; Silva et al., 2013
Há pouca informação sobre sua
ação probiótica
Este é o primeiro registro de sua
ação na melhoria do
crescimento de peixes

54
Mecanismo celular e molecular dos
probióticos
● Muitos estudos reportam o efeito sobre crescimento em várias
espécies de peixes
● Pouquíssimos estudos avaliaram o que ocorre a nível celular e
molecular
– Fibras hiperplásicas recém recrutadas são relativamente pequenas
– Aumentam o volume através de crescimento hipertrófico
● Hiperplasia: associada a fibras pequenas
● Hipertrofia: correlacionada com fibras de dimensões maiores
Diâmetro das fibras individuais pode ser usado para avaliar o
crescimento muscular sob a influência de diferentes probióticos
nativos

55
probióticos
● Fibras de diferentes classes indicativo do grau de formação de→
novas fibras e da variação da taxa de crescimento das fibras
existentes
– Foi observado padrão de distribuição semelhante em juvenis de T.
tambroides sob a influência de diferentes alimentos vivos e formulados²
– O presente estudo corroborou que diferentes probióticos associados ao
hospedeiro alteraram a distribuição de freqüência das fibras musculares
brancas com exceção das fibras hiperplásticas (classe de diâmetro 10)
2 - Asaduzzaman et al., 2017

56
probióticos
● Fibras hipertróficas (diâmetro > 50 μm) foi significativamente
maior nos tratamentos com Alcaligenes sp. e Bacillus sp.
– Possibilidade: regulação de fatores genéticos associados ao
crescimento, como demonstrado pelas mudanças dos seus padrões
de expressão de mRNA

57
probióticos
● Crescimento de músculo em peixes:
– Fatores exógenos e endógenos
(hormônios e genética)
● Administração de probiótico nativo a
nível molecular
– Genes relacionados ao crescimento
– Tratamentos com Alcaligenes sp. e
Bacillus sp. apresentaram 2,5-3,0
mais expressão do mRNA GH da
hipófise
1 - Inui and Ishioka, 1985; Fauconneau et al., 1996
● Estudos anteriores
demonstraram resultados
semelhantes
– Foi observado nesse estudo
um incremento não
significativo estatísticamente
na proteína múscular nos
tratamentos com
Alcaligenes sp. e Bacillus sp.
Indicando que há regulação, por parte do
probiótico nativo, que pode estar envolvido no
crescimento muscular hipertrófico como
revelado na análise morfométrica do músculo

58
probióticos
● IGF’s estimulam absorção de glucose e alanina, síntese de proteína e
proliferação dos mioblastos
– Demonstrado em outras espécies de teleósteos¹
●
Foi observado em T. tambroides uma expressão regulada de IGF-1, mas não
de IGF-2
– Probióticos nativos possuem papel importante no crescimento muscular hipertrófico
● Muitos estudos² demonstraram que suplementação de probióticos pode
regular fortemente a expressão de IGF-1
1 - Castillo et al., 2004; Codina et al., 2008; Rius-Francino et al., 2011; Garikipati and Rodgers, 2012a, 2012b; Montserrat et
al., 2012)
2 - Carnevali et al., 2006; Avella et al., 2010; Shaheen et al., 2014

59
probióticos
● Expressão de IGF-1 tem correlação positica com a
performance de crescimento¹
● Resultados semelhantes foram observados quando foram
adicionados probióticos à àgua de cultivo de peixe palhaço
(Amphiprion ocellaris)
– Houve um aumento inesperado de IGF-1 e IGF-2 e um peso corporal
três vezes maior comparado ao grupo controle²
● 1 - Carnevali et al., 2006
● 2 - Avella et al., 2010

60
probióticos
● A importância da expressão de IGF-1 e IGF-2 pode ser espécie-específica¹
– Truta arco-íris²: o mRNA de IGF-1 aumentou significativamente após a
realimentação de peixes em jejum, mas apenas um aumento pequeno ou mais
lento da expressão de mRNA de IGF2
– Sparus aurata³: IGF2 teve efeitos mais fortes do que o IGF-1 na proliferação de
miócitos
– Na truta arco-íris4
, foi demonstrado que os IGFs também regulam o crescimento
muscular aumentando a expressão de fatores reguladores miogênicos (myf5,
MyoD and myogenin) e regulação negativa da expressão de genes relacionados
com miostatina e atrofia
1 - Chauvigne et al., 2003; Peterson and Small, 2004
2 - Chauvigne et al., 2003; Gabillard et al., 2006
3 - Rius-Francino et al., 2011
4 - Fuentes et al., 2012

61
probióticos
● Muitos estudos reportaram que MSTN age como regulador
negativo que inibe a proliferação de células-satélite durante o
desenvolvimento e crescimento do músculo
● Nessa pesquisa foi observado que houve uma expressão de
mRNA do MSTN não-significativa
– Isso indica que probióticos nativos não possuem efeitos inibidores
sobre o MSTN
Entretanto, a regulação de miostatina no
crescimento do músculo depende da espécie,
condições nutricionais, fase de crescimento e tipo
de músculo (Patruno et al., 2008).

63
Conclusão
1) Bactérias nativas, especialmente Alcaligenes sp. AFG22,
podem ser utilizadas como probiótico para melhorar o
crescimento de juvenis de Mahseer
– Bacillus sp. AHG22 também tem efeito positivo
2) Crescimento do T. tambroides é principalmente governado pelo
crescimento hipertrófico e regulado pela expressão gênica de
GH e IGF-1
3)Shewanella sp. não apresentou função satisfatória no
crescimento

64
Conclusão
● Neste estudo, foi focado inicialmente nos efeitos nutricionais
de probióticos nativos
– T. tambroides é uma espécie de crescimento lento
– Não haviam registros de infeccções sérias destas espécies de
bactérias
● Novas estudos são necessários para avaliar:
1) Efeitos de probióticos sobre sistema imunológico e genes de
resistência a doenças
2) Efeitos sobre animais maiores

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