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Bioquímica Estrutural
         Enzimas




     Profª Kasue
Enzimas
• São proteínas que aceleram a velocidade das
  reações químicas em sistemas biológicos;
• Não são consumidas ou alteradas durante a catálise;
• São altamente específicas em relação aos seus
  substratos;
• Não alteram o equilíbrio das reações;
• Têm sua atividade regulada geneticamente ou por
  condições metabólicas


                        Profª Kasue
Classificação

Classe                         Tipo de reação catalisada

1- Oxidorredutases             Reações de óxido-redução

2- Transferases                Transferência de grupos
                               funcionais
3- Hidrolases                  Reações de hidrólise

4- Liases                      Remoção de grupos

5- Isomerases                  Isomerização

6- Ligases                     Formação de ligação entre 02
                               moléculas
                         Profª Kasue
Cofatores e coenzimas

• Algumas enzimas são proteínas simples.
  Exemplos: pepsina, tripsina
• A maioria das enzimas necessitam de
  cofatores e coenzimas para exercerem
  atividade catalítica;




                     Profª Kasue
Cofatores metálicos

Metais de transição         Metais alcalino e alcalino
                            terrosos
Fe2+                        Na+
Zn2+                        K+
Cu2+                        Mg2+
                            Ca2+




                      Profª Kasue
Coenzimas
Moléculas orgânicas pequenas, frequentemente
derivadas de vitaminas

Coenzima                        Fonte vitamínica
Coenzima A                      Ácido pantotênico
Flavina                         Riboflavina (B2)
Nicotinamida                    Nicotinamida (Niacina)
Pirofosfato de tiamina          Tiamina (B1)
Retinal                         Vitamina A

                         Profª Kasue
Isoenzimas

• As isoenzimas ou isozimas são formas moleculares
  múltiplas de uma enzima, que realizam a mesma
  ação catalítica e ocorrem na mesma espécie animal.
• Exemplo: lactato−desidrogenase (LDH): um
  tetrâmero formado por duas espécies diferentes de
  cadeias polipeptídicas, denominadas M (músculo) e
  H (coração)




                        Profª Kasue
Composição das subunidades da LDH e
        suas principais localizações
Tipo          Composição           Localização
LDH-1         HHHH                 Miocárdio e
                                   hemácias
LDH-2         HHHM                 Miocárdio e
                                   hemácias
LDH-3         HHMM                 Cérebro e fígado
LDH-4         HMMM                 -
LDH-5         MMMM                 Músc. esquelético
                                   e fígado

                     Profª Kasue
Aplicações clínicas das enzimas
      Enzimas do plasma, LCR, urina e exsudatos


  Processo normal de destruição e reposição celular

Processos patológicos                 Lesão tecidual

            Aumento da permeabilidade
            celular

        Aumento da concentração no plasma
                        Profª Kasue
Enzimas dosadas no laboratório clínico

Enzimas                   Órgão ou tecido afetado
Aldolase                  Músculo, coração
Amilase                   Pâncreas
CPK                       Coração, músculo, cérebro
Fosfatase ácida           Próstata
Fosfatase alcalina        Fígado, ossos
LDH                       Fígado, coração, eritrócitos
TGP                       Fígado, coração
TGO                       Fígado, coração

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Cinética enzimática

 Especificidade: As enzimas são altamente específicas
  tanto na reação catalisada como na sua escolha de
  reagentes, os quais são chamados de substratos.

 Centro ativo: é a região que se liga aos substratos (e
  ao grupamento prostético, se houver algum), e
  contém os radicais de aminoácidos que participam
  diretamente na geração e quebra de ligações. Estes
  radicais são chamados de grupamentos catalíticos.

                         Profª Kasue
Características do centro ativo:
-Ocupa uma parte relativamente pequena do
volume total de uma enzima;
- É uma entidade tridimensional formada por
grupamentos que vêm de diferentes partes da
seqüência linear de aminoácidos;
- Os substratos são ligados a enzimas por
atrações fracas múltiplas;
- Centros ativos são fendas ou frestas;
- A especificidade de ligação depende do arranjo
precisamente definido de átomos no centro
ativo.

                     Profª Kasue
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Catálise

• Para que uma reação ocorra, as espécies
  reagentes devem possuir energia que lhes
  permita atingir um estado reativo, chamado
  estado de transição. Para levar todos os
  átomos ou moléculas de um mol de
  substância ao estado de transição, necessita-
  se de uma quantidade de energia, em calorias,
  definida como energia de ativação (Ea)


                     Profª Kasue
Profª Kasue
Constante de Michaelis-Menten
• A uma concentração constante de enzima, a
  velocidade de reação aumenta com o aumento da
  concentração do substrato, até que seja alcançada
  uma velocidade máxima. Os centros catalíticos são
  preenchidos e, então, a velocidade de reação alcança
  o máximo;




                        Profª Kasue
• A concentração de substrato necessária para obter a
metade da velocidade máxima é chamada de constante
de Michaelis (Km), e é expressa em moles de substrato
por litro de solução;
• Representa a concentração de substrato necessária
para saturar metade da quantidade da enzima e é
característica de cada enzima.
                        Profª Kasue
• Característicasdo Km:
-Km é característica de uma enzima e seu
respectivo substrato;
- Reflete a afinidade de uma enzima pelo seu
substrato;
- É numericamente igual à concentração do
substrato no qual a velocidade da reação é igual à
½ Vmáx. Não varia com a concentração da enzima;
- Valores baixos de Km: refletem uma alta
afinidade da enzima pelo seu substrato;
- Valores altos de Km: refletem uma baixa
afinidade da enzima pelo seu substrato.

                      Profª Kasue
Fatores que afetam a atividade enzimática
a) Temperatura:
• Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reação;
• Mais moléculas adquirem energia suficiente para atingir o
  estado de transição;
• A velocidade é acelerada pelo aumento da temperatura até
  atingir uma temperatura ótima na qual a enzima opera com a
  máxima eficiência;
• Como as enzimas são proteínas, os valores de temperatura
  ótima situam-se entre 40 e 45 °C e dependem do pH e da
  força iônica;
• Acima dessa temperatura, a atividade das enzimas declina por
  desnaturação protéica.

                            Profª Kasue
Profª Kasue
b) pH

• Alterações moderadas
  de pH afetam o estado
  iônico da enzima, e
  freqüentemente
  também o do substrato.
• O valor do pH no qual a
  atividade da enzima é
  máxima é chamado pH
  ótimo.


                        Profª Kasue
c) Concentração da enzima

• A velocidade máxima da
  reação é uma função da
  quantidade de enzima
  disponível;
• A velocidade aumenta
  proporcionalmente pela
  introdução de mais enzima
  ao sistema;
• A velocidade inicial da
  reação enzimática é
  diretamente proporcional à
  concentração de enzima
  (existindo substrato em
  excesso)

                           Profª Kasue
d) Concentração do substrato

• A velocidade inicial da
  reação é diretamente
  proporcional à
  concentração do
  substrato;
• A adição de mais
  reagente não aumenta
  mais a velocidade, pois
  todo reagente só existe
  na forma de complexos
  enzima−substrato (ES).
                        Profª Kasue
Regulação da atividade enzimática

Inibição enzimática
Modificação covalente
Modificação alostérica
Retroalimentação




                    Profª Kasue
Inibição da atividade enzimática
• Inibidores são substâncias que reduzem a atividade
  das enzimas;
• Exemplos: fármacos, antibióticos, preservativos de
  alimentos e venenos;
• Atuam como reguladores das vias metabólicas;
• Muitas terapias por fármacos são baseadas na
  inibição enzimática;
• Utilizados no desenvolvimento de técnicas para
  demonstrar a estrutura física e química, e as
  propriedades funcionais das enzimas.
                        Profª Kasue
Tipos de inibição
       Reversível             Irreversível


                 Não
Competitiva
              competitiva




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Inibição reversível

• Reversível competitiva: Características dos
  inibidores:
 competem diretamente com o substrato normal
  pelo sítio ativo das enzimas.
 São moléculas estruturalmente semelhantes ao
  substrato.
 O inibidor (I) competitivo reage reversivelmente
  com a enzima para formar um complexo
  enzima−inibidor (EI) análogo ao complexo
  enzima−substrato, mas cataliticamente inativo:
   E+I       EI + S → Não há reação
                       Profª Kasue
Profª Kasue
Inibição da succinato desidrogenase

               Profª Kasue
• Reversível não competitiva: Características:
 O inibidor não-competitivo se liga tanto à enzima
  como ao complexo ES em um sítio diferente do sítio
  de ligação do substrato.
 A ligação do inibidor não bloqueia a ligação do
  substrato, mas provoca uma modificação da
  conformação da enzima que evita a formação de
  produto:
  E+I     EI + S EIS → Não há reação
  E + S ES + I EIS → Não há reação


                       Profª Kasue
Profª Kasue
Modificação covalente

• Características:
 Modificações covalentes reversíveis;
 Reações catalisadas por outras enzimas;
 Exemplo:
  - fosforilação: quinases
  - defosfolorilação: fosfatases




                        Profª Kasue
Enzima
                  ativa



Defosforilação                 Fosforilação
 (fosfatases)                  (quinases)



                 Enzima
                 inativa

                 Profª Kasue
Modificação alostérica

• Características das enzimas alostéricas:
Enzimas reguladoras;
Sofrem mudanças conformacionais quando a
  elas se ligam moduladores específicos;
O sítio de ligação (sítio alostérico) aos
  moduladores é diferente e distante do sítio
  ativo;
Os moduladores se ligam reversível e não
  covalentemente ao sítio alostérico
                     Profª Kasue
Efetor negativo: reduz a afinidade da enzima pelo
substrato, diminui a velocidade da reação
Efetor positivo: aumenta a afinidade da enzima pelo
substrato, eleva a velocidade da reação
                      Profª Kasue
Retroalimentação (feedback)
 Ocorre uma diminuição (ou aumento) da atividade
enzimática de acordo com o aumento (ou diminuição) de
compostos relacionados com o produto da reação.




Regulação de uma via biossintética por inibição retroativa
(feedback): Na via de biossíntese da isoleucina a partir da
treonina , o acúmulo do produto, isoleucina (F), provoca a
inibição da primeira reação da via; a isoleucina liga-se à
enzima que catalisa esta reação (enzima 1) reduzindo sua
atividade.
                         Profª Kasue
Inibidores enzimáticos e fármacos




Esquema resumido da replicação viral com as etapas em
que atuam alguns medicamentos
                        Profª Kasue
O


                                           O                                          NH

                                                 N                                              O
H2N                COOH                N                      NH

                                                                      O                    OH
                                H 2N       N     N
       Substrato: PABA                     H
                                                                             OH


                                                     Produto: Ácido fólico

H2N                SO2NH 2


      Inibidor: Sulfanilamida



 Sulfanilamida compete com o Ácido p-
 aminobenzóico, na síntese do ácido fólico,
 necessário para o crescimento bacteriano

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Enzimas

  • 1. Bioquímica Estrutural Enzimas Profª Kasue
  • 2. Enzimas • São proteínas que aceleram a velocidade das reações químicas em sistemas biológicos; • Não são consumidas ou alteradas durante a catálise; • São altamente específicas em relação aos seus substratos; • Não alteram o equilíbrio das reações; • Têm sua atividade regulada geneticamente ou por condições metabólicas Profª Kasue
  • 3. Classificação Classe Tipo de reação catalisada 1- Oxidorredutases Reações de óxido-redução 2- Transferases Transferência de grupos funcionais 3- Hidrolases Reações de hidrólise 4- Liases Remoção de grupos 5- Isomerases Isomerização 6- Ligases Formação de ligação entre 02 moléculas Profª Kasue
  • 4. Cofatores e coenzimas • Algumas enzimas são proteínas simples. Exemplos: pepsina, tripsina • A maioria das enzimas necessitam de cofatores e coenzimas para exercerem atividade catalítica; Profª Kasue
  • 5. Cofatores metálicos Metais de transição Metais alcalino e alcalino terrosos Fe2+ Na+ Zn2+ K+ Cu2+ Mg2+ Ca2+ Profª Kasue
  • 6. Coenzimas Moléculas orgânicas pequenas, frequentemente derivadas de vitaminas Coenzima Fonte vitamínica Coenzima A Ácido pantotênico Flavina Riboflavina (B2) Nicotinamida Nicotinamida (Niacina) Pirofosfato de tiamina Tiamina (B1) Retinal Vitamina A Profª Kasue
  • 7. Isoenzimas • As isoenzimas ou isozimas são formas moleculares múltiplas de uma enzima, que realizam a mesma ação catalítica e ocorrem na mesma espécie animal. • Exemplo: lactato−desidrogenase (LDH): um tetrâmero formado por duas espécies diferentes de cadeias polipeptídicas, denominadas M (músculo) e H (coração) Profª Kasue
  • 8. Composição das subunidades da LDH e suas principais localizações Tipo Composição Localização LDH-1 HHHH Miocárdio e hemácias LDH-2 HHHM Miocárdio e hemácias LDH-3 HHMM Cérebro e fígado LDH-4 HMMM - LDH-5 MMMM Músc. esquelético e fígado Profª Kasue
  • 9. Aplicações clínicas das enzimas Enzimas do plasma, LCR, urina e exsudatos Processo normal de destruição e reposição celular Processos patológicos Lesão tecidual Aumento da permeabilidade celular Aumento da concentração no plasma Profª Kasue
  • 10. Enzimas dosadas no laboratório clínico Enzimas Órgão ou tecido afetado Aldolase Músculo, coração Amilase Pâncreas CPK Coração, músculo, cérebro Fosfatase ácida Próstata Fosfatase alcalina Fígado, ossos LDH Fígado, coração, eritrócitos TGP Fígado, coração TGO Fígado, coração Profª Kasue
  • 11. Cinética enzimática  Especificidade: As enzimas são altamente específicas tanto na reação catalisada como na sua escolha de reagentes, os quais são chamados de substratos.  Centro ativo: é a região que se liga aos substratos (e ao grupamento prostético, se houver algum), e contém os radicais de aminoácidos que participam diretamente na geração e quebra de ligações. Estes radicais são chamados de grupamentos catalíticos. Profª Kasue
  • 12. Características do centro ativo: -Ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de uma enzima; - É uma entidade tridimensional formada por grupamentos que vêm de diferentes partes da seqüência linear de aminoácidos; - Os substratos são ligados a enzimas por atrações fracas múltiplas; - Centros ativos são fendas ou frestas; - A especificidade de ligação depende do arranjo precisamente definido de átomos no centro ativo. Profª Kasue
  • 14. Catálise • Para que uma reação ocorra, as espécies reagentes devem possuir energia que lhes permita atingir um estado reativo, chamado estado de transição. Para levar todos os átomos ou moléculas de um mol de substância ao estado de transição, necessita- se de uma quantidade de energia, em calorias, definida como energia de ativação (Ea) Profª Kasue
  • 16. Constante de Michaelis-Menten • A uma concentração constante de enzima, a velocidade de reação aumenta com o aumento da concentração do substrato, até que seja alcançada uma velocidade máxima. Os centros catalíticos são preenchidos e, então, a velocidade de reação alcança o máximo; Profª Kasue
  • 17. • A concentração de substrato necessária para obter a metade da velocidade máxima é chamada de constante de Michaelis (Km), e é expressa em moles de substrato por litro de solução; • Representa a concentração de substrato necessária para saturar metade da quantidade da enzima e é característica de cada enzima. Profª Kasue
  • 18. • Característicasdo Km: -Km é característica de uma enzima e seu respectivo substrato; - Reflete a afinidade de uma enzima pelo seu substrato; - É numericamente igual à concentração do substrato no qual a velocidade da reação é igual à ½ Vmáx. Não varia com a concentração da enzima; - Valores baixos de Km: refletem uma alta afinidade da enzima pelo seu substrato; - Valores altos de Km: refletem uma baixa afinidade da enzima pelo seu substrato. Profª Kasue
  • 19. Fatores que afetam a atividade enzimática a) Temperatura: • Quanto maior a temperatura, maior a velocidade da reação; • Mais moléculas adquirem energia suficiente para atingir o estado de transição; • A velocidade é acelerada pelo aumento da temperatura até atingir uma temperatura ótima na qual a enzima opera com a máxima eficiência; • Como as enzimas são proteínas, os valores de temperatura ótima situam-se entre 40 e 45 °C e dependem do pH e da força iônica; • Acima dessa temperatura, a atividade das enzimas declina por desnaturação protéica. Profª Kasue
  • 21. b) pH • Alterações moderadas de pH afetam o estado iônico da enzima, e freqüentemente também o do substrato. • O valor do pH no qual a atividade da enzima é máxima é chamado pH ótimo. Profª Kasue
  • 22. c) Concentração da enzima • A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade de enzima disponível; • A velocidade aumenta proporcionalmente pela introdução de mais enzima ao sistema; • A velocidade inicial da reação enzimática é diretamente proporcional à concentração de enzima (existindo substrato em excesso) Profª Kasue
  • 23. d) Concentração do substrato • A velocidade inicial da reação é diretamente proporcional à concentração do substrato; • A adição de mais reagente não aumenta mais a velocidade, pois todo reagente só existe na forma de complexos enzima−substrato (ES). Profª Kasue
  • 24. Regulação da atividade enzimática Inibição enzimática Modificação covalente Modificação alostérica Retroalimentação Profª Kasue
  • 25. Inibição da atividade enzimática • Inibidores são substâncias que reduzem a atividade das enzimas; • Exemplos: fármacos, antibióticos, preservativos de alimentos e venenos; • Atuam como reguladores das vias metabólicas; • Muitas terapias por fármacos são baseadas na inibição enzimática; • Utilizados no desenvolvimento de técnicas para demonstrar a estrutura física e química, e as propriedades funcionais das enzimas. Profª Kasue
  • 26. Tipos de inibição Reversível Irreversível Não Competitiva competitiva Profª Kasue
  • 27. Inibição reversível • Reversível competitiva: Características dos inibidores:  competem diretamente com o substrato normal pelo sítio ativo das enzimas.  São moléculas estruturalmente semelhantes ao substrato.  O inibidor (I) competitivo reage reversivelmente com a enzima para formar um complexo enzima−inibidor (EI) análogo ao complexo enzima−substrato, mas cataliticamente inativo: E+I EI + S → Não há reação Profª Kasue
  • 29. Inibição da succinato desidrogenase Profª Kasue
  • 30. • Reversível não competitiva: Características:  O inibidor não-competitivo se liga tanto à enzima como ao complexo ES em um sítio diferente do sítio de ligação do substrato.  A ligação do inibidor não bloqueia a ligação do substrato, mas provoca uma modificação da conformação da enzima que evita a formação de produto: E+I EI + S EIS → Não há reação E + S ES + I EIS → Não há reação Profª Kasue
  • 32. Modificação covalente • Características:  Modificações covalentes reversíveis;  Reações catalisadas por outras enzimas;  Exemplo: - fosforilação: quinases - defosfolorilação: fosfatases Profª Kasue
  • 33. Enzima ativa Defosforilação Fosforilação (fosfatases) (quinases) Enzima inativa Profª Kasue
  • 34. Modificação alostérica • Características das enzimas alostéricas: Enzimas reguladoras; Sofrem mudanças conformacionais quando a elas se ligam moduladores específicos; O sítio de ligação (sítio alostérico) aos moduladores é diferente e distante do sítio ativo; Os moduladores se ligam reversível e não covalentemente ao sítio alostérico Profª Kasue
  • 35. Efetor negativo: reduz a afinidade da enzima pelo substrato, diminui a velocidade da reação Efetor positivo: aumenta a afinidade da enzima pelo substrato, eleva a velocidade da reação Profª Kasue
  • 36. Retroalimentação (feedback)  Ocorre uma diminuição (ou aumento) da atividade enzimática de acordo com o aumento (ou diminuição) de compostos relacionados com o produto da reação. Regulação de uma via biossintética por inibição retroativa (feedback): Na via de biossíntese da isoleucina a partir da treonina , o acúmulo do produto, isoleucina (F), provoca a inibição da primeira reação da via; a isoleucina liga-se à enzima que catalisa esta reação (enzima 1) reduzindo sua atividade. Profª Kasue
  • 37. Inibidores enzimáticos e fármacos Esquema resumido da replicação viral com as etapas em que atuam alguns medicamentos Profª Kasue
  • 38. O O NH N O H2N COOH N NH O OH H 2N N N Substrato: PABA H OH Produto: Ácido fólico H2N SO2NH 2 Inibidor: Sulfanilamida Sulfanilamida compete com o Ácido p- aminobenzóico, na síntese do ácido fólico, necessário para o crescimento bacteriano Profª Kasue