Apresentação do paper "De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs".

1. Colored De Bruijn
Graphs
Marcos Castro

2. De novo assembly and genotyping of variants
using colored de Bruijn Graphs
1

3. “
Variantes genéticas e HTS

4. “
Abordagem tradicional:
mapear os reads para um genoma de
referência.

5. “
Limitação 1: a amostra pode conter
sequência faltante.

6. “
Limitação 2: sequências referências
incompletas.

7. “
Limitação 3: reads de regiões faltantes
frequentemente mapeiam para regiões
parálogas levando a falsos variant calls.

8. “
Limitação 4: amostras em estudo podem
não ter uma referência disponível ou
adequada.

9. “
Limitação 5: os métodos não determinam
a exata localização/tamanho de
variantes.

10. “
Limitação 6: focam em um único tipo de
variante, isso pode levar a erros.

11. “Algumas limitações podem ser resolvidas
com de novo assembly.
Exemplo: tipo de variante
De novo assembly também possui
limitações.

12. “
Métodos de montagem tem ignorado
informação pré-existente de variantes
conhecidas ou sequência referência.

13. “
Objetivo desse artigo: detectar e
caracterizar variações genéticas em um
ou mais indivíduos.

14. “Os algoritmos propostos fazem uso de
Grafos De Bruijn (DBG).
Acrescentam ao DBG clássico coloração
dos nós e arestas por amostras que estão
sendo observadas.

15. “
Leva em conta informações das amostras:
uma ou mais sequências referências e
variantes conhecidas.

16. “
O método também é capaz de detectar
variação em espéces sem uma referência,
combinando informações através de
vários indivíduos para melhorar a
acurácia.

17. “
Nome da aplicação desenvolvida: Cortex.
Site:
http://cortexassembler.sourceforge.net

18. “
DBG’s representam informação
sobreposta.
Muito utilizados em montagem de
genoma. Exemplos: Velvet, Abyss etc.

19. “O grafo consiste de um conjunto de nós
representando palavras de tamanho K.
Essas palavras são k-mers.
K-mers são substrings!

20. “
Arestas direcionadas juntam os k-mers.

21. “
Variações entre genomas geram novos
nós e arestas.

22. “
Exemplo: ACT, k = 2
K-mers: AC, CT
AC CT
ACT
nó
aresta
nó

23. “
O grafo pode apresentar estruturas
conhecidas.
Exemplo: bolhas.

24. “Bolha:

25. “
Um DBG colorido generaliza a formulação
original para várias amostras.
A identidade de cada amostra é mantida
pela coloração dos nós.

26. “
Alguns algoritmos para descoberta de
variantes e genotipagem:
1) Bubble-calling
2) Path divergence

27. “
Bubble-calling: método mais simples para
identificar bolhas em um único indivíduo
diplóide.

28. “
A abordagem bubble-calling pode ter uma
alta taxa de falsos positivos que pode ser
melhorado com a inclusão de um genoma
de referência.

29. “
Esses falsos positivos são causadas pela
dificuldade de separar bolhas de repetição
e de variação.

30. “
Descoberta de variante em um único indivíduo diploide.
A referência está em vermelho.

31. “
Resumindo: polimorfismos verdadeiros
geram bolhas que divergem da referência,
enquanto que estruturas de repetição
levam a bolhas também observadas na
referência.

32. “
O que temos é um genoma de referência
auxiliando na detecção de variantes.

33. “
Todos os tipos de variantes podem induzir
bolhas.

34. “
Para variantes complexas (grandes
deleções, novas inserções, inversões) pode
ser difícil gerar um contig limpo.

35. “
PD algorithm pode aumentar
substancialmente a capacidade de
detectar varitantes.

36. “
Caso simples: amostras são combinadas
numa única cor.

37. “
Mantendo cores separadas para cada
amostra , tem-se a informação adicional
sobre se uma bolha é induzida por
repetições ou erros.

38. “
Quando é induzida por repetições, muitas
ou todas as amostras apresentam
cobertura de ambos os caminhos na
bolha.

39. “
Várias amostras (cada uma com um cor diferente).
Cobertura normal,
nenhuma variância
entre amostras.

40. “
Bolhas de repetição: ambos os lados da bolha estão
presentes em todas as amostras.

41. “
Portanto, pode ser descoberta variante
mesmo em espécies onde não há
nenhuma referência adequada.

42. “
Tem-se desenvolvidos métodos
estatísticos que permitem a classificação
probabilística de estruturas de bolhas
decorrentes de erros, repetições ou
variantes.

43. “
Se tiver um genoma de referência, essa
abordagem pode ajudar a distinguir
variantes verdadeiras de erros e
estruturas de repetição.

44. “
DBG coloridos podem ser usados para
genotipar amostras em loci conhecida
mesmo quando a cobertura é insuficiente.

45. “
Em azul temos a cobertura (insuficiente).
Os alelos estão em vermelho e verde.

46. “
Foi construído um DBG colorido da
sequência referência, variantes alélicas
conhecidas e dados a partir da amostra.

47. “Cortex é um assembler eficiente do ponto
de vista de memória.
Ele constrói e representa um DBG
colorido. Realiza variant calling e
genotipagem de dados HTS.

48. “
Foi utilizada uma eficiente hash table que
codifica implicitamente o grafo.
O uso de memória é previamente
especificado de acordo com uma fórmula.

49. “
Várias operações tem complexidade linear
ou melhor.

50. “
K-mers e seus complementos reversos são
armazenados em um único nó.

51. “
Valor da hash table é um array de
inteiros representando a cobertura de
cada cor.

52. “
Para cada k-mer, uma flag binária é
usada para cada nucleotídeo para
verificar se uma determinada aresta está
presente.

53. “
É o único assembler capaz de lidar com
vários eucariotos simultaneamente.
Exemplo: 10 seres humanos utiliza menos
de 256GB de RAM.

54. “
Exemplo de K: 75
(teste com dados de humanos)

55. “
O aumento do K (tamanho do k-mer)
aumenta a probabilidade de um k-mer
conter um erro.

56. “
O tamanho do k-mer maximiza a
sensibilidade do BC algorithm.

57. “
Exemplo: com cobertura 50x, K = 65 e
100bp reads, foi identificado 86% dos
SNPs de 92% possíveis.

58. “
O Cortex se utiliza de DBG colorido para
representar informações de várias fontes
e abordagens estatísticas para detectar
variantes de diferentes tipos.

59. “Um implementação eficiente do DBG
colorido permite a utilização de dados de
várias amostras bem como sequências de
referências e variantes conhecidas.
Todos são incluídos numa única estrutura
de grafo. A identidade da amostra é
preservada com o uso de cores.

60. “
Essa abordagem permite a análise
simultânea de vários genomas.
Isso pode ser poderoso para detectar
variantes precisas sem qualquer
necessidade de um genoma de referência.

61. “
É possível a análise HTS de variações
genéticas em qualquer espécie.

62. “
A abordagem também possui limitações.

63. “
Limitação 1: não foi usada informação
read-pair para melhorar a montagem
local.

64. “
Limitação 2: explosão do grafo quando
mais indivíduos são incluídos.

65. “
Limitação 3: aumenta necessidade de
correção de erro quando o k-mer
aumenta.

66. Succint Colored de Bruijn Graphs2

67. “
DBG colorido foi introduzido em 2012.
Objetivo: detectar e genotipar variantes
genéticas simples e complexas em um
indivíduo ou população.

68. “
Relembrando o DBG clássico:
1) Conjunto de strings (sequence reads)
2) Vértice para cada (k-1)-mer.
3) Aresta para cada k-mer com (k-1)-mer
prefixo e (k-1)-mer sufixo.

69. “
Um contig é um caminho sem
ramificação.

70. “
A aresta em um DBG colorido é o mesmo
do DBG clássico.

71. “
A diferença: cada vértice ((k-1)-mer) e
aresta (k-mer) estão associados a uma
lista de cores correspondendo as
amostras.

72. “
Dado um conjunto de n amostras, existe
um conjunto C de n cores: c[1], c[2], c[3],
…, c[n] onde c[i] corresponde a amostra i e
todos os k-mers e (k-1)-mers que estão
contidos na amostra i são coloridos com
c[i].

73. “
Uma bolha no grafo corresponde a um
ciclo direcionado e é considerada um
indicativo de variação biológica.

74. “
Essas cores permitem que não perder o
controle dos indivíduos dos quais os
kmers foram originados.

75. “
Relembrando: o Cortex utiliza DBG
colorido para montar vários genomas
simultaneamente, por isso é importante o
uso das cores para manter um controle.

76. “
Nesse artigo foi desenvolvida uma
estrutura de dados eficiente para o
armazenamento e uso do DBG colorido.

77. “
Comparado ao Cortex, essa estrutura
reduz dramaticamente a quantidade de
memória para armazenar e utilizar o DBG
colorido com alguma penalidade de
execução.

78. “
Método VARI - 2016

79. “
Datasets, números de cores, k-mers etc.
foram removidos para eu poder colocar no slide...

80. “
Resumindo: Cortex ganha em tempo de
execução e o VARI ganha em eficiência de
memória.

81. Voltando ao Cortex...3

82. “
A detecção de variantes genéticas entre
amostras quando não há uma sequência
referência introduz desafios.

83. “
A acurácia do variant calling pode ser
melhorada adicionando uma sequência
referência.

84. “
Existem várias abordagens para o variant
calling: bubble calling, path divergence,
multiple-sample analysis, genotyping.

85. “
Algoritmo Bubble Calling

86. “Lembrando:
1) Bolhas podem ser induzidas por
variantes, repetições ou erros de
sequenciamento.
2) Variantes podem ser separadas de
repetições por inclusão da referência.

87. “
Alguns conceitos importantes para a
compreensão do algoritmo...

88. “
1) Nó: representa um k-mer (string de
tamanho K restrita ao alfabeto A, C, T, G).

89. “
2) Supernode: caminho de comprimento
máximo com restrição que somente o
primeiro/último nós do caminho podem
ter grau de entrada/saída != 1.

90. “
3) Bubble: é um par de supernodes que
tem os mesmos nós de início e fim.

91. “
4) Branch: cada um dos supernodes
constituindo uma bolha.

92. “
5) Tip: um pequeno caminho que termina
em um nó com grau de saída 0.

93. “
5) Confounded: uma variante que se
sobrepõem com outras partes do genoma
(ou com ela própria) impedindo que se
forma uma bolha limpa.

94. “O algoritmo Bubble Caller foi
implementado como um percurso de uma
hash table.
O tempo de acesso numa hash é
constante, portanto, o caminho tem um
custo proporcional ao tamanho da tabela.

95. “

96. “
n é um nó do grafo de bruijn

97. “
G é o grafo de bruijn

98. “todo o grafo é coberto

99. “ se estamos diante de uma
nova bifurcação...

100. “
marca o nó como visitado

101. “
obtém as arestas de saída

102. “
obtém os supernodes

103. “
marca os supernodes
como visitados

104. “
se os dois supernodes se
encontram no mesmo nó
e na mesma orientação,
então temos uma bolha

105. “
Path Divergence Caller Algorithm

106. “
Vermelho: alelo de referência.
Azul: o indivíduo

107. “
Mesmo quando não se forma uma bolha limpa,
pode-se descobrir variantes através da divergência
do caminho de referência.

108. “
Ao encontrar um breakpoint (verde), pega-se o contig
mais longo da amostra
(exemplo: caminho até o próximo cruzamento).

109. “
O azul pontilhado é uma sequência de repetição dentro
do alelo de referência presente em outro local
dentro do genoma da amostra.
o algoritmo
não é afetado

110. “
Algoritmo de Genotipagem
Tem-se um grafo com uma cor para cada
alelo conhecido, uma cor para o genoma
de referência e uma cor para amostra.

111. “
Algoritmo de Genotipagem
Tem-se um grafo com uma cor para cada
alelo conhecido, uma cor para o genoma
de referência e uma cor para amostra.

112. Referências
■ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3272472/
■ http://biorxiv.org/content/biorxiv/early/2016/02/18/040071.full.pdf