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REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 
10 
Volume 14 - Número 2 - 2º Semestre 2014 
PROPRIEDADES ANTIBACTERIANA E COAGULANTE DA PEÇONHA DE 
ESPÉCIMES JUVENIS DE Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) 
Jacqueline Ramos Machado Braga1; Diego dos Santos Pereira2 
RESUMO 
Serpentes da espécie Bothrops leucurus são responsáveis por cerca de 70% dos acidentes que ocorridos na Bahia, Brasil. A 
peçonha é uma mistura biológica complexa de toxinas que podem provocar dor, necrose, hemorragia e, em casos graves, a 
morte. No entanto, vários estudos descrevem que a peçonha pode apresentar uma forte ação antimicrobiana. Este estudo teve 
como objetivo analisar o efeito antibacteriano da peçonha de B. leucurus juvenis, em cepas de bactérias Gram- positivas 
(Escherichia coli ) e bactérias Gram- negativas ( Staphylococcus aureus) , bem como avaliar a sua ação coagulante em sangue 
de cavalo. A susceptibilidade das cepas bacterianas foi avaliada usando o método de difusão de ágar para determinar o 
potencial antimicrobiano em diferentes concentrações de um pool de peçonhas, enquanto que a coagulação foi medida em 
minutos, através do método de Lee-White, nas mesmas concentrações da peçonha. Os resultados mostraram ausência de 
atividade antimicrobiana para E. coli e S. aureus com todas as concentrações testadas (5 a 1000μg/mL). Apesar da peçonha 
de algumas espécies de Bothrops ter sido descrita como tendo um elevado poder microbicida, supõe-se que a sazonalidade, a 
idade da serpente, diferenças de sexo e/ou dietas podem levar a variações na composição química desta peçonha e consequente 
diferenças nas respostas biológicas. No presente estudo, a peçonha de B. leucurus juvenis mostrou atividade coagulante em 
todas as concentrações testadas, com tempo de coagulação máximo de cerca de 3 min, mesmo quando testado a uma 
concentração dez vezes menor que a máxima, o que confirma a sua elevada atividade coagulante quando comparada com o 
controle sem peçonha (16min) . Os resultados confirmam a atividade coagulante e mostram a ausência de atividade 
antimicrobiana da peçonha de serpentes B. leucurus juvenis. Isso sugere que mudanças na composição química da peçonha 
de B. leucurus podem estar relacionados à idade do animal, interferindo no seu potencial antibacteriano. 
Palavras-chave: Veneno, serpente, Bothrops. 
ANTIBACTERIAL AND COAGULANT PROPERTIES OF THE VENOM JUVENILES 
SPECIMENS Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) 
ABSTRACT 
Bothrops leucurus snakes are responsible for about 70 % of snakebites occurred in Bahia, Brazil. Its venom is a complex 
biological mixture of toxins that can cause pain, necrosis, hemorrhage, and in severe cases, death. However, several 
studies describe that the venom may have a strong antimicrobial action. This study aimed to evaluate the antibacterial 
effect of the venom of B. juveniles leucurus , in strains of Gram - positive bacteria (Escherichia coli) and Gram - negative 
bacteria (Staphylococcus aureus) and evaluate its coagulant action in horse blood . The susceptibility of the bacterial 
strains was evaluated using the agar diffusion method to determine the antimicrobial activity at different concentrations 
of pooled venoms, while coagulation was measured in minutes using the Lee -White method, the same concentration of 
poison. The results showed no antimicrobial activity against E. coli and S. aureus in all concentrations tested (5 to 
1000μg/mL). Despite the venom of some Bothrops species have been described as having a high microbicidal power, it 
is assumed that seasonality , the age of the snake, sex differences and / or diets can lead to variations in the chemical 
composition of the venom and the consequent differences in biological response . In the present study, the venom of B. 
leucurus juveniles showed coagulant activity at all concentrations tested, with maximum clotting time of about 3 min, 
even when tested at a concentration ten times less than the maximum, which confirms its high coagulation activity 
compared with the control without venom (16min). The results confirm the coagulant activity and show the absence of 
antimicrobial activity of the B. leucurus juveniles snakes venom. This suggests that changes in the chemical composition 
of the venom of B. leucurus may be related to the age of the animal, interfering with their antibacterial potential. 
Keywords: Venom, snake, Bothrops.
11 
INTRODUÇÃO 
O Ofidismo é o estudo das serpentes e 
seus diferentes tipos de peçonhas. Esta área 
engloba não só aspectos relacionados à 
composição, que pode variar até mesmo dentro 
da própria espécie, mas questões relacionadas 
aos parâmetros biológicos, avaliações 
epidemiológicas e demais tópicos que envolvem 
o animal e sua peculiar forma de defesa. No 
Brasil, a maioria dos acidentes ofídicos, 
envolvendo humanos e animais, são causados por 
serpentes do gênero Bothrops, onde ocorrem no 
Nordeste 12 das 24 espécies existentes no país, 
sendo a Bahia um dos principais estados do 
Nordeste que propiciam habitat adequado a 
espécies tropicais (Lira-da-Silva et al., 2009). 
Em 2001, foram registrados na Bahia 
cerca de 655 casos de acidentes ofídicos somente 
com espécies do gênero Bothrops (Mise et al., 
2007). No entanto, estima-se que os casos de 
envenenamento por serpente ocorram muito mais 
vezes do que apontam os registros, já que na 
maioria dos acontecimentos o paciente tem 
dificuldade em se dirigir até um posto de saúde 
adequado ou faz o tratamento em casa através de 
técnicas alternativas (Torres, 2010). 
A B. leucurus é a serpente que apresenta 
o maior índice de ocorrência de acidentes no 
Recôncavo da Bahia, enquanto que a B. jararaca 
e B. jararacussu têm maior ocorrência ao sul no 
litoral da Bahia e em poucos municípios ao norte 
do estado. Apesar do registro de algumas 
ocorrências de B. jararacussu no município de 
Cruz das Almas-Ba, não há números 
significativos de acidentes com esta espécie, nem 
ocorrência de outras espécies do gênero Bothrops 
nesta região (Brazil, 2010). 
Segundo Queiróz et al. (2008), as 
peçonhas das serpentes brasileiras, sobretudo as 
Bothrops, são misturas biológicas complexas de 
toxinas, enzimas e outras substâncias ativas. 
Essas substâncias apresentam ações 
neurotóxicas, miotóxicas, proteolíticas e 
hemorrágicas, porém muitos desses 
componentes têm funções essenciais na 
coagulação sanguínea, pressão arterial, 
agregação plaquetária, transmissão do impulso 
nervoso, funções analgésicas e anticancerígenas. 
A peçonha de Bothrops pode causar, além de dor 
local e mionecrose, atividade fibrinolítica, 
proteolítica, hemorrágica, distúrbios como 
cefaléia, vômitos, náuseas, oligúria, hemorragia, 
hipotensão, visão turva, tremores e, em casos 
mais graves, insuficiência renal aguda e 
hemorragia sistêmica que evolui para um quadro 
de choque cardiovascular (Brazil, 2010). 
Estudos mostram que fosfolipases 
encontradas na peçonha de serpentes do gênero 
Bothrops, possuem grande potencial bactericida 
para uma grande variedades de bactérias Gram-positivas 
e Gram-negativas, além da peçonha 
conter uma miotoxina com potencial 
antiparasitário contra protozoários como 
Leishmania ssp (Stabeli et al., 2006). Por esta 
razão, as peçonhas caracterizam-se como 
possíveis ferramentas de diagnóstico e fontes 
para medicamentos. A L aminoácido oxidase I, 
isolada da peçonha da serpente B. alternatus, 
oferece uma potente atividade antibacteriana 
contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus 
(Izidoro et al., 2006). Um estudo realizado com a 
peçonha da B. jararaca demonstrou que a toxina 
foi capaz de inibir formas promastigotas do 
Tripanosoma cruzi, causando rompimento da 
membrana e desordem mitocondrial, além de 
promoverem ações contra o vírus da dengue 
(Sant’ana et al., 2008). 
Vários compostos de peçonhas animais 
são utilizados como drogas antineoplásicas por 
serem caracterizados como ricas fontes de 
componentes farmacologicamente ativos. Os 
peptídeos anticancer presentes nas peçonhas 
contém também Proteínas Anticâncer de 
Ocorrência Natural (NOAPs), encontrados em 
serpentes de diversas famílias. Vários estudos 
demonstraram que preparações com peçonha 
bruta, bem como com seus componentes isolados 
e purificados de B. jararaca inibem em 
camundongos o crescimento de melanoma, 
sarcoma, células de leucemia, hepatoma e câncer 
de mama (Libério et al., 2013). 
Segundo dados do Ministério da Saúde, 
as doenças causadas por bactérias são 
responsáveis por pelo menos 60% das 
internações, porém menos de 5% evolui para 
casos graves. A maior preocupação dos médicos 
relaciona-se com as infecções hospitalares que 
podem acometer pacientes debilitados, de modo 
a piorar ainda mais seu quadro clinico. Em
12 
hospitais, as bactérias se encontram de forma 
bastante disseminada, por isso existe o risco de 
desenvolver rapidamente resistência a 
determinados antibióticos. Por esta razão, é 
necessária a busca constante por novas drogas 
capazes de inibir o crescimento ou promover a 
morte, principalmente daquelas que são 
colonizadoras de tecidos vivos (Torres et al., 
2010). 
A variação individual da peçonha de 
serpentes juvenis ainda é pouco conhecida. Em 
estudo recente, Dias et al. (2013) relatam que ao 
analisar peçonhas de 21 espécimes juvenis de B. 
jararaca, observaram que para alguns 
componentes da peçonha, a atividade era 
semelhante entre alguns espécimes, sendo 
diferente para outros. O estudo mostrou também 
que existia variação na atividade coagulante, mas 
não na atividade de ativação da protombina. O 
estudo concluiu que a variação observada nos 
peçonhas de B. jararaca juvenis não é um 
resultado de mudanças ontogenéticas ou dieta, 
mas existe desde muito cedo na vida do animal. 
Variações na composição das peçonhas 
podem levar a diferentes atividades biológicas 
sobre organismos teste, o que pode refletir 
também em diferenças na resposta à soroterapia. 
O presente trabalho teve como objetivo analisar 
o efeito antibacteriano e coagulante da peçonha 
de serpentes juvenis da espécie B. leucurus. 
MATERIAIS E MÉTODOS 
Peçonha 
Um pool de peçonhas de serpentes 
juvenis da espécie B. leucurus foi gentilmente 
cedido pela Profa. Dra. Rejane Maria Lira-da- 
Silva, do Núcleo de Ofiologia e Animais 
Peçonhentos (NOAP) da Universidade Federal 
da Bahia. Após extraída, ass peçonha foram 
esterilizadas, secas a vácuo e estocadas (-20ºC) 
até a sua utilização. Posteriormente, a peçonha 
foi diluída para uma solução estoque 
(1000μg/ml) em solução salina (tampão PBS, pH 
7,4) que foi utilizada nos ensaios. 
Microrganismos 
As cepas bacterianas de Escherichia coli 
e Staphylococcus aureus foram gentilmente 
cedidas pela Profa. Dra. Norma Suely 
Evangelista Barreto, do Laboratório de 
Microbiologia de Alimentos e Ambiental 
(NEPA) da Universidade Federal do Recôncavo 
da Bahia. Com o auxílio de uma alça 
bacteriológica estéril, foram colhidas colônias 
bacterianas de E. coli e S.aureus isoladamente, 
suspensas em 5 ml de solução salina (0,9%) e 
homogeneizadas. A turbidez do inóculo foi 
ajustada a 0,5 da escala de MacFarland (2x108 
UFC/ml). Com auxílio do swab, foi feita a 
semeadura dos microrganismos (17ml) na 
superfície do meio de cultura ágar Mueller- 
Hinton. 
Atividade antibacteriana 
A susceptibilidade das cepas bacterianas 
foi analisada através do método de difusão em 
ágar, para determinação do potencial 
antibacteriano da peçonha. Com auxílio de uma 
pipeta, a peçonha foi inoculada em discos de 
difusão de papel esterilizados (3μl peçonha/PBS) 
em diferentes concentrações (5, 10, 15, 25, 55, 
75, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 μg/ml). Para 
o controle negativo, foi utilizada solução salina 
(0,9%) e antibiótico (Imipenem,) para o controle 
positivo. As placas que receberam os discos 
foram incubadas a 37oC/24h e a atividade 
antibacteriana foi observada nas placas que 
apresentaram qualquer halo de inibição em torno 
do disco de difusão. As zonas de inibição foram 
registradas em mm de diâmetro. Todos os 
ensaios foram realizados em duplicata, sendo 
considerada apenas a média dos diâmetros dos 
respectivos halos de inibição. 
Determinação do tempo de coagulação 
(Teste de Lee-White) 
Para o teste de atividade coagulante 
foram coletados 10ml de sangue de cavalo em 
tubos de vidro sem anticoagulante. A coleta foi 
realizada por médicos veterinários e seguiu os 
princípios éticos em pesquisa animal, adotados 
pelo Comitê Brasileiro de Experimentação 
Animal. Para comprovar a saúde do animal, foi 
realizado hemograma com contagem de 
plaquetas, assegurando a hemostasia normal do 
animal. 
O Teste de Lee-White foi realizado em 
triplicata com aproximadamente 0,5ml de sangue 
em tubos de vidro sem adição de peçonha 
(controle) e em tubos contendo 0,5ml da peçonha 
de B. leucurus nas diluições de 5, 10, 50, 80, 400, 
600, 800 1000μg/ml que foram imediatamente
13 
colocados em banho-maria para aferir o tempo de 
coagulação. Após 1 minuto, o primeiro tubo de 
cada ensaio era inclinado até que o mesmo 
pudesse ser inclinado 90°, sem que o sangue 
escorresse. O procedimento foi repetido nos 
tubos subsequentes a cada 30 segundos até 
observar-se a formação do coágulo. O tempo 
compreendido entre o momento da coleta e a 
total coagulação do sangue, foi marcado como 
sendo o tempo total de coagulação. 
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
O pool de peçonhas de espécimes juvenis 
de B. leucurus não apresentou atividade 
antibacteriana sobre S. aureus (Gram+) ou sobre 
E. coli (Gram-), em todas as concentrações 
testadas (Figura 1). Em todos os testes, as cepas 
bacterianas demonstraram crescimento normal 
nas placas, com apresentação do halo de inibição 
apenas no disco controle positivo que continha 
antibiótico. 
Figura 1 – Ensaio antibacteriano com peçonha de B. 
leucurus. Em A- com cepa de S. aureus. Em B- com cepa 
de E. coli. Halo de inibição visível apenas no controle 
positivo (setas). 
Este resultado não corrobora o estudo de 
Torres et al., (2010), que encontrou atividade 
antimicrobiana (S.aureus, C. albicans, P. 
aeruginosa) e antiparasitária, (Leishmania ssp. e 
T. cruzi), utilizando a peçonha de B. leucurus em 
concentrações a partir de 250μg/ml. Entretanto, 
tal estudo não revela a idade das serpentes 
utilizadas nos ensaios. 
Os dados do presente estudo podem ser 
explicados pelos achados de Queiróz et al., 
(2008), que analisando a composição e ação de 
peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, 
demostraram que existe uma grande variação na 
composição e atividades das toxinas presentes na 
peçonha. Em estudo in vitro, Campos et al., 
(2013) também demonstraram que existe 
variação nos tipos de enzimas presentes nas 
peçonhas de espécies de Bothrops. Tal variação 
poderia levar a efeitos biológicos diferenciados. 
Nossos achados estão de acordo com os 
resultados do estudo de Núñez et al., (2009) 
onde, através de avaliação proteômica e 
transcriptômica da peçonha de serpentes do 
gênero Bothrops, observaram que existem 
diferenças significativas nas concentrações dos 
componentes da peçonha, para diferentes idades. 
Enquanto jovens, as serpentes deste estudo 
apresentaram quase 50% da sua peçonha 
composta por metaloproteases do tipo PI. Já 
quando adultas, a mesma proporção é verificada 
para metaloproteases do tipo PIII, estando as PI 
em composições diminutas. Além destes 
compostos, o estudo mostrou ainda que houve 
grande variação na quantidade de fosfolipases do 
tipo A2 (PLA2). Estas diferenças na composição 
das peçonhas entre serpentes adultas e jovens da 
mesma espécie, poderiam também induzir 
alterações nos mecanismos de ação de cada uma 
das peçonhas. 
Diversos estudos demonstraram que a 
composição da peçonha de serpente exibe 
variações associadas com a origem geográfica, 
habitat, variações sazonais, dieta, idade e sexo 
(Furtado et al., 2006; Núñez et al., 2009; Alape- 
Girón, 2008.). 
Torres et al., (2010) observaram que a 
fração da PLA2 e da L-Aminoácido Oxidase 
(LAAO) da peçonha de B. leucurus não induziu 
qualquer grau de inibição nas cepas bacterianas 
testadas. Estes achados corroboram nossos 
resultados, sugerindo que talvez as peçonhas que 
contenham elevada concentração de 
A 
B
14 
determinados compostos podem não apresentar 
atividade antimicrobiana. A ausência de 
atividade antimicrobiana verificada no presente 
estudo pode sugerir a presença de elevadas 
concentrações de PLA2 e de LAAO, entretanto 
estudos de proteômica e transcriptômica da 
peçonha de B. leucurus da Bahia poderiam 
confirmar tal hipótese. 
Os resultados observados com o ensaio de 
Lee-White mostraram que os tubos controle 
apresentaram tempo de coagulação (TC) total de 
16 min. Nos tubos teste, entretanto, houve 
coagulação total nas concentrações de 100 a 1000 
μg/ml em cerca de 2 min, apresentando variação 
significativa do tempo somente quando testado 
em concentrações 100 vezes menores que a 
solução estoque (Figura 2) (Gráfico1). 
Figura 2 – Efeito coagulante da peçonha de B. leucurus em 
sangue de cavalo. 
Gráfico 1 – Tempo total de coagulação (TC) do sangue de 
cavalo com diferentes concentrações de peçonha de B. 
leucurus, em comparação ao seu controle. 
Segundo Brazil (2010), a peçonha de B. 
leucurus promove uma forte ação hemorrágica 
local, podendo evoluir de forma sistêmica. Os 
componentes da peçonha penetram na circulação 
sanguínea, consomem o fibrinogênio que se 
deposita em microcoágulos principalmente nos 
pulmões. Assim, o restante do sangue fica 
incoagulável por falta do fibrinogênio, sem que 
necessariamente haja hemorragia. Esta aparece 
quando as paredes dos vasos sanguíneos menores 
são lesadas pela ação proteolítica da peçonha. 
O presente estudo encontrou uma forte 
ação coagulante em todos os tubos testados, 
resultando em Tempos de Coagulação (TC) entre 
2 e 3min, mesmo em concentrações dez vezes 
menores que a máxima. Segundo Ribeiro & 
Jorge (1990) e Tokarnia & Peixoto (2006), a 
coagulação e a hemorragia são mecanismos que 
se sucedem quando se trata de envenenamento, 
pois o forte efeito coagulante apresentado pela 
peçonha de Bothrops induz ao consumo dos 
fatores responsáveis pela coagulação. O 
consumo exacerbado desses fatores leva à queda 
dos níveis de fibrinogênio, ausência de 
protrombina e deficiência parcial da 
tromboplastina, sem a redução do número de 
plaquetas, o que induz a desintegração dos 
trombos, tornando o sangue mais fluido e 
incoagulável, evoluindo fisiologicamente para 
uma hemorragia. 
CONCLUSÕES 
Os resultados apresentados sugerem que 
a peçonha de espécimes juvenis de B. leucurus 
apresenta forte efeito coagulante, entretanto sem 
atividade antibacteriana sobre cepas de S. aureus 
e E.coli. Os achados da ação da peçonha obtidos 
nesse trabalho abrem novas possibilidades para 
os estudos referentes à variação protéica da 
composição da peçonha de serpentes juvenis, da 
espécie B. leucurus que habitam a Bahia, 
sugerindo que o fator idade do animal pode 
interferir na ação biológica da peçonha. 
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BRAZIL, T. K. 2010. Catálogo da fauna 
terrestre de importância médica da Bahia. 
Edufba, Salvador- BA: Edufba, 2010, 202p. 
18 
16 
14 
12 
10 
8 
6 
4 
2 
0 
0 5 10 50 80 400 600 800 1000 
Concentração veneno (μg/ml) 
Tempo de coagulação total (min)
15 
DIAS, G.S.; KITANO, E.S.; PAGOTTO, A.H; 
SANT’ANNA, S.S.; ROCHA, M.M.T.;, 
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M. C.; ROMÃO, P. R.; GUERRA-SÁ, R.; 
VIERA, C. A.; GIGLIO, J.R.; FONTES, M. R.; 
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example of function versatility of snake venom 
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Pharmacol., n. 142, p. 3-4, 2006. 
TOKARNIA, C. H. & PEIXOTO, P. V. A 
importância dos acidentes ofídicos como causa 
de mortes em bovinos no Brasil. Pesq. Vet. Bras., 
v.26, n.2, p. 55-68, 2006. 
______________________________________ 
1- Jacqueline Ramos Machado Braga 
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); 
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas 
(CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de 
Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, 
Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 
jacquebraga@ufrb.edu.br e jacquebraga@globo.com 
2- Diego dos Santos Pereira 
Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); 
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas 
(CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de 
Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, 
Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 
digopereira2006@hotmail.com

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  • 1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 10 Volume 14 - Número 2 - 2º Semestre 2014 PROPRIEDADES ANTIBACTERIANA E COAGULANTE DA PEÇONHA DE ESPÉCIMES JUVENIS DE Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) Jacqueline Ramos Machado Braga1; Diego dos Santos Pereira2 RESUMO Serpentes da espécie Bothrops leucurus são responsáveis por cerca de 70% dos acidentes que ocorridos na Bahia, Brasil. A peçonha é uma mistura biológica complexa de toxinas que podem provocar dor, necrose, hemorragia e, em casos graves, a morte. No entanto, vários estudos descrevem que a peçonha pode apresentar uma forte ação antimicrobiana. Este estudo teve como objetivo analisar o efeito antibacteriano da peçonha de B. leucurus juvenis, em cepas de bactérias Gram- positivas (Escherichia coli ) e bactérias Gram- negativas ( Staphylococcus aureus) , bem como avaliar a sua ação coagulante em sangue de cavalo. A susceptibilidade das cepas bacterianas foi avaliada usando o método de difusão de ágar para determinar o potencial antimicrobiano em diferentes concentrações de um pool de peçonhas, enquanto que a coagulação foi medida em minutos, através do método de Lee-White, nas mesmas concentrações da peçonha. Os resultados mostraram ausência de atividade antimicrobiana para E. coli e S. aureus com todas as concentrações testadas (5 a 1000μg/mL). Apesar da peçonha de algumas espécies de Bothrops ter sido descrita como tendo um elevado poder microbicida, supõe-se que a sazonalidade, a idade da serpente, diferenças de sexo e/ou dietas podem levar a variações na composição química desta peçonha e consequente diferenças nas respostas biológicas. No presente estudo, a peçonha de B. leucurus juvenis mostrou atividade coagulante em todas as concentrações testadas, com tempo de coagulação máximo de cerca de 3 min, mesmo quando testado a uma concentração dez vezes menor que a máxima, o que confirma a sua elevada atividade coagulante quando comparada com o controle sem peçonha (16min) . Os resultados confirmam a atividade coagulante e mostram a ausência de atividade antimicrobiana da peçonha de serpentes B. leucurus juvenis. Isso sugere que mudanças na composição química da peçonha de B. leucurus podem estar relacionados à idade do animal, interferindo no seu potencial antibacteriano. Palavras-chave: Veneno, serpente, Bothrops. ANTIBACTERIAL AND COAGULANT PROPERTIES OF THE VENOM JUVENILES SPECIMENS Bothrops leucurus (WAGLER, 1824) ABSTRACT Bothrops leucurus snakes are responsible for about 70 % of snakebites occurred in Bahia, Brazil. Its venom is a complex biological mixture of toxins that can cause pain, necrosis, hemorrhage, and in severe cases, death. However, several studies describe that the venom may have a strong antimicrobial action. This study aimed to evaluate the antibacterial effect of the venom of B. juveniles leucurus , in strains of Gram - positive bacteria (Escherichia coli) and Gram - negative bacteria (Staphylococcus aureus) and evaluate its coagulant action in horse blood . The susceptibility of the bacterial strains was evaluated using the agar diffusion method to determine the antimicrobial activity at different concentrations of pooled venoms, while coagulation was measured in minutes using the Lee -White method, the same concentration of poison. The results showed no antimicrobial activity against E. coli and S. aureus in all concentrations tested (5 to 1000μg/mL). Despite the venom of some Bothrops species have been described as having a high microbicidal power, it is assumed that seasonality , the age of the snake, sex differences and / or diets can lead to variations in the chemical composition of the venom and the consequent differences in biological response . In the present study, the venom of B. leucurus juveniles showed coagulant activity at all concentrations tested, with maximum clotting time of about 3 min, even when tested at a concentration ten times less than the maximum, which confirms its high coagulation activity compared with the control without venom (16min). The results confirm the coagulant activity and show the absence of antimicrobial activity of the B. leucurus juveniles snakes venom. This suggests that changes in the chemical composition of the venom of B. leucurus may be related to the age of the animal, interfering with their antibacterial potential. Keywords: Venom, snake, Bothrops.
  • 2. 11 INTRODUÇÃO O Ofidismo é o estudo das serpentes e seus diferentes tipos de peçonhas. Esta área engloba não só aspectos relacionados à composição, que pode variar até mesmo dentro da própria espécie, mas questões relacionadas aos parâmetros biológicos, avaliações epidemiológicas e demais tópicos que envolvem o animal e sua peculiar forma de defesa. No Brasil, a maioria dos acidentes ofídicos, envolvendo humanos e animais, são causados por serpentes do gênero Bothrops, onde ocorrem no Nordeste 12 das 24 espécies existentes no país, sendo a Bahia um dos principais estados do Nordeste que propiciam habitat adequado a espécies tropicais (Lira-da-Silva et al., 2009). Em 2001, foram registrados na Bahia cerca de 655 casos de acidentes ofídicos somente com espécies do gênero Bothrops (Mise et al., 2007). No entanto, estima-se que os casos de envenenamento por serpente ocorram muito mais vezes do que apontam os registros, já que na maioria dos acontecimentos o paciente tem dificuldade em se dirigir até um posto de saúde adequado ou faz o tratamento em casa através de técnicas alternativas (Torres, 2010). A B. leucurus é a serpente que apresenta o maior índice de ocorrência de acidentes no Recôncavo da Bahia, enquanto que a B. jararaca e B. jararacussu têm maior ocorrência ao sul no litoral da Bahia e em poucos municípios ao norte do estado. Apesar do registro de algumas ocorrências de B. jararacussu no município de Cruz das Almas-Ba, não há números significativos de acidentes com esta espécie, nem ocorrência de outras espécies do gênero Bothrops nesta região (Brazil, 2010). Segundo Queiróz et al. (2008), as peçonhas das serpentes brasileiras, sobretudo as Bothrops, são misturas biológicas complexas de toxinas, enzimas e outras substâncias ativas. Essas substâncias apresentam ações neurotóxicas, miotóxicas, proteolíticas e hemorrágicas, porém muitos desses componentes têm funções essenciais na coagulação sanguínea, pressão arterial, agregação plaquetária, transmissão do impulso nervoso, funções analgésicas e anticancerígenas. A peçonha de Bothrops pode causar, além de dor local e mionecrose, atividade fibrinolítica, proteolítica, hemorrágica, distúrbios como cefaléia, vômitos, náuseas, oligúria, hemorragia, hipotensão, visão turva, tremores e, em casos mais graves, insuficiência renal aguda e hemorragia sistêmica que evolui para um quadro de choque cardiovascular (Brazil, 2010). Estudos mostram que fosfolipases encontradas na peçonha de serpentes do gênero Bothrops, possuem grande potencial bactericida para uma grande variedades de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além da peçonha conter uma miotoxina com potencial antiparasitário contra protozoários como Leishmania ssp (Stabeli et al., 2006). Por esta razão, as peçonhas caracterizam-se como possíveis ferramentas de diagnóstico e fontes para medicamentos. A L aminoácido oxidase I, isolada da peçonha da serpente B. alternatus, oferece uma potente atividade antibacteriana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus (Izidoro et al., 2006). Um estudo realizado com a peçonha da B. jararaca demonstrou que a toxina foi capaz de inibir formas promastigotas do Tripanosoma cruzi, causando rompimento da membrana e desordem mitocondrial, além de promoverem ações contra o vírus da dengue (Sant’ana et al., 2008). Vários compostos de peçonhas animais são utilizados como drogas antineoplásicas por serem caracterizados como ricas fontes de componentes farmacologicamente ativos. Os peptídeos anticancer presentes nas peçonhas contém também Proteínas Anticâncer de Ocorrência Natural (NOAPs), encontrados em serpentes de diversas famílias. Vários estudos demonstraram que preparações com peçonha bruta, bem como com seus componentes isolados e purificados de B. jararaca inibem em camundongos o crescimento de melanoma, sarcoma, células de leucemia, hepatoma e câncer de mama (Libério et al., 2013). Segundo dados do Ministério da Saúde, as doenças causadas por bactérias são responsáveis por pelo menos 60% das internações, porém menos de 5% evolui para casos graves. A maior preocupação dos médicos relaciona-se com as infecções hospitalares que podem acometer pacientes debilitados, de modo a piorar ainda mais seu quadro clinico. Em
  • 3. 12 hospitais, as bactérias se encontram de forma bastante disseminada, por isso existe o risco de desenvolver rapidamente resistência a determinados antibióticos. Por esta razão, é necessária a busca constante por novas drogas capazes de inibir o crescimento ou promover a morte, principalmente daquelas que são colonizadoras de tecidos vivos (Torres et al., 2010). A variação individual da peçonha de serpentes juvenis ainda é pouco conhecida. Em estudo recente, Dias et al. (2013) relatam que ao analisar peçonhas de 21 espécimes juvenis de B. jararaca, observaram que para alguns componentes da peçonha, a atividade era semelhante entre alguns espécimes, sendo diferente para outros. O estudo mostrou também que existia variação na atividade coagulante, mas não na atividade de ativação da protombina. O estudo concluiu que a variação observada nos peçonhas de B. jararaca juvenis não é um resultado de mudanças ontogenéticas ou dieta, mas existe desde muito cedo na vida do animal. Variações na composição das peçonhas podem levar a diferentes atividades biológicas sobre organismos teste, o que pode refletir também em diferenças na resposta à soroterapia. O presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito antibacteriano e coagulante da peçonha de serpentes juvenis da espécie B. leucurus. MATERIAIS E MÉTODOS Peçonha Um pool de peçonhas de serpentes juvenis da espécie B. leucurus foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Rejane Maria Lira-da- Silva, do Núcleo de Ofiologia e Animais Peçonhentos (NOAP) da Universidade Federal da Bahia. Após extraída, ass peçonha foram esterilizadas, secas a vácuo e estocadas (-20ºC) até a sua utilização. Posteriormente, a peçonha foi diluída para uma solução estoque (1000μg/ml) em solução salina (tampão PBS, pH 7,4) que foi utilizada nos ensaios. Microrganismos As cepas bacterianas de Escherichia coli e Staphylococcus aureus foram gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Norma Suely Evangelista Barreto, do Laboratório de Microbiologia de Alimentos e Ambiental (NEPA) da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Com o auxílio de uma alça bacteriológica estéril, foram colhidas colônias bacterianas de E. coli e S.aureus isoladamente, suspensas em 5 ml de solução salina (0,9%) e homogeneizadas. A turbidez do inóculo foi ajustada a 0,5 da escala de MacFarland (2x108 UFC/ml). Com auxílio do swab, foi feita a semeadura dos microrganismos (17ml) na superfície do meio de cultura ágar Mueller- Hinton. Atividade antibacteriana A susceptibilidade das cepas bacterianas foi analisada através do método de difusão em ágar, para determinação do potencial antibacteriano da peçonha. Com auxílio de uma pipeta, a peçonha foi inoculada em discos de difusão de papel esterilizados (3μl peçonha/PBS) em diferentes concentrações (5, 10, 15, 25, 55, 75, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 μg/ml). Para o controle negativo, foi utilizada solução salina (0,9%) e antibiótico (Imipenem,) para o controle positivo. As placas que receberam os discos foram incubadas a 37oC/24h e a atividade antibacteriana foi observada nas placas que apresentaram qualquer halo de inibição em torno do disco de difusão. As zonas de inibição foram registradas em mm de diâmetro. Todos os ensaios foram realizados em duplicata, sendo considerada apenas a média dos diâmetros dos respectivos halos de inibição. Determinação do tempo de coagulação (Teste de Lee-White) Para o teste de atividade coagulante foram coletados 10ml de sangue de cavalo em tubos de vidro sem anticoagulante. A coleta foi realizada por médicos veterinários e seguiu os princípios éticos em pesquisa animal, adotados pelo Comitê Brasileiro de Experimentação Animal. Para comprovar a saúde do animal, foi realizado hemograma com contagem de plaquetas, assegurando a hemostasia normal do animal. O Teste de Lee-White foi realizado em triplicata com aproximadamente 0,5ml de sangue em tubos de vidro sem adição de peçonha (controle) e em tubos contendo 0,5ml da peçonha de B. leucurus nas diluições de 5, 10, 50, 80, 400, 600, 800 1000μg/ml que foram imediatamente
  • 4. 13 colocados em banho-maria para aferir o tempo de coagulação. Após 1 minuto, o primeiro tubo de cada ensaio era inclinado até que o mesmo pudesse ser inclinado 90°, sem que o sangue escorresse. O procedimento foi repetido nos tubos subsequentes a cada 30 segundos até observar-se a formação do coágulo. O tempo compreendido entre o momento da coleta e a total coagulação do sangue, foi marcado como sendo o tempo total de coagulação. RESULTADOS E DISCUSSÕES O pool de peçonhas de espécimes juvenis de B. leucurus não apresentou atividade antibacteriana sobre S. aureus (Gram+) ou sobre E. coli (Gram-), em todas as concentrações testadas (Figura 1). Em todos os testes, as cepas bacterianas demonstraram crescimento normal nas placas, com apresentação do halo de inibição apenas no disco controle positivo que continha antibiótico. Figura 1 – Ensaio antibacteriano com peçonha de B. leucurus. Em A- com cepa de S. aureus. Em B- com cepa de E. coli. Halo de inibição visível apenas no controle positivo (setas). Este resultado não corrobora o estudo de Torres et al., (2010), que encontrou atividade antimicrobiana (S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa) e antiparasitária, (Leishmania ssp. e T. cruzi), utilizando a peçonha de B. leucurus em concentrações a partir de 250μg/ml. Entretanto, tal estudo não revela a idade das serpentes utilizadas nos ensaios. Os dados do presente estudo podem ser explicados pelos achados de Queiróz et al., (2008), que analisando a composição e ação de peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, demostraram que existe uma grande variação na composição e atividades das toxinas presentes na peçonha. Em estudo in vitro, Campos et al., (2013) também demonstraram que existe variação nos tipos de enzimas presentes nas peçonhas de espécies de Bothrops. Tal variação poderia levar a efeitos biológicos diferenciados. Nossos achados estão de acordo com os resultados do estudo de Núñez et al., (2009) onde, através de avaliação proteômica e transcriptômica da peçonha de serpentes do gênero Bothrops, observaram que existem diferenças significativas nas concentrações dos componentes da peçonha, para diferentes idades. Enquanto jovens, as serpentes deste estudo apresentaram quase 50% da sua peçonha composta por metaloproteases do tipo PI. Já quando adultas, a mesma proporção é verificada para metaloproteases do tipo PIII, estando as PI em composições diminutas. Além destes compostos, o estudo mostrou ainda que houve grande variação na quantidade de fosfolipases do tipo A2 (PLA2). Estas diferenças na composição das peçonhas entre serpentes adultas e jovens da mesma espécie, poderiam também induzir alterações nos mecanismos de ação de cada uma das peçonhas. Diversos estudos demonstraram que a composição da peçonha de serpente exibe variações associadas com a origem geográfica, habitat, variações sazonais, dieta, idade e sexo (Furtado et al., 2006; Núñez et al., 2009; Alape- Girón, 2008.). Torres et al., (2010) observaram que a fração da PLA2 e da L-Aminoácido Oxidase (LAAO) da peçonha de B. leucurus não induziu qualquer grau de inibição nas cepas bacterianas testadas. Estes achados corroboram nossos resultados, sugerindo que talvez as peçonhas que contenham elevada concentração de A B
  • 5. 14 determinados compostos podem não apresentar atividade antimicrobiana. A ausência de atividade antimicrobiana verificada no presente estudo pode sugerir a presença de elevadas concentrações de PLA2 e de LAAO, entretanto estudos de proteômica e transcriptômica da peçonha de B. leucurus da Bahia poderiam confirmar tal hipótese. Os resultados observados com o ensaio de Lee-White mostraram que os tubos controle apresentaram tempo de coagulação (TC) total de 16 min. Nos tubos teste, entretanto, houve coagulação total nas concentrações de 100 a 1000 μg/ml em cerca de 2 min, apresentando variação significativa do tempo somente quando testado em concentrações 100 vezes menores que a solução estoque (Figura 2) (Gráfico1). Figura 2 – Efeito coagulante da peçonha de B. leucurus em sangue de cavalo. Gráfico 1 – Tempo total de coagulação (TC) do sangue de cavalo com diferentes concentrações de peçonha de B. leucurus, em comparação ao seu controle. Segundo Brazil (2010), a peçonha de B. leucurus promove uma forte ação hemorrágica local, podendo evoluir de forma sistêmica. Os componentes da peçonha penetram na circulação sanguínea, consomem o fibrinogênio que se deposita em microcoágulos principalmente nos pulmões. Assim, o restante do sangue fica incoagulável por falta do fibrinogênio, sem que necessariamente haja hemorragia. Esta aparece quando as paredes dos vasos sanguíneos menores são lesadas pela ação proteolítica da peçonha. O presente estudo encontrou uma forte ação coagulante em todos os tubos testados, resultando em Tempos de Coagulação (TC) entre 2 e 3min, mesmo em concentrações dez vezes menores que a máxima. Segundo Ribeiro & Jorge (1990) e Tokarnia & Peixoto (2006), a coagulação e a hemorragia são mecanismos que se sucedem quando se trata de envenenamento, pois o forte efeito coagulante apresentado pela peçonha de Bothrops induz ao consumo dos fatores responsáveis pela coagulação. O consumo exacerbado desses fatores leva à queda dos níveis de fibrinogênio, ausência de protrombina e deficiência parcial da tromboplastina, sem a redução do número de plaquetas, o que induz a desintegração dos trombos, tornando o sangue mais fluido e incoagulável, evoluindo fisiologicamente para uma hemorragia. CONCLUSÕES Os resultados apresentados sugerem que a peçonha de espécimes juvenis de B. leucurus apresenta forte efeito coagulante, entretanto sem atividade antibacteriana sobre cepas de S. aureus e E.coli. Os achados da ação da peçonha obtidos nesse trabalho abrem novas possibilidades para os estudos referentes à variação protéica da composição da peçonha de serpentes juvenis, da espécie B. leucurus que habitam a Bahia, sugerindo que o fator idade do animal pode interferir na ação biológica da peçonha. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRAZIL, T. K. 2010. Catálogo da fauna terrestre de importância médica da Bahia. Edufba, Salvador- BA: Edufba, 2010, 202p. 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 50 80 400 600 800 1000 Concentração veneno (μg/ml) Tempo de coagulação total (min)
  • 6. 15 DIAS, G.S.; KITANO, E.S.; PAGOTTO, A.H; SANT’ANNA, S.S.; ROCHA, M.M.T.;, ZELANIS, A.; SERRANO, S.M.T. Individual variability in the venom proteome of juvenile Bothrops jararaca specimens. Jour. Proteom. Res., v. 12, n.10, p. 4585-4598, 2013. FURTADO, M.F.; TRAVAGLIA-CARDOSO, S.R.; ROCHA, M.M. Sexual dimorphism in venom of Bothrops jararaca (Serpentes: Viperidae). Toxicon, v. 48, n.4, p. 401–410, 2006. IZIDORO, L. F. M.; RIBEIRO, M. C.; SOUZA, G. R. L.; SANT’ANA, C. D.; HAMAGUCHI, A.; SAMPAIO, S. V.; SCARES, A. M.; RODRIGUES, V. M. Biochemical and functional characterization of an L-amino acid oxidase isolated from Bothops pirajai snake venom. Bioorg. Med. Chem., v.14, n.20, p. 7034– 7043, 2006. LIBÉRIO M.S.; JOANITTI G.A.; FONTES W.; CASTRO M.S. Anticancer peptides and proteins: a panoramic view. Prot. & Pept. Let., n.20, p.380-391, 2013. LIRA-DA-SILVA, M. R; MISE, Y. F; CASAIS-E- SILVA, L. L; ULLOA. J; BRENO HAMDAN, B; BRAZIL T. K. Morbimortalidade por ofidismo no Nordeste do Brasil (1999-2003). Gaz. Med. Ba., n. 79, p. 21-25, 2009. MISE, Y. F; LIRA-DA-SILVA, R. M; CARVALHO, F. M. Envenenamento por serpentes do gênero Bothrops no Estado da Bahia: aspectos epidemiológicos e clínicos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v.40, n.5, p. 569-573, 2007. NÚÑEZ, V.; CID, P.; SANZ, L.; DE LA TORRE, P.; ANGULO, Y.; LOMONTE, B.; GUTIÉRREZ, J. M.; CALVETE, J. J. Snake venomics and antivenomics of Bothrops atrox venoms from Colombia and the Amazon regions of Brazil, Perú and Ecuador suggest the occurrence of geographic variation of venom phenotype by a trend towards paedomorphism. Jour. Proteom., n.73, p.57-78, 2009. QUEIROZ, G. P.; PESSOA, L. A.; PORTARO, F. C. V.; FURTADO, M. DE F. D.; TAMBOURGI, D. V. Interspecific variation in venom composition and toxicity of brazilian snakes from Bothrops venom. Toxicon, n.52, p. 842-851, 2009. RIBEIRO, L. A. & JORGE, M. T. Epidemiologia e quadro clínico dos acidentes por serpentes Bothrops jararaca adultas e filhotes. Ver. Inst. Med. Trop., v.32, n.6, p. 436-442, 1990. SANT’ANA, C.D.; MENALDO, D. L.; COSTA, T. R.; GODY, H.; MULLER, V. D. M.; AQUINO, V. H.; ALBUQUERQUE, S.; SAMPAIO, S. V.; MONTEIRO, M. C.; STÁBELI, R. G. SOARES, A. M. Antiviral and antiparasite properties of an L-Amino Acid Oxidase from the snake Bothrops jararaca: cloning and identification of a complete cDNA sequence. Biochem. Pharmacol., n.76, p. 279- 288, 2008. STÁBELI, R. G.; AMUI, S. F.; SANT’ANA, C. D.; PIRES, M. G.; NOMIZO, A.; MONTEIRO, M. C.; ROMÃO, P. R.; GUERRA-SÁ, R.; VIERA, C. A.; GIGLIO, J.R.; FONTES, M. R.; SOARES, A. M. Bothrops moojeni miotoxin-Ii, an Lys49 Phospholipase A2 homologue: an example of function versatility of snake venom proteins. Comp. Biochem. Physiol. Toxicol. Pharmacol., n. 142, p. 3-4, 2006. TOKARNIA, C. H. & PEIXOTO, P. V. A importância dos acidentes ofídicos como causa de mortes em bovinos no Brasil. Pesq. Vet. Bras., v.26, n.2, p. 55-68, 2006. ______________________________________ 1- Jacqueline Ramos Machado Braga Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas (CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 jacquebraga@ufrb.edu.br e jacquebraga@globo.com 2- Diego dos Santos Pereira Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB); Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas (CCAAB); Setor de Biologia - Laboratório de Imunobiologia (IMUNOBIO); Rua Rui Barbosa, n.740, Centro, Cruz das Almas- Bahia –Brasil - CEP:44380-000 digopereira2006@hotmail.com