Apresentação artigo: SOROS, C. L.; DENGLER, N. G. Derivation ontogenetic and cell differentiation in photosynthetic tissues of C3 and C4 Cyperaceae. Am Journ Bot. 2001.

1. Mestranda: Leyde Nayane Nunes dos Santos Silva
Professora: Delmira da Costa Silva
Disciplina: Anatomia Vegetal Avançada

2. Cyperaceae Juss
• 5.387 espécies distribuídas em 106 gêneros
(Govaerts et al., 2007);
• Ocorrem através de uma ampla gama de
altitudes desde o nível do mar até 5000m no
Himalaia;
• Tem grande importância
econômica;

3. Abstract
Four variants of Kranz anatomy occur in the Cyperaceae. Three of these anatomical types
(fimbristyloid, chlorocyperoid, and eleocharoid) are unique among taxa with C,
photosynthesis in that the photosynthetic carbon reduction tissue (PCR, functional equiv-
alent of bundle sheath) is located within the vascular strand and is separated from the primary
carbon assimilation tissue (PCA, positional equivalent of mesophyll) by the mestome sheath
layer. In the fourth anatomical type, rhynchosporoid, PCR tissue is located in the position of
the mestome sheath. In this study, we compared two aspects of development of PCR and PCA
tissues in representatives of the C, and C, types: (I) ontogenetic derivation and (2) cellular
differentiation. Analysis of the planes of cell division associated with procambial strand
formation indicated that PCR tissue is always derived from the procambium, while PCA
tissue is derived from the ground meristem. These cell lineages remain distinct after the initial
organization of vascular strands. Analysis of cell differentiation using accumulation of cell-
type-specific photosynthetic enzymes as markers of differentiation indicated that, with one
exception, a low level of non-cell-specific enzyme accumulation preceded abundant and cell-
specific accumulation of photosythetic enzymes at the distal end of the leaf elongation zone.
Enzyme accumulation coincided spatially (and temporally) with structural aspects of cell
differentiation. Previous cladistic analyses have indicated that these anatomical types
represent separate evolutionary origins of the C4, pathway, and the differences in
developmental pathways observed here reflect these independent origins from C3, ancestors.
Keywords: C, photosynthesis; cell differentiation; cell lineage; Cyperaceae; Kranz anatomy;
PEPCase; RuBPCase.
•4 variantes de anatomia Kranz ocorrem em cyperaceae;
•3 desses tipos anatômicos (fimbristyloides,
chlorocyperóide e eleocharóide) são unicos entre os taxa
com fotossíntese C4;
•PCR – dentro da cadeia vascular e é separado do tecido
de assimilação primária de carbono (PCA). No 4º tipo
(Rhinchosporóide) o tecido PCR está localizado na
bainha da endoderme;
•Nesse estudo foi feita a comparação de 2 aspectos do
desenvolvimento de PCR e PCA e a diferenciação
celular.

4. Introdução
• As vias fotossintéticas de C4 requerem a
atividade coordenada de dois tipos celulares
fotossintéticos: PCA e PCR;
• O termo Kranz;
Cymbopogon citratus

5. • Tipos anatômicos para o taxa Cyperaceae:
1. Rhynchosporóide;
2. Chlorocyperóide;
3. Fimbristylóide;
4. Eleocharóide.
Introdução

6. • São definidos pela presença ou ausência da
bainha de feixe parenquimatoso, a posição do
tecido de PCR, a posição onde o PCR está (se
na borda interna do parênquima, é
interrompido por grandes elementos de
metaxilema ou é continuo);
Introdução

7. • Rhynchosporóide:
A camada de PCR se encontra na posição da
bainha de endoderme comparável C3 Cyperaceae,
e uma bainha parenquimática está presente (Fig.
1B)
• Nos tipos chlorociperóide e fimbristylóide, o
tecido PCR está na posição da borda interna do
parênquima do tecido vascular comparável de
C3 e cyperáceas, em grandes veias principais, a
camada de PCR é interrompida por grandes
elementos do metaxilema (Fig. C e D)
Introdução

8. • No tipo anatômico eleocharóide, a camada de
PCR se encontra na posição da borda interior
do parênquima, mas esta camada é contínua, e
se estende entre os vasos do metaxilema
grandes e bainha da endoderme em veias
maiores ( Fig. 1E)
Introdução

9. Objetivos
• Investigar dois aspectos do desenvolvimento
de células PCA e PCR;
• Determinar se os clados principais diferiam em
vias de desenvolvimento usados para alcançar
o amadurecimento da Anatomia Kranz.

10. Materiais e Métodos
• Material vegetal e condições de crescimento;
• Identificação da zona de alongamento da folha;
• Derivação ontogenética do tecido
fotossintético;
• Imunolocalização.

11.  Material vegetal e condições de crescimento;
• Plantas de espécies C3 Cyperus Eragrostis e três espécies
C4, Rhynchospora rubra (NADP-ME, tipo anatômico
rhynchosporoide), Pycreus polystachyos (NADP-ME, tipo
anatômico chlorociperóide), e Eleocharis retroflexa (NAD-ME, tipo
anatômico eleocharoide) foram cultivadas em estufas da
Universidade de Toronto. Locais e coletores de sementes ou material
preservado estão listadas na (Tabela 1) ; testemunhos estão
depositadas no Royal Ontario Museum Herbarium, Canadá
(TRT). Além de tipagem anatómica, todas as espécies examinadas
neste estudo eram previamente bioquimicamente digitada por
análise com enzimas e / ou razões de isótopos de carbono ( quadro
1 ).
Materiais e Métodos

12. Materiais e Métodos

13. Identificação da zona de alongamento da
folha;
Materiais e Métodos
Ultramicótomo Sorvall
MT-2 (3mm)
Secções transversais
Epon ou Sppur
Inclusão
Lavagem
Etanol 70%
Formalina e ácido
acético glacial-etanol
(70%)
Fixação
Coloração Azul de
toluidina
Comprimento total da
folha ou do colmo foram
medidos para cinco
plantas replicadas para
cada uma das quatro
espécies investigadas

14.  Identificação da zona de alongamento da folha;
Os comprimentos de cinco células epidérmicas foram
medidos a 1,0 mm de intervalo ao longo do
comprimento de cada folha em expansão usando um
micrômetro fase em um microscópio Polyvar
Reichert. Uma vez que anteriormente o alongamento
das células da epiderme pode ser usado como um
marcador para o limite distal da zona de alongamento
de folhas (identificado utilizando critérios
independentes), foi medida a distância a partir da base
da folha para as mais proximais completamente
alongadas das células epidérmicas (Soros e Dengler,
1996).
Materiais e Métodos

15. Derivação Ontogenética dos tecidos
fotossintéticos;
Materiais e Métodos
Ultramicótomo Sorvall
MT-2 (3mm)
Secções transversais
Epon ou Sppur
Inclusão
Pós - fixação
Tetróxido de ósmio
paraformaldeído a 4%
e glutaraldeído 2%,
Fixação - ápices
Coloração Azul de
Toluidina a 0,05% e
Carbonato de Sódio a
0,1%
Espécimes de 4 – 8
semanas
Fotografados em um
microscópio Polyvar
(Reichert-Jung,
Viena, Áustria)

16. • Inferiu a equivalência posicional do tecido
PCR a partir das relações de determinação de
células de linhagem de veias e tecidos
associados.
• Os planos formativos do procâmbio e do
meristema fundamental foram determinados
nas seções em série através da mitose ou pares
de células irmãs, separadas por uma parede
celular visivelmente fina
Materiais e Métodos

18. • Para este estudo, os feixes principais foram
identificados como aqueles com lacunas do
protoxilema e elementos do metaxilema, enquanto
que as veias pequenas foram aquelas sem lacunas
do protoxilema e elementos do metaxilema
pequenos. Estas contagens forneceram dados
quantitativos para descrições qualitativas de outro
padrão, proporcionando assim um apoio adicional
para a interpretação das relações posicionais em
tecidos maduros.
Materiais e Métodos

19. Imunolocalização
Materiais e Métodos
Seções transversais (7
mm) de espessura
foram cortadas em um
micrótomo rotativo e
montados em poli – L
- lisina
Desidratação e
métodos de
incorporação feitos de
acordo com Dengler et
al. (1995)
Ápices foram fixados em 3: 1 de
etanol: ácido acético glacial
overnight à temperatura
ambiente.
Três vértices idênticos, cada um
contendo 5-10 folhas de cada
espécie foram examinados para
cada enzima
Isolamento de proteínas
RuBPCase e produção de
anticorpos foram realizados como
descrito por Dengler et al. (1995)
Imunolocalização de acordo
com Dengler et al., (1995)
™ Immunoselect
imunocitoquímica, ELISA,
imunotransferência e
System
Seções transversais
semifinas foram feitas
em micrótomo rotativo

20.  Imunolocalização;
Os anticorpos primários foram diluídos 1: 5000 para
RuBPCase e 1: 2000 para PEPCase. Lâminas de
controle paralelos usando soro pré-imune no lugar do
anticorpo primário foram executados com cada
experimento RuBPCase e slides omitindo o anticorpo
primário, mas incluindo todos os outros passos foram
executados como controles para os experimentos
PEPCase. Em algumas experiências, as outras espécies,
com padrões de imunolocalização conhecidos (por
exemplo, Stenotaphrum secundatum ; Sud e Dengler,
2000) foram incluídos nas mesmas lâminas como
controles positivos.
Materiais e Métodos

21. Resultados
• O arranjo espacial dos tecidos fotossintéticos
das três formas e da análoga as C3 é altamente
incomum; isso porque tecido PCR está
localizado na borda interna do parênquima do
feixe vascular;
• A posição do tecido de PCR atrás da barreira
fornecido pelas paredes da bainha suberizadas
da endoderme potencialmente melhora CO2 ,
reduzindo a concentração de fuga apoplástica;

22. Resultados
 Identificação da zona de alongamento de folha
• A zona de alongamento foi mais ou menos constante
em toda extensão das folhas de idades crescentes, com
base no padrão de alongamento das células
epidérmicas;
• Em cada espécie, as folhas mais jovens
macroscopicamente visível ou colmo foi menor do que
a zona de alongamento;
• Folhas maduras que tinha cessado a expansão ainda
tinha uma zona de células epidérmicas menores na
base, embora o tecido vascular maduro estivesse
estendido ao longo da zona.

23. Resultados
Nas folhas de C3, o
crescimento parou
quando a folha
atingiu ~175 mm
Zona de
alongamento ~ 6-
8% na folha
madura
As folhas ou os colmos das espécies
representativas (C4) eram mais curtos e
tinham zonas proporcionalmente mais
curtas de alongamento de folhas, mas
estes ainda ocupavam ~ 8% do
comprimento da folha madura ou do
colmo
o alongamento da zona estendida ~ 3,0 mm,
com base em medições de células
epidérmicas e 2,4 ± 0,2 mm, com base no
nível das lacunas de floema

24. Derivação ontogenética dos tecidos
fotossintéticos
• Nas quatro espécies representativas
examinadas, feixes longitudinais foram
organizados durante os primeiros quatro a
cinco plastocronos do desenvolvimento foliar
Resultados

25. • Nos estágios iniciais de desenvolvimento dos
feixes maiores observados, o procâmbio estava
geralmente distinguido do meristema
fundamental pelo menor diâmetro celular e
ausência de vacúolos no citoplasma;
Resultados

26. • Na espécie C3 Cyperus Eragrostis, fios
procambiais poderiam ser reconhecidos pela
redução no tamanho dos vacúolos e pelos
planos distintos de divisão celular;
Resultados

27. • Divisões subsequentes dentro do procâmbio
ocorreu quer no interior da camada periférica
"B“ ou dentro da região "A", mantendo-se a
distinção destas duas linhagens
Resultados

28. • Durante as
fases iniciais da
formação do
cordão
procambial,
divisões
longitudinais
no interior do
meristema
fundamental
adjacente
ocorreu em
todos os planos;
Resultados

29. • Após a formação da camada "C" a partir do
resto do meristema fundamental ("D" região),
ela tende a permanecer distinta do tecido
fundamental circundante;
Resultados

30. • Em veias principais e secundárias, a diferenciação dos elementos PP
da primeira região dentro de "A" forneceu um marcador, indicando
que a região "A" se formou no tecido vascular com fronteira no
interior do parênquima, na sua periferia, a região "B" formou a
endoderme, região "C", formou a bainha do feixe parenquimatoso, e
a região "D" formou o tecido fundamental adjacente .
Resultados

31. Resultados e Discussão
A proporção de
divisões que deram
origem a derivados
refletem a separação
de tecido vascular e
linhagens da bainha
de mestoma desde
cedo

32. Resultados
A diferenciação celular
• a diferenciação das células foi avaliada através
da acumulação de células específicas do
RuBPCase enzimas fotossintética e PEPCase.
• Em Cyperus Eragrostis, RuBPCase e PEPCase
não foram detectadas dentro da zona de
divisão celular (1mm)

33. Resultados

34. • O mesmo padrão foi observado, em geral o
representante das três C4 examinadas, mas
diferem ligeiramente em tempo de acumulação
da enzima (Fig. 9 B e D);
• Chlorocyperóide não foi detectado dentro da
zona de divisão cel; RubPCase foi mas não cel
– especifica; PEPCase não foi detectada nesse
nivel mas apareceu acima da base da folha;
Resultados

35. • Acumulação destas enzimas precedeu tanto a
diferenciação de protofloema e protoxilema e
formação do extenso espaço intercelular no
mesofilo;
Resultados

36. • Acumulação destas enzimas precedeu tanto a
diferenciação de protofloema e protoxilema e
formação do espaço aéreo intercelular extensa
no mesofilo;
Resultados

37. Resultados

38. Resultados

39. Resultados

40. • A posição do tecido de PCR atrás da barreira
fornecida pelas paredes da bainha suberizadas do
mestoma potencialmente melhora o CO2,
reduzindo a concentração de fuga apoplástica;
• Esta versão única de anatomia Kranz levanta
interessantes questões de desenvolvimento,
particularmente em relação: à derivação
ontogenética dos tecidos fotossintéticos, o padrão
temporal de diferenciação fotossintética celular e
da evolução desses padrões de desenvolvimento
dentro da Cyperaceae.
Discussão

41. Derivação Ontogenética de tecidos e de PCR
associada
• Apesar da variação no padrão anatômico
maduro entre os tipos, verificou-se que o
tecido PCR é sempre derivado do procâmbio e
CPA é sempre derivado do meristema
fundamental;
Discussão

42. • Especificamente, procâmbio dá origem ao
tecido vascular, incluindo a margem interior do
parênquima (PCR tecido no fimbristyloide,
chlorociperóide e tipos eleocharoide), e a
bainha de mestoma (tecidos PCR do tipo
rhynchosporoide), enquanto meristema
fundamental adjacente forma o mesofilo (PCA
tecido em tipo C4) e bainha parenquimática,
quando presente;
Dicussão

43. Discussão

44. Referência extra
Simpson, D. A., Yesson, C., Culham, A., Couch, C. A.,
Hodkinson, T., Jones, M., Waldren, S., Parnell, J. (eds.)
Climate chan nge, ecology and systematics. Cambrigde
University Press, pp. 439 – 456. ISBN 9780521766098
(Chapte19) avaible at http;//centaur.reading.ac.uk/20419/