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ELETROFORESE
As moléculas de interesse bioquímico apresentam cargas elétricas
Grande parte das pesquisas atuais em biologia estuda aspectos ligados às
proteínas e aos ácidos nucléicos. Essas macromoléculas têm uma característica
bastante importante: apresentam várias regiões (grupamentos) com cargas elétricas.
As proteínas apresentam tanto grupamentos com cargas positivas quanto
grupamentos com cargas negativas, provenientes dos aminoácidos que as
constituem. As cargas são resultado da ligação ou perda de prótons. Os prótons (H+)
são íons com carga positiva. Alguns grupos são neutros e ao receberem um próton,
tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH2, que, ligando-se a prótons, é convertido
a -NH3
+). Outros grupos são neutros mas, ao perderem um próton, tornam-se
negativos (é o caso do grupo -COOH, que se converte em -COO-). Estas perdas e
adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra.
A somatória das cargas de todas as regiões carregadas de uma proteína
confere uma carga total à proteína. Como foi assinalado, essa carga total da
proteína pode variar dependendo do pH do meio.
Já os ácidos nucléicos (DNA e RNA) apresentam uma situação mais simples
do que as proteínas porque só apresentam as cargas negativas dos grupos fosfato.
Outra característica interessante dos ácidos nucléicos que surge de sua estrutura
polimérica repetitiva é que a razão entre o número de cargas negativas e o número
de átomos que compõem o ácido nucléico é praticamente constante,
independentemente do tamanho ou da seqüência de nucleotídeos da molécula.
As cargas elétricas migram quando submetidas a uma diferença de potencial
elétrico

2. Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença
de potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são
conectados à solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as
cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles. Os ácidos
nucléicos, como são carregados negativamente, migram em direção ao pólo positivo.
Essa migração das cargas quando são submetidas a uma diferença de
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potencial é chamada de eletroforese.
A eletroforese normalmente é realizada com suportes
Apesar de corresponder a uma migração de cargas em solução, a eletroforese
não é normalmente realizada em soluções “puras”. Isso porque as soluções estão
sujeitas a uma série de influências físicas do ambiente que lhes causam
perturbações. Dentre as inúmeras fontes dessas perturbações destacam-se as
ondas mecânicas e até mesmo movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento
da solução causado pela aplicação da diferença de potencial. As perturbações fazem
com que a eletroforese, nessas condições, seja um processo muito pouco
reprodutível, com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim,
dispersas.
Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais
perturbações à eletroforese são minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes
rígidas - conhecidas como suportes - com as quais a solução interage e que diminuem
as perturbações mecânicas e os movimentos de convecção no líquido. Existem dois
tipos básicos de suportes: os suportes de papel e os suportes de gel.
Nos suportes de papel, a natureza hidrofílica da celulose faz com que se
forme uma película de líquido sobre o papel. Como a interação entre a fase aquosa e
a celulose é intensa, a solução sofre pouca influência de fatores mecânicos.
Exemplos de suportes desse tipo são o papel de filtro e o acetato de celulose.

3. Já nos suportes de gel, a solução fica retida dentro dos poros da trama do
polímero que compõe o gel. Dessa forma, a solução também pode ser poupada de
turbulências e convecções. Exemplos de suportes desse tipo são os géis de agarose
e poliacrilamida.
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A velocidade de migração das cargas é influenciada por diversos fatores
Vimos que vários fatores físicos, como choques mecânicos e alterações na
temperatura, podem afetar drasticamente a migração de cargas em solução. Esses
fatores podem ser contornados pelo uso de suportes para a eletroforese. Porém,
outros fatores podem influenciar o movimento das cargas, principalmente a
velocidade de migração de macromoléculas, mesmo se utilizamos suportes. Três
fatores se destacam: a intensidade da diferença de potencial aplicada, a carga total
da macromolécula e o tamanho da macromolécula.
A principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença de
potencial. Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada,
maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.
Por outro lado, se considerarmos a carga total da macromolécula, quanto
maior for essa carga, maior será a atração eletrostática da molécula pelo pólo de
sinal oposto. Dessa forma, quanto maior for a carga da macromolécula, maior será a
sua velocidade de migração eletroforética.
O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade
de migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o
solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a
macromolécula, menor a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal
oposto.
A eletroforese pode ser usada para separar moléculas com carga

4. Tendo em vista todos os fatores influentes sobre a migração eletroforética,
consideremos uma solução em que haja uma mistura de macromoléculas com
tamanhos e/ou cargas diferentes. Ao aplicarmos uma diferença de potencial a esta
solução, as moléculas migrarão com velocidades e/ou direções diferentes,
dependendo de seus tamanhos e cargas. Ao final de um dado intervalo de tempo, ao
desligarmos a fonte da diferença de potencial, cada tipo de molécula estará em um
lugar diferente da solução no espaço entre o pólo positivo e o pólo negativo.
Essa potencialidade da eletroforese é usada para separar macromoléculas
contidas numa mistura complexa. Com efeito, a eletroforese encontra inúmeras
aplicações tanto na pesquisa e no desenvolvimento biotecnológico baseados na
tecnologia do DNA recombinante quanto nos diagnósticos clínico e forense, como
veremos ao longo deste curso.
Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das
macromoléculas, podemos separá-las mais com base na carga ou mais com base em
seu tamanho.
Na eletroforese em suporte de papel, a fricção com o suporte que as
macromoléculas experimentam é pequena, o que faz com que o tamanho da molécula
não influencie profundamente a sua velocidade de migração. Sendo assim, as
moléculas são preferencialmente separadas com base em suas cargas. Esse tipo de
eletroforese encontra grande utilidade na separação de proteínas que, devido à
variada composição de seus aminoácidos, apresentam grandes diferenças na carga
total.
No entanto, a eletroforese em papel não é útil na separação de ácidos
nucléicos. Como vimos acima, a quantidade de cargas por massa molar de ácido
nucléico é praticamente constante, independentemente do tamanho ou da seqüência
de nucleotídeos da molécula. Sendo assim, todas as moléculas de ácido nucléico em
uma solução sofreriam a mesma atração eletrostática pelo pólo positivo. Mas, como
o suporte de papel não apresenta grande capacidade de separar moléculas com base
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5. no tamanho molecular, os diferentes fragmentos de ácido nucléico não seriam
separados nesse suporte.
Esse problema é resolvido nos suportes em gel. Nestes suportes, como a
solução está contida na trama do gel, a fricção entre as macromoléculas e o suporte
é grande. Ou seja, os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as
moléculas com base no tamanho molar, sendo praticamente o único tipo de suporte
para eletroforese utilizado para a separação de fragmentos de ácidos nucléicos.
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