Biotecnologia: cultivo de células vegetais

Semana da Biologia
Minicurso - Biotecnologia: cultivo de células vegetais
Cederj - Volta Redonda

Biotecnologia: cultivo de células vegetais – Aula 1

Bem vindo ao nosso curso sobre Cultura de células e tecidos vegetais in
vitro. Será um prazer ensinar um pouquinho sobre essa magnífica técnica, suas
aplicações e utilidades no nosso cotidiano. Talvez ainda não tenha percebido,
mas a Biotecnologia vegetal já está presente no seu dia-a-dia e através
desse curso você observará isso.
Nesta aula você deverá aprender:
 O que é a biotecnologia/biotecnologia vegetal e suas aplicações;
 O crescimento e desenvolvimento vegetal;
 O princípio da técnica de cultura de tecidos vegetais;
 O que é explante, sua diversidade e como eles são utilizados na
cultura de células e tecidos vegetais;
 Diferenciar embriogênese somática e organogênese, e seu
desenvolvimento de modo direto e indireto.
Qualquer dúvida entre em contato através do nosso fórum, disponível na
página do curso.

Nathalia Torres Dutra

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O que é Biotecnologia?

Desmembrando o termo Biotecnologia temos “bio” que significa vida e
“tecnologia” que segundo o Minidicionário da Língua Portuguesa (Dermival R.
Rios) significa: ciência ou tratado das artes e ofícios em geral; aplicação dos
conhecimentos científicos à produção em geral. De maneira ampla, a
biotecnologia consiste na aplicação de uma diversidade de princípios científicos
e técnicas, principalmente, de biologia celular e biologia molecular em
organismos vivos - no caso da biotecnologia vegetal o organismo vivo utilizado
são as plantas ou “partes” delas - visando à obtenção de produtos e serviços. A
utilização da biotecnologia se torna pertinente quando é sócio-econômica e
culturalmente aceitável, sustentável e ambientalmente segura contribuindo para
o desenvolvimento técnico-científico e proporcionando benefícios mensuráveis.
A biotecnologia engloba conceitos de diversas matérias que você já
estudou ou ainda estudará: Biologia celular, Biologia molecular, Bioinformática,
Genética, Bioquímica, Bioética, Cultura de células e tecidos, Química entre
outras (Figura 1).

Figura 1: Áreas científicas envolvidas no estudo da biotecnologia. (Fonte:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Biotecnologia.jpg)

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O que é cultivar células ou tecidos in vitro

Com certeza você já deve ter ouvido falar nas expressões “cultivo
celular” e “in vitro”. No nosso cotidiano, cada vez com mais intensidade, vemos
notícias sobre pesquisas com células tronco, formação de tecidos artificiais,
produção de embriões através da fertilização in vitro, produção de biomoléculas
(como hormônios) através de organismos geneticamente modificados (...). O
que essas pesquisas têm em comum: todas realizam o cultivo in vitro seja de
células procarióticas mais simples ou mais complexas como as células e
tecidos animais ou vegetais.
Cultivar células e tecidos significa, em síntese, manter vivas células e
tecidos retirados de um organismo. Essa manutenção geralmente é feita em
tubos de ensaio, garrafas ou placas de petri (Figura 2) em ambiente estéril
(livre de contaminação por microrganismos) contendo um meio de cultura
nutritivo. Nos dias de hoje esses recipientes podem ser feitos de plástico, mas
antigamente todos eram de vidro. Daí o surgimento da expressão in vitro.
B

A

A

C

D

Figura 2: Recipientes utilizados para o cultivo de células in vitro. (Fonte: Ahttp://www.frilabo.pt/fcms/index.php?option=content&task=view&id=49, B- http://www.
quebarato.com.br/tubo-de-ensaio-acrilico-para-lembrancinha-r-0-79__15BC7B.html Chttp://www.duran-group.com/en/products-solutions/laboratory-glassware/products/
boiling-flasks-and-general-laboratory-glassware/erlenmeyer-flask.html, D- http://www.
spectrun.com.br/site/index.php?pag=visualiza_cat&id=1553&cat=4

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Crescimento e desenvolvimento vegetal

O desenvolvimento vegetal se inicia na embriogênese que transformará
uma célula única – o zigoto - em um embrião multicelular. Esse, ainda no início
do seu desenvolvimento, já estabelecerá e apresentará o plano básico do
corpo da planta e formará os primeiros meristemas que darão origem aos
tecidos e órgãos da planta adulta (Figura 3).

A embriogênese é o processo através do qual o embrião é
formado e se desenvolve. Embora geralmente o embrião se
desenvolva a partir da formação do zigoto, células somáticas
também podem sofrer embriogênese em condições
especiais. Calma! Isso será visto ao longo do curso!

Meristema pode ser definido como um tecido constituído de
células indiferenciadas que possuem a capacidade de se
dividir continuamente e originar novas células
indiferenciadas e também de células diferenciadas. Isto
significa que uma célula meristemática pode originar
qualquer tipo de célula especializada do corpo do vegetal.


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Figura 3: A organização apical-basal de tecidos e órgãos vegetais é estabelecida bem
cedo e em regiões específicas do embrião. (Fonte: A= http://www.ufpel.tche.br/cenbiot
/DiferenciacaoVegetal2009.pdf, B= Livro Fisiologia Vegetal – Lincoln Taiz e Eduardo
Zeiger 3ª Edição

No período pós-embrionário as células meristemáticas através da
divisão, expansão e diferenciação celular vão gerar tecidos e órgãos com
funções especializadas e padrões específicos que vão determinar o tamanho, a
forma e a estrutura definitiva da planta. Através da figura 4 observamos que a
planta apresenta tecidos altamente organizados e diferenciados. Os fatores
que levam uma célula indiferenciada a formar células totalmente especializadas
são muito estudados e ainda apresentam muitas perguntas sem respostas,
mas sabe-se que são regulados pela expressão diferenciada de genes e
também através da interação do organismo vegetal com o ambiente.


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Figura 4: Estrutura da planta adulta com seus tecidos altamente especializados.
(Fonte: Material didático de Claudete Santa Catarina e Vanildo Silveira)

Princípio da cultura de tecidos vegetais

A cultura de células e tecidos vegetais é uma técnica biotecnológica em
que células ou fragmentos de tecidos isolados – chamados de explantes - são
cultivados in vitro sob condições químicas e ambientais controladas. Esses
explantes se dividem e se desenvolvem igualmente às plantas em seus
ambientes naturais. O objetivo é desenvolver um novo organismo idêntico ao
original, no caso a planta matriz (planta em que se retiraram as células ou
fragmentos de tecidos), ou seja, é realizada uma clonagem vegetal. (Figura 5).
Essa técnica se baseia na teoria da totipotencialidade.

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Figura 5: Desenvolvimento de uma nova planta a partir de explantes de uma planta
matriz. Fonte: http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio01/1hp_11.pdf Clonagem de
plantas in vitro: uma realidade. Gilberto B. Kerbany. Instituto de Biociência da
Universidade de São Paulo.

Totipotência é a capacidade de uma única célula se dividir e
reconstituir um organismo inteiro. Através da técnica de
cultivo in vitro uma célula somática diferenciada de um
organismo pluricelular é capaz de originar um indivíduo
idêntico a sua matriz doadora (clone), comportando-se como se
fosse uma célula-ovo ou zigoto. Você verá isso com mais
detalhes quando falarmos de embriogênese somática.

Além da clonagem vegetal, essas células e tecidos cultivados in vitro
podem ser utilizados para estudos básicos na área de biologia molecular,
biologia celular, genética, bioquímica. Muito do que você aprende na faculdade
foi descoberto através de pesquisas utilizando técnicas como estas que você
está aprendendo nesse curso.


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Um pouco de história

A teoria da totipotencialidade foi formulada por Matthias Schleiden &
Theodor Schwann, em 1838, constituindo um dos primeiros fundamentos da
cultura in vitro. Essa teoria afirma que cada célula possui o potencial genético
para reconstituir um organismo inteiro, nesse caso uma planta completa. É
claro que essa capacidade se manifesta sob condições especiais de estímulo.
Haberlandt, um fisiólogo vegetal austro-húngaro, por volta de 1902, foi o
primeiro a manipular um sistema de cultura in vitro de plantas, procurando
estabelecer e consolidar um sistema de micropropagação (produção rápida de
milhares de clones de uma planta). Infelizmente, por limitações técnicas da
época, seus esforços falharam. Contudo, alguns anos mais tarde a partir dos
trabalhos de Robbin (1922) e White (1934) em ponta de raízes; cultura de
embriões, por La Rue (1936); cultura de calos, por Gautheret Nobécourt (1939);
enriquecimento de meios nutritivos com leite de coco, por van Overbeek, 1941;
uso de plantas de tabaco como modelo experimental para estudo de
morfogênese, por Skoog, desde 1944, e uso de meristemas apicais na
obtenção de plantas livres de vírus, por Morel & Martin,1952, abriram-se os
caminhos que a cultura de tecido de plantas percorreria triunfalmente ao longo
de todo o século XX, com mais e mais descobertas e aplicações. (Fonte: L.
Pedro Barrueto Cid).


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Fontes de explantes

Como foi dito anteriormente, explantes são as células ou fragmentos de
tecidos de uma planta doadora que são cultivados in vitro originando uma nova
planta idêntica a matriz.
Esses explantes podem ser obtidos de várias partes da planta. Cada
espécie devido a suas diversidades genéticas, condições ambientais em que
vive, diferenças morfológicas e diversos outros fatores vai apresentar um tecido
“mais favorável a gerar” novas plantas. Abaixo listamos alguns tecidos vegetais
que são comumente utilizados para o cultivo de plantas in vitro.
 Cultura de meristema: consiste no estabelecimento da cultura vegetal
através do meristema apical vegetal, originando normalmente um único
broto (Figura 6).

Figura 6: Fonte: A= Modificado de http://www.botanica.cnba.uba.ar/Trabprac/Tp4/
Lagerminacion.html; B= http://professores.unisanta.br/maramagenta/
meristemastecidos.asp


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 Cultura de ápices caulinares: é o estabelecimento in vitro a partir de
ápices caulinares maiores do que aqueles utilizados para iniciar a cultura
de meristema, tendo alguns primórdios foliares. Essas brotações apicais
podem produzir múltiplas brotações. (Figura 7).

Figura 7: A) ápice isolado; B) ápice recém-transferido in vitro; C) enraizamento de
ápice após vinte dias da transferência in vitro; D) brotações foliares após 20 dias da
transferência in vitro. (SILVA, P.P. et al, 2010).

 Cultura de segmentos nodais: Contém segmentos caulinares que
carregam gemas simples ou múltiplas. Cada gema desenvolve para
formar

uma

única

brotação

(Figura

8).

Gemas

são

regiões

meristemáticas, ou seja, regiões compostas por células que ainda não
se diferenciaram.


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A

B

Figura 8: (A) Segmento nodal e (B) gema lateral. (Fonte: A= http://en.wikipedia.
org/wiki/Plant_stem e B= http://www.feiradeciencias.com.br/sala26/26_feira_06.asp)

 Cultura de embriões: É iniciada a partir de embriões zigóticos, ou seja,
os embriões que são extraídos das sementes. Os embriões germinam
originando plântulas (Figura 9).

Figura 9: Embrião da semente de mamão. Fonte: Cid (2003).


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 Discos de folhas e segmentos de raiz (Figura 10).

Figura 10: Folha e regiões da raiz. Fonte: A= http://pt.wikipedia.org/wiki/Folha; B=
http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/reino-plantae/estrutura-da-raiz-3.php

Assepsia dos explantes

Para a escolha do explante devemos levar em consideração a idade, as
condições fisiológicas e fitossanitárias da planta matriz e suas necessidades
específicas para o cultivo in vitro. Além disso, os explantes antes de serem
inoculados ao meio de cultura devem passar por um processo de assepsia.
Assim como o meio de cultura será nutritivo para favorecer o crescimento da
nova planta, ele também será para o crescimento de microrganismos
indesejáveis. Desta forma, realizamos a assepsia para eliminar fungos,
bactérias e demais microrganismos que porventura estejam presentes no
explantes e, assim, mantendo as culturas isentas de contaminação (Figura 11).


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BACTÉRIAS
FUNGOS

VÍRUS

PROTISTAS

Figura 11: A assepsia dos explantes elimina fungos, bactérias, vírus e protistas
possibilitando a indução e manutenção de uma cultura isenta de microrganismos.

A assepsia é realizada utilizando soluções aquosas contendo agentes
desinfestantes. Esses são utilizados em concentrações específicas e devem
ficar em contato com o explante por tempo determinado já que em grandes
concentrações ou longos períodos de tempo são tóxicos para as células.
Abaixo uma tabela lista os principais desinfestantes utilizados para a assepsia
de explantes vegetais.


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Agente
desinfestante

Concentração
do ingrediente
ativo

Fitotoxicidade

Tempo de
desinfestação

Hipoclorito de
sódio (água
sanitária
comercial 40%)

0,25 – 1%

Moderada

5 a 20 min.

Hipoclorito de
cálcio

9-10%

Moderada

5 a 20 min.

H202

3-10%

Alta

5 a 20 min.

Etanol

70%

Alta

0,5 a 1 min.

De forma geral, o protocolo para a assepsia do explante se divide em
duas fases. A primeira pode ser realizada na própria bancada do laboratório e
consiste em lavar seu explante de 4 a 5 vezes com água associada a uma gota
de detergente. Após deve-se lavar com álcool 70% de 1 a 5 minutos e
posteriormente de 10 a 30 minutos com Hipoclorito de sódio – ou o
desinfestante mais propício - associado a uma gota de detergente. A segunda
fase consiste na lavagem do explante por 4 vezes com água destilada
autoclavada. Autoclavar é um processo em que o material – no caso a água - é
submetida à esterilização, ou seja, torna-se isenta de qualquer microrganismo
ou esporo desse. Essa lavagem com água destilada deverá ser realizada no
fluxo laminar – um aparelho que possui um fluxo direcionado de ventilação com
filtros especiais que proporcionam um ambiente com condições assépticas
também essenciais para se evitar a contaminação da sua cultura.
Você deve ter reparado que nós estamos falando o tempo todo de
assepsia, solução estéril. Isso é muito importante! Deve ficar sempre claro que
toda a manipulação de células e tecidos vegetais deve ser realizada em um
ambiente o mais livre de contaminação possível, afinal, como dissemos
anteriormente queremos que nossa planta se desenvolva livre de qualquer
contaminação que possa prejudicá-la.

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Após a assepsia, o explante é transferido para o ambiente in vitro
contendo o meio de cultura estéril. O desenvolvimento do explante pode
ocorrer por diferentes caminhos morfogenéticos, ou seja, a divisão, expansão e
diferenciação celular para a formação da nova planta poderá se realizar por
diferentes rotas.
Os explantes no início do seu crescimento e/ou desenvolvimento in vitro
podem se multiplicar formando uma cultura de tecidos desorganizada na forma
de calos ou suspensões (Figura 12). Calos são várias células agregadas de
forma desorganizada que se originam da proliferação desordenada a partir de
tecidos ou órgãos cultivados in vitro. Suspensões celulares são a proliferação
de células isoladas ou pequenos aglomerados de células dispersos em um
meio líquido, sob agitação.

Figura 12: A= Calo embriogênico de eucalipto (Fonte: Cid, 2003). B= cultura em
suspensão celular (Fonte: Koehler, 2006)

Mas também podem se desenvolver de forma organizada através da
formação de tecidos vegetais. (Figura 13).


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Figura 13: Desenvolvimento vegetal
http://www.danielafafe.blogspot.com/

in

vitro

por

organogênese.

Fonte:

Além disso, de acordo com explante escolhido e os estímulos aplicados
a ele, podemos ter o desenvolvimento de um embrião, que de acordo com a
teoria da totipotencialidade, se transformará em uma nova planta. Essa forma
de desenvolvimento é chamada embriogênese somática. Lembrando que se
diz embrião somático, pois o embrião terá origem de tecidos ou células já
diferenciadas de uma planta matriz e não da união dos gametas para formação
do zigoto. Ou podemos ter o desenvolvimento direto de órgãos vegetais (sem a
formação do embrião) até a formação do organismo inteiro – essa forma de
desenvolvimento se chama organogênese. Esses conceitos de embriogênese e
organogênese são muito importantes e também serão abordados em aulas
posteriores.
Unindo todos esses conceitos que foram apresentados até aqui temos
que a partir da transferência do explante para o meio de cultura poderemos
obter:


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A embriogênese somática direta: a partir do explante já há formação do
embrião somático que formará de uma nova planta.
A embriogênese somática indireta: a partir do explante se forma o calo
que é um tecido desorganizado que após crescimento e diferenciação celular
originará o embrião somático.


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A organogênese direta: a partir do explante já há formação de tecidos
organizados e diferenciados que continuaram o seu desenvolvimento até a
formação de uma nova planta.
A organogênese indireta: a partir do explante se forma o calo que é um
tecido desorganizado que após crescimento e diferenciação celular originará
diretamente os tecidos vegetais organizados e diferenciados (sem a formação
de embrião).

Na próxima aula, será abordado como é realizada a manutenção das
culturas vegetais, a constituição e preparação de meios de culturas e como
esses podem influenciar no desenvolvimento dos explantes nas diferentes
rotas mencionadas acima.


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Fontes:
 Alves, C.; Oliveira, J.R.; Reis, E.S.; Corrêa, R.M.; Souza, J.; Silva,
J.C.O.; De Paula, J.C.R.; Rofrigues, R.H.F.; De Souza, M.A.; Mendonça,
M.R. A cultura de tecidos na agricultura. I Jornada Científica e VI FIPA
do
CEFET
Bambuí.
[http://www.cefetbambui.edu.br/str/artigos
_aprovados/Ci%C3%AAncias%20Agrarias/14-PT-12.pdf]
 Fisiologia Vegetal – Lincoln Taiz e Eduardo Zeiger, 3ª Edição
 Guerra M. P.; NODARI R. O. Apostila de Biotecnologia vegetal. Apostila
de aula. [http://www.cca.ufsc.br/lfdgv/Apostila.htm]. 2007.
 L. Pedro Barrueto Cid; A propagação in vitro de plantas. O que é isso? –
Cultura de tecidos, 2003.
 Silva, P.P; Contim, L.A.S; Freitas, D.V; Aride, P.H.R; Santos, A.L.W.
Estabelecimento in vitro de ápices caulinares de Sumaúma (Ceiba
pentandra L. Gaertn), 2010.
 Santa-Catarina, C; Silveira, V. INTRODUÇÃO À CULTURA DE
TECIDOS VEGETAIS. Apostila de aula, 2010;
 Santa-Catarina, C; Silveira, V. CONDIÇÕES PARA A CULTURA IN
VITRO. Apostila de aula, 2010;
 Torres AC, Caldas LS, Buzzo JÁ. (Eds). Cultura de Tecidos e
Transformação Genética de Plantas. v.1. e 2. Brasília, Embrapa,
1998.1999.


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