Trabalho relacionado com a seleção de fungos filamentosos produtores de lipase

1.
SELEÇÃO DE MEIOS DE PRODUÇÃO DE LIPASE POR
Aspergillus ssp
Lima, B.F.(1)
; Correia, M. A. B.(1)
; Santos Cordeiro, C.C.(1)
; Andrade Silva, N.
R.(1)
; Sá Muniz, M. C.(1)
; Amorim, H. S.(1)
; Lima, J. M. M.(2)
; Alves da Silva,
C.A.(1)
brindizeflima@hotmail.com
(1)
Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP, Recife – PE, Brasil;
(2)
Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife – PE, Brasil.
RESUMO
As lipases produzidas por micro-organismos constituem um grupo de enzimas com
elevada aplicação biotecnológica. O gênero Aspergillus apresenta um elevado
potencial biotecnológico em produzir inúmeras enzimas extracelulares, ácidos
orgânicos e outros metabólitos secundários de importância biotecnológica. Foram
realizados ensaios de produção de lipase com as amostras de Aspergillus denominadas
de SIS 10 e SIS 16, isoladas da Caatinga de Pernambuco, utilizando diferentes meios
de produção de lipase, meio 1: Glicose (0,1g/L), MgSO4.7H2O (0,2 g/L), K2HPO4
(O,7g/L), extrato de levedura (O,4g/L), óleo de oliva (2,0 v/v), pH 6,5; meio 2: óleo
de oliva (30 mL), peptona (70g/L), NaNO3 (1g/L), KH2PO4 (1 g/L), MgSO4.7H2O
(0,5 g/L), pH7,0; meio 3: NaNO3 (0,05g/L), MgSO4.7H2O (0,05g/L), KCl (0,05g/L),
KH2PO4 (0,2g/L), extrato de levedura (0,1g/L), peptona (0,5g/L), óleo de oliva 1%,
pH 5,5. Os experimentos foram realizados em shaker orbital, 150 rpm, 28ºC, durante
144 horas. As amostras coletadas foram submetidas à determinação do pH e atividade
lipolítica expressa em U/mL. Os resultados obtidos demonstraram que o meio 2
apresentou uma maior atividade lipolítica para as amostras testadas, sendo que a SIS

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10 obteve uma atividade de 22,64 U/mL em 120 horas, e a SIS 16 uma atividade de
26,52 U/mL em 144 horas.
Palavras-chaves: Produção Enzimática, Enzima, Caatinga.
INTRODUÇÃO
A biotecnologia é vista como sendo uma forte e confiável tecnologia,
relativamente de baixo risco, capaz de ser implementada em larga
escala e em grande variedade de setores industriais (ALENCAR, 2011).
As enzimas industriais são grandes representantes dos processos
biotecnológicos. O setor de produção de enzimas apresenta muitas
iniciativas de pesquisa e desenvolvimento, que resulta na produção de
diversos novos produtos e no aprimoramento dos processos e
desempenho de produtos já existentes no mercado (SANTOS et al.
2013).
Atualmente existem quase 4.000 enzimas que são conhecidas, e destas,
cerca de apenas 200 estão sendo utilizadas comercialmente. As maiorias
das enzimas industriais são de origem microbiana. E vem conquistando
uma faixa crescente do mercado, no entanto várias questões ainda estão
em aberto, e persiste à busca de conhecimentos mais específicos, tanto
em relação à fisiologia dos micro-organismos, como também a estrutura

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e comportamento catalítico destas enzimas em meio aquoso e orgânico
(CAPRA, 2009; PEREIRA; FREITAS, 2012; CAMARGO, 2012).
Enzimas são proteínas que apresentam configuração globular,
constituídas de estruturas terciárias ou quaternárias, cuja função
principal é atuar como catalisador biológico, acelerando a velocidade de
diversas reações químicas existentes no organismo, sem, contudo serem
modificadas durante o processo, pois possuem elevada especificidade e
estão associadas a todos os eventos metabólicos (SOUZA; RABELLO;
ASCHERI, 2011). Biocatalisadoras e com propriedades que as tornam
altamente requisitadas, são muito ativas e versáteis, realizando uma
serie de transformações de modo seletivo e rápido. A grande vantagem
é que elas catalisam as transformações moleculares sem a ocorrência de
reações paralelas, o que é comum em sínteses químicas isso devido sua
especificidade (MOURA et al.,2013).
Neste contexto, este trabalho propôs produzir lipase através de amostras
de fungos filamentosos identificados como Aspergillus ssp, isoladas da
Caatinga de Pernambuco, utilizando meios reportados na literatura como
bons produtores de lipase afim de selecionar as melhores condições de
produção.

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MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismos
Foram utilizados culturas de fungos filamentosos do gênero
Aspergillus, recolhidos e isolados da Caatinga de Pernambuco
denominados de SIS 10 e SIS 16 previamente catalogados no Banco de
Culturas da Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP),
localizado no Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais
(NPCIAMB). As culturas foram mantidas em meio Ágar Sabouraud
Dextrose (ASD), com a seguinte composição: dextrose (40 g/L),
peptona (10 g/L), ágar (20 g/L), água destilada 1000 mL e pH 5,6.
Inóculo
A cultura esporulada foi suspensa em solução de Tween 80 VETEC a
0,01%. A contagem do número de esporos e células em suspensão
procedendo-se utilizando câmara de Neubauer e microscópio binocular.
Foram utilizados volumes de 2 mL da suspensão quantificados no valor
de 107
.
Seleção de meios de produção
O crescimento ocorreu em Erlenmeyers de 500 mL em shaker orbital a
86 rpm a 28º C, durante 144 horas, com volume útil de 250 mL (% p:v).

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As amostras de Aspergillus foram testados em 3 meios de produção da
enzima reproduzidos por Colen (2006). O Meio 1 possui a seguinte
composição: meio 1: Glicose (0,1g/L), MgSO4.7H2O (0,2 g/L),
K2HPO4 (O,7g/L), extrato de levedura (O,4g/L), óleo de oliva (2,0
v/v), pH 6,5; meio 2: óleo de oliva (30 mL), peptona (70g/L), NaNO3
(1g/L), KH2PO4 (1 g/L), MgSO4.7H2O (0,5 g/L), pH7,0; meio 3:
NaNO3 (0,05g/L), MgSO4.7H2O (0,05g/L), KCl (0,05g/L), KH2PO4
(0,2g/L), extrato de levedura (0,1g/L), peptona (0,5g/L), óleo de oliva
1%, pH 5,5. Todo o experimento foi realizado em triplicata, e as
amostras coletadas no processo incubação foram submetidas à
determinação do pH e atividade lipolítica.
Determinação da atividade lipolítica
A atividade enzimática de lipase foi detectada através da metodologia
descrita por Soares et al. (1999). Foi realizada uma reação de uma
mistura contendo 5 ml de uma emulsão de óleo de oliva e goma arábica
(7%), 2 mL de tampão fosfato de sódio (0,1 M) pH 7,0 e 1 mL do
extrato bruto filtrado da lipase produzida na encubação em meio
líquido. A mistura foi agitada em shaker orbital a 82 rpm, 37 ºC,
durante 10 minutos. A reação foi parada através da adição de 10 mL de
uma mistura acetona-etanol-água (1:1:1), que irá liberar os ácidos
graxos livres presentes na mistura, e titulado com uma solução de KOH

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(0,04 N) na presença do indicador fenolftaleína. Os ensaios foram
realizados em triplicatas e a atividade enzimática foi determinada
através da seguinte relação: uma unidade da atividade lipolítica (U/mL)
será definida como a quantidade da enzima bruta que liberou 1 µ/mL de
ácido graxo por minuto.
Cálculo da atividade enzimática
A atividade enzimática de lipase foi calculada através da equação
seguinte equação:
AE (U/mL) = (Va-Vb) x N x 1000
t x Vc
Ode: AE é a atividade lipolítica (U/mL); Va é o volume da amostra
titulada (mL); Vb é o volume da amostra utilizado na reação (mL); N é
a normalidade da solução de KOH (mol/L); t é o tempo de reação em
minutos (SOARES, et al, 1999).

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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste estudo foram realizados ensaios para a determinação da produção
de lipase em três diferentes meios de produção denominados de meio 1,
meio 2 e meio 3 reportados na literatura como produtores de lipase.
Verificou-se que o micro-organismos SIS 10 e SIS 16 obtiveram melhor
desempenho no meio 2. O SIS 10 obteve uma atividade lipolítica
equivalente a 22,64 (U/mL) em 120 horas, em comparação com o SIS
16 que obteve uma produção equivalente a 26,52 (U/mL) em 144 horas.
Os meios 1 e 3 não demonstraram valores significativos de produção de
lipase com ambos micro-organismos em comparação com o meio 2. No
meio 2 houve um decréscimo na atividade lipolítica em 144 horas com
o SIS 10. Esta redução na produção pode ser devido à inativação da
enzima por proteases extracelulares (SANCHEZ; DEMAIN, 2002; TAVARES
et al., 2011).
Tabela 1. Atividade lipolítica do SIS 10 em 3 diferentes meios.
Tempo (horas) Meio 1 (U/mL) Meio 2 (U/mL) Meio 3 (U/mL)
24 0 6,52 0
48 0 9,84 0
72 0 17,04 0
96 1,04 20,40 0,52
120 0,64 22,64 0
144 0 10,24 0

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Tabela 2. Atividade lipolítica do SIS 16 em 3 diferentes meios.
Tempo (horas) Meio 1 (U/mL) Meio 2 (U/mL) Meio 3 (U/mL)
24 0 7,72 0
48 0 8,8 0
72 0 21,84 0
96 1,44 22,80 0
120 0 17,32 0
144 0 26,52 0
Carvalho e colaboradores (2005) constatou em um meio de cultura
contendo extrato de levedura 0,1%, bactepeptona 0,5%, glicose 1%,
óleo de oliva 0,5%, Triton 100 e outros minerais atingiu a atividade
lipolítica de 18,0 U/mL 30Cº após 72 horas de incubação utilizando
Aspergillus niger van Tieghem, comparando-o com Geotrichum
candidum Link ex Leman e Penicillium solitum Westling que obteve
atividade lipolítica 12,8U/mL e 10,5U/mL respectivamente.
Feitosa (2009) cita que na literatura a temperatura de 37ºC e pH de
7,0 foram definidos como ótimos para as lipase. Variações bruscas
dos valores de pH indicam consumo dos substratos no meio
(TAVARES et al. 2011). Este fato pode ser evidenciados nas Figuras 1
e 2.

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Figura 1. Representação da variação do pH nos
diferentes meios do micro-organismo SIS 10.
Figura 2. Representação da variação do pH nos
diferentes meios do micro-organismo SIS 16.
CONCLUSÃO
As cepas de Aspergillus ssp isoladas da Caatinga de Pernambuco
denominadas SIS 10 e SIS 16 demonstraram capacidade para produção

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de lipase. Dentre os meios utilizados, o meio 2 provou ser eficiente na
produção enzimática com o micro-organismos testados.
REFERÊNCIAS
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f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Processo de Desenvolvimento Ambiental,
Departamento de Núcleo de Pesquisas de Ciências Ambientais (NPCIAMB),
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