project mutamba

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  1. 1. 1. DADOS CADASTRAIS DO SOLICITANTE NOME: Paulo Antônio Rodrigues Gouveia ENDEREÇO: Rua Goianesia, nº78, Conjunto Urbanístico. CIDADE: Araguaina - TO CEP: 77818-772 CNPJ/CPF: 388.684.581-87 INSCRIÇÃO ESTADUAL: --- 2. DADOS AMOSTRA IDENTIFICAÇÃO DO PRODUTO: “Extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia. TOTAL AMOSTRA: 5 frascos. LOCAL DE PRODUÇÃO: Fornecido pelo solicitante. LOTE: --- VALIDADE: --- 3. ENSAIOS ENSAIOS REALIZADOS: Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade antiviral (HIV) in vitro. 4. EXECUÇÃO DOS ENSAIOS KYOLAB LABORATÓRIO LTDA. CNPJ: 05.758.608/0001-01 Rua Lauro Vanucci, 1020 – Jd. Santa Cândida – Campinas-SP CEP: 13087-548 RESPONSÁVEL PELO ENSAIO: Thaís Barbizan Ferreira da Costa e Dr. Amilcar Tanuri DATA DE RECEBIMENTO DA AMOSTRA: Fevereiro/2012 Período de realização do ensaio: Abril/Maio 2012 Data emissão do relatório: 01/06/2012 Kyolab, 01 de junho de 2012. KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  2. 2. RELATÓRIO TÉCNICO Purificação do “extrato” aquoso de Guazuma ulmifolia e estudo da atividade antiviral (HIV) in vitro. 1. Identificação da amostra Extrato aquoso de Guazuma ulmifolia fornecido pelo solicitante. 2. Objetivos Purificação do extrato aquoso e avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro. 3. Método 3.1 Purificação do extrato aquoso: Foi realizada uma filtração do extrato fornecido e após uma partição líquido – líquido com hexano e butanol, como pode ser observado no fluxograma 1. O hexano extraiu muito pouco, com isso, não se obteve uma massa significativa. Foi realizada uma Cromatografia em Camada Delgada para uma comparação da composição química das diferentes amostras obtidas com a partição. Para avaliação da atividade antiviral (HIV) in vitro, foram enviadas as amostras: Fração butanólica (BuI), Fração aquosa (AQI) e extrato total após a filtração (TI). KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  3. 3. Extrato aquoso Guazuma V= 200mL - Funil de separação; - 200mL Hexano; - Agitação e separação das fases. Fr. Hexânica Fr. Aquosa - 200mL Butanol; - Agitação; - Separação das fases. FR. BuOH 1 Agrupamento das duas frações. Fr. Aquosa - 100mL Butanol; - Agitação; - Separação das fases. FR. BuOH 2 m = 166,7mg Fr. Aquosa M = 1,4662g Fluxograma 1: Partição líquido/líquido extrato aquoso de Guazuma ulmifolia. KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  4. 4. Cromatografia em Camada Delgada: Pontos: 1) Extrato aquoso após filtração; 2) Fração Aquosa; 3) Fração Butanólica. Eluente: Acetato de etila: Ác. Fórmico: Água ( 90:5:5) Revelador: Solução de Anisaldeído. 3.2 Teste de ação antiviral das frações (BUI e AQI) e extrato (TI), vindos da Guazuma ulmifolia usando células MT4. 3.2.1 Vírus padrão: isolado NL4-3 (subtipo B, padrão) purificado de passagem em cultura de células MT-4. Título: 103 TCID50 / ml. 3.2.2 Linhagem celular utilizada: MT-4, linhagem linfocitária estabelecida em cultura, CD4+, expressando co-receptores CCR5 e CXCR4 do HIV-1. Célula formadora de sincício (SI) e muito sensível à infecção pelo HIV-1. KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  5. 5. 3.2.3 Desenho do ensaio: Infecção em placa de 96 poços, contendo 104 células/poço, infectadas com MOI (multiplicidade de infecção) de 0,002 (recomendação do NIH= 0,001 a 0,01). As três amostras (BUI, TI, e AQI) vindos da Guazuma ulmifolia, foram diluídos em DMSO a 20mg/ml e posteriormente diluído em meio base RPMI 1640 para 200µg/ml no primeiro poço das células infectadas previamente com o isolado HIV-1 NL4-3 (subtipo B). Depois as células foram expostas a concentrações decrescentes da droga, a partir de fator de 5 de diluição. O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 adicionado de 10% de soro fetal bovino, antibióticos estreptomicina/penicilina a 1% e L-glutamina a 0,2mgml. O poço mais concentrado possuía concentração final de 200µg/ml, seguindo-se as diluições sucessivas de 5 vezes como indicado: 40µg/ml, 8µg/ml, 1,6 µg/ml, 0,32µg/ml. No último e nono poço, foi mantido como controle da infecção, sem a presença da droga. Cada linha de 10 poços de infecção foi produzida em sextuplicata, para tratamento estatístico posterior. Um quarto “array” (linha) de 10 poços de células foi exposto à diluição seriada da droga, como descrito, mas sem a presença de vírus, para análise de citotoxidade da droga, nesta faixa de concentração. A infecção, mantida em estufa CO2 5% a 37°C, foi acompanhada diariamente por microscopia óptica de fase, para análise do aparecimento de sincícios, o que acontece geralmente no quarto dia pós-infecção. 3.2.4 Revelação do ensaio: A técnica utilizada de coloração CellTiter-Blue Assay da Promega para medida da viabilidade celular, foi utilizada no sexto dia p.i., a fim de permitir a diferenciação de viabilidade celular pós formação de sincício. Após coloração, a placa de 96 poços será lida em fluorimetro 560. Ex. /590. Em. Os resultados foram analisados em matriz Microsoft Excel p/ Windows (Office 98), efetuando-se a correção do branco, e a plotagem em gráfico da KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  6. 6. frequência de emissão do ensaio (em porcentagem, usando como padrão 100% a emissão de poço de células viáveis sem infecção) como medida da viabilidade celular. O valor de 50% da emissão do padrão foi considerado como ponto de “cutoff” para o cálculo do EC50 (concentração inibitória da droga em 50% da infecção) após obtenção, no gráfico, da equação da curva de regressão logarítmica (ou semi-logarítmica). Um novo experimento com a amostra Bu1 foi realizado para corroborar os dados anteriores e também confirmar efeito anti-HIV desta amostra. KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  7. 7. 4. Resultados Observam-se abaixo os dados brutos do ensaio com as amostras de Guazuma ulmifolia. Experimento 1: ug/ml AQ1 100 1 3218.536 3742.886 3791.326 3111.216 3035.973 3018.325 20 2 3787.642 3349.466 3862.401 19477.83 11976.43 10846.91 4 3 3054.273 2993.495 3165.824 4366.21 8528.929 24493.36 0.8 4 3029.623 2921.36 3175.966 2674.602 5251.845 10675.08 0.16 5 3050.815 3504.554 3471.753 3761.903 4034.446 10511.61 0.032 6 2942.556 3313.594 3284.441 3076.742 6046.562 11035.92 0.0064 7 2838.061 3368.63 3324.773 6052.958 9489.978 13717.92 0.00128 8 3266.952 3508.849 3071.067 3048.72 7767.46 7460.173 0 MOCK 9 10 3856.086 21463.08 3831.135 14058.51 4265.1 20294.67 7240.043 7477.002 10664.81 12772.81 11631.7 14904.05 T1 1 4678.774 3648.367 4505.607 3478.071 3464.056 3466.57 2 4786.826 4698.749 4855.646 11082.36 18769.24 30047.38 3 3640.615 3396.308 3050.558 20798.67 23575.37 42701.53 4 3197.269 3033.221 3060.215 3092.523 6290.354 20304.38 5 2969.581 2937.966 2851.461 6175.344 11040.51 21610.14 6 3167.663 3177.718 3222.067 9931.44 12574.45 33459.76 7 3161.772 3185.137 3087.069 6314.826 6861.942 23847.6 8 2945.539 2912.907 3152.385 6791.282 10059.75 20340.6 9 2893.992 3171.715 3232.763 7868.27 20465.64 24218.94 10 15247.06 16203.14 19429.31 11966.43 22468.87 29270.19 BU1 1 3780.665 3725.434 3694.26 3706.6 3751.745 3786.029 2 6687.205 9439.628 6138.598 9131.073 13926.65 21043.8 3 4030.617 3754.924 3697.187 9456.156 13667.83 35402.97 4 3735.877 3216.574 3453.84 4017.167 5648.854 20247.16 5 3343.416 3391.877 3268.927 6634.354 28670.71 40455.04 6 3349.616 3571.244 3461.059 4801.022 11885.63 36367.43 7 3335.424 3594.279 3536.97 3718.691 6658.553 14835.89 8 3387.817 3599.979 3485.578 4119.047 3977.721 9229.815 9 3535.693 3483.987 3595.887 19062.17 6637.935 14016.52 10 21099.38 20940.39 28091.88 10836.41 13054.59 23878.32 KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  8. 8. Figura 1: Sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1, e AQ1. Podese verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 20ug/ml. Experimento 2: Seguem abaixo os dados da repetição do experimento com a amostra Bu1. ug/ml 120 1823.828 1754.799 1744.599 1723.314 1745.994 1811.232 24 7267.684 7431.17 6982.898 7768.199 26911.6 27341.41 4.8 3611.812 3269.485 4333.729 3425.291 31401.27 35005.58 0.96 3179.984 3695.089 4048.463 4360.88 34002.62 33018.74 0.192 3606.229 3082.308 3943.282 3168.434 32780.6 33096.76 0.0384 3365.61 4431.423 4972.181 3841.711 31191.5 34080.29 KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br 0.00768 3273.242 3857.433 3180.402 3847.31 33799.98 34062.86 0.001536 4442.716 3150.869 3760.187 3339.885 34284.94 35448.51 0 4141.916 3247.724 4009.271 3148.082 3049.602 3335.248 CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151 MOCK 33535.09 33003.2 31025.81 35635.67 35846.08 33422.74
  9. 9. Figura 2: Repetição do experimento anterior com o extrato BU1. O histograma mostra sobrevivência da célula MT4 infectada com vírus HIV-1 pNL43 com um MOI de 0,01 e simultaneamente a citotoxidade com diferentes concentrações da amostra BU1. Podemos verificar uma proteção parcial das células com a amostra BU1 ( 30%) na concentração de 24ug/ml. Repare que a citotoxidade do BU1 ainda é muito alta e encobre o efeito antiviral. KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151
  10. 10. 5. Conclusões Como visto no primeiro experimento, a amostra com atividade antiviral mais marcante foi a BU1. O segundo experimento, validou e pode-se observar a sobrevivência da célula MT4 com diferentes concentrações das amostras BU1, TN1 e AQ1. Verifica-se uma proteção parcial das células com a amostra BU1 (30%) na concentração de 20ug/ml. Contudo, a amostra não protegeu a totalidade das células porque ainda há muitos compostos tóxicos na mesma. Há necessidade de purificação a partir da planta in natura para realização e repetição dos testes. ____________________________ Luiz Francisco Pianowski Presidente KYOLAB Laboratório Ltda www.kyolab.com.br CNPJ: 05.758.608/0001-01 Laboratório: Rua Lauro Vannucci, nº 1020 – Jd. Sta. Cândida Campinas – SP CEP: 13087-548 Fone: 55 (19) 4062-8090 / (11) 4063-8090 Ramal: 1100 Administrativo: Av. José da Rocha Bonfim, nº 214 – Edifício Londres - Cond. Praça Capital Campinas- SP CEP: 13080-650 Fone/FAX: 55 (19) 37091151

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