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Apresentação de Rubem

Apresentação referente à Projeto de Pesquisa IFMA-Fapema

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POTENCIALANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE
CULTURA DE FUNGOS PROVENIENTES DE SEDIMENTO DE MANGUE
Orientadora: Cristina de Andrade Monteiro, Professora Doutora do
IFMA Campus Monte Castelo.
Bolsista: Rubem Crisney Salgado da Silva: Licenciando do Curso de
Biologia pelo IFMA Campus Monte Castelo.
1
INTRODUÇÃO
 Os manguezais apresentam condições ambientais hostis de sobrevivência tais
como temperatura, alta salinidade, baixa oxigenação, influência de maré
(Alappatt, 2018).
 Os fungos se destacam nestes ambientes produzindo metabólitos secundários
exclusivos e diversificados que podem apresentar propriedades eficazes no
tratamento de diversas doenças ou condições de morbidade (Rodrigues et al.,
2020; Mohammed et al., 2021).
2
INTRODUÇÃO
 A Organização Mundial de Saúde declara que a resistência às drogas
está entre os dez principais problemas de saúde pública (OMS, 2010).
 Resistência aos antimicrobianos compromete as opções terapêuticas dos
tratamento das doenças fúngicas e bacterianas (Mack; Bielicki, 2019)
 Nesse sentido, destacamos que o Maranhão é detentor de um dos maiores
ecossistemas de manguezais do país. Mesmo apresentando significante
relevância, não há estudos dos manguezais que explorem a análise
biotecnológica dos metabólitos fúngicos.
3
FONTE: Autor (2022)
Figura 1. Área de manguezal poluída
4
5
Figura 2. Área de manguezal com muito lixo
Figura 3. Área de manguezal afetada diretamente
por atividade humana
FONTE: Autor (2022)
OBJETIVOS
Geral
 Explorar a diversidade fúngica de manguezais em São Luís-MA caracterizando-os com relação às
atividades biológicas de seus extratos.
Específicos
 Produzir extratos a partir de culturas líquidas de fungos promissores;
 Verificar a atividade antimicrobiana dos extratos fúngicos, determinando as concentrações inibitórias
mínimas e as ações bactericidas e fungicidas;
 Determinar a atividade antioxidante dos extratos;
 Explorar os constituintes metabólitos dos extratos promissores por meio de ensaios cromatográficos
(CCDC, CLAE).
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Apresentação de Rubem

  • 1. POTENCIALANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DE EXTRATOS DE CULTURA DE FUNGOS PROVENIENTES DE SEDIMENTO DE MANGUE Orientadora: Cristina de Andrade Monteiro, Professora Doutora do IFMA Campus Monte Castelo. Bolsista: Rubem Crisney Salgado da Silva: Licenciando do Curso de Biologia pelo IFMA Campus Monte Castelo. 1
  • 2. INTRODUÇÃO  Os manguezais apresentam condições ambientais hostis de sobrevivência tais como temperatura, alta salinidade, baixa oxigenação, influência de maré (Alappatt, 2018).  Os fungos se destacam nestes ambientes produzindo metabólitos secundários exclusivos e diversificados que podem apresentar propriedades eficazes no tratamento de diversas doenças ou condições de morbidade (Rodrigues et al., 2020; Mohammed et al., 2021). 2
  • 3. INTRODUÇÃO  A Organização Mundial de Saúde declara que a resistência às drogas está entre os dez principais problemas de saúde pública (OMS, 2010).  Resistência aos antimicrobianos compromete as opções terapêuticas dos tratamento das doenças fúngicas e bacterianas (Mack; Bielicki, 2019)  Nesse sentido, destacamos que o Maranhão é detentor de um dos maiores ecossistemas de manguezais do país. Mesmo apresentando significante relevância, não há estudos dos manguezais que explorem a análise biotecnológica dos metabólitos fúngicos. 3
  • 4. FONTE: Autor (2022) Figura 1. Área de manguezal poluída 4
  • 5. 5 Figura 2. Área de manguezal com muito lixo Figura 3. Área de manguezal afetada diretamente por atividade humana FONTE: Autor (2022)
  • 6. OBJETIVOS Geral  Explorar a diversidade fúngica de manguezais em São Luís-MA caracterizando-os com relação às atividades biológicas de seus extratos. Específicos  Produzir extratos a partir de culturas líquidas de fungos promissores;  Verificar a atividade antimicrobiana dos extratos fúngicos, determinando as concentrações inibitórias mínimas e as ações bactericidas e fungicidas;  Determinar a atividade antioxidante dos extratos;  Explorar os constituintes metabólitos dos extratos promissores por meio de ensaios cromatográficos (CCDC, CLAE). 6
  • 7. METODOLOGIA BACTÉRIA ATCC Staphylococcus aureus 25923 Enterococcus faecalis 29212 Klebsiella pneumonia Escherichia coli 25922 Pseudomonas aeruginosa 27853 LEVEDURA C. albicans 90028 C. krusei 6258 C. parapsilosis 22019  As linhagens teste que estão sendo usadas são as de referência: Tabela 1. Patógenos utilizados em testes.  Todas da Coleção de Culturas do Laboratório de Biologia do Instituto Federal do Maranhão. 7
  • 8.  Os fungos dos manguezais foram isolados em Ágar Batata Dextrose (BDA) a partir de amostras de sedimentos (total 10, 5 por período seco/chuvoso).  Coletados do manguezal do bairro Ipase (2º32’10”S e 44º15’40”W) e o manguezal do bairro Bacanga (2º32’48”S e 44º18’12”W). METODOLOGIA Figura 4. Localização do ponto de coleta bairro Ipase Figura 5. Localização do ponto de coleta bairro Bacanga FONTE: Autor (2022) FONTE: Autor (2022) 8
  • 9. FONTE: Autor (2022) Figura 6. Pesquisadores demarcando localização dos pontos de coleta. 9
  • 10. FONTE: Autor (2022) Figura 7. Pesquisador em coleta de solo de mangue. 10
  • 11. 11 Figura 8. Pesquisadores em coleta de solo de mangue. FONTE: Autor (2022)
  • 12. Figura 9. Diversidade e identificação de fungos do sedimento de manguezal por microcultivo. Fonte: Autor (2023) 12
  • 13. • Preparação dos sobrenadantes de cultura e dos extratos fúngicos  (De acordo com Hamzah et al, 2018, com adaptações desta pesquisa). Fungos foram inoculados em meio caldo batata (MCB) e crescidos sob agitação por 2, 4 e 7 dias. Sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação (10 000 rpm, 10 min) e testados por Microdiluição para verificar o potencial antimicrobiano e determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM). METODOLOGIA Figura 10. Preparação de sobrenadantes Fonte: Autor (2023) 13
  • 14. METODOLOGIA  Preparação dos extratos fúngicos para os testes de ágar difusão e microdiluição (CLSI, 2019) Figura 11. Sobrenadantes sob liofilização Figura 12. Extratos prontos para teste. 14 Fonte: Autor (2023)
  • 15. 15 Figura 13. Aluna e alunos pesquisadores em bancada Fonte: Autor (2023) METODOLOGIA
  • 16. 16  O gênero Candida constitui o principal grupo de leveduras que causam infecções oportunistas em seres humanos e, uma vez que a exposição aos fármacos têm diminuído a sensibilidade das cepas, há falha na terapia antifúngica. RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 14. Infecções por Candida Fonte: Internet
  • 17. RESULTADOS E DISCUSSÃO 17  Nossos resultados ratificam que os fungos se destacam pela elevada capacidade de produzir metabólitos secundários (Chen; Hu, 2021; Poleto et. al., 2021). P 107 Figura 15. Extrato do P107 com halo de inibição de raio de 16 mm contra C. albicans. P601 P115 Figura 16. Extratos de leveduras de mangue P115 e P601 apresentando halo de inibição contra C. albicans de raio de 6mm e 15mm, respectivamente. Fonte: Autor (2023)
  • 18. 18 Figura 17. Extrato do P107 com halo de inibição de raio de 8 mm contra C. krusei. Figura 18. Extrato do P203 com halo de inibição de raio de 16 mm contra C. albicans. P 107 Fonte: Autor (2023) RESULTADOS E DISCUSSÃO
  • 19. 19 Cabeça aspergilar Conidióforo Figura 19. Fotomicrografia do fungo P 107 (400x). P 107 Fonte: Autor (2023)
  • 20. 20 RESULTADOS E DISCUSSÃO As bactérias parecem estar adaptadas às Unidades de Terapia Intensiva (UTIs) dos hospitais, ambiente que deveria ser praticamente livre de agentes infecciosos por causa da gravidade da saúde de seus pacientes. Conclusão de um levantamento feito por pesquisadores do Hospital das Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP-USP). (Pesquisa FAPESP) Figura 20. Foliculite por Pseudomonas aeruginosa Figura 21. Ectima causada por S. aureus Fonte: Grupo de Patologia Infecciosa AEpap
  • 21. 21 Neste sentido, os resultados desta pesquisa apontam para uma alternativa biotecnológica a partir da atividade antimicrobiana dos extratos de fungo de mangue tanto contra patógenos do gênero Candida quanto para bactérias. RESULTADOS E DISCUSSÃO P404 P601 P107 P905 P805 Figura 23. Extratos dos fungos P404, P601 e P107 com halos de 3mm, 3mm e 6mm, respectivamente. Figura 22. Ação inibitória dos extratos dos fungos P905 e P805 com halos de 7mm e 6mm, respectivamente. Fonte: Autor (2023)
  • 22. 22 P203 P601 P404 P203 P601 P404 S. aureus E. Coli CIP +S.a +E.coli C- CIP P203 P601 P404 Figura 24. Teste de microdiluição dos extratos P203, P 601 e P 404 contra Escherichia coli e Staphylococus aureus. A ciprofloxacina (CIP) é o antibiótico padrão. Os resultados anteriores foram confirmados em microdiluição. Foi possível verificar que o extrato da linhagem P203 apresentou CIM de 250 ug/mL inibindo o crescimento da bactéria RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 25
  • 23. 23 RESULTADOS E DISCUSSÃO No teste abaixo, obtivemos a confirmação da ação antimicrobiana a partir do sobrenadante liofilizado do fungo P805, que apresenta uma CIM de 12,5 ug/mL para Escherichia coli e 100 ug/mL para Staphylococus aureus Figura 26 Figura 27
  • 24.  Manguezais dos bairros Ipase e Bacanga apresentam alta diversidade fúngica: Aproximadamente: 55 fungos tipo levedura e 82 tipo filamentoso, total das duas coletas(.  Fungos avaliados produziram extratos dotados de atividade antimicrobiana contra leveduras e bactérias de interesse clínico  As CIMs dos extratos contra os isolados testados foram extremamente baixas com valores entre 12,5 - 250 ug/mL  Extratos provavelmente contem metabólitos que precisams ser isolados  Metábolitos poderão ser utilizadas como alternativa à produção de formulações naturais e sustentáveis que sejam efetivas contra os micro-organismos resistentes  Estapas futuras: análises química para o isolamento e identificação dos metabólitos presentes nos potenciais extratos bem como a identificação molecular das linhagens envolvidas. 24 CONCLUSÃO
  • 25. • ALAPPATT JP. Structure and species diversity of mangrove ecosystem. In: Sivaperuman C, Velmurugan A, Singh A, Jaisankar I, editors. Biodiversity and climate change adaptation in tropical islands. London: Elsevier; 2018. p. 127–144 • CLSI. CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standardM27-A3, 3rd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2008. CLSI. Perfomance standards for antimicrobial susceptibility testing (Supplement M100), 29th ed., Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 2019. • CHENG, Z., PAN, J., TANG, W., CHEN, Q., AND LIN, Y. Biodiversity and biotechnological potential of mangrove-associated fungi. J. For. Res. 20, 63–71. 2009. doi: 10.1007/s11676-009-0012-4 • Fioravanti, C. (n.d.). Bactérias em UTI. Fapesp.br. Retrieved October 6, 2023, from https://revistapesquisa.fapesp.br/bacterias-em-uti/ • HAMZAH T, LEE S, HIDAYAT A, TERHEM R, FARIDAH-HANUM I, MOHAMED R. Diversity and Characterization of Endophytic Fungi Isolated From the Tropical Mangrove Species, Rhizophora mucronata, and Identifification of Potential Antagonists Against the Soil-Borne Fungus, Fusarium solani. Front. Microbiol. 9:1707. 2018. doi: 10.3389/fmicb.2018.01707 25 BIBLIOGRAFIA