bovine Tuberculosis

1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

2. • Enfermidade infecto-contagiosa de evolução crônica;
• Caracterizada por lesões de aspecto nodular  Tubérculos;
• Localizados em qualquer órgão
Linfonodos cabeça e tórax; pulmões, fígado, pleura e peritôneo.
Acomete bovinos e bubalinos, podendo afetar o homem.
(ALMEIDA et al., 2004; BRASIL, 2006; HEINEMANN et al., 2008)
Tuberculose Bovina

3. Tuberculose Bovina
• Principal causa de mortes no final século XIX
e início século XX (revolução industrial)
Carmichael (1810)
• Ensaio sobre natureza da escrófula
• Leite de vaca era frequentemente responsável
pela doença

4. Tuberculose Bovina
Klencke (1846)
História clínica de 16 crianças alimentadas
com leite de vacas tuberculosas
Tuberculose intestinal, ganglionar, cutânea e óssea
Escrófula humana e doença encontrada nos animais eram idênticas

5. • Identificação do bacilo 1882 – Robert Koch (1843-1902)
Medidas de combate à doença
Implantação de programas de controle e erradicação
(FELDMAN, 1955)
Mycobacterium sp.

6. Epidemiologia
Mycobacterium tuberculosis
• 1/3 da população mundial está infectada;
• Países em desenvolvimento: 5 – 10% Tb extrapulmonar
• 2 milhões de óbitos a cada ano;
• 22 países representam 80% dos doentes;
• Brasil: 53,4 casos/ 100.000 hab.

7. Distribuição geográfica da Tuberculose:
Relação com os índices sócio-econômicos das diversas nações
• Taxa de incidência:
 Baixas nos países desenvolvidos
 Altas nos países cuja população está sujeita à desnutrição e
más condições de habitação
 Nigéria
(ABRAHÃO, 1998)
45% casos de TB humana por M. bovis  Ingestão de carne
(FELDMAN, 1955)
Epidemiologia

8. Década 60-70
Epidemiologia
Tuberculose homem controlada em países desenvolvidos e em desenvolvimento.
 Crescimento desordenado dos centros urbanos
 Condições sanitária precárias
 Síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS)
 Presença de reservatórios silvestres
 Declínio do investimento em programas de controle
Aumento do número de casos de tuberculose ativa
(PARREIRAS, 2003; SALAZAR, 2005, JORGE, 2011)

9. Distribuição
- Distribuição cosmopolita e maior prevalência em países em
desenvolvimento,
(KANTOR & RITACCO, 1994)
- Países oficialmente livres: Áustria, Bélgica, Dinamarca, França,
Finlândia, Alemanha, Luxemburgo, Suécia, Noruega e os Países Baixos
(DE LA RUA-DOMENECH, 2006; MATHEWS et al., 2006a)
Epidemiologia

10. - Espanha, Grécia, Inglaterra, Itália, Irlanda, Portugal, Nova Zelândia e EUA
não conseguem erradicar a tuberculose
*Transmissão silvestre
- Presente em todos os continentes
• 51% (26/51) na África
• 48,8% (21/43) nas Américas (América do Norte e do Sul e Ilhas do Caribe)
• 44,4% (20/45) na Ásia
• 68,8% (35/51) na Europa
• 5,3% (1/19)Oceania
(DE LA RUA-DOMENECH, 2006; MATHEWS et al., 2006a; WHITE et al., 2008)
Epidemiologia

11. A tuberculose é a doença infecciosa reemergente que mais mata no mundo.
Distribuição cosmopolita  maior prevalência em países em desenvolvimento
2011
Registrados 1,4 milhões de óbitos
8,7 milhões de pessoas adoeceram.
Principais determinantes são o Mycobacterium tuberculosis eM. bovis
(ABALOS & RETAMAL, 2004)
Epidemiologia

12. Ocorrência no Mundo
• 1981 - Síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS)
• Aumento do número de casos de tuberculose ativa
Organização Mundial de Saúde
• 1/3 da população mundial infectada M. tuberculosis,
• 1990-1999  88 milhões de casos novos de TB
8 Milhões  infecção pelo HIV
Epidemiologia

13. Tuberculose
Estimativa da taxa de incidência de Tuberculose por país, 2011
Fonte: OMS-WHO (2010)

14. Agropecuária
Rebanho de 209.541.109 cabeças
Nordeste é detentor de 28.762.119 (13,73% do efetivo)
Bahia  10.528.419 cabeças (36,6% NE)
(IBGE, 2010)
Epidemiologia

15. • Aumento da densidade populacional de bovinos por propriedade,
• Introdução de animais ou material genético infectado,
• Contaminação ambiental,
• Manejo sanitário,
• Tipo de exploração.
(IBGE, 2010)
Epidemiologia
Tuberculose bovina

16. Epidemiologia
Tunísia
102 amostras de leite de vacas positivas TB
5 (4,9%) amostras  M. bovis
(KAHLA et al., 2011)
Índia
161 amostras de origem bovina
54 isolados  Complexo M. tuberculosis
(SRIVASTAVA et al., 2008)
40  M. bovis
14  M. tuberculosis

17.  America Latina
70% dos bovinos estão em áreas de elevada prevalência
(KANTOR & RITACCO, 2006)
 Brasil
Prevalência média nacional de 1,3% (1989-1998)
(BRASIL, 2006)
Epidemiologia

18. Exames de carcaças em matadouros-frigoríficos
Prevalência de tuberculose
Minas Gerais: 0,17%
Pará: 5,16%
Rio Grande do Sul: 0,64%
(ARAÚJO, 2004)
Medidas sanitárias no rebanho
Fonte:arquivo pessoal
Epidemiologia

19. Minas Gerais
Em 1600 propriedades e 23000 animais
Prevalência de rebanhos infectados: 5%
Prevalência de animais reagentes: 0,85%
Maior prevalência em rebanhos leiteiros com algum grau de
(BRASIL, 2006)
tecnificação da produção (15%).
Epidemiologia
• 1999

20. Epidemiologia
Paraíba
• 2008-2009
Prevalência TB: 0,48% (305/62867)
(SIMÕES, 2011)
Região do agreste:  n° de animais reagentes
Predominância de gado leiteiro e criação do tipo intensiva

21. Epidemiologia
Paraíba
• 2008-2009
Sertão Paraibano: menor prevalência de TB
Criação predominantemente extensiva
Fatores climáticos  clima seco e temperaturas elevadas
(SIMÕES, 2011)
Prevalência TB: 0,48% (305/62867)

22. Epidemiologia
Bahia
• 2008-2010
Prevalência de foco de TB: 1,6%
Prevalência de animais reagentes: 0,21%
Fatores de risco
 Exploração leiteira
 Tipo de exploração mista (leite e corte)
 Fêmeas com idade superior a 24 meses
(COSTA, 2012)
(ADAB, 2010)

23. Epidemiologia
Bahia
• 2008-2010
Foco de TB - C1
2,0% (1,0-4,2)
(COSTA, 2012)
Foco de TB – C2
2,9% (1,5-5,5)

24. Ilhéus – BA
Teste intradérmico cervical comparado – 916 bovinos
Prevalência de foco de TB: 10,6%
Prevalência de animais reagentes: 2,8%
(RIBEIRO, 2003)
Salvador– BA
Inspeção post mortem  43 carcaças lesões sugestivas de TB
7 amostras positivas para M. bovis pela PCR
(COSTA, 2008)
Epidemiologia

25. Epidemiologia
Propriedades com exploração de corte  menor prevalência,
Sistema de criação extensivo,
Bovinos abatidos precocemente.
(COSTA, 2012)
Bahia
• 2008-2010

26. Transmissão Mycobacterium bovis
compra
venda
Produtos lácteos
Carne
Pasteurização
Inspeção de carne
Biossegurança
Vigilância
Tuberculinização
Rebanho
bovino
Biossegurança
Via indireta
Manejo
Ambiente infectado
Grupo social
Texugo
Direta: bovino para texugo
Direta: Texugo para bovino
Tuberculinização
Tuberculinização
Frigoríficos
Tuberculinização
Biossegurança
Manejo
Tuberculinização
Biossegurança
Vigilância
Manejo do rebanho
Preocupação Preocupação
Não é realizada tuberculinização
Vigilância limitada

27. • Transmissão silvestre
- Pastos contaminados
- Proximidade entre fazendas e bioma preservados
(Smith et al., 2004; Mathews et al., 2006b)
• Reservatórios silvestres:  incidência e manutenção da doença
Inglaterra e Irlanda
Texugo
(Meles meles)
Nova Zelândia
Furão
(Mustela putorius)
Marsupial
(Trichosurus vulpecula)
http://www.badgers.org http://upload.wikimedia.org http://upload.wikimedia.org
Estados Unidos
Cervídeos
http://www.trabalhonota10.com.br
Epidemiologia

28. Agente Etiológico
•Complexo Mycobacterium tuberculosis
Inclui os patógenos humanos e animais
 M. tuberculosis,
 M. bovis,
 M. africanum,
 M. microti,
 M. canettii,
 M. pinnipedii

29. Resistência do Mycobacterium bovis
• Instalações: .................. 2 anos;
• Fezes: ........................... 2 anos;
• Água: ............................. 1 ano;
• Solo: ............................. 2 anos;
• Pastagens: .................... 2 anos;
• Carcaça: ..................... 10 meses.
(RUSSEL et al., 1984)

30. Mycobacterium bovis
 Maior prevalência no gado de leite e menor no de corte
 Exposição do bovino de leite aos membros infectados do rebanho
• Tempo • Densidade
85,2% dos animais com diagnóstico bacteriológico positivo TB
(LOPES FILHO, 2010)
Faixa etária: 2,5 anos até 7 anos de idade

31. Imunopatogenia
• Invasão dos alvéolos pelos bacilos
• Multiplicação do M. bovis dentro dos macrófagos
• Formação de granuloma no foco inicial
• Desenvolvimento da resposta imune e de hipersensibilidade tardia
• Propagação do bacilo para o linfonodo satélite, formando o complexo primário
Imunidade mediada por célula (CMI)

32. • Via aerógena (inalatória) → mais comum
80-90% das infecções
*UFC via intra-traqueal (6-11 bacilos)
• Via digestória → leite infectado, alimento ou água contaminada
Bezerros e humanos
(DE LA RUA-DOMENECH, 2006; DUARTE, 2010)
Transmissão

33. M. bovis
• Produtos de abscedação de
linfonodos,
• Corrimento nasal
• Leite,
• Fezes,
• Urina,
• Secreções uterovaginais,
• Sêmen.
Eliminação

34. Tuberculose zoonótica
Doença ocupacional
• Tratadores de rebanhos bovinos
• Açougueiros e magarefes
(ABRAHÃO, 1999, LOPES 2008)
• Veterinários
• Membros da comunidade rural
Fonte:arquivo pessoal
Fonte: www.dfid-ahp.org.uk

35. Amostra de leite de 27 vacas  rebanho positivo para TB
(JORGE, 2011)
Tuberculose zoonótica
12 isolados  Complexo Mycobacterium tuberculosis
4 isolados  M. bovis
leite “in natura” de vacas de rebanho com diagnóstico de tuberculose
oferece risco ao consumo humano

36. Perdas econômicas
• Perdas por morte de animais,
• Redução de 10 a 20% da produção de leite e do ganho de peso,
• Diminuição da eficiência reprodutiva,
• Descarte precoce e eliminação de animais de alto valor zootécnico,
• Condenação de carcaças ao abate,
• Perda de mercados potenciais e restrição às exportações.
(FERREIRA NETO & BERNARDI, 1997; FUVERKI, 2008; OLIVEIRA et al., 2008; PACHECO et al., 2009)

37. BRASIL
• 2001
Programa Nacional de Controle e Erradicação da
Brucelose e Tuberculose (PNCEBT)
• Teste alérgico tuberculínico
• Reduzir o impacto da TB no comércio nacional e internacional
de animais e produtos de origem animal.
(COSTA, 2012)

38. Métodos de diagnóstico da Tuberculose
• Exame clínico
• Teste alérgico tuberculínico
Exame post mortem
Histopatológicos
Bacteriológicos
Biologia molecular
(COSTA, 2008)

39. Métodos de diagnóstico da Tuberculose
Exame clínico
Teste alérgico tuberculínico
Rastreamento de focos pela rotina de
inspeção em matadouros-frigoríficos
(COSTA, 2008)
Exame post mortem
Histopatológicos
Bacteriológicos
Biologia molecular Vigilância Epidemiológica e
erradicação da doença

40.  Sinais clínicos
• Doença crônica e debilitante
Emagrecimento progressivo, apetite alterado, febre baixa e
irregular, diminuição da produção de leite, aumento de
linfonodos, tosse, expectoração mucopurulenta e diarréia.
•  gânglios linfáticos → compressão de nervos
• Glândula mamária → assimétrica e nódulos não dolorosos
Leite → floculento e aquoso
http://www.revistaveterinaria.com.br

41.  Sinais clínicos
Doença crônica e debilitante

42.  2.7 – Diagnóstico
DIRETOS:
• Detecção e identificação do agente etiológico
•Histopatologia
•Bacteriologia
• Detecção de DNA pela PCR
INDIRETOS:
• Resposta do animal ao agente etiológico
• Resposta imuno-alérgica cutânea –tuberculina
Fonte:arquivo pessoal
Fonte:arquivo pessoal Fonte: http://info.fujita-hu.ac.jp

43. Diagnóstico
Diagnóstico clínico
Pouca relevância na fase inicial da enfermidade
Tuberculose avançada 
Exame clínico
Investigação epidemiológica
Diagnóstico clínico associado à reação de tuberculinização

44. Diagnóstico
- Hipersensibilidade tardia tipo IV
(BRASIL, 2008)
- Forma indireta por meio de imunoalérgico
*PPD bovino e aviária
(NEIL et al., 1994)
- Tipos
• Teste tuberculínico caudal (TPC)
• Teste cervical simples (TCS)
• Teste cervical comparativo (TCC)
(SILVA et al., 2006)
Diagnóstico alérgico cutâneo
Fonte: Brasil. 2006. Fonte:arquivo pessoal Fonte:arquivo pessoal

45. Diagnóstico
Diagnóstico anatomopatológico
 Necropsia
 Inspeção sanitária de carcaças
 Considerável dificuldade
 Muitos processos inflamatórios granulomatosos
 Características morfológicas semelhantes a TB
(OLIVEIRA et al., 1986; SALAZAR, 2005; LOPES FILHO, 2010)

46.  Achados post mortem
Importante na vigilância epidemiológica da tuberculose
(KANTOR & RITACCO, 2006)
- Inspeção dos linfonodos
• Cabeça (mandibulares, parotídeos, retrofaringeos)
• Torácicos (mediastínicos e bronquiais)
• Carcaça (pré-escapulares, ilíacos, isquiáticos, sacral e inguinal)
• Pulmões, fígado, baço, rins, úbere e órgãos genitais
(CORNER, 1994)
Fonte:arquivo pessoal

47. Diagnóstico Anatomopatológico
Detecção de lesões presuntivas de TB   Variável
• Etiópia
(MENZIES & NEILL, 2000; SALAZAR, 2005)
Inspeção post mortem  29,4% das carcaças com lesões
• Austrália
Inspeção post mortem  95% das carcaças com lesões
Fonte:arquivo pessoal
Inspeção post mortem em matadouro  47% das lesões em carcaças
(TEKLU et al., 2004)
(CORNER et al., 1994)

48. Lesões sugestivas de tuberculose em carcaças de bovinos
(ALMEIDA, 2004)
Achados post mortem
• Mato Grosso do Sul
487.047 bovinos abatidos  63 (0,013%) condenações
Lesões macroscópicas
Regiões tórax: 49,21%
Regiões carcaça: 33,33%
Regiões cabeça: 11,11%
Regiões abdômen: 6,35%

49. Inspeção post mortem  70 – 90% das lesões presuntivas de TB
Linfonodos da cabeça
Cavidade torácica
Diagnóstico Anatomopatológico
(SALAZAR , 2005)
Fonte:arquivo pessoal
Fonte:arquivo pessoal
(PRATES, 2012)

50. Diagnóstico
Histopatologia
 Diagnóstico complementar ao exame post mortem
 Indicativos de tuberculose
• Organização do granuloma (HE)
• Presença do bacilo (Ziehl-Neelsen)
(VARELLO et al., 2008)
Fonte: Ulrichs & Kaufmann, 2006
Fonte: Ulrichs & Kaufmann, 2006

51. Histopatologia
 Indicativos de tuberculose
• Organização do granuloma (HE)
• Presença do bacilo (Ziehl-Neelsen)
(CORNER, 1994)
 Diagnóstico complementar ao Exame post mortem
(VARELLO et al., 2008)
Fonte: Ulrichs & Kaufmann, 2006
Curto período (2 dias) e baixo custo
Confirmado pelo cultivo da amostra
Fonte: Ulrichs & Kaufmann, 2006

52. Diagnóstico
Isolamento e identificação
Diagnóstico definitivo da tuberculose
Técnicas bacteriológicas Baixa sensibilidade
Métodos drásticos de descontaminação do material
Concentração de bactérias → 5000 a 10000 UFC/ mL
(CORNER, 1994; WARDS et al., 1995; ZANINI et al., 2001)

53. Isolamento e identificação
Condições de colheita X Conservação das amostras
(RICHARDS & WRIGHT, 1983; DUARTE, 2010)
Isolamento bacteriano
Congelada: - 20°C 90% das amostras positivas / 100 dias.
Solução de borato de sódio
(Na2B4O7.10H2O)
8 semanas em temp. ambiente
Refrigerada: 4 a 6°C/2 dias
Fonte:arquivo pessoal

54. Isolamento e identificação
Bacteriológico
Cultura
• Muco laríngeo e traqueal
• Fezes
• Fluxo uterino ou pus
• Material colhido por punção:
• Urina
• Leite
Amostras para a investigação do bacilo da Tb
Exsudatos
Líquidos articulares e cefaloraquidianos

55. Isolamento e identificação
Métodos de descontaminação:
1- Cloreto de 1-Hexadecilpiridino 1,5% (HPC)
2- NaOH 4% (Método Petroff )
3- Ácido sulfúrico 12%
Contaminação – 3%
Contaminação – 33%
Contaminação – 21,7%
(AMBRÓSIO et al., 2008)

56. Isolamento e identificação
Métodos de descontaminação:
1- Cloreto de 1-Hexadecilpiridino 1,5% (HPC)
2- NaOH 4% (Método Petroff )
3- Ácido sulfúrico 12%
Contaminação – 3%
Isolados BAAR – 40%
Contaminação – 33%
Isolados BAAR – 13%
Contaminação – 21,7%
Isolados BAAR – 1,7%
(AMBRÓSIO et al., 2008)

57. Isolamento e identificação
Pinto et al.(2002)
Diagnóstico bacteriológico associado a inspeção post mortem
Animais TCC positivo com
lesões sugestivas de TB
Ausência de micobactérias  35,4%
Reduzido número de micobactérias nas lesões no
momento da colheita das amostras

58. - Cultivo:
M. bovis  dificuldade em crescer em meios de cultura glicerinados
• Stonebrink-Lesslie
• Lowenstein-Jensen (piruvato)
(BUDDLE et al., 1994; MARCONDES et al., 2006; OIE, 2012)
Nutriente energético: piruvato de sódio
(HEWINSON et al., 2006; KANTOR et al., 2008)
Isolamento e identificação
Fonte:arquivo pessoal

59. Isolamento e identificação
Incubação: 36 a 37 °C / até 90 dia
(MARCONDES et al., 2006)
Tempo de crescimento Stonebrink-Leslie : 21 dias a 36 dias
(CORNER, 1994; MOTA et al., 2001)
MOTA et al. ( 1997)
Tempo de crescimento entre 30-60 dias: 75,7% das amostras
entre 60-90 dias: 18,9% das amostras
Fonte:arquivo pessoal
Mycobacterium bovis

60. Incubação: 36 a 37 °C / até 90 dias
(MARCONDES et al., 2006)
Isolamento e identificação
Tempo de crescimento Stonebrink-Leslie : 21 dias a 36 dias
(CORNER, 1994; MOTA et al., 2001)
Mota et al. ( 1997)
Tempo de crescimento entre 30-60 dias: 75,7% das amostras
entre 60-90 dias: 18,9% das amostras
Fonte:arquivo pessoal
Mycobacterium bovis

61. Isolamento e identificação
(MOTA et al. 2001; BRASIL, 2005)
Fonte:arquivo pessoal
Características de crescimento
 Superfície granular com pequena
protuberância,
 Crescimento pobre ou disgônico.
Colônias:
 Creme-amareladas,
 Pequenas,
 Arredondadas,
 Bordas irregulares,

62. Confirmação de BAAR: Coloração de Ziehl-Neelsen
(ROWE & DONAGHY, 2008)
Coloração Ziehl-Neelsen
Vantagens: fácil execução e baixo custo
Desvantagens: Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus
(PRITCHARD, 1998)
Isolamento e identificação
Fonte:arquivo pessoal

63. Isolamento e identificação
 Redução de nitrato
 Produção de niacina
 β-glicosidase
 Capacidade de hidrólise enzimática do TWEEN 80
 Urease
 Susceptibilidade ao TCH (Hidrazida do ácido Tiofeno-2-carboxílico)
 Susceptibilidade à pirazinamida
(Brasil, 2005)
Provas bioquímicas

64. Diagnóstico
Diagnóstico molecular
Reação em cadeia da polimerase - PCR
(NOORDHOEK et al., 1994)
Rapidez no diagnóstico
Auxílio a inspeção sanitária
 PCR multiplex
 Spoligotyping
 PCR-PRA
 MIRU-VNTR
 PCR real-time

65. Diagnóstico molecular
PCR multiplex

66. Revisão de Literatura
Diagnóstico molecular
PCR multiplex
RD12 absent (306 bp)
RD4 absent (268 bp)
RD1 present (146 bp)
RD9 absent (108 bp)
RD12 present
(369 bp)
RD9 present
(235 bp)
RD4 present
(172 bp)
Técnica promissora para a vigilância de TB em matadouros-frigoríficos
(FURLANETTO et al., 2012)

67. Diagnóstico molecular
Spoligotyping
Detecção e tipificação das micobactérias do complexo M. tuberculosis
Comparação de estirpes com poucas cópias de IS6110
Polimorfismo do DNA na região do locus de repetição direta (DR) do
complexo M. tuberculosis
Investigação epidemiológica da Tuberculose
(SMITH et al., 2004; SANTOS et al., 2007)

68. Diagnóstico molecular
Spoligotyping

69. Diagnóstico molecular
Spoligotyping
(KAMERBEEK et al., 1997)

70. Diagnóstico molecular
Spoligotyping
Reyes et al. (2012)
Estudaram a epidemiologia do M. bovis em bovinos no México
878 isolados de M. bovis
67% dos isolados de rebanhos leiteiros
Espoligotipos SB673 (15%) e SB669 (12%)
Rebanhos de corte  14 isolados
Transmissão da TB do gado de leite para o de corte

71. Controle
Minimizar o impacto da doença na pecuária e na população humana
 Tuberculinização periódica,
 Sacrifício dos bovinos reagentes ,
 Confirmação do diagnóstico  exames histopatológicos
bacteriológicos,
 Controle do trânsito de animais,
(FERREIRA NETO & BERNARDI, 1997, COLLINS, 2006)

72. Controle
(FERREIRA NETO & BERNARDI, 1997, COLLINS, 2006)
 Quarentena,
 Notificação,
 Controle de reservatórios,
 Criação de divisões entre regiões e propriedades.
Propriedades certificadas como livres de tuberculose e que
ofereçam ao consumidor produtos de baixo risco sanitário.

73. Tuberculose bovina em carcaças de animais abatidos no
Estado da Bahia por métodos microbiológicos e moleculares.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
Pesquisa Veterinária Brasileira
2013

74. Monitoramento dos
Matadouros-frigoríficos
Inspeções post mortem de bovinos
Dez matadouros-frigoríficos com serviço de inspeção
oficial no Estado da Bahia

75. Amostras:
Solução saturada de borato de sódio

76. 180 AMOSTRAS
Análise bacteriológica

77. Análise bacteriológica
180 AMOSTRAS
Processamento
Armazenamento (- 20°C)
Maceração
Descontaminação
cloreto de 1-Hexadecilpiridinio a 1,5%

78. Análise bacteriológica
180 AMOSTRAS
Processamento
Maceração
Descontaminação
cloreto de 1-Hexadecilpiridinio a 1,5%
Inoculação
ST LJ

79. Análise bacteriológica
180 AMOSTRAS
Processamento
Inoculação
ST LJ
Incubação

80. Análise bacteriológica
180 AMOSTRAS
Processamento
Inoculação
ST LJ
Incubação
Ziehl-Neelsen
BAAR

81. Biologia Molecular
Inativação da bactéria
Suspensão bacteriana - 200μL de tampão TE
(10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8.0)
Inativação e extração DNA
PCR multiplex
Spoligotyping

82. Biologia Molecular
PCR multiplex
Primers
Regiões genômicas de diferença do complexo
M. tuberculosis - RD1, RD4, RD9 e RD12
(WARREN et al., 2006)

83. Biologia Molecular
Spoligotyping
Primers
DRa : 5’-GGTTTTGGGTCTGAC GAC-3’, biotinilado em 5’
DRb : 5’-CCGAGAGGGGACGGA AAC-3’
(KAMERBEEK et al.,1997)
Material e métodos
Controle positivo
DNA M. tuberculosis H37Rv
DNA M. bovis BCG
Controle negativo
H2O ultra-pura

84. Biologia Molecular
Material e métodos
Spoligotyping
Ciclos
96 ⁰C – 3 minuto
96 ⁰C – 1 minuto
55 ⁰C – 1 minuto
72 ⁰C – 30 segundos
Ciclo de extensão final 72 ⁰C – 5 min.
(KAMERBEEK et al.,1997)
20 X
Produtos da PCR
Hibridados em membrana
Revelação
Filme radiográfico

85. Resultados e Discussão
 180 carcaças
Exame post mortem
71% bovinos machos  ≤ 32 meses de idade
Perrez et al. (2002)
lesões sugestivas de TB ou outras linfadenites
Diferença na detecção de lesão sugestiva ou não de Tuberculose
 Experiência do Inspetor
 Tempo disponível para examinar a carcaça

86. Resultados e Discussão
 180 carcaças  Exame post mortem
 Linfonodos da cabeça e pescoço
 Pulmões
 Linfonodos torácicos
 Fígado
 Peritôneo
 Localização das lesões

87. Resultados e Discussão
Gathogo et al. (2012)
 Localização das lesões  929 carcaças
 Gânglios linfáticos brônquicos e mediastinais
 Pulmões
 Linfonodos em outras regiões
Biffa et al. (2012)
 Localização das lesões  327 carcaças
 Linfonodos respiratórios e pulmões  50,9%
 Linfonodos mesentéricos e intestinais  16,5%

88. Resultados e Discussão
 Crescimento disgônico
 Coloração creme- amareladas
 Pequenas
 Bordas irregulares
Bacteriologia
180 amostras 25 (14%) das amostras

89. Resultados e Discussão
Bacteriologia
180 amostras
25 (14%) das amostras
Tempo crescimento: 34 dias (22-63d)
Crescimento das primeiras colônias
 21 dias (COUSINS et al., 1989)
 28 dias (MOTA et al., 2001)
 36dias (CORNER, 1994)

90. Resultados e Discussão
PCR multiplex
25 isolados 14 (56%) isolados com perfil de amplificação
Perfil de amplificação de Mycobacterium bovis por m-PCR a partir de isolados de cultivo bacteriano.

91. Resultados e Discussão
PCR multiplex
25 isolados 11 (44%) isolados sem perfil de amplificação
Duarte, 2010
Característica fenotípicas e bioquímicas
Micobacterias Não causadoras de Tuberculose (MNT)
 64% (7/11) de complexo M. terrae
 27% (3/11) de M. fortuitum
 9% (1/11) de M. kansasii

92. Resultados e Discussão
PCR multiplex
Furlanetto et al. (2012)
Diagnóstico da TB em linfadenites observadas durante o abate de bovinos
 Mycobacterium bovis 7% (14/ 198) das amostras
Detecção de focos remanescentes de tuberculose

93. Resultados e Discussão
Minas Gerais
Prevalência de tuberculose (1993-1997)
 Mycobacterium bovis 0,07% em 954.640 bovinos abatidos
Região sudoeste de MG 0,17% amostras TB positiva
(BAPTISTA et al., 2004)
Região com gado leiteiro

94. Resultados e Discussão
Bahia
 14 Isolados de M. bovis em bovinos abatidos em matadouros-frigoríficos
 Caráter crônico da enfermidade
 Sistema de criação extensiva
Rodriguez (2005).
Menor prevalência de TB na rede SIF
Predominância de abate de bovino de corte
Prevalência de animais reatores à tuberculina na Bahia  0,21% (0,07-0,6%)
(COSTA, 2012)

95. Resultados e Discussão Spoligotyping
Tabela 1 - Perfil genotípico dos espoligotipos obtidos e designação internacional. Bahia, 2012.
Padrão do
espoligotipoa
Perfil do espoligotipob
Isolados
(%)
Município de
procedência
SB0121                             5 (36) Euclides da Cunha - BA
Ipirá - BA
Pojuca - BA
Serrinha - BA
SB295                           2 (14) Alagoinhas - BA
Glória - BA
SB1055                            2 (14) Pedrão - BA
Ribeira do Pombal - BA
SB1145                      1 (7,2) Alagoinhas - BA
SB0140                          1 (7,2) Santo Antônio de Jesus - BA
SB1648                            1 (7,2) Baianópolis - BA
SB0828                             1 (7,2) Baianópolis - BA
EG-BA12*                           1 (7,2) Itabaianinha - SE
a: Nome internacional atribuído pelo Mbovis.org; b: Caixas pretas e brancas indicam a presença e ausência, respectivamente, do espaçador
específico na posição 1-43, no locus de repetição direta; * - Novo espoligotipo encontrado e que foi nomeado pelos autores.

96. Resultados e Discussão
designação internacional. Bahia, 2012.
 Spoligotyping  conhecer a diversidade genotípica do M. bovis
Isolados
Espoligotipo SB 121
 5(36%) isolados
 Mais frequente Brasil – 29,1%
México – 11%
(PARREIRAS et al. 2012, ZUMÁRRAGA et al. 2012)
(%)
Município de
procedência
     5 (36) Euclides da Cunha - BA
Ipirá - BA
Pojuca - BA
Serrinha - BA
   2 (14) Alagoinhas - BA
Glória - BA
   2 (14) Pedrão - BA
Ribeira do Pombal - BA
     1 (7,2) Alagoinhas - BA
     1 (7,2) Santo Antônio de Jesus - BA

97. Resultados e Discussão
Espoligotipo SB 121
 Portugal – 26,29%
 Espanha – 29,6%
 França
 Itália
 Bélgica
 África do Sul
(MICHEL et al., 2008, BONIOTTI et al., 2009)
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/
(DUARTE et al., 2008, RODRIGUEZ et al., 2010)

98. Isolados
(%)
Resultados e Discussão
      5 (36) Ipirá - BA
Serrinha - BA
Pojuca - BA
Euclides da Cunha - BA
Espoligotipo SB 295
Município de
procedência
    2 (14) Alagoinha - BA
Ribeira do Pomba - BA
      1 (7,2) Alagoinhas - BA
      1 (7,2) Santo Antônio de Jesus - BA
    1 (7,2) Baianópolis - BA
    1 (7,2) Baianópolis - BA
      1 (7,2) Itabaianinha - SE
(ZUMÁRRAGA et al. 2012)
 2(14%) isolados
Glória - BA
    2 (14) Pedrão - BA
 Frequencia Brasil – 24%
Argentina – 0,4%
Lesões sugestivas de TB em bovinos abatidos em SP
25,6% (11/43) isolados de M. bovis
indicam a presença e ausência, respectivamente, do espaçador
espoligotipo encontrado e que foi nomeado pelos autores.
(RODRIGUEZ et al. (2010)
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/

99. (%)
 5 (36) Ipirá - BA
Resultados e Discussão
Serrinha - BA
Pojuca - BA
Euclides da Cunha - BA
Espoligotipo SB 1055
procedência
 2 (14) Alagoinha - BA
Glória - BA
 2 (14) Pedrão - BA
Ribeira do Pombal - BA
 1 (7,2) Alagoinhas - BA
 1 (7,2) Santo Antônio de Jesus - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Itabaianinha - SE
 Brasil Minas Gerais  3,3% (PAREIRA et al. 2012)
Bahia  71,4% (COSTA et al. 2010)
Argentina, Paraguai, Uruguai, México e Costa Rica
(COSTA et al., 2010; PARREIRAS et al., 2012)
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/
 2(14%) isolados
presença e ausência, respectivamente, do espaçador
encontrado e que foi nomeado pelos autores.

100.      5 (36) Ipirá - BA
Resultados e Discussão
   2 (14) Alagoinha - BA
Espoligotipo SB 1145
   2 (14) Pedrão - BA
 1 (7,2%) isolados
Serrinha - BA
Pojuca - BA
Euclides da Cunha - BA
Ribeira do Pomba - BA
     1 (7,2) Alagoinhas - BA
     1 (7,2) Santo Antônio de Jesus - BA
    1 (7,2) Baianópolis - BA
    1 (7,2) Baianópolis - BA
     1 (7,2) Itabaianinha - SE
(PARREIRAS et al., 2012)
Glória - BA
 Brasil São Paulo  0,1% (1/248)
Minas Gerais  3,3% (2/61)
(RODRIGUEZ, 2005)
indicam a presença e ausência, respectivamente, do espaçador
encontrado e que foi nomeado pelos autores.
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/

101. Euclides da Cunha - BA
 2 (14) Alagoinha - BA
Resultados e Discussão
Glória - BA
 2 (14) Pedrão - BA
Espoligotipo SB 0140
(www.mbovis.org)
(PARREIRAS et al., 2012)
 1 (7,2) Alagoinhas - BA
 1 (7,2%)  1 isolados
(7,2) Santo Antônio de Jesus - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Itabaianinha - SE
Ribeira do Pomba - BA
 Brasil São Paulo  16% (7/43)
Minas Gerais  3,3% (2/61)
(RODRIGUEZ, 2005)
Argentina, Paraguai, Uruguai e México
presença e ausência, respectivamente, do espaçador
encontrado e que foi nomeado pelos autores.
(REYES et al., 2012; ZUMÁRRAGA et al. 2012)
Austrália, Bélgica, França, Holanda, Irlanda, Reino Unido e África do Sul
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/

102. Glória - BA
Isolados
Município de
procedência
 2 (14) Pedrão - BA
Resultados (%)
e Discussão
 5 (36) Ipirá - BA
 1 (7,2) Alagoinhas - BA
Espoligotipo  1 (7,2) SB 0828
Santo Antônio de Jesus - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1  (7,2%) 1 isolados
(7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Itabaianinha - SE
Ribeira do Pomba - BA
Serrinha - BA
Pojuca - BA
Euclides da Cunha - BA
 2 (14) Alagoinha - BA
Glória - BA
França , Espanha e Itália
presença e ausência,  2 (14) respectivamente, Pedrão - BA
do espaçador
encontrado e que foi nomeado pelos autores.
 1 (7,2) Alagoinhas - BA
Espoligotipo  1 (SB 7,2) 1648
Santo Antônio de Jesus - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
 1  (7,2%) 1 isolados
(7,2) Baianópolis - BA
 1 (7,2) Itabaianinha - SE
Ribeira do Pomba - BA
Dinamarca
presença e ausência, respectivamente, do espaçador
encontrado e que foi nomeado pelos autores.
(www.mbovis.org)
(www.mbovis.org)
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/
http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT_ONLINE/

103. Ribeira do Pomba - BA
 1 (7,2) Alagoinhas - BA
 Resultados 1 (7,2) e Discussão
Santo Antônio de Jesus - BA
Espoligotipo  1 (7,2) EG-BA12
Baianópolis - BA
 1 (7,2) Baianópolis - BA
  1 (7,2%) 1 (7,2) isolados
Itabaianinha - SE
presença e ausência, respectivamente, do espaçador
Bahia
que foi nomeado pelos autores.
 São Paulo,
 Minas Gerais,
 Argentina,
 México,
 Espanha ,
 Portugal,
 Espanha.
SB295, SB121, SB1055, SB1145 e SB140
 França
 Espanha
 Itália
 Dinamarca
SB1648, SB828

104. Conclusão
 Associação entre a inspeção post mortem de rotina em matadouros-frigoríficos
e a PCR multiplex foi eficiente na identificação do M. bovis,
 Técnica do spoligotyping permitiu identificar o polimorfismo entre
os isolados de M. bovis de bovinos abatidos no Estado da Bahia,

105. Conclusão
 Dados para estudo epidemiológico da TB e desenvolvimento de
estratégias para o seu controle,
 Possibilidade na detecção de novos focos de tuberculose no Estado da
Bahia.
 Permite a adoção de medidas sanitárias em curto período de tempo.

106. Projetos de pesquisas ClínicaMédica de Ruminantes:
 Prevalência e classificação das afecções podais em vacas lactantes na
bacia leiteira de Ilhéus/ Itabuna, Bahia.
 Uso de métodos bacteriológicos e moleculares no isolamento de
Mycobacterium bovis em bovinos abatidos em matadouros e em
produtos de origem animal vendidos em feiras livres do litoral sul.