Aula pós EFEE-USP maio/2010

1. Forças mecânicas nos sistemas cardiovascular e circulatório Vinícius Bassaneze vinicius.bassaneze@incor.usp.br Link para download dessa aula http://tiny.cc/cszx8 Instituto do Coração (InCor) - HC/FMUSP Universidade de São Paulo

2. Tópicos de hoje 1- Forças mecânicas em sistemas biológicos: exemplos e aplicações; 2- Forças hemodinâmicas: Cisalhamento/Estiramento; 3- Aparelhos para aplicação de forças mecânicas em modelos in vitro; 4- Aplicação de shear stress em células tronco mesenquimais de gordura

3. Atrito VETORESFORÇA Pressão Estiramento Força: qualquer influência que faça um corpo livre alterar seu estado de movimento

4. DETECTAR e/ou USAR forças mecânicas confere vantagem adaptativa Vibriocholerae Lactobacillussp Amoeba proteus Mimosa pudica

5. Detecção de forças mecânicas em sistemas biológicos TATO! Pressão Textura Movimento e propriocepção Corpúsculos de Pacini Pacini

6. Definição de STRESS mecânico Stress é, por convenção, definido como uma força que age em uma determinada área Equivale à pressão Apresenta diversos nomes de unidades de representação http://www.geology.sdsu.edu/visualstructure/vss/htm_hlp/stres_d.htm Dina é a força necessária para impor a aceleração de um 1cm/s2 a um corpo de 1g de massa (g×cm/s2 )

7. Resumidamente – em corpos sólidos Componentes “Shear Stress“(paralelo) “Normal Stress” (perpendicular) Compressional esmagamento Tensional Estiramento (“stretch”) http://earthquake.usgs.gov/image_glossary/stress.html

8. Mecanosensores em sistemas biológicos complexos? Because, according to Newton’s laws, physical force drives all movements, feedback mechanisms in which forces guide cell behavior would be an attractive mechanism to enhance the robustness of these processes.

9. Estrutura - vasos sanguíneos http://www.coryi.org/cardiology/index.htm Sentido do fluxo

10. Forças hemodinâmicas Shear stress Força de atrito devido à passagem do sangue pela superfície interna do vaso Células endoteliais respondem ao shear strees Alterações morfológicas e funcionais em regiões específicas do vaso Região de alto shear Davies PF, Polacek DC & cols. Arch Pathol Lab Med. 1992 Região de baixo shear

11. “Shear Stress” Força de cisalhamento O gradiente de velocidade próximo à parede do vaso determina o seu “shear stress” (w) Essa força tende a dispor o endotélio e as camadas internas das artérias na direção do fluxo sangüíneo Davies PF, Polacek DC & cols. Arch Pathol Lab Med. 1992. Lei de Poiseuille Onde w é o shear stress (dinas/cm2) µ é a viscosidade em uma determinada temperatura Q é o volume do fluxo r é o raio (cm) Sendo: µ é a viscosidade em uma determinada temperatura 0é a viscosidade a 0ºC T é a temperatura determinada A e B são constantes do específicas (depende do material)

12. Efeitos na células endoteliais – sinalização celular Estiramento Shear Stress J Vasc Surg. 2000 Oct;32(4):789-94. Endothelial cell response to different mechanical forces. Azuma N, Duzgun SA, Ikeda M, Kito H, Akasaka N, Sasajima T, Sumpio BE.

13. Efeitos na células endoteliais - morfologia Malek, A.M. & Izumo, S. (1996)

18. Modelo in vitro de shear stress Sistema “cone plate” Shear stress variável (fisiológico: 0-30 dynas/cm2) em fluxo laminar Variação dos tempos de exposição (minutos, horas, dias, semanas) Alterações morfofuncionais de células endoteliais (e outras). Diferenciação de células-tronco (EPCs e embrionárias). Fórmula: Cone Placa de cultura Células

20. Tensile stress variável (fisiológico: 10-15% deformação radial, 1Hz)

21. Variação dos tempos de exposição (minutos, horas, dias, semanas

22. Cardiomiocitos

23. Célulasmusculareslisashttp://www.gencompare.com/Bioflex_%20FlexStop_Cell_Stretch_Controller.htm

24. Células-tronco Células-tronco: Enorme potencial terapêutico Engenharia de tecidos, terapia celular e terapia gênica Dois tipos de células-tronco Células-tronco embrionárias Considerações éticas e dificuldades na regulação celular Células tronco adultas São imunocompatíveis e não há problemas éticos relacionados. Células-tronco mesenquimais (hACs) obtidas de tecido adiposo tem se mostrado experimentalmente promissoras Stem Cells . Scientific Progress and Future Research Directions; June 2001

25. hASC e o sistema vascular Evidências de participação no processo de angiogênese/vasculogênese Modelo de isquemia do membro posterior Oclusão da artéria femoral de ratos Rehman J, ConsidineR.V.etalCirculation. 2004;109:r52-r58. Miranville A, Bouloumie A. etalCirculation. 2004;110:349-55. Planat-Benard V, Casteilla L. etalCirculation.2004;109:656-63 Diferenciação in vitro Mesenquimais de tecido adiposo FLK-1+ em células endoteliais: tratamento com VEGF Biochem Biophys Res Commun. 2005 Jul 1;332(2):370-9 Controle Tratado Matrigel 0 horas 48 horas Microangiografia

27. Modelo de diferenciação – células do sistema vascular e imune FLT1+ CD45+ CD34+ cKIT- Tronco - Hematopoiética Precursor Linfóide Precursor Mielóide Eritrócitos Plaquetas Basófilos Linfócitos B Linfócitos T FLK1+, CD34+ CD133-, VE-Cad- vWF-, CD31- Eosinófilos Neutrófilos Macrófagos Hemangioblasto Dendríticas linfóide Plasmócitos Monócitos Dendríticas Mastócitos FLK1+, CD34+ CD133+, VE-Cad+ vWF-, CD31- EPC FLK1+, CD34+ CD133-, VE-Cad+ vWF+, CD31+ FLK1+, CD34+ CD133-, VE-Cad- vWF-, CD31- Angioblasto Célula endotelial

28. Forças hemodinâmicas Shear stress Força de atrito devido à passagem do sangue pela superfície interna do vaso Células endoteliais respondem ao shear strees Alterações morfológicas e funcionais em regiões específicas do vaso EPCsand células-tronco embrionáriasdiferenciam sob estímulo de shear stress Região de alto shear Davies PF, Polacek DC & cols. Arch Pathol Lab Med. 1992 Região de baixo shear

29. Objetivo Testar a hipótese de que o shear stress modula a diferenciação de células mesenquimais de tecido adiposo humano em células endoteliais

30. Extração das hASC Coleta de material de lipoaspiração Transporte em PBS, 4ºC - Digestão Colagenase IA0,075% 30 - 45min - Descarte sobrenadante - Plaqueamento - Centrifugação (15 min, 1.500RPM)

31. Extração das hASC Coleta de material de lipoaspiração Transporte em PBS, 4ºC - Digestão Colagenase IA0,075% 30-45min - Descarte sobrenadante - Plaqueamento - Centrifugação (15 min, 1.500RPM)

32. Extração das hASC Coleta de material de lipoaspiração Transporte em PBS, 4ºC - Digestão Colagenase IA0,075% 30-45min - Descarte sobrenadante - Plaqueamento - Centrifugação (15 min, 1.500RPM)

33. Extração das hASC Coleta de material de lipoaspiração Transporte em PBS, 4ºC - Digestão Colagenase IA0,075% 30-45min - Descarte sobrenadante - Plaqueamento - Centrifugação (15 min, 1200 g) Fração Vascular Estromal

34. Extração das hASC Coleta de material de lipoaspiração Transporte em PBS, 4ºC - Digestão Colagenase IA0,075% 30-45min - Descarte sobrenadante - Plaqueamento - Centrifugação (15 min, 1.500RPM)

36. Estufa 37°C, 5% CO2- Centrifugação (15 min, 1.500RPM) Condições de cultivo: -DMEM Low glucose + 10% Soro Fetal Bovino (FBS) -Passagens 1-14 -Repiquequandoem 80% confluência

37. Teste in vitro - shear stress Sistema “cone plate” Shear stress (10 dynas/cm2) Tempos de exposição (24h, 48h, 96h, 144h) A diferenciação das células mesenquimais Marcadores específicos das células mesenquimais e endoteliais Citometria de fluxo (FACS) RT-PCR Cone Placa de cultura Células

39. Produção de óxido nítrico é dependente de NOS Bassaneze V, andKrieger JE etalStemCellsDev. 2009 Sep 15 Bonferroniposttest (2w ANOVA)

41. Produção de VEGF é mediada por óxido nítrico Bassaneze V, andKrieger JE etalStemCellsDev. 2009 Sep 15 Bonferroniposttest (2w ANOVA)

43. Falhou em induzir significantemente marcadores de superfície endoteliais, enquanto que os mesenquimais (CD29 e CD90) foram mantidos)

44. Induz a produção de NO, a qual é dependente provavelmente de ativação de NO sintase endotelial (eNOS)

45. Promove a produção de VEGF que é mediada por NO

46. Próximo passo

48. Mecanismos de reparo cardiovascular Adaptado de StemCells. 2008 Sep;26(9):2201-10

49. Desafios atuais Células-tronco pluripotente induzidas (iPS) Adaptado de 2007 Jul 19;448(7151):313-7 Mesma morfologia Geração de quimeras Diferenciação em endotelial / efeito do shear stress?