biomassa

1. 1
UNIVERSIDADE DA INTEGRAÇÃO INTERNACIONAL DA LUSOFONIA
AFRO-BRASILEIRA
INSTITUTO DE ENGENHARIA E DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
ENGENHARIA DE ENERGIAS
LABORATÓRIO DE ENERGIA DA BIOMASSA
CHARLES ALVES MONTEIRO
DAVI FERNANDES ANANIAS DA ROCHA
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
ACARAPE - CEARÁ
02 DE MAIO DE 2017

2. 2
CHARLES ALVES MONTEIRO
DAVI FERNANDES ANANIAS DA ROCHA
IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Relatório referente à aula prática da
disciplina de Laboratório de Energia da
Biomassa, do curso de Engenharia de
Energias da Universidade da Integração
Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira.
Orientadora: Professora Dra. Maria
Cristiane Martins de Souza
ACARAPE - CEARÁ
02 DE MAIO DE 2017

3. 3
Sumário
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................4
2 OBJETIVOS............................................................................................................................5
3 MATERIAIS E METÓDOS...................................................................................................5
3.1 Processo de ativação do suporte nanopartículas magnéticas (NPMG) com
glutaraldeído.............................................................................................................................5
3.2 Processo de imobilização da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em
suporte (NPMG) ......................................................................................................................5
3.3 Medida de atividade hidrolítica – Enzima imobilizada...........................................5
3.4 Sobrenadante......................................................................................................................6
3.5 Análise dos produtos da reação.....................................................................................6
3.6 Medida de atividade hidrolítica da enzima CALB em presença de solução
pNPB...........................................................................................................................................7
4 RESULTADOS........................................................................................................................7
4.1 Processo de imobilização da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em
suporte (NPMG) ......................................................................................................................7
4.2 Medida de atividade hidrolítica – Enzima imobilizada...........................................7
4.3 Sobrenadante......................................................................................................................7
4.4 Análise dos produtos da reação.....................................................................................8
4.5 Medida de atividade hidrolítica da enzima CALB em presença de solução
pNPB...........................................................................................................................................8
5 CONCLUSÃO.........................................................................................................................9
6 REFERÊNCIAS......................................................................................................................9

4. 4
1 INTRODUÇÃO
A imobilização de enzimas em suportes apropriados se constitui em área de
interesse enquanto pode significar melhoria de processos e barateamento de custos. O
suporte ideal deve adsorver irreversivelmente a enzima, sem afetar sua atividade e sem
interferir na reação enzimática.
As lipases são enzimas que atuam sobre lipídeos, catalisando alguma reação
química que estas moléculas possam sofrer. No sistema digestivo humano, ela tem
como função, basicamente, transformar lipídeos (Gorduras) em ácidos gordos e glicerol,
isto ocorre quando o pâncreas libera um suco que contém várias enzimas, uma delas é a
lipase, no intestino delgado.
As Lipases são classificadas como hidrolases (triacilglicerol acil-hidrolases, EC
3.1.1.3) e atuam na hidrólise de triacilgliceróis formando ácidos graxos livres e glicerol
em meio aquoso ou na reação inversa em meio orgânico. Devido ao procedimento de
isolamento, as enzimas provenientes de micro-organismos são mais utilizadas
industrialmente.
Os métodos de imobilização de enzimas ou células são empregados com a
finalidade de tornar a enzima inerte ao meio reacional, por estar ligada, química ou
fisicamente, em um suporte sólido. A imobilização de enzimas pode ser utilizada como
método para reutilização, estabilização ou purificação de proteínas. Enzimas quanto
imobilizadas apresentam, em muitos casos, maior estabilidade, por apresentarem uma
estrutura mais rígida quando se ligam ao suporte. Utilizando suportes específicos é
possível purificar enzimas a partir de um extrato enzimático rico em proteínas.
O suporte será previamente preparado por modificação química com
glutaraldeído para possibilitar a ligação da enzima CALB no mesmo. A produção
biotecnológica do biodiesel com lipase tem estado no foco de vários estudos recentes e
tem tido um rápido desenvolvimento, dado ao interesse de se adotar processos
ecologicamente aceitáveis.

5. 5
2 OBJETIVOS
O objetivo principal da prática da imobilização de uma enzima é obter um
biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo.
Sendo os processos de bioconversão enzimática bastante utilizados na produção,
transformação e valorização de matérias-primas.
3 MATERIAIS E METÓDOS
3.1 Processo de ativação do suporte nanopartículas magnéticas (NPMG) com
glutaraldeído
A ativação das NPMG (0,01g) foi realizada com glutaraldeído em solução de
25%. A mistura foi mantida sob agitação (200 rpm) por 2 horas à temperatura ambiente
(25°C). Finalmente o suporte foi lavado com hexano para remover o excesso de agente
ativador. A função do glutaraldeído é reagir formando uma retícula (rede) de ligações
para imobilização enzimática (SOUZA, 2013).
3.2 Processo de imobilização da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em
suporte (NPMG)
O processo de imobilização foi realizado pelo contato de 0,01 g de (NPMG) com
0,5 mL de solução enzimática (20 μL de enzima (CALB) + tampão de fosfato de sódio
pH 7,0). A mistura foi mantida sob agitação (200 rpm) por 1 horas à temperatura
ambiente (25°C).
3.3 Medida de atividade hidrolítica – Enzima imobilizada
A reação de hidrólise foi realizada com 0,01 g de CALB – NPMG + 0,6 g de
óleo de soja (MM = 874,8 g/mol) em uma proporção reacional 5 : 1 (razão molar H2O :
óleo) + 600 μL de H2O. A mistura foi mantida sob agitação (200 rpm) por 1 horas à
temperatura ambiente (25°C).

6. 6
3.4 Sobrenadante
Com uma pipeta retirou-se o que sobrou 100 μL da solução sobrenadante de
enzima após imobilização + 0,6 g de óleo de soja + 600 μL de H2O. A mistura foi
mantida sob agitação (200 rpm) por 1 horas à temperatura ambiente (25°C).
3.5 Análise dos produtos da reação
IA – Índice de acidez
O índice de acidez foi determinado utilizando a equação abaixo, descrita abaixo:
𝐼𝐴 = 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒( 𝑁𝑎𝑂𝐻) × 𝑀𝑀(𝐾𝑂𝐻)× 𝑓 ×
𝑉𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
𝑀𝑟𝑒𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑙
𝐼𝐴 = 0,02
𝑚𝑜𝑙
𝐿
× 56,11
𝑔
𝑚𝑜𝑙
× 1,1306 ×
𝑉𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
0,3𝑔
A análise dos produtos da reação para obter o índice de acidez foi feita através
de titulação ácido-base, pois esse é um dos parâmetros especificados para controle de
qualidade do biodiesel e facilmente pode ser analisado no laboratório de forma manual,
apesar da técnica utilizada não ser tão precisa. Para realizar a titulação foi necessário a
padronização do álcool com fenolftaleína adicionando NaOH até ficar rosa.
IAI – Índice de acidez inicial do óleo
Para acidez do óleo, pesou-se 0,35 g da amostra do óleo em um Erlenmeyer e
anotou-se a massa. Colocou-se 20 ml de álcool (já neutralizado) e 4 gotas de
fenolftaleína 1 %. Titulou-se com NaOH 0,1 M, sempre agitando o frasco, até aparecer
uma mudança de coloração (rósea) e anotou-se o volume de NaOH.
IAB – Índice de acidez inicial do óleo Sobrenadante
Para acidez do óleo sobrenadante reacional, pesou-se 0,3 g da amostra do óleo
em um Erlenmeyer e anotou-se a massa. Titulou-se com NaOH 0,1 M, sempre agitando
o frasco, até aparecer uma mudança de coloração (rósea) e anotou-se o volume de
NaOH.

7. 7
3.6 Medida de atividade hidrolítica da enzima CALB em presença de solução
pNPB
A atividade hidrolítica da CALB solúvel e imobilizada determinasse usando
butirato de p-nitrofenol (pNPB) como substrato, a pH 7,0 e 25°C, com modificações.
Após hidrólise enzimática hidrolisa a p-nitrofenol butirato (solução amarela).
Uma curva padrão é realizada a partir de conceitos conhecidos de pNPB (diferentes
colorações de amarelo).
4 RESULTADOS
4.1 Processo de imobilização da enzima lipase B de Candida antarctica (CALB) em
suporte (NPMG)
Resulta em biocatalisador com 80
𝑈
𝑔
de atividade.
4.2 Medida de atividade hidrolítica – Enzima imobilizada
Cálculo da água para hidrolise:
Massa de óleo utilizada 06 g (MM = 874,8 g/mol)
5 : 1
H2O : óleo
5 x 18 g/mol 874,8 g/mol
X 0,6 g
X = 600 𝜇𝐿 de H2O
4.3 Sobrenadante
Em 100 𝜇𝐿 de solução sobrenadante de enzima, é equivalente a 1,67 % massa
catalisada.
A reação foi de 1,67 % de catalizador líquido ou sólido no meio reacional.

8. 8
4.4 Análise dos produtos da reação
IAI – Índice de acidez inicial do óleo
Volume de NaOH utilizado 0,5 ml:
𝐼𝐴𝐼 = 0,02
𝑚𝑜𝑙
𝐿
× 56,11
𝑔
𝑚𝑜𝑙
× 1,1306 ×
0,5 𝑚𝐿
0,3𝑔
𝐼𝐴𝐼 = 2,11 × 10−3
IAB – Índice de acidez inicial do óleo Sobrenadante
Volume de NaOH utilizado 0,4 ml:
𝐼𝐴𝐵 = 0,02
𝑚𝑜𝑙
𝐿
× 56,11
𝑔
𝑚𝑜𝑙
× 1,1306 ×
0,4 𝑚𝐿
0,3𝑔
𝐼𝐴𝐵 = 1,69 × 10−3
O índice de acidez do óleo deve ser maior do que o do óleo sobrenadante, pois
os ácidos graxos livres estão em maior quantidade já que ainda não reagiram.
4.5 Medida de atividade hidrolítica da enzima CALB em presença de solução
pNPB
Atividade enzima no branco: 80
𝑈
𝑚𝐿
.
Atividade teórica no branco de imobilização: 105
𝑈
𝑚𝐿
× 20𝜇𝐿 ×
1𝑚𝐿
103 𝜇𝐿
= 210 ×
10−3
𝑈.
Atividade teórica (100 % imobilizada = 210 × 10−3
𝑈 / 0,01 NPMG).
Atividade sobrenadante = 50 % do branco e 50 % do imobilizada.

9. 9
5 CONCLUSÃO
A prática experimental apresentou o processo de imobilização de uma enzima
com o intuito de obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não fossem
afetadas durante os processos. A reação não ocorreu totalmente devido as precariedades
do laboratório encontradas nos processos para realizar a reação e até mesmo análise
mais específicas, como índice de acidez. Entretanto, foi possível apresentar o processo e
posteriormente verificar na literatura.
O índice de acidez do óleo apresentou-se maior do que o do óleo sobrenadante,
pois os ácidos graxos livres estão em maior quantidade já que ainda não reagiram.
6 REFERÊNCIAS
CANILHA, LARISSA; CARVALHO, WALTER DE; SILVA, JOÃO B. A.
BIOCATALISADORES IMOBILIZADOS: USO DE CÉLULAS E ENZIMAS
IMOBILIZADAS EM PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS. BIOTECNOLOGIA
CIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO, V. 9, N. 36, P.48-57, 2006.
SOUZA, M. C. M. DE. IMOBILIZAÇÃO DE LIPASE DE CANDIDA ANTARCTICA
DO TIPO B EM NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS VISANDO A APLICAÇÃO
NA SÍNTESE DE ÉSTERES. UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ, 2013.
SOUZA, M. C. M. DE. MANUAL DE PRÁTICAS DE LABORATÓRIO DE
BIOMASSA. LABORATÓRIO DE ANÁLISE QUÍMICA E BIOMASSA. CAMPUS
DAS AURORAS - UNILAB.