capitulo 2 isolamento e purificacao de bioprodutos a

Isolamento e purificação de bioprodutos
1 Introdução
Neste capítulo serão descritas e analisadas algumas das principais operações unitárias
típicas usadas no isolamento e purificação “Downstream” de bioprodutos e realizadas após
a descarga do fermentador ou biorreactor. A diversidade e crescente importância
apresentada pelos produtos biotecnológicos incentivaram o desenvolvimento de vários
processos e estratégias de purificação. Uma dessas estratégias baseia-se na introdução de
modificações genéticas em novos microrganismos produtores com o objectivo de aumentar
ou facilitar a purificação específica, em particular de proteínas, integrando estratégias de
biossíntese e purificação no desenvolvimento de novos bioprocessos.
A natureza dos produtos da indústria biotecnológica, designados por bioprodutos,
bem como sua localização na célula produtora são muito diversificados (ex: ácidos
orgânicos, antibióticos, polissacarídeos, hormonas, aminoácidos, peptídeos e proteínas,
entre muitos outros). Como resultado dessa diversidade, não há processos de isolamento e
purificação de aplicação geral pois exigem comprovação experimental prévia.
O processo de isolamento e purificação de um dado bioproduto pode ser dividido em
quatro etapas principais:
- Separação de células e/ou fragmentos celulares do meio de cultivo (clarificação);
- Concentração e/ou purificação de baixa resolução, a qual compreende a separação do
bioproduto alvo, por exemplo uma proteína, em relação a moléculas com características
físico-químicas significativamente diferentes (água, iões, pigmentos, ácidos nucleicos,
polissacarídeos, lípidos, etc);
- Purificação de alta resolução, a qual compreende a separação de classes de biomoléculas
com características físico-químicas muito semelhantes ao bioproduto alvo,
- Finalmente, operações para acondicionamento final do bioproduto que permitem a sua
estabilidade durante meses ou anos.
Para além destas operações típicas, no caso de produtos intracelulares ou associados
às células, é necessário efectuar a rotura ou permeabilização celular, processo que é
efectuado sobre um concentrado de células, também designado por pasta celular, obtido

após a separação ou clarificação do meio de cultivo.
A efectivação de cada etapa não necessariamente compreende a aplicação de uma
única operação unitária individual. Por exemplo, após uma precipitação específica de
impurezas, por adição de um sal, é necessária uma diálise para ajuste da força iónica a
valores adequados a uma purificação do bioproduto alvo, por exemplo, usando uma
cromatografia de troca iónica. Por outro lado, há bioprodutos (ex: ácidos orgânicos, enzimas
industriais, etc) cuja aplicação não requer elevado grau de pureza, de modo que operações
cromatográficas não são necessárias. Todavia, a redução do número de etapas é de fundamental
importância na viabilidade do processo industrial. Este facto é facilmente compreensível, por
exemplo, se a cada operação unitária o rendimento em produto for de 90%, a aplicação de nove
operações levará a um rendimento final de cerca de apenas 40%.
Na Tabela.1 são descritas algumas operações unitárias viáveis em escala industrial.
Tabela 1 — Operações unitárias viáveis em escala de produção industrial.
Etapa do processo Operações unitárias
Clarificação Filtração convencional; centrifugação; filtração tangencial;
floculação
Rotura celular Homogeneização de alta pressão; moagem em moinho de bolas;
rotura celular por processos químico ou enzimático
Isolamento e purificação Precipitação; ultrafiltração; extracção em sistemas de duas
de baixa resolução fases liquidas imiscíveis
Purificação de alta resolução Cromatografia de troca iónica; de afinidade (biológica ou química);
hidrofóbica; de fase reversa; filtração gel ou exclusão molecular
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Tratamento final Cristalização; liofilização; secagem
A definição das operações unitárias de um processo de isolamento e purificação de
um dado bioproduto depende do uso final da biomolécula alvo, das suas características
físico-químicas, bem como a natureza e importância das eventuais impurezas presentes na
formulação do bioproduto final. Produtos destinados a usos terapêuticos e analíticos são,
obviamente, os que requerem maior nível de pureza e, portanto, a complexidade do
processo de purificação é elevada. A principal consequência desta complexidade é o custo

do processo de purificação em relação ao custo final do produto, o qual pode chegar a
80%.1
2. Processos de separação sólido-liquido
A separação das células de um meio de fermentação esgotado ou de uma suspensão
celular, mais ou menos concentrada, é frequentemente a primeira operação unitária do
processo de isolamento e purificação de um dado bioproduto. O meio resultante, praticante
isento de células, é denominado clarificado ou filtrado consequência respectivamente de
uma centrifugação ou filtração. Serão descritas aqui algumas operações unitárias de
clarificação viáveis em escala industrial: filtração convencional, filtração tangencial e
centrifugação. A Figura 1 apresenta a faixa de dimensão das células microbianas a serem
removidas e a respectiva operação unitária mais adequada.
Figura 1 - Classificação de operações unitárias de clarificação em função das dimensões de células
microbianas.
2 1 Filtração
A filtração convencional aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões
celulares, em geral, previamente diluídas, da ordem de milhares de litros, contendo
bioprodutos extracelulares e situações nas quais condições de assépsia não são
absolutamente necessárias.2
Na operação de filtração da suspensão celular, sob pressão, é direccionada
perpendicularmente a um meio filtrante. A fracção volumétrica que atravessa o meio
filtrante é denominada filtrado, e da contínua deposição das células sobre o meio filtrante,
resulta a formação de um ‘bolo de filtração”.
O processo de filtração é descrito pela lei de Darcy, a qual correlaciona o fluxo de

filtração (F) da fase líquida expresso, em geral, em litros por m2
de área e por hora,
(também designado por outros autores como velocidade do líquido- m/h) que permeia ou
atravessa o meio filtrante de acordo com a diferença de pressão aplicada (equação 1):
F = K.∆P / (µ.l) (1)
onde: F = fluxo de filtração da fase liquida (l /m2
.s)
K = permeabilidade do leito (m2
)
∆P = diferença de pressão através do leito (N/m2
)
l = espessura do leito (m)
µ = viscosidade do líquido (kg/m.s)
l / K = resistência à filtração (1/m)
O fluxo de filtração da fase líquida que permeia ou atravessa o meio filtrante pode ser
determinado experimentalmente no laboratório ou num protótipo à escala piloto de acordo
com a equação 2.
F = dV / (A.dt) (2)
onde: A = área de filtração (m2
)
V = volume de filtrado (L)
t = tempo de filtração (s)
As resistências da operação de filtração (l / K) são definidas como a soma das
resistências do meio filtrante (Rm) e do bolo de filtração (Rc) de acordo com a equação 3.
l / K = Rm +Rc (3)
A resistência do bolo de filtração, Rc depende da concentração de células na
suspensão, X (g/L), do volume filtrado até um certo instante, V, da área de filtração, A, e da
resistência específica do bolo de filtração, α (m/g), de acordo com a equação 4.
Rc = α X V / A (4)
Para os bolos de filtração compressíveis formado por micélio, de alguns fungos e
leveduras, a resistência específica α varia com a pressão de acordo com a equação 5:
α = α´ (∆P)s
(5)
onde: α’= constante relacionada ao tamanho e forma das células,
S= compressibilidade do bolo de filtração (adimensional que varia de 0 a 1).
A compressibilidade S pode ser determinada através de ensaios de filtração em escala
de laboratório, com base na determinação de valores da constante α em função da pressão.

A combinação das equações 1 a 5 resulta na equação 6, que representa o tempo
necessário à filtração (t) de um volume V de suspensão contendo células sujeitas à
compressibilidade, sob uma determinada diferença de pressão constante através de uma
área fixa A e quando Rm é desprezável em relação a Rc.
t = µ α´ X V / (2 ∆P(1-s)
A2
) (6)
Bolos de filtração rígidos apresentam S igual a zero e, portanto, exigem tempos de
filtração significativamente menores em relação aos bolos de filtração contendo fungos e
algumas leveduras ou bactérias na forma de micélio muito compressíveis, para as quais o
valor de S pode facilmente chegar a 0,8. Adjuvantes de filtração, normalmente terra
diatomácea, podem ser adicionados aos meios de fermentação compostos por suspensões
celulares deste tipo, mais ou menos diluídas, e/ou depositados na forma de uma fina
camada sobre o meio filtrante. A adsorção das células e, em particular micélio, sobre essas
partículas de adjuvante resulta na redução da compressibilidade do bolo de filtração, bem
como evita a penetração de células ou seus fragmentos celulares no meio filtrante, com
consequente entupimento do filtro.
O equipamento mais frequentemente utilizado na clarificação deste tipo de
suspensões celulares é o filtro rotativo a vácuo, FRV, apresentado na Figura 2. Consiste
num tambor oco e rotativo (1 rpm) coberto com uma malha metálica filtrante, a qual, por
sua vez, é coberta com uma camada de 5 a 20 cm de terra diatomácea e, neste último caso,
corresponde aproximadamente a uma carga de adjuvante de cerca 20 Kg/m2
. O tambor fica
parcialmente submerso em um recipiente que contém a suspensão diluída e, em geral,
previamente tratada com adjuvante de filtração antes de ser filtrada, a qual é suavemente
agitada para evitar sedimentação das células e do adjuvante de filtração. Esta suspensão
celular previamente tratada é alimentada continuamente para dentro do recipiente
submergindo a mesma área externa do tambor e a reduzida pressão no interior do mesmo
promove a sucção do micélio adsorvido no adjuvante de filtração contra o meio filtrante e,
logo, a filtração. Verifica-se na Figura 2 que o FRV é dividido em zonas de imersão, de
lavagem, de secagem e de remoção contínua de uma fina camada de poucos milímetros do
bolo de filtração, que constitui vantagem deste tipo de filtro sobre os demais.
Estes filtros podem funcionar durante várias horas (16 a 18 horas) mas antes de
esgotar a camada de adjuvante de filtração depositada em cima do meio filtrante. Antes de

iniciar uma nova etapa de filtração o FRV tem de ser lavado e revestido com nova camada
de adjuvante de filtração que pode levar algumas horas (ex: 6 a 8 horas). Estes tempos de
funcionamento e preparação do filtro têm de ser considerados quando se pretende escolher
o FVR mais adequado para um dado bioprocesso.
Figura 2 Filtro rotativo a vácuo com adjuvante de filtração.
Com esse objectivo é conveniente começar por definir o caudal operacional (Qop) do
“batch” a filtrar, isto é, volume a filtrar (Vfilt) pelo tempo disponível de filtração (Tdisp)
antes de chegar a este sector da fábrica um novo “batch” a filtrar.
Qop = Vfilt / Tdisp
Assim, a área do FRV pode ser estimada a partir do Qop e se se tiver determinado
num protótipo à escala laboratorial ou piloto o fluxo de filtração (F) que atravessa o bolo de
filtração com as mesmas características e submetido à mesma diferença de pressão.
A = Qop / F
No caso de se pretender escolher um equipamento de série de algum fabricante
credenciado neste tipo de aplicações o FRV pode ser escolhido no catálogo do fabricante
com uma área superior ao estimado após um sobredimensionamento de 20%.
No caso do micélio não ser muito compressível nas condições de funcionamento

optimizadas na escala laboratorial e piloto então, neste caso, usa-se outro tipo de FRV com
uma tela filtrante aderente ao meio de filtrante do tambor pois não é necessário o uso de
adjuvante de filtração. Neste caso, após a aderência do micélio à tela filtrante por sucção, o
micélio é lavado na zona de lavagem e, posteriormente, parcialmente seco (30 a 50%) na
zona de secagem. Por último, este tipo de micélio é removido continuamente da tela
filtrante por simples acção da gravidade quando a tela filtrante dá uma volta de cerca de
180º antes de ser de novo encaminhada ao recipiente contendo a suspensão celular a filtrar
(Figura 3).
Figura 3 FRV com tela filtrante.
2.2 Centrifugação
Células em suspensão em um meio líquido sofrem sedimentação por acção da força
da gravidade, processo denominado sedimentação cujo tempo depende principalmente do
tamanho das células, da diferença de densidade em relação ao meio líquido, da
concentração celular e, também da viscosidade da suspensão celular.
A centrifugação compreende a aceleração dessa sedimentação, por acção de um
campo gravitacional centrífugo.

Suspensões celulares, de bactérias e leveduras, com dimensões muito pequenas para
serem separadas eficientemente no FRV ou não podem ser tratadas facilmente com
adjuvantes de filtração (por exemplo, quando o bioproduto é intracelular) ou exigirem
condições de assepsia (por exemplo, quando se trabalha com microrganismos patogénicos)
então, nestes casos, as células podem ser clarificadas ou separadas do meio de fermentação
através da centrifugação.
Da centrifugação resultam sempre novas suspensões celulares mais concentradas (ex:
até 120 a 250 g peso seco/l) em relação à original (ex: 2 a 100 g peso seco/l), também
designada por pasta celular. Esta pasta celular mesmo muito concentrada está em grande
contraste com o bolo de filtração onde as células estão parcialmente secas, apesar de
estarem relativamente húmidas (20 a 50%), o que constitui vantagem desta última operação
unitária em relação à centrifugação.
A centrifugação destas células baseia-se na diferença de densidade entre a célula (ρc)
e o meio líquido (ρ), na viscosidade do meio líquido (µ), na força motriz [dada pelo produto
entre o quadrado da rotação angular (w - rad/s) e a distância radial desde o centro da
centrífuga até a célula (r) sedimentada no extremidade, em geral, cónica da centrifuga] e no
diâmetro da partícula, d, de acordo com a equação 7, onde vc, representa a velocidade de
sedimentação da célula no campo centrifugo.2
vc = d (ρc - ρ) w2
r / (18 µ ) (7)
A razão entre a força motriz, w2
r, e a aceleração padrão da gravidade, g, representa
um múltiplo desta última e é dada pela equação 8. Fc representa, portanto, o incremento da
força da acção da gravidade na sedimentação forçada em um campo centrífugo.
Fc= w2
r / g (8)
O valor da variável Fc deve ser mencionado na caracterização de uma centrifugação,
juntamente com o tempo adoptado para se obter um determinado grau de clarificação. Por
exemplo, para a centrifugação de leveduras, valores da ordem de 3.000g e alguns minutos
são suficientes para obter sedimentação completa das células.
Na clarificação de suspensões microbianas, é comum a utilização de centrífugas
tubulares e centrífugas de discos (Fig. 4). As primeiras podem operar sob refrigeração e
com valores de Fc bastante elevados, da ordem de 13.000 a 17.000g, embora a sua
capacidade seja limitada a algumas dezenas de litros na extremidade cónica de

sedimentação da centrífuga e o modo de operação seja descontínuo. As centrífugas de
discos, embora operem sob valores menores de Fc, de 5.000 a 15.000g, permitem
processamento contínuo até 200 m3
/h. A inclusão dos discos aumenta a área de
sedimentação, reduzindo o tempo em relação a uma centrífuga sem discos.
Figura 4- Dois tipos básicos de centrífugas. Centrífuga de discos (a) centrífuga tubular (b).
Devido à natureza descontínua e contínua do modo de operação das centrífugas
consideradas, a tubular aplica-se a suspensões celulares com o máximo 30 g/l de células
enquanto a centrífuga de discos usa-se para suspensões celulares mais concentradas e maior
volume a processar. Valores de concentração celular até 100 g/l resultam de cultivos em
alta concentração celular ou de operações prévias de floculação das células pelo uso de
floculantes para agregar as células bacterianas mais pequenas (ex: Escherichia coli)
aumentando o tamanho e/ou densidade destas novas partículas celulares.
Estes floculantes tiram partido do facto de as células microbianas serem
caracterizadas por uma carga global negativa na sua superfície.
Um critério qualitativo simples pode ser utilizado no projecto da operação de
centrifugação em escala industrial. Baseia-se na manutenção do valor do produto entre Fc
(equação 8) e o tempo (t).2
Para operar a centrífuga industrial com a mesma eficiência obtida a nível laboratorial
ou à escala piloto procura-se manter o mesmo valor constante de Fc . t . Por exemplo, se
3.000g durante cinco minutos são suficientes para a obtenção de um sedimento compacto e

um sobrenadante de turbidez aceitável, 1.500g durante dez minutos, na centrífuga
industrial, deverão resultar um sobrenadante e um sedimento de mesmas características em
relação àquele obtido em laboratório ou escala piloto.
A clarificação de suspensões de leveduras por centrifugação é eficientemente
realizada enquanto para bactérias a reduzida dimensão das partículas exige valores de Fc
significativamente maiores e, portanto, quando possível o uso de agentes floculantes ou
recomenda-se uma comparação com a microfiltração quanto a desempenho e custo.
As centrífugas tubulares podem funcionar durante algum tempo até atingir a
capacidade máxima de volume de células sedimentadas no seu interior. Nesta altura a
centrífuga tem de parar para ser removido sedimento celular e isto pode levar algum tempo
diminuindo a produtividade do equipamento antes de este voltar a estar em condições
operacionais.
Assim, para escolher o modelo para um dado bioprocesso é necessário saber o
volume das células microbianas produzidas e existente no final da fermentação (Vcélulas) e a
capacidade volumétrica na centrífuga tubular de modo a calcular o número de
sedimentações necessárias.
De acordo com o tempo disponível (tdisp) até recepcionar outro lote (“batch”) neste
sector da fábrica e tendo em conta o tempo de centrifugação (tcent) para atingir a capacidade
máxima e o tempo de descarga (tdesc) do sedimento será então possível estimar o número de
centrifugações a processar neste período.
Nº ciclos centrifugação = tdisp / (tcent + tdesc)
Então a capacidade da centrifuga tubular a operar eficientemente num dado
bioprocesso seria de:
Capacidade centrífuga tubular = Vcélulas / Nº ciclos centrifugação
No caso de se ter um volume de fermentação ou uma concentração celular muito
elevada então temos um grande volume de células para sedimentar, neste caso, o melhor é
escolher uma centrífuga de discos que opera com descarga contínua ou descargas
intermitentes na forma de uma pasta celular mais concentrada do que a suspensão celular
original.
Na escolha do modelo mais adequado da centrífuga de discos de um dado fabricante
com experiência de fabrico deste equipamento e já validado em aplicações semelhantes tem

de saber-se o caudal operacional exigido pelo bioprocesso.
O caudal operacional (Qop) é calculado pela razão do volume a processar por batch
(Vferm) e o tempo disponível (tdisp) para processar o lote ou batch de fermentação. Este
tempo disponível é o tempo real de centrifugação eficiente descontando o tempo para
atingir o estado estacionário de funcionamento, isto é, atingir a força g correcta e após
terminada a centrifugação lavar e limpar os discos e rectificar se está tudo bem antes de
novo funcionamento (em projecto pode considerar-se cerca de 6 a 8 horas).
Qop = Vferm / tdisp
Com base nos caudais nominais definidas pelo fabricante para aplicações
semelhantes então escolhe-se o modelo de centrífuga com um caudal nominal cerca do
dobro do caudal operacional definido anteriormente.
2.3 Microfiltração de filtração tangencial
Microfiltração de filtração tangencial (Figura 5) é o termo empregado para definir os
processos de microfiltração nos quais o fluido de alimentação escoa tangencialmente à
superfície do meio filtrante em oposição à filtração perpendicular, por exemplo, que ocorre
no FRV. Nesses processos a tensão de torque do fluido minimiza a acumulação de células e
seus fragmentos na superfície da membrana.1,3,4,5
Figura 5. Esquema de uma filtração tangencial.
O desempenho de uma filtração tangencial é, em geral, caracterizado por duas

variáveis: fluxo de filtrado e coeficiente de retenção de sólidos em suspensão ou solutos. O
fluxo de filtrado (J) em microfiltração varia de 50 a 100 l/h.m2
e é definido pela equação 9:
J = Qfil / A (9)
onde: Qfil = Caudal operacional de filtrado (L/h)
A = área da membrana (m2
)
A determinação do coeficiente de retenção (R) de solutos ou sólidos R é dada pela equação
10.
R = 1 – Cf / Cr (10)
onde: Cf = concentração de solutos ou sólidos no filtrado
Cr = concentração de solutos ou sólidos no concentrado ou retentado.
O fluxo de filtrado e o coeficiente de retenção de solutos ou sólidos são influenciados pelos
fenómenos de concentração de polarização (formação de um gradiente de concentração de
células ou solutos próximos à superfície da membrana) e “fouling” (bloqueio ou
estreitamento dos poros da membrana resultante da deposição de solutos ou sólidos no
interior do meio filtrante). O fenómeno de concentração de polarização é reversível com
uma simples alteração das condições de operação do processo, como por exemplo o
aumento da velocidade tangencial, da pressão ou a variação do pH. No caso do “fouling”,
estas alterações no processo não podem resolver o problema e, por isso, para recuperar o
fluxo tem de se proceder a lavagens com diferentes agentes alcalinos ou detergentes, água
quente, e “backwashing”, isto é, fluxo de água e outros agentes de limpeza no sentido
contrário ao convencional da operação de filtração.1
. Os efeitos da concentração de
polarização e do “fouling” podem ser minimizados, quando se conduz a filtração a uma
velocidade de escoamento da suspensão (ve) da ordem de 0,2 a 0,5 m/s para módulos de
membrana placas e quadros, de 2 a 5 m/s para filtros tubulares e a uma pressão
transmembranar (∆PTM) na faixa de 100 a 500kPa.1,4,6,7,8,9
A velocidade de escoamento da
suspensão, ve, e a pressão transmembranar são definidas pelas equações 11 e 12.
ve = Qa /At (11)
onde: Qa = Caudal de alimentação do meio (m3
/h)
At = A área da secção transversal do canal de escoamento da suspensão (m2
)
∆PTM = (Pa + Pr) / 2 - Pf (12)
onde: Pa = pressão de alimentação (N/m2
)

Pr = pressão no retentado (N/m2
)
Pf = pressão do filtrado (N/m2
)
Os fenómenos de “fouling” e concentração de polarização aumentam a resistência à
passagem da fase liquida e, logo, diminuem fluxo de filtrado através da membrana
representada pela equação 13.
J = ∆PTM / (µ (Rm +Rcp +Rf)) (13)
onde: µ = viscosidade do fluido de alimentação
Rm = resistência da membrana
Rcp = resistência devido à concentração de polarização
Rf = resistência devido ao “fouling”
Uma grande variedade de membranas e equipamentos para filtração tangencial está
disponível no mercado. A escolha da membrana e do filtro mais adequado vai depender do
material a ser filtrado e do processo global de purificação.3
As membranas de microfiltração
são fabricadas, em geral, na forma de tubos constituídos por fibras ocas ou tubos paralelos
concêntricos (Fig. 6) ou de placas e quadros (Fig. 7). Os filtros com membranas do tipo
fibras ocas, assim como os do tipo placa e quadro, possuem uma elevada área filtrante por
unidade de volume do filtro, porém são bastante susceptíveis a entupimentos nos canais de
escoamento da suspensão celular. Os filtros com membranas de tubos paralelos
concêntricos, possuem pequena área filtrante por unidade de volume, porém podem ser
operados em regime turbulento e são de limpeza fácil.
Figura 6. Filtro tubular dotado de várias fibras ocas.

Figura 7. Filtro tipo placa e quadro.
As variáveis de um processo de filtração são as mesmas em qualquer escala.
Portanto, a partir de estudos realizados em laboratório, obtém-se a velocidade tangencial de
alimentação, a pressão transmembranar e a capacidade de filtração (J). Após definidas essas
condições de trabalho, poderá ser feita a ampliação de escala em função do volume a ser
processado. O processo de filtração tangencial pode ser conduzido utilizando-se um ou
mais filtros. No caso de ser utilizado somente um filtro, é necessário instalar um sistema de
recirculação quando se desejar um retentado mais concentrado. Para os sistemas
constituídos por mais de um filtro, o sistema pode ser configurado em série ou em paralelo
sem essa recirculação.
Os diferentes módulos de microfiltração funcionam durante algum tempo em estado
transiente mas rapidamente se forma a camada de concentração de polarização e “fouling”
e, então, atinge-se um fluxo de filtração mais ou menos constante (50 a 100 l/m2
. h) de
acordo com o tipo de condições operacionais, em particular, de diferença transmembranar,
caudal de alimentação, viscosidade da suspensão celular, distribuição do tamanho das
células e fragmentos celulares, presença de agentes tensioactivos como antiespumas, óleos,
etc.
Após finalizada a separação das células ou a concentração da suspensão celular tem
de proceder-se a um período (em falta de tempos reais e em projecto admitir cerca 6 a 8 h)
de lavagem e regeneração das membranas com soluções de hidróxido de sódio, detergentes,
água quente, e “backwashing” no final do qual se faz um teste de fluxo de filtração com
água para avaliar a eficiência da membrana antes de poder voltar a operar novo ”batch” de
meio de fermentação.
Na escolha de uma unidade de microfiltração para separação das células de bactérias

e leveduras ou esterilização de meios de cultura usam-se membranas com 0,2 a 0,45 µm de
diâmetro médio de poro. Para escolher o número de filtros necessários de acordo com o
fabricante com provas dadas neste tipo de aplicações e com equipamento de série precisa-se
de saber qual o caudal operacional (Qop) a processar, isto é, saber o volume a processar
(Vproc) e o tempo real de microfiltração (tmicrofilt) disponível para processar o “batch”.
Qop = Vproc / tmicrofilt
Se dividir este valor pelo fluxo de filtrado da microfiltração (J) obtido
experimentalmente em escala laboratorial ou piloto podemos então estimar a área de
filtração:
A = Qop / J
Se não se souber qual o fluxo de filtrado obtido na microfiltração pode admitir-se um
valor mínimo de 50 l/m2
.h e ter, assim, uma primeira estimativa do valor da área do módulo
de microfiltração. Com este valor, em geral, sobredimensionado cerca de 20%, pode-se
então estimar o número de filtros de um dado fabricante a funcionar em série ou em
paralelo que constituem o sistema de microfiltração de acordo com os prossupostos
anteriores.
3 Rotura das células
A libertação dos produtos intracelulares, biossintetizados e acumulados no interior
das células microbianas, requer a rotura ou permeabilização das células com recurso a
operações conduzidas sobre o concentrado obtido após a clarificação.3,10,11,12
A rotura ou
permeabilização celular para a recuperação de produtos intracelulares termolábeis ou
sujeitos a acção de proteases deve ser conduzido rapidamente e a baixas temperaturas.
Há diferentes estruturas de paredes celulares (Fig. 8). As células animais possuem
membranas frágeis e fáceis de serem rompidas enquanto as bactérias, leveduras e outras
formas de fungos possuem paredes rígidas e que exigem elevadas tensões de corte para o
conseguir.10

Figura 8. Diferentes estruturas de paredes celulares de microrganismos.
Os métodos de rotura ou permeabilização celular podem ser classificados como:
mecânicos (homogeneizador de alta pressão, moinho de bolas, sonicação ou ultrassons),
não mecânicos (choque osmótico, congelamento e descongelamento, secagem); químicos
(com agentes alcalinos, solventes, detergentes e ácidos) e enzimáticos (lise enzimática ou
inibição da síntese da parede celular).11
Para se definir o processo de rotura ou permeabilização celular a ser utilizado, alguns
factores são levados em consideração, como: rendimento, especificidade, necessidade de
controlo de temperatura, custo da operação unitária e capital a investir.10,11
3.1 Métodos enzimáticos
Métodos enzimáticos de rotura celular são adequados para a recuperação de

biomoléculas sensíveis à tensão de corte ou pressão de trabalho geradas pelos métodos
mecânicos. Há enzimas específicas que são capazes de hidrolisar paredes celulares de
células microbianas. Quando uma certa porção de parede extracelular é fragilizada
(permeabilizada) ou removida, a pressão osmótica interna rompe a membrana
citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio externo.
As paredes celulares de leveduras são muito diferentes das bactérias e, portanto, os sistemas
enzimáticos para a lise celular são específicos para cada grupo particular de microrganismo.
As paredes celulares de leveduras possuem duas camadas principais (Fig. 8), sendo
uma camada externa que compreende o complexo proteína-manano e uma camada mais
interna de glucano. O sistema enzimático para a rotura celular de leveduras é composto,
portanto, de diferentes enzimas como glucanases, proteases e mananases. Estas enzimas
atuam sinergeticamente na lise da parede celular, mas somente duas delas são essenciais
para a rotura completa da célula: uma protease para degradar a camada externa de proteína-
manana e uma glucanase para degradar a camada interna de glucano.
A composição das paredes celulares das bactérias varia com o facto de elas serem
gram-positivas ou gram-negativas. Nas bactérias gram-positivas os peptidioglicanos estão
em maior proporção na parede e estão associados com ácido teicóico e polissacarídeos. As
bactérias gram-negativas têm uma parede celular de dupla camada, composta por
peptidioglicano, proteínas, fosfolipídeos, lipoproteínas e lipopolissacarídeos. As principais
enzimas bacteriolíticas são: glucosidases, acetilmuramilalanina amidases, endopeptidases e
proteases.
Algumas vantagens desse tipo de rotura celular são: facilidade no controlo do pH e
temperatura, baixo investimento de capital e alta especificidade para degradação da parede
celular. As principais desvantagens são: o elevado custo das enzimas e a variação da
eficiência da lise enzimática com o estado fisiológico do microrganismo.1,3,5,8,10
3.2 Métodos mecânicos
Embora existam muitos exemplos específicos de rotura celular por processos
químicos e enzimáticos, são os métodos mecânicos que têm sido mais utilizados
industrialmente. O tamanho e a forma das células, assim como a estrutura da parede celular,

são factores determinantes para a definição do tipo de processo a ser utilizado para a rotura
celular por processos mecânicos. De entre os equipamentos que podem ser utilizados
industrialmente, destacam-se o homogeneizador de alta pressão e o moinho de bolas.3,12
Os homogeneizadores são, basicamente, constituídos de pistões projectados para
aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem através de um orifício
estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão (Fig. 9).
A queda instantânea de pressão associada ao impacto, provoca uma eficiente rotura celular
sem danificar proteínas. Nesse tipo de rotura mecânica as células maiores rompem-se mais
facilmente, assim como pressões mais elevadas aumentam a eficiência da rotura celular.
Pressões de 5.000 a 20.000 psi e velocidades de alimentação na faixa de 180 a 280 m/s
(caudal de alimentação a dividir pela secção recta do tubo de acesso à câmara de
homogenização) são comumente utilizadas para a rotura celular (Fig. 9). O processo
conduzido a pressões elevadas proporciona altos rendimentos de recuperação, usando
somente uma etapa do processo. No entanto, rotura celular em múltiplas etapas de
homogeneização podem ser utilizados para aumentar o rendimento do processo.8,10
Do
mesmo modo, um melhor controlo da temperatura por arrefecimento prévio da suspensão
celular dá melhor resultados antes de voltar a proceder a nova etapa de homogenização.
Figura 9. Homogenizador de alta pressão utilizado na rotura de células.
Vários factores operacionais afectam o desempenho de um homogeneizador de alta
pressão: pressão de operação, temperatura, fase de crescimento do microrganismo,
condições de cultivo, tipo de célula e concentração celular.3,12
Um modelo matemático de
primeira ordem permite descrever a libertação da proteína intracelular a partir de uma

célula cuja concentração máxima intracelular equivalente [Protm] obtêm-se no final com a
libertação total.
d[Prot]/dt= k (∆P)α
n
Da sua integração para n passagens da suspensão celular no homogenizador resulta a
equação 14, que representa a variação da eficiência desse processo de rotura celular em
função do número de passagens (n) através da válvula do homogeneizador e da pressão
(∆P), fixadas as condições de operação como temperatura e tipo de célula.13
log ([Protm]/ ([Protm]– [Prot])) = k (∆P)α
n (14)
onde: [Protm,] = concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/l)
[Prot] = concentração de proteína liberada (g/l)
k = constante de rotura celular que depende da temperatura, da concentração e do tipo
de célula (min-1
)
α = constante que é função do tipo de célula e das condições de crescimento (varia de
0,86 a 2,9)3,12
Na ampliação de escala do processo de rotura celular em homogeneizador de alta
pressão, alguns parâmetros devem permanecer constantes como: velocidade de
alimentação, pressão e temperatura de operação, número de passagens através da válvula do
homogeneizador, viscosidade e concentração celular da alimentação.
Para escolher o homogenizador de alta pressão a usar na rotura celular industrial
deve-se então ter em conta o caudal operacional (Qop) a processar, isto é, volume da
suspensão celular e o tempo disponível para processar cada “batch”. Neste caso tem de se
ter em conta que no caso de múltiplas etapas de homogeneização (n) para além do tempo
efectivo de homogeneização (thomog) tem de se considerar o tempo necessário para proceder
ao arrefecimento (tarref) da suspensão celular antes de efectuar nova etapa e após terminada
a homogeneização o equipamento deve ser limpo (tlimpeza) como seja uma operação rápida
com água quente e alguma solução alcalina.
tdisp = n . (thomog + tarref) + tlimpeza
A escolha do modelo de homogenizador de alta pressão de um dado fabricante com
provas dadas neste tipo de aplicações, nas mesmas condições de pressão e temperatura,
pode ser efectuado com base no caudal nominal do fabricante em relação ao caudal
operacional sobredimensionado cerca de 20%.

4. Processos de concentração de bioprodutos
4.1 Precipitação
O processo mais simples na concentração de bioprodutos seria usar processos de
desidratação como evaporação contudo para além do gasto de energia associado a esta
operação, ela também é incompatível com muitos bioprodutos termolábeis. Assim, a
precipitação de bioprodutos em meios aquosos é um dos métodos tradicionais de
concentração deste tipo de bioprodutos.
A precipitação não apresenta elevada capacidade de separação de bioprodutos com
propriedades físico-químicas muito semelhantes como sejam diferentes proteínas, razão
pela qual é considerado um método baixo ou moderado em termos de poder de purificação.
A precipitação de um dado bioproduto depende essencialmente da sua solubilidade
como sejam: concentração e pI do bioproduto e impurezas, força iónica, temperatura, tipo e
natureza dos iões, presença ou adição de solventes ou co- solventes, entre outras variáveis.
Do mesmo modo também é esta variável (solubilidade) que permite o passo reversível de
redissolução de um dado bioproduto entretanto precipitado. Nestas duas etapas sequenciais
obtêm-se a eliminação de algumas impurezas que não precipitam ou não redissolvem com o
bioproduto alvo e, por outro lado, procura-se simultaneamente no passo de redissolução
concentrar também o bioproduto alvo em relação à solução original.
Por exemplo, a solubilização de proteínas precipitadas pode ser dimensionada de
modo a promover a redução do volume inicial e, portanto, levar ao aumento da
concentração. Em função desta possibilidade, a precipitação/redissolução pode anteceder
processos de elevada resolução, como a cromatografia.
O aumento de escala desta operação de precipitação depende então do volume a
processar e da solubilidade do bioproduto alvo nas condições experimentais optimizadas à
escala laboratorial ou piloto e, do modo como será possível remover o precipitado (ex:
centrifugação ou filtração) e efectuar de seguida a sua redissolução. Contudo, os
rendimentos de precipitação e redissolução de qualquer bioproduto devem ser elevados (>
90%) de modo a não afectar gravemente o rendimento global do bioprocesso.
A precipitação de proteínas resulta normalmente numa modificação da sua estrutura

tridimensional. Trata-se, portanto, de método agressivo para essas moléculas, pois sua
função bioquímica depende da estrutura. A aplicação desse método somente é viável,
portanto, quando a adequada conformação da proteína é recuperada no passo de
redissolução.
A precipitação de proteínas em altas concentrações salinas dá-se o nome de “salting-
out”. A adição de sais a concentrações de 1,5 a 3,0 M reduz a disponibilidade de água,
devido a hidratação dos novos iões adicionados e dissolvidos na solução de precipitação.
Em consequência, reduz-se a disponibilidade de moléculas de água que circundam as zonas
hidrófobas da superfície da proteína, criando-se condições para a agregação e consequente
precipitação, a qual ocorre principalmente por interacção entre as zonas hidrófobas de
diferentes moléculas de proteína. Estas interacções entre as proteínas conduzem à formação
de agregados proteicos cuja dimensão pode ser facilmente separada da solução de
precipitação por centrifugação ou filtração.
Uma descrição quantitativa clássica do “salting-out” é dada pelo modelo de Cohn 14
(equação 15), no qual o parâmetro β é uma constante que representa a solubilidade da
proteína em um sistema com força iónica zero, e é função do tipo da proteína, pH e
temperatura, com valor mínimo no ponto isoelétrico. O parâmetro Ks é chamado constante
de “salting-out” e é função do tipo de agente de precipitação e da proteína, sendo
independente do valor do pH e da temperatura.
Log S = β - Ks I (15)
onde: S = solubilidade da proteína (M)
I = força iónica do meio (M)
β = constante que representa a solubilidade da proteína quando I é zero (M)
Ks = constante de “salting-out”
Misturas de diferentes proteínas não obedecem a essa equação, já que a solubilidade
de uma determinada proteína é reduzida pelas demais moléculas estruturalmente
semelhantes e pode inclusive ocorrer então a co-precipitação, ou seja, a agregação de
diferentes proteínas.
Os sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade, aumentam
a tensão superficial do solvente, resultando menor nível de hidratação das zonas hidrófobas
e, portanto, aumentam a probabilidade de interacção entre estas zonas. Os sais mais

empregados são: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amónia.
Vários solventes orgânicos miscíveis em água, particularmente os álcoois e a acetona,
promovem também a precipitação de proteínas. O principal efeito é a redução da actividade
da água pela diminuição da constante dieléctrica do meio (Fig. 10).
Figura 10 Agregação de proteínas por interacções electrostáticas entre superfícies com
cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.
As consequências da redução da constante dieléctrica do meio de precipitação podem
ser descritas da seguinte forma: imobilização parcial das moléculas de água através da
hidratação do grupo polar do solvente orgânico, com simultâneo deslocamento das
moléculas de água das zonas hidrofílicas do bioproduto e, consequentemente, redução da
densidade da camada de hidratação e da parcela de solubilidade conferida por estas zonas.
Ainda, devido à redução da constante dieléctrica do meio de precipitação resulta,
assim, uma maior disponibilidade de cargas superficiais da proteína (antes neutralizadas por
iões de sinal contrário em solução) para interacções electrostáticas com outras moléculas de
proteínas. Finalmente, ocorre atracção electrostática entre diferentes moléculas de proteína,
através das cargas superficiais de sinal contrário com formação do precipitado e agregados
proteicos mais fáceis de separar da solução de precipitação. A redução da constante
dieléctrica ou polaridade do meio de precipitação interfere, portanto, na fracção da
solubilidade da proteína conferida pelas interacções iónicas e hidrofílicas com o solvente

aquoso, por exemplo, a água ou tampão.
O solvente polar afecta a camada de hidratação que se localiza próxima às zonas
hidrófobas da proteína e passa a circundá-las, devido à maior solubilidade destas em meio
de precipitação com solvente. Esse tipo de interacção do solvente com as zonas hidrófobas
internas causa alteração irreversível da conformação da proteína. A redução da temperatura
até valores da ordem de 0°C ou menores, minimiza esse efeito, pois a flexibilidade da
molécula proteica é menor, o que reduz a capacidade de penetração do solvente. Para altas
temperaturas, a molécula proteica possui uma flexibilidade natural e permite o contacto do
solvente polar com os resíduos internos hidrófobos da proteína, causando desnaturação.
A precipitação da enzima amiloglucosidase produzida por Aspergilius awamori em
cultura submersa, por acção de etanol (60% v/v), promoveu aumento de 67% da actividade
específica (razão entre a actividade enzimática Act e a concentração de proteína total
[Prot]), o que significa que houve real purificação da enzima. Recuperação de 100% da
actividade enzimática foi obtida quando a temperatura foi controlada em 5°C.15
Isto
significa que nestas condições experimentais ocorreu a precipitação total da
amiloglucosidase enquanto uma parte (33%) das impurezas, proteínas não enzimáticas,
permanecem em solução nestas condições experimentais.
1,67 = Actespi / Actespo = {Acti/[Proti] / Acto/[Proto]}
Como não houve perda de actividade então
Acti = Acto
e, logo,
1,67 = [Proto] / [Proti]
isto é, redução de 33% na quantidade de proteína não enzimática.
Uma vantagem significativa do uso de solventes é a redução da densidade do meio
líquido, o que favorece a sedimentação do precipitado, podendo-se eliminar inclusive a
necessidade do uso de uma centrífuga.
Na precipitação por acção de solventes, o parâmetro crítico na ampliação de escala
do processo é o controlo da transferência de calor para baixar e manter a temperatura baixa
na solução de precipitação. Perdas no rendimento e na qualidade final do produto são
frequentemente verificadas. O processo contínuo, em reactores do tipo CSTR ou de fluxo
tipo pistão, pode apresentar vantagens no controlo desses parâmetros, resultando um

fraccionamento mais preciso e redução de perdas por desnaturação.
Já na precipitação por "salting-out”, as características do precipitado são o factor
fundamental para a adequada ampliação de escala do processo. Nesse caso, manter
constante a potência transmitida por unidade de volume durante a agitação e o tempo do
processo, é recomendável. O objectivo é não modificar a tensão de corte imposta no
agitador, de modo a obter agregados de precipitados de densidade e tamanho constante.
Factores como a concentração do agente de precipitação, pH e temperatura do
processo, obviamente são mantidos constantes no aumento de escala do processo.
5 Ultrafiltração
No caso de proteínas e outros bioprodutos afins nem sempre é conveniente e possível
recorrer à precipitação como processo de concentração devido às potenciais alterações
conformacionais irreversíveis da sua estrutura tridimensional ou desactivação no caso de
enzimas. Por isso, a ultrafiltração (UF) tem sido uma operação muito estudada na
concentração de proteínas, enzimas, anticorpos, hormonas, e outros bioprodutos afins, em
geral, também termolábeis.
A ultrafiltração consiste no transporte de soluções através de membranas com poros
de diâmetros de 0,001 a 0,1 µm, sob pressão transmembranar de 100 a 500 kPa e fluxo de
filtrado de 10 a 200 l/h.m2
, e são usadas para concentrar macromoléculas como proteínas ou
polissacarídeos. Nesse processo, a água e outras moléculas pequenas (menores que os
diâmetros dos poros) passam pela membrana enquanto moléculas com tamanhos superiores
ao diâmetro nominal de separação do poro da membrana (também designado “cut-off”)
ficam retidas no concentrado. “Diâmetro nominal de separação” é a melhor forma de
expressar o tamanho do poro de uma membrana de ultrafiltração. Ele é definido como a
massa molecular mínima de uma molécula globular que é retida pela membrana.1,3,5,16
Os tamanhos dos poros das membranas de ultrafiltração não são uniformes e
apresentam uma distribuição normal ao redor do tamanho médio do poro. A faixa dessa
distribuição varia de acordo com o método de fabricação da membrana e, também, entre
fabricantes. Por isto, o “cut-off” da membrana a ser utilizada deve ser 20% menor que a
massa molecular da proteína alvo mas pode atingir os 50%.5

Concentrar proteínas por ultrafiltração tem várias vantagens, a saber: separar
bioprodutos de caldos fermentados diluídos, promover a concentração de compostos a
baixa temperatura e pressão, possibilitar a retirada de sais e outras moléculas pequenas e
manter constante o pH do meio.5,16
A ultrafiltração pode também ser aplicada para a purificação de proteínas de acordo
com o tamanho das moléculas. Apesar de ser um método atractivo de purificação, na
prática a resolução ou seja a purificação obtida com esta técnica é baixa. Isso ocorre porque
a distribuição do tamanho dos poros não é uniforme, as moléculas lineares passam mais
facilmente pela membrana que as globulares e a concentração de polarização e o “fouling”
reduzem o “cut-off” da membrana.5
O aumento de escala segue os mesmos procedimentos delineados na microfiltração e
no caso de não se saber o fluxo de filtração experimental pode assumir, em termos de
projecto, o valor de 25 l/h.m2
.
6. Extracção com duas fases líquidas imiscíveis
6.1 Extracção com sistemas de duas fases líquidas, uma aquosa e outra de solvente orgânico
A extracção de biomoléculas em sistemas de duas fases líquidas imiscíveis,
constituídas de uma fase aquosa e outra de um solvente orgânico (ex: metilisobutil cetona –
MIK), é utilizada em escala industrial há cerca de 60 anos na purificação de antibióticos,
ácidos orgânicos e outros bioprodutos afins.2
Esta operação unitária tem, em geral, como principal objectivo a concentração dos
bioprodutos na fase de solvente orgânico e eliminação de muitas impurezas também
extracelulares presentes nos meios de fermentação.
A extracção de um dado bioproduto depende essencialmente da sua solubilidade nas
duas fases imiscíveis (orgânica vs aquosa) de acordo com vários factores principais como
sejam: natureza do solvente orgânico, temperatura, pI, pH do meio aquoso, cargas
superficiais, concentração do bioproduto, força iónica, presença de agentes complexantes
como tensioactivos ou detergentes, entre outros. Estes últimos tendem a neutralizar as
cargas dos bioprodutos como moléculas complexas e multifuncionais como os antibióticos

permitindo, desse modo, a sua acumulação na fase orgânica.
O aumento de escala desta operação de concentração resultante da extracção depende
da potência de agitação necessária para dispersar uma fase imiscível na outra, da razão
volumétrica das duas fases a processar, do coeficiente de partição (Kpart) do bioproduto alvo
entre as duas fases imiscíveis e da eficiência com que se separam as duas fases após a
extracção por simples sedimentação ou centrifugação.
Kpart = [Bioproduto]org / [Bioproduto]aq
O rendimento da extracção depende muito do diagrama de fases obtido no equilíbrio
assim como das condições optimizadas na escala laboratorial e piloto que levaram à
maximização do coeficiente de partição.
6.2 Extracção em sistemas de duas fases líquidas aquosas
No caso de bioprodutos serem proteínas, altamente sensíveis à desnaturação do
solvente orgânico, podem ser purificadas em sistemas constituídos por duas fases aquosas
imiscíveis, resultante de uma partição diferenciada da molécula alvo e impurezas entre as
fases líquidas aquosas. O elevado teor de água, 75 a 80% em massa, garante o
microambiente ideal para a manutenção das propriedades biológicas das proteínas. Em
1956, Albertsson17
propôs o uso de sistemas de duas fases aquosas para a purificação de
proteínas e partículas celulares. Desde então, este tipo de extracção tem sido aplicada à
purificação de produtos obtidos em células animais, vegetais e microbianas, na separação
de vírus, organelos e ácidos nucleicos.
Nos sistemas de duas fases líquidas aquosas, a molécula alvo e as impurezas são
também separadas, como resultado de suas diferentes solubilidades nas duas fases líquidas
aquosas imiscíveis. São factores decisivos as propriedades superficiais das proteínas, como
carga eléctrica e hidrofobicidade, além da massa molecular. 1,17
Sistemas de duas fases aquosas são formados pela utilização de determinados
polímeros (ex: dextrano - Dx, polietilenoglicol - PEG) em uma mesma solução ou ainda,
polímeros (ex: PEG) em combinação com solutos de baixa massa molecular (ex: tampões e
sais). Alguns exemplo de sistemas deste tipo de extracção mais comuns são
polietilenoglicol (PEG)/dextrano (Dx), polipropilenoglicol(PPG)/Dx, sulfato de dextrano de

sódio/PPG; PEG/ fosfato de potássio, PEG/sulfato de magnésio, PEG/citrato de sódio.
Actualmente são muito utilizados os sistemas PEG/sal, por apresentarem rápida
separação das fases, baixo custo e, principalmente, maior selectividade na separação deste
tipo de biomoléculas.
O sistema de duas fases aquosas também é representado em um diagrama de fases, no
qual a ordenada representa a composição em massa da molécula que apresenta maior
concentração na fase superior (fase de menor densidade) e a abscissa representa a
composição da molécula de maior concentração na fase inferior (fase de maior densidade).
Composições representadas por pontos acima da curva de equilíbrio levam à formação de
duas fases e, abaixo da curva, a uma só fase. A formação de um sistema de duas fases
aquosas depende, portanto, da concentração dos componentes do sistema. A Figura 11
apresenta a curva binodal de um diagrama de fases em um sistema PEG/fosfato.
Figura 11 - Curva binodal de um sistema PEG/fosfato(% m / m).
No equilíbrio, o sistema de composição inicial M, passa a apresentar as composições
indicadas pelos pontos T (fase superior) e B (fase inferior), de tal modo que ambos os
componentes do sistema estão presentes nas fases líquidas. A recta TMB é chamada linha
de equilíbrio (“tie-line”). Sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma
linha de equilíbrio, possuem a mesma composição final (fases superior e inferior), porém, a
relação de volumes entre as fases é diferente para cada composição inicial e, logo, conduz a
rendimentos de extracção diferentes. A razão entre os segmentos TM e BM é igual à razão
entre os volumes de fase inferior e superior. As diversas linhas de equilíbrio existentes são

paralelas entre si.
Quanto maior for a massa molecular do polímero, menor a concentração necessária
para a formação de duas fases, ou seja, a curva binodal desloca-se no sentido da região
monofásica. Valores de pH, tipo de sal e temperatura também são variáveis que influem a
curva binodal.
A literatura apresenta diagramas de fases para diversos sistemas de duas fases
aquosas, principalmente PEG/dextrano e PEG/sal. Porém, como os diagramas são
específicos para cada sistema e condição (pH, temperatura e massa molecular dos
polímeros), frequentemente é necessário determiná-lo ou comprová-lo
experimentalmente.17
A partição de proteínas ou outras biomoléculas entre as duas fases aquosas imiscíveis
é regida pela condição de menor potencial químico ou maior solubilidade, isto é, a
biomolécula apresentará maior concentração na fase onde seu potencial químico for menor.
Frequentemente, determina-se o coeficiente de partição, Kpart, para avaliação da eficiência
da extracção (equação 16). Esse coeficiente é dado pela relação entre as concentrações de
uma determinada biomolécula nas fases superior e inferior, no equilíbrio. Coeficientes de
partição para a molécula de interesse e para as demais moléculas, significativamente
distintos, indicam ocorrência de purificação.
Kpart= Csi / Cii (16)
onde: Csi = concentração do soluto i na fase superior
Cii = concentração do soluto i na fase inferior
Como as biomoléculas distribuem-se entre as fases em conformidade com suas
solubilidades, características físico-químicas das proteínas (hidrofobicidade e carga
superficial) e da solução (pH e força iónica), serão determinantes para o valor do K.
Por exemplo, para sistemas formados por fosfatos ou sulfatos, a solubilidade das proteínas
é significativamente reduzida pelo mecanismo de “salting-out”, já que concentrações de 0,5
a 2 M são necessárias para o estabelecimento das duas fases. Consequentemente,
deslocamentos da composição do sistema para longe da curva binodal resultam em aumento
do efeito de “salting-out” e, portanto, redução da solubilidade das moléculas, com
consequências sobre os valores de Kpart.17
O tipo de polímero e sua massa molecular também influem no valor de Kpart. Por

exemplo, em sistemas constituídos por PEG de massa molecular superior a 1.500 Da, a
partição de proteínas pode ser favorável à fase salina, devido ao mecanismo da exclusão
molecular. A magnitude desse fenómeno é directamente proporcional à massa molecular
das proteínas.1
A clarificação para remoção de células e seus fragmentos pode ser executada em um
sistema de duas fases aquosas. Como a centrifugação requer valor elevado de Fc (factor de
centrifugação) para promover a sedimentação de sólidos de pequena dimensão, os sistemas
de extracção podem ser vantajosamente aplicados, pois ainda podem reduzir o número de
operações unitárias do processo, já que através de uma etapa de extracção pode-se clarificar
o meio e fraccionar proteínas. As células e seus fragmentos, geralmente localizam-se na
interface do sistema ou na fase líquida inferior.
O equilíbrio é rapidamente atingido após a agitação e mistura dos diferentes
componentes para formação de fases. A completa separação das fases em sistemas
PEG/dextrano requer 5 a 30 minutos, dependendo da concentração e massa molecular do
polímero. Nos sistemas PEG/fosfato esse tempo é inferior a 5 minutos. Embora sejam
intervalos de tempo bastante reduzidos, a separação das fases usualmente é acelerada
através do uso de centrífugas.
A repetida aplicação da extracção em sistemas de duas fases aquosas é recurso
vigoroso na purificação de proteínas. Na purificação de amiloglucosidase extracelular
produzida por Aspergilius awamori, através de uma sequência de duas extracções em
sistemas PEG/fosfato, a maior parte dos contaminantes foi gradativamente extraída na fase
superior, enquanto a enzima permaneceu na fase salina e foi totalmente recuperada.18
Essa
estratégia é particularmente importante na purificação de meios muito complexos, por
exemplo, meios contendo proteínas diversas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e pigmentos
oriundos da rotura celular.
Modificações nos sistemas de duas fases aquosas para a partição de proteínas por
afinidade podem aumentar a resolução na purificação. Normalmente utiliza-se um polímero
ligado a algum componente que tenha afinidade pela proteína de interesse. Por exemplo,
sendo a molécula alvo uma enzima, o substrato pode ser acoplado ao polímero.
No aumento de escala, valores idênticos do coeficiente de partição (Kpart) em relação
à escala de laboratório podem ser obtidos, desde que as composições e proporções dos

volumes de fases sejam mantidas, além da promoção de condições adequadas à completa
homogeneização para que o equilíbrio entre as fases seja atingido. A purificação em
extractores centrífugos, de volumes de 10.000 1itros de meio contendo insulina produzida
em E. coli, tem sido estudada em empresas como a Genentech Inc.19
São diversas as vantagens apresentadas pelos sistemas de duas fases aquosas para a
purificação de proteínas e outras biomoléculas afins: possibilidade de operação contínua em
larga escala à temperatura ambiente; manutenção das proteínas em solução em fases de
polímeros ou sais que as protegem da desnaturação; possibilidade de eliminação de
algumas etapas do processo de purificação para moléculas intracelulares, devido à
extracção de células e seus fragmentos simultânea ao fraccionamento de proteínas e outras
biomoléculas.
7 Processos de purificação de bioprodutos
7.1 Cromatografia
Nos processos cromatográficos, os bioprodutos presentes numa fase líquida são
adsorvidos em um suporte de material poroso. A posterior remoção gradual dos
bioprodutos por acção de uma fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das
diferentes moléculas (Fig. 12).
Figura 12. Ilustração de um processo cromatográfico genérico, onde trA, trB e trC
representam os tempos de retenção das moléculas A, B e C.
A configuração física geral é a de uma fase estacionária (suporte ou matriz sólida)

empacotada em uma coluna, através da qual a fase móvel circula, em geral, com recurso a
uma bomba pistão ou de seringa que cria pressão positiva e empurra o líquido para dentro
da coluna onde contactar com o suporte sólido. A fase estacionária é constituída por um
suporte polimérico poroso, que se apresenta em partículas esféricas de aproximadamente
100 µm, embebidas em um dado solvente, o qual pode constituir a maior parte desta fase
(~90%).
O cromatograma é um gráfico que representa a concentração das biomoléculas no
eluente que sai da coluna, medida em termos de absorvância, por exemplo a 280nm ou
valor do índice de refracção, em função do tempo ou do volume de eluente que passou pela
coluna. O volume que passa pela coluna até o instante de saída de uma certa biomolécula
(instante este representado por uma curva ou pico no cromatograma) é o volume de
retenção, Vr, específico daquela biomolécula. Alternativamente ao volume de retenção,
utiliza-se o tempo de retenção, tr, e relacionados entre si pelo caudal da fase móvel que
atravessa a coluna (Figuras 12 e 13).
Figura 13 Representação ilustrativa de um cromatograma e variáveis típicas de um processo
cromatográfico.
Na Figura 13 representam-se algumas grandezas utilizadas na avaliação do
desempenho de processos cromatográficos. A concentração das biomoléculas A, B e C é
determinada mediante a comparação do valor da área abaixo das respectivas curvas, com os
valores obtidos com uma recta de calibração obtida com a biomolécula pura.
A eficiência da purificação pode ser avaliada em função do grau de separação das
biomoléculas, o qual é denominado resolução cromatográfica, Rs. Na separação de duas

moléculas, A e B, Rs é determinado pelos valores dos tempos de retenção e pela grandeza
Wb (definida na Fig. 12), conforme a equação17:
Rs = (trB - trA) / ((1/2) . (WbA-WbB)) (17)
Para valores de Rs < 1 as biomoléculas são incompletamente separadas; valores de Rs
iguais a 1, as curvas tocam-se nas bases (situação das moléculas A e B na Fig. 12); e para
valores de Rs > 1 as duas moléculas encontram-se totalmente separadas, situação
representada na Figura 12 para as moléculas B e C.
A seguir, descrevem-se os processos cromatográficos industrialmente mais utilizados,
como: a filtração gel ou também designada cromatografia de exclusão molecular, baseada
na separação de moléculas em função do seu volume efectivo na fase móvel, e a troca
iónica, baseada na adsorção das biomoléculas ao adsorvente. Processos como a interação
hidrofóbica10
(baseada na adsorção de zonas mais hidrófobas de biomoléculas sobre
ligandos hidrofóbicos ou alquilicos covalentemente ligados ao suporte cromatográfico) e a
cromatografia de afinidade20
(baseada em interacções especificas entre determinados
resíduos de aminoácidos e ligantes associados à matriz ou, interacções bioquímicas
específicas) vêm ganhando cada vez mais uso e, portanto, também devem ser considerados
no desenvolvimento de um processo de purificação de proteínas e biomoléculas afins.
7.2 Filtração Gel
As diferentes biomoléculas são inicialmente retidas nos poros de uma matriz de
porosidade definida, em função de seu tamanho ou volume efectivo. Moléculas cujo
volume efectivo excede o volume do poro, são expulsas da coluna rapidamente no chamado
volume espacial, Ve, o qual representa o volume de eluente presente nos interstícios da
matriz. Em contrapartida, biomoléculas com volume efectivo mais pequeno em relação ao
volume dos poros, penetram nos mesmos e, em seguida, são arrastadas pelo eluente, o qual
é uma solução tampão adequada à manutenção da estabilidade da biomolécula alvo. Em
face deste comportamento, a ordem de recuperação selectiva das moléculas no fluxo de
eluente tem início com as maiores biomoléculas, prosseguindo em direcção às de menor
dimensão resultando na prática na colecta de fracções de eluente com biomoléculas
diferentes volumes efectivos. As diferentes moléculas são, portanto, excluídas do leito em

função de seu tamanho ou volume efectivo (Fig. 14)
.
Figura 14 Recta calibração de proteínas numa coluna de filtração gel
Condições que resultem da exclusão da biomolécula de interesse (ex: proteína) e
retenção das impurezas (ou vice-versa), são as mais apropriadas. Essas situações
pressupõem diferenças significativas entre o volume efectivo da biomolécula alvo e das
impurezas, o que nem sempre ocorre.
Há vários modelos na literatura que descrevem o mecanismo de separação na
filtração gel em função das dimensões dos poros do gel e tamanho da biomolécula alvo.21
As matrizes para filtração gel de alta resolução são constituídas de polímeros
vinílicos hidrofílicos ou agarose com elevada proporção de ligações cruzadas, em partículas
de 5 a 50 µm. Aumentos de resolução e reduções do tempo de separação são obtidos com o
uso de pequenas partículas.
No desenvolvimento do processo devem ser consideradas as seguintes variáveis: pH e
eluente compatíveis com o produto, selecção do gel com base na sua porosidade e
compatibilidade com o pH a ser adoptado.
7.3 Cromatografia de troca iónica
A cromatografia de troca iónica é das mais frequentemente utilizadas, pois as resinas

empregadas apresentam elevada capacidade de adsorção de biomoléculas (ex: proteínas).
Este é um processo de separação baseado na interacção que zonas de uma
biomolécula têm com os sítios iónicos de carga oposta na matriz sólida. A fase estacionária,
ionicamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e
apresentam cargas de sinais opostos. Para ocorrer a adsorção dos iões da fase móvel na
estacionária, controlam-se factores como pH e força iónica.10
De acordo com o grupo
iónico ligado covalentemente à matriz sólida, os suportes ou adsorventes iónicos são
classificados em aniónicos e catiónicos. Os suportes aniónicos trocam aniões e apresentam,
portanto, grupos iónicos positivos ligados à matriz enquanto os suportes catiónicos,
inversamente, trocam catiões e apresentam grupos iónicos negativos ligados à matriz.1
Após serem adsorvidos à matriz, os bioprodutos podem ser subsequentemente eluídos por
deslocamento competitivo com outros iões, com a mesma carga da proteína adsorvida,
porém com maior força de interacção com a fase sólida estacionária. Os diferentes graus de
interacção electrostática entre o suporte e os iões da fase móvel regem esse tipo de
cromatografia.22
Esse método tem uma aplicabilidade muito ampla, pois considera-se que todas as
biomoléculas (ex: proteínas) são electricamente carregadas quando expostas a um
determinado pH. Mesmo proteínas com pontos isoelétricos idênticos podem ser separadas
de uma mistura, pois o sítio de anexação da proteína à matriz de troca iónica é determinado
pela carga superficial da proteína e a sua proximidade de outras cargas e não pela sua carga
global.3
É comum encontrar condições de adsorção da proteína alvo à matriz, enquanto a
maioria das impurezas, com a mesma carga iónica global, são eluídas.23,24
A matriz de um suporte iónico é constituída de um material poroso, natural ou
sintético, inerte, insolúvel em água e em solventes orgânicos, apresentando ligações
covalentes a grupos funcionais iónicos. Quanto à natureza dos materiais, os adsorventes são
classificadas em inorgânicos e orgânicos, podendo, estes últimos, serem naturais ou
sintéticos. Em geral as resinas orgânicas são mais eficientes, altamente polimerizadas, com
ligações cruzadas e amplamente utilizadas.
A capacidade total de um suporte iónico é medida pela quantidade de moléculas
carregadas na fase móvel, que podem ser adsorvidas por unidade de volume ou massa de
adsorvente. Por exemplo, a capacidade ou massa de proteína adsorvida depende da

porosidade e do tamanho dos poros da resina. Para uma determinada proteína, a capacidade
de adsorção do adsorvente pode ser determinada somente após ensaios laboratoriais. Poros
maiores tornam os sítios carregados mais acessíveis que poros menores, pois facilitam a
difusão de proteínas no interior dos poros do suporte. Nesse caso, o tamanho do poro é
normalmente descrito pelo seu limite de exclusão, isto é, a maior proteína globular (medida
em daltons) que pode ser absorvida pelo poro.10
Os tipos de grupos ligados à matriz classificam os suportes iónicos em fortes, médios
e fracos. Os suportes iónicos fortes são aqueles que estão completamente ionizados em
grande faixa de pH. Os suportes iónicos fracos e médios são aqueles que dependem do grau
de dissociação do grupo funcional ligado covalente à sua estrutura e, logo, a sua capacidade
é influenciada pelo valor do pH na fase móvel. Por outro lado, não há diferença se uma
resina de troca iónica é fraca ou forte em termos de disponibilidade de carga. É importante
notar que os termos “fraco” e “forte” não se referem à interacção de ligação da proteína à
resina e nem à estabilidade da matriz; eles se referem somente à extensão da dissociação
dos grupos funcionais na matriz no sentido clássico da química ácido-base e função do
valor do pH.10,22
A cromatografia de troca iónica é processada de forma descontínua em quatro ou
cinco etapas principais (Fig. 15).
No primeiro caso as etapas são: de carga da amostra, eluição do bioproduto e
regeneração seguida de uma etapa de equilíbrio da fase sólida enquanto, no segundo caso,
há que acrescentar mais uma etapa de lavagem da matriz que antecede a etapa de eluição
para eliminar as impurezas não adsorvidas com utilização dea mesma solução usada
previamente na etapa de equilíbrio do suporte iónico e a eficiência de lavagem pode ser
relacionada com a recuperação da linha de base de absorvância da fase móvel medida por
um espectrofotómetro à saída da coluna.
Na primeira ou duas primeiras etapas (carga e lavagem do adsorvente) a proteína alvo
é adsorvida e impurezas não adsorvidas são eliminadas da fase sólida pela lavagem. Na
etapa de eluição aplica-se um eluente (por exemplo, NaC1 1M) para promover a desorção
da proteína da fase sólida. Na etapa seguinte consiste na desorção e eliminação de todas as
proteínas e outras impurezas que ainda permanecem ligados à coluna através da
regeneração do adsorvente através do uso de agentes alcalinos em soluções salinas (ex:

NaOH 0,5 M em NaCl também 0,5M). Por último, procede-se à etapa de equilíbrio pelo
uso de uma solução tampão de modo a repor o pH e a força iónica que promovem a
máxima adsorção do bioproduto alvo.10
Figura 15. Cromatograma típico de uma coluna com monitorização A280nm.
No aumento de escala de um processo cromatográfico aumenta-se o volume da
coluna. Em geral, o seu comprimento permanece constante, de tal forma que o aumento do
volume do processo implica no aumento do diâmetro da coluna. A velocidade superficial
linear da fase móvel (caudal dividido pela área da secção recta da coluna) deve ser a mesma
nas duas escalas. O grau de resolução cromatográfica e o rendimento do processo são
definidos nas colunas em pequena escala. Se todas as outras variáveis são mantidas
constantes, o desempenho do processo, em maior escala, deverá ser muito próximo àquele
obtido à escala de laboratório.10
O aumento de escala pode então ser estimado de acordo com a massa de
biomoléculas alvo a processar (o produto da concentração da biomolécula alvo pelo volume

a carregar na coluna) em relação à capacidade de adsorção do suporte (g biomolécula/ml ou
g de adsorvente) determinado no laboratório ou escala piloto. Com base na estimativa do
volume de suporte ou adsorvente e fixado a altura da coluna calcula-se o diâmetro da
coluna mas não esquecendo que tem de se manter constante a velocidade superficial linear
(vl) optimizado em pequena escala.
Com base no diâmetro da coluna e da velocidade superficial linear é então possível
calcular o caudal operacional que pode atravessar a coluna à escala industrial.
Qop = vl π D2
/ 4
Nos suportes cromatográficos da Pharmacia à base de géis de agarose os volumes
típicos admitidos à coluna nas 5 etapas principais são, em geral:
- O volume de equilíbrio corresponde, em geral, 3 a 5 volumes de coluna de modo a
garantir que o adsorvente se encontra nas condições ideais (ex: cargas iónicas) para a
adsorção do bioproduto alvo.
- O volume de carga não deve exceder a capacidade de adsorção e, em geral, a nível
industrial não deve conduzir a um rendimento da etapa de adsorção e lavagem inferior 90 -
95%.
- O volume de lavagem com a mesma solução usada na etapa de equilíbrio da coluna
corresponde a cerca de 3 a 5 volumes de coluna para eliminar as impurezas não adsorvidas
e recuperar a linha de base de monitorização da absorvância da fase móvel.
- O volume de eluição do eluente corresponde também a cerca de 3 a 5 volumes da coluna
de modo a fraccionar o bioproduto alvo das outras impurezas que também tinham sido
adsorvidas. Convêm identificar na colecta a fracção de eluente com maior pureza e
concentração em bioproduto alvo e, em geral, a nível industrial também convêm obter um
rendimento de eluição equivalente a 90 a 95% da quantidade de biomolécula adsorvida.
- O volume de regeneração corresponde também entre 2 e 5 volumes de coluna de modo a
garantir que o bioproduto, mas principalmente impurezas, são eliminadas na sua totalidade
da coluna e, desse modo, não afectam negativamente a eficiência da coluna na próxima
etapa de adsorção e eluição do bioproduto alvo.
Com base nestes volumes admitidos à coluna e caudais operacionais pode-se então
estimar os gastos de reagentes e recursos humanos calculando o tempo de ciclo completo
do processo cromatográfico.

tciclo = tcarga + tlavagem + teluição + tregeneração + tequilibrio
Assim, de acordo com o tempo disponível para processar um determinado lote ou
“batch” e o tempo de ciclo completo do processo cromatográfico é então possível calcular o
número de ciclos possíveis efectuar no tempo para processar um “batch”. No caso de ser
possível fazer mais do que um ciclo de cromatografia e o bioproduto em solução está em
condições de elevada estabilidade isto significa que se pode reduzir o volume do adsorvente
e, logo, a coluna estimado anteriormente subdividindo o volume de batch a aplicar pelo
número de ciclo. Esta optimização é importante pois permite diminuir o investimento na
coluna cromatográfica fazendo vários ciclos no tempo disponível entre processamento de
dois lotes de produção consecutivos.
8 Tratamento final
O grau de pureza necessário de um produto biotecnológico depende de sua aplicação
final. A simples secagem de microrganismos cultivados para produção de proteína celular é
suficiente para a sua comercialização. Extractos enzimáticos impuros, ou parcialmente
purificados, podem ser utilizados como catalisadores em conversões químicas industriais
como, por exemplo, na produção de xarope enriquecidos de frutose utilizando a enzima
glucose isomerase. No entanto, uma purificação praticamente total é necessária para grande
parte dos produtos biotecnológicos, especialmente aqueles de uso farmacêutico e analítico.
Neste caso os bioprodutos devem estar puros, secos, cristalinos ou amorfos. Para tanto,
devem ser submetidos a alguns tratamentos finais como a cristalização ou a liofilização.2
A liofilização é o processo de remoção de um solvente, tipicamente a água, de uma
solução por sublimação. Nesse processo a amostra é congelada e, em seguida, submetida a
baixa pressão para sublimação da água livre e os solutos são concentrados na forma sólida e
secos. Como resultado as propriedades físico-químicas (pH, força iónica, viscosidade,
ponto de congelamento, tensão superficial e interfacial) da fase não congelada alteram-se
significativamente. Os materiais liofilizados são apresentados na forma de pó e as
actividades biológicas mantêm-se estáveis por muito mais tempo, quando comparada com a
conservação em solução aquosa. Por esse motivo, muitas proteínas comerciais estão
disponíveis na forma liofilizada. Porém, se a liofilização não for adequadamente planeada

pode ocorrer desnaturação da enzima.3,5
Embora seja uma técnica amplamente empregada
na conservação de muitos materiais, em sua maioria biológicos, há uma série de factores
envolvidos na liofilização, que devem ser manipulados de forma a obter-se um material de
boa qualidade.25
A cristalização é o processo de nucleação e crescimento ou agregação de cristais de
bioprodutos presentes em soluções homogéneas supersaturadas. É uma técnica vulgarmente
utilizada na fase final dos processos de purificação de antibióticos, ácidos orgânicos,
proteínas, entre outras biomoléculas. A cristalização é de grande importância em processos
biotecnológicos, pois permite a armazenagem estável destes bioprodutos durante meses ou
anos. Na etapa final de purificação de bioprodutos estes devem estar em um grau
relativamente elevado de pureza apesar da cristalização pode ocorrer em misturas impuras.
Após a cristalização, o bioproduto (ex: antibiótico) pode ser recuperado por filtração ou
centrifugação seguido de secagem. Bioprodutos cristalizados são estáveis, pois as
moléculas estão imobilizadas. No caso da cristalização de enzimas a partir de soluções
proteicas impuras, por exemplo contaminadas por proteases, têm sua actividade preservada
uma vez que a enzima também cristaliza.2,24
É importante destacar que algumas proteínas podem ser desnaturadas com a
cristalização. Uma alternativa simples é precipitar a proteína com sulfato de amónio e obter
um precipitado amorfo. Esse procedimento proporcionará a maioria das vantagens da
cristalização, excepto que não haverá garantia da inactivação pelas proteases e, ainda, será
necessário remover o sal imediatamente antes da reutilização da proteína.2
Outra opção para
a estabilização de proteínas é mantê-las em glicerol, sorbitol ou sacarose na concentração
de aproximadamente 50% e armazenar a -50ºC. Caso a amostra congele, as proteínas serão
protegidas pelos agentes estabilizantes (ex: glicerol, sorbitol, sacarose, etc) dos danos
causados pelos cristais de gelo formados.24
9 Rotinas analíticas
A percentagem de recuperação e o grau de purificação da biomolécula alvo devem
ser monitorizados em cada etapa do processo de isolamento e purificação.
Rotinas que levam à medição directa de uma certa quantidade de bioproduto (ex:

proteína) presente num determinado volume, isto é, a sua concentração, viabilizam a
determinação de balanços de massa e, portanto, as percentagens recuperadas em cada etapa
do processo. No caso de antibióticos, ácidos orgânicos, e outros bioprodutos similares a sua
quantificação é feita com recursos a processos analíticos simples como métodos
espectrofotométricos, titulação, cromatografia (ex: HPLC, entre outros). No caso de
bioprodutos como as enzimas a sua quantificação indirecta é obtida com relativa facilidade,
quando a biomolécula considerada apresenta actividade biológica específica, como por
exemplo, actividade enzimática ou antigénica.
A actividade enzimática é por definição a velocidade inicial da reacção específica
catalisada pela enzima, determinada em condições padronizadas de pH, temperatura, força
iónica e concentração do substrato; portanto, condições facilmente reprodutíveis. Define-se,
em geral, uma unidade de actividade enzimática como sendo a quantidade de produto
liberado ou substrato consumido (µmol) em um minuto nas condições do ensaio. Dessa
forma, em cada etapa do processo, determina-se a capacidade biológica da molécula
considerada (unidades de actividade enzimática) a qual, associada aos volumes envolvidos,
permite determinar a percentagem recuperada quando comparada com a quantidade
disponível após a etapa isolamento ou purificação anterior.
O exemplo que segue representa um balanço de actividade enzimática realizado em
um processo de extracção em sistema de duas fases aquosas, muito embora os princípios
adoptados neste exemplo, apliquem-se a qualquer outro método de purificação. É frequente
expressar a actividade enzimática especificamente em relação a um volume, Actinicial (U/L),
conforme se apresenta no exemplo que segue. Na equação 18, Vinicial refere-se ao volume de
meio contendo enzima e impurezas, a ser submetido à extracção, e o termo ACTinicial,
representa a actividade enzimática total contida no meio.
ACTinicial (U) = Actinicial (U / L) x Vinicial (L) (18)
Após a extracção, a enzima distribui-se entre os volumes das fases superior, Vfase
superior e inferior, Vfase inferior em conformidade com sua solubilidade, conforme foi discutido
anteriormente. A actividade enzimática total, ACT, em cada fase pode ser determinada
pelas equações 19 e 20.
ACTfase superior (U) = Actfase superior (U / L) x Vfase superior (L) (19)
ACTfase inferior (U) = Actfase inferior (U / L) x Vfase inferior (L) (20)

As percentagens recuperadas e extraídas em cada fase, atingido o equilíbrio, Rfase superior e
Rfase inferior podem ser determinadas através da equação 21, onde ACTfase representa a
actividade enzimática na fase considerada.
R(%)=ACTfase / ACTinicial x100 (21)
Eventuais perdas do produto, físicas ou por desnaturação, são determinadas através da
equação 22. Tais perdas, é importante frisar, podem ocorrer em qualquer etapa do processo
de purificação de enzimas.
ACTperda = ACTinicial - ACTfase superior - ACTfase inferior (22)
A purificação refere-se à variação da fracção da biomolécula alvo em relação às
outras impurezas, isto é, razão da concentração do bioproduto alvo em relação à
concentração das impurezas. Um aumento dessa fracção significa o enriquecimento do
meio em relação à biomolécula alvo.
Quando a biomolécula é uma enzima, a pureza em cada etapa pode ser definida como
sendo a razão entre a actividade enzimática Act (U/ml) e a concentração de proteína total,
[Prot] (mg/ml), razão essa também denominada actividade específica, Actesp (equação 23).
Nesse caso, o grau de pureza, GP, será dado pela variação do valor de Actesp entre duas
etapas de isolamento ou purificação consecutivas ou reportada em relação ao meio inicial,
conforme se descreve na equação 24:
Actesp (U/mg)= Act / [Prot] (23)
GP = Actesp i / Actesp o (24)
onde: Actesp i = actividade específica em uma certa etapa do processo
Actesp o = actividade específica no meio inicial
A determinação de concentração total de proteína é possível com recurso a vários
métodos analíticos, por exemplo, biureto-reagente alcalino de cobre; Lowry-Folin-
Ciocalteau; absorção de raios UV a 280nm (aminoácidos aromáticos) ou a 205-220nm
(peptídeos); ácido bis-cincrônico; Bradford, Biureta, etc. Cada um desses métodos baseia-
se em princípios diferentes, razão pela qual os resultados obtidos não são iguais e, portanto,
não devem ser comparados. Além disso, mesmo que se adopte uma única metodologia, o
resultado obtido somente expressará a verdadeira concentração de proteínas se a curva de
calibração for determinada com solução de proteínas de composição idêntica à solução
alvo.26
Para minimizar esta situação usa-se uma proteína como a Albumina de Soro Bovino

(BSA), como proteína padrão (“standard”).
No caso de purificação de proteínas, a electroforese é rotina comum no
acompanhamento de processos de purificação. Consiste na separação das proteínas por
acção de um campo eléctrico que força o movimento das moléculas electricamente
carregadas através de um gel de poliacrilamida ou agarose. As proteínas apresentam
mobilidade em conformidade com sua carga total, massa molecular e intensidade do campo
eléctrico. Segue-se a detecção, a qual compreende a coloração das proteínas distribuídas
sobre o gel, geralmente com o corante “Coomassie Brilliant Blue”, embora outros corantes
possam ser utilizados. Como resultado, visualiza-se uma sequência de traços (bandas) azuis
e supõe-se que a cada banda corresponda uma proteína. A introdução de padrões permite
estimar a massa molecular das proteínas da amostra, bem como identificar a banda
correspondente à proteína alvo. O número de bandas obtidas está directamente relacionado
à pureza da amostra e, portanto, a uma completa purificação corresponde uma única banda,
relativa à biomolécula alvo.27
A análise electroforética da Figura 16 representa a evolução
da concentração intracelular de uma proteína heteróloga (troponina C) no cultivo de
Escherichia coli.
Figura 16 Gel de electroforese típico indicando a evolução da acumulação da proteína
intracelular troponina C (TnC) em Escherichia coli. À esquerda do gel estão indicadas as
massas moleculares dos padrões (kDa) e abaixo, o tempo de cultivo em horas.
Ao lado das rotinas de monitorização de um processo de purificação, deve-se
também adoptar rotinas destinadas a determinar as principais características das moléculas

presentes no meio a ser purificado. Essa caracterização do meio deverá nortear a selecção
adequada de operações do processo de purificação.
Um procedimento básico consiste no fraccionamento das proteínas presentes no meio
em um sistema de filtração gel preparativa, isto é, um sistema capaz de processar volumes
da ordem de vários mililitros. A aplicação de rotinas específicas para a detecção da
molécula alvo nas diversas fracções, associada à determinação da concentração de proteína
total em cada fracção, permite determinar a proporção em massa das moléculas que
constituem as impurezas.
Impurezas de massa molecular significativamente distintas em relação à massa
molecular da molécula alvo, podem ser eliminadas por filtração gel ou ultrafiltração. A
massa molecular pode ser estimada de duas formas: através de uma curva de calibração
(Fig 14) com moléculas de massas moleculares conhecidas no sistema de filtração gel
acima mencionado (são variáveis desta curva, a massa molecular ou volume efectivo das
moléculas e o volume de eluição de cada uma delas); injectando-se no gel de electroforese
moléculas de massa molecular conhecida juntamente com as fracções obtidas na filtração
gel.
Grandes diferenças entre a solubilidade da molécula alvo e impurezas, são um
indicativo de que métodos como a extracção em sistemas de duas fases aquosas ou
precipitação devem ser explorados. Uma forma simples de avaliar a solubilidade de
proteínas é submetê-las à precipitação com (NH4)2SO4. As proteínas que exigirem menor
concentração do sal para precipitarem totalmente, são as de menor solubilidade. Assim, é
possível ordenar as moléculas fraccionadas na filtração gel preparativa de acordo com a sua
ordem de solubilidade.
A cromatografia de troca iónica é das mais utilizadas, devido ao elevado poder de
resolução e capacidade de processamento. A opção por esta cromatografia obviamente deve
considerar a capacidade de adsorção das moléculas sobre uma determinada resina catiónica
ou aniónica. Essa capacidade é determinada através de curvas de titulação electroforética.
Na curva de titulação electroforética, determina-se a velocidade de migração de uma
proteína, denominada mobilidade, em um campo eléctrico sob determinadas condições
(temperatura, tampão, composição do gel). Trata-se de uma electroforese conduzida em um
gel que apresenta um gradiente de pH formado entre um cátodo e um ânodo, estando o

cátodo sob valor de pH maior em relação ao ânodo. As proteínas, por apresentarem carácter
anfotérico, terão carga positiva sob valores de pH abaixo de seu ponto isoeléctrico (pI) e
carga negativa sob valores de pH acima do ponto isoelétrico. Dessa forma, onde quer que
as proteínas estejam em relação ao gradiente de pH, elas migrarão em direcção ao seu ponto
isoelétrico em conformidade com a sua carga. Proteínas com mobilidades electroforéticas,
isto é, distâncias percorridas, muito diferentes na região de valores de pH abaixo do pI
provavelmente sofrerão separação eficiente em uma resina trocadora de catiões.27
10 O processo integrado de purificação
Conforme mencionou-se anteriormente, as etapas iniciais do processo de purificação
compreendem as operações unitárias, destinadas à remoção de células e seus fragmentos
celulares seguidas de operações de concentração e purificação da biomolécula alvo. A
determinação das características do produto e das principais impurezas é fundamental no
sucesso da selecção das operações subsequentes de purificação propriamente dita, uma vez
que o fraccionamento está baseado nas propriedades físico-químicas das moléculas
envolvidas (Tabela 2).
Tabela 2 Características relevantes de microrganismos e seus produtos ao processo de
purificação em escala industrial.
Operação unitária Características determinantes
Centrifugação Densidade e tamanho das células; viscosidade do meio
Filtração convencional Compressibilidade e tamanho das células
Microfiltração Tamanho das células ou partículas
Homogeneização de alta
pressão
Resistência física da parede celular ao gradiente de
pressão
Moinho de bolas Resistência física da parede celular à tensão de corte
Extracção e precipitação Solubilidade de proteínas
Cromatografia de troca
iónica
Mobilidade electroforética de proteínas
Ultrafiltração, filtração gel Massa molecular
Alguns critérios norteiam a escolha das operações de clarificação e homogeneização
de alta pressão. Grandes volumes de suspensões de leveduras são eficientemente
clarificados por centrifugação enquanto para volumes moderados de suspensões bacterianas

uma comparação entre a centrifugação e a filtração tangencial merece ser efectuada.
Microrganismos filamentosos, por outro lado, são clarificados através de filtração
convencional, devido à reduzida velocidade de sedimentação destes organismos de baixa
densidade e elevada viscosidade associadoa este tipo de suspensões celulares.
A modificação da estrutura de moléculas é um recurso importante para o aumento do
poder de resolução de determinadas operações de purificação e, consequentemente, redução
do número de etapas envolvidas.28
Por exemplo, a introdução de sequências terminais à
estrutura da proteína alvo que a transferiram e acumulem no espaço periplásmico e
implementação destas modificações via engenharia genética, possibilita a extracção apenas
das moléculas do espaço periplásmico, o que significa menor contaminação do bioproduto
alvo.
A adsorção em leito expandido tem sido cada vez mais adoptada, pois possibilita a
redução do número de etapas, uma vez que a captura de proteínas se dá a partir de meios
que contêm partículas, procedimento que viabiliza a clarificação de uma suspensão ou de
um homogeneizado de células e a purificação da molécula alvo em uma única operação.
Além disso, a redução do tempo de processamento diminui a possibilidade de hidrólise da
molécula alvo por acção de proteases, normalmente presentes quando se trata de produtos
intracelulares.30
A caracterização prévia do produto e impurezas, descrita anteriormente, é
fundamental à selecção das operações de purificação, pois quanto mais reduzido for o
número do reduzido número destas operações menor é o custo do processo e maior é o
rendimento do produto.
Além da caracterização das moléculas, também devem ser consideradas
características inerentes às operações. Por exemplo, na filtração gel ocorre diluição
significativa, isto é, a concentração das moléculas nas fracções colectadas é menor que a
concentração na amostra injectada na coluna. Por essa razão, a filtração gel é empregada na
última etapa de um processo de purificação, pois ao contrário, acarretaria aumento do
volume de meio a ser tratado ao longo do processo. No final do processo, pode-se empregar
a ultrafiltração para ajuste da concentração. A cromatografia de troca iónica, ao contrário
da filtração gel, promove o aumento da concentração das moléculas.
Em resumo, pode-se dizer que o sucesso técnico e económico do processo de

produção de um bioproduto alvo está relacionado à selecção adequada das técnicas de
isolamento e purificação e da ordem de aplicação das mesmas. As seguintes regras gerais
podem ser consideradas para uma abordagem inicial do problema: escolha de processos de
purificação baseados nas diferenças apresentadas em uma dada propriedade físico-química
das moléculas (produto e impurezas); remoção das impurezas presentes em maior
concentração nas etapas iniciais do processo; aplicação de técnicas de alta resolução em
relação ao produto, nas etapas finais do processo.31

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