O documento discute os principais conceitos e técnicas da histologia, incluindo a definição de histologia, os principais tipos de tecidos, as etapas para preparação de lâminas histológicas e os diferentes tipos de microscopia utilizados para análise de tecidos.
2. O termo histologia foi usado pela primeira
vez em 1819 por Mayer
Mayer fez a conjunção do termo histos =
tecido e logos = estudo.
Tecido
Um conjunto de células que apresentam
mesma forma, mesma função e mesma
origem embrionária?
Não possui muita sustentação histológica-
3. O sangue:
hemácia (disco bicôncavo, anucleado na
maioria dos animais domésticos)- transporta
oxigênio e gás carbono
neutrófilo- é uma célula fagocitadora.
TECIDO é um conjunto de células que
apresentam a mesma função geral e a mesma
origem embrionária.
4. Espermatozóide e o óvulo – fecundação –
zigoto
sucessivas mitoses- clivagem. Cada célula é
chamada de blastômero (totipotentes)
Mórula
Blástula
Gástrula- Ectoderma, endoderma
A partir do endoderma forma-se o
mesoderma
5. Ectoderma forma-se o tecido nervoso e
alguns epitélios de revestimento;
Mesoderma origina-se a maioria dos tecidos
conjuntivos e musculares;
Endoderma alguns epitélios de revestimento.
7. Os tecidos são constituídos por células e
matriz extracelular
A matriz extracelular - fibrilas de colágeno e
membranas basais.
pesquisa biomédica - células produzem a
matriz extracelular mas são influenciadas e
controladas por moléculas da matriz.
8. Células e matriz extracelular formam uma
entidade continua que funcionam
conjuntamente e reagem frente a estímulos e
inibidores.
O tamanho pequeno das células e dos
componentes de matriz torna a histologia
dependente do uso de microscópios.
9. O método mais utilizado em Histologia é o
preparado histológico permanente (lâmina
histológica) estudado em microscópio óptico.
Os tecidos devem ser seccionados para se
obterem cortes delgados
Micrótomo -
Artefatos- distorções e perda de
componentes celulares
1ª ) Coleta da Amostra
10. a) Biópsia cirúrgica
b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos
(estômago, intestino, etc) através de endoscopia;
c) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é
obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão),
sem precisar abrir a cavidade natural;
d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra
corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou
órgãos (ex. mama, útero);
e) Necrópsia.
11. 2º) Fixação- pode ser:
Químicas- para microscopia óptica- solução isotônica
tamponada de formaldeído a 4%. Microscópio eletrônico-
solução de glutaraldeído tamponado, seguida por uma
segunda fixação em tetróxido de ósmio,
físicos- utilizando-se o calor ou o frio.
O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da
peça, constituição do tecido, poder de fixação do fixador,
objetivos a pesquisar e temperatura ambiente.
De forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma
espessura de 4 mm o tempo mínimo de fixação é de doze
(12) horas.
Obs: Para que se possa examinar o tecido ósseo ou tecido
com áreas de calcificação, deve-se antes de processá-lo,
incluí-lo e cortá-lo, proceder à descalcificação .
12. a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no
fixador;
b) O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes (10
X) maior que o volume da peça coletada.
Objetivos da fixação:
a) Inibir ou parar a autólise tecidual;
b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as
substâncias insolúveis;
c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles
no manuseio e procedimentos técnicos posteriores;
d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares;
e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos;
f) Facilitar a subsequente coloração.
13. 3ª) Processamento:
Para que o grau de firmeza seja atingido, o
tecido deve ser completamente impregnado com
algum meio de sustentação que manterá juntas
as células e as estruturas intercelulares.
Os materiais de sustentação usados são
denominados materiais de inclusão.
Certos materiais de inclusão, tais como
“Carbowax” e a gelatina são solúveis em água e
os tecidos não precisam ser desidratados antes
do uso.
14. 4ª) Desidratação- imergindo o bloco de
tecido em concentrações crescentes de álcool
etílico.
O álcool é o agente mais utilizado (70% - 80%
- 90% - 100%) para se evitar a retração
pronunciada do tecido ocasionando lesões
estruturais da célula de caráter irreversível.
O álcool endurece mais o tecido.
O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes
maior que o volume da peça.
15. 5ª) Diafanização (Clarificação) - consiste na
infiltração do tecido por um solvente da parafina
que seja ao mesmo tempo desalcolizante.
A parafina não se mistura com água e nem com
álcool. Ambos devem ser completamente
removidos para que a parafina possa penetrar
eficientemente no tecido.
O xilol é comumente utilizado. É chamado de
agente clarificador porque torna o tecido semi-
translúcido, quase transparente.
Os reagentes mais utilizados são: toluol,
clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de
metila.
16. 6ª) Inclusão (Impregnação)
A finalidade é eliminar completamente o xilol
contido no material e a total penetração da
parafina nos vazios deixados pela água e
gordura, antes existentes no tecido.
Este processo serve também para preparar o
material para os cortes, removendo o
clarificante e endurecendo-o suficientemente
e dando-lhe a consistência adequada para
que possa ser cortado.
17. 7ª) Microtomia
Para se obter cortes de material incluído em parafina
ou por congelação é necessário um instrumento
especial: o micrótomo.
8ª) Colagem do Corte à Lâmina
As fitas de cortes de parafina são estiradas
cuidadosamente e os cortes individuais são
separados por um bisturi.
Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um
ponto de aderência (normalmente com albumina de
ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-
maria (água morna) de forma que as dobras
provocadas pelo corte no tecido desapareçam.
18. 9º) Coloração
Dentre todos os corantes, a combinação de
hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente
usada.
A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo
das células e outras estruturas acidas (como
porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz
da cartilagem hialina).
A eosina- cora o citoplasma e o colágeno em
cor-de-rosa.
Antes que o corte seja corado, a parafina em que
ele foi incluído deve ser removida.
20. 10ª ) Montagem
Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada,
ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para
remover, de novo, a água.
Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser montado em
um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os
cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá).
Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a
lamínula é posicionada sobre o corte de forma delicada, de uma
forma tal que o meio de montagem cubra completamente o
corte.
Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o
meio de montagem se espalha formando uma delgada película
entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar
firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de
montagem.
21. MICROSCOPIA DE LUZ - preparações coradas
são examinadas por iluminação que atravessa
o espécime.
Resolução- a menor distancia entre duas
partículas ou duas linhas que permite que
elas sejam vistas como dois objetos
separados.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DE
CONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA-
permitem a observação de células e cortes
não corados.
22. MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO- raios de luz
passam através de um filtro polarizador (como
um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma
só direção.
MICROSCOPIA CONFOCAL- ele torna possível
focalizar um plano de foco muito delgado do
espécime.
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA- Substancias
fluorescentes com afinidade por moléculas
presentes nas células ou na matriz podem set
usadas como corantes fluorescentes, como o
alaranjado de acridina, que pode combinar-se
com o DNA e o RNA.
23. Microscopia Eletrônica de Transmissão-
Técnicas de congelação permitem o exame
de tecidos por microscopia eletrônica sem a
necessidade de fixação e inclusão em resina.
Com estas técnicas ha menos artefatos.
Tecidos congelados podem ser seccionados e
submetidos a técnicas citoquímicas
imunocitoquímicas ou podem ser fraturados
(criofratura, freeze fracture) para fornecer
detalhes da estrutura interna de membranas
celulares.
24. Microscopia Eletrônica de Varredura- fornece
imagens pseudotridimensionais das
superfícies de células, tecidos e órgãos.
Mostra somente uma visão de superfícies.
O interior de órgãos pode ser analisado
congelando células ou órgãos e em seguida
fraturando-os para expor as suas superfícies
internas.
25. RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE
TECIDOS- permite a localização de
substancias radioativas em tecidos pelo efeito
de sua radiação em emulsões fotográficas.
Precursores- aminoácidos radioativos,
nucleotídeos radioativos, açucares radioativos
etc.
26. CULTURA DE CELULAS E TECIDOS
As células e os tecidos são cultivados em soluções de
composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) as
quais são frequentemente adicionados componentes do
soro.
As células devem ser inicialmente separadas
mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático.
Culturas primarias- células cultivadas em suspensão ou
sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro,
superfícies sobre as quais elas costumam aderir e crescer
sob forma de uma única camada de células.
Transformação- oncogênes
27. A cultura de células tem sido extensamente
usada para o estudo do metabolismo de
células normais e cancerosas e para o
desenvolvimento de novos fármacos.
Esta técnica também é útil para o estudo de
microorganismos que só crescem no interior
de células, como os vírus, micoplasma e
alguns protozoários.
Em citogenética, a determinação do cariótipo
pode ser realizada pelo cultivo de linfócitos
do sangue ou de fibroblastos da pele.
28. FRACIONAMENTO CELULAR- processo físico pelo
qual e usada forca centrifuga para separar
organelas e componentes celulares em função de
seus coeficientes de sedimentação.
HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA- métodos que
identificam e localizam substancias tanto em
cortes histológicos como em células cultivadas.
Estes métodos normalmente originam
substancias
insolúveis coloridas ou eletro-densas, que
permitem a
localização de átomos ou moléculas por
microscopia de luz ou eletrônica.
29. Muitos procedimentos histoquímicos são usados
em diagnostico laboratorial.
A reação de Perls para ferro, as reações de PAS-
amilase para glicogenio e Alcian blue para
glicosaminoglicanas são habitualmente aplicadas
a biopsias de tecidos de pacientes em que se
quer diagnosticar doenças em que se acumulam
nos tecidos quantidades elevadas de ferro (por
exemplo, hemocromatose, hemossiderose),
glicogênio (glicogenoses), glicosaminoglicanas
(mucopolissacaridoses) e esfingolipídios
(esfingolipidoses).
30. Marcadores- podem ser visto por meio d e
um microscópio de luz ou eletrônico
Os marcadores mais usados são:
substancias fluorescentes
átomos radioativos
Moléculas de enzimas como a peroxidase
metais (geralmente partículas de ouro).
31. Imunocitoquímica- uma interação altamente
especifica entre moléculas e aquela que
ocorre entre um antígeno e seu anticorpo.
HIBRIDIZACAO IN SITU -é excelente para
averiguar se uma célula tem uma sequencia
especifica de DNA
32. Distorções e Artefatos Causados pelo Processamento dos
Tecidos
A Totalidade do Tecido- uma grande dificuldade
apresentada por cortes de microscopia de luz é a
impossibilidade de se corar diferencialmente todos os
componentes das células e tecidos em um só preparado.
Duas Dimensões e Três Dimensões- quando uma
estrutura tridimensional e cortada em secções muito
delgadas, as secções parecem ter só duas dimensões:
comprimento e largura.
Isto frequentemente conduz o observador a erros se ele
não se conscientizar de que uma esfera seccionada se
parece com um circulo e que um tubo seccionado se
parece com um anel