Histologia1

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Histologia1

  1. 1. Profª. Dr. Deuzuitadeuzuitasantos@globo.com
  2. 2.  O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer Mayer fez a conjunção do termo histos = tecido e logos = estudo. Tecido Um conjunto de células que apresentam mesma forma, mesma função e mesma origem embrionária? Não possui muita sustentação histológica-
  3. 3.  O sangue: hemácia (disco bicôncavo, anucleado na maioria dos animais domésticos)- transporta oxigênio e gás carbono neutrófilo- é uma célula fagocitadora. TECIDO é um conjunto de células que apresentam a mesma função geral e a mesma origem embrionária.
  4. 4.  Espermatozóide e o óvulo – fecundação – zigoto sucessivas mitoses- clivagem. Cada célula é chamada de blastômero (totipotentes) Mórula Blástula Gástrula- Ectoderma, endoderma A partir do endoderma forma-se o mesoderma
  5. 5.  Ectoderma forma-se o tecido nervoso e alguns epitélios de revestimento; Mesoderma origina-se a maioria dos tecidos conjuntivos e musculares; Endoderma alguns epitélios de revestimento.
  6. 6. EpitelialConjuntivoMuscularnervoso
  7. 7.  Os tecidos são constituídos por células e matriz extracelular A matriz extracelular - fibrilas de colágeno e membranas basais. pesquisa biomédica - células produzem a matriz extracelular mas são influenciadas e controladas por moléculas da matriz.
  8. 8.  Células e matriz extracelular formam uma entidade continua que funcionam conjuntamente e reagem frente a estímulos e inibidores. O tamanho pequeno das células e dos componentes de matriz torna a histologia dependente do uso de microscópios.
  9. 9.  O método mais utilizado em Histologia é o preparado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico. Os tecidos devem ser seccionados para se obterem cortes delgados Micrótomo - Artefatos- distorções e perda de componentes celulares 1ª ) Coleta da Amostra
  10. 10.  a) Biópsia cirúrgica b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc) através de endoscopia; c) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade natural; d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero); e) Necrópsia.
  11. 11.  2º) Fixação- pode ser: Químicas- para microscopia óptica- solução isotônica tamponada de formaldeído a 4%. Microscópio eletrônico- solução de glutaraldeído tamponado, seguida por uma segunda fixação em tetróxido de ósmio, físicos- utilizando-se o calor ou o frio. O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da peça, constituição do tecido, poder de fixação do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente. De forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma espessura de 4 mm o tempo mínimo de fixação é de doze (12) horas. Obs: Para que se possa examinar o tecido ósseo ou tecido com áreas de calcificação, deve-se antes de processá-lo, incluí-lo e cortá-lo, proceder à descalcificação .
  12. 12.  a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador; b) O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes (10 X) maior que o volume da peça coletada. Objetivos da fixação: a) Inibir ou parar a autólise tecidual; b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis; c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores; d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares; e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; f) Facilitar a subsequente coloração.
  13. 13.  3ª) Processamento: Para que o grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado com algum meio de sustentação que manterá juntas as células e as estruturas intercelulares. Os materiais de sustentação usados são denominados materiais de inclusão. Certos materiais de inclusão, tais como “Carbowax” e a gelatina são solúveis em água e os tecidos não precisam ser desidratados antes do uso.
  14. 14.  4ª) Desidratação- imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico. O álcool é o agente mais utilizado (70% - 80% - 90% - 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O álcool endurece mais o tecido. O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.
  15. 15.  5ª) Diafanização (Clarificação) - consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina não se mistura com água e nem com álcool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol é comumente utilizado. É chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi- translúcido, quase transparente. Os reagentes mais utilizados são: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila.
  16. 16.  6ª) Inclusão (Impregnação) A finalidade é eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes existentes no tecido. Este processo serve também para preparar o material para os cortes, removendo o clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada para que possa ser cortado.
  17. 17.  7ª) Microtomia Para se obter cortes de material incluído em parafina ou por congelação é necessário um instrumento especial: o micrótomo. 8ª) Colagem do Corte à Lâmina As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi. Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho- maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam.
  18. 18.  9º) Coloração Dentre todos os corantes, a combinação de hematoxilina e eosina (HE) é a mais comumente usada. A hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas acidas (como porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz da cartilagem hialina). A eosina- cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa. Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida.
  19. 19. Existe um grande número de técnicas.
  20. 20.  10ª ) Montagem Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada, ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para remover, de novo, a água. Finalmente, o corte é banhado em xilol antes de ser montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá). Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada sobre o corte de forma delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte. Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se espalha formando uma delgada película entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de montagem.
  21. 21.  MICROSCOPIA DE LUZ - preparações coradas são examinadas por iluminação que atravessa o espécime. Resolução- a menor distancia entre duas partículas ou duas linhas que permite que elas sejam vistas como dois objetos separados. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE E DECONTRASTE DIFERENCIAL DE INTERFERENCIA- permitem a observação de células e cortes não corados.
  22. 22.  MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO- raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um filtro Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção. MICROSCOPIA CONFOCAL- ele torna possívelfocalizar um plano de foco muito delgado do espécime. MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA- Substancias fluorescentes com afinidade por moléculas presentes nas células ou na matriz podem set usadas como corantes fluorescentes, como o alaranjado de acridina, que pode combinar-se com o DNA e o RNA.
  23. 23.  Microscopia Eletrônica de Transmissão- Técnicas de congelação permitem o exame de tecidos por microscopia eletrônica sem a necessidade de fixação e inclusão em resina. Com estas técnicas ha menos artefatos. Tecidos congelados podem ser seccionados e submetidos a técnicas citoquímicas imunocitoquímicas ou podem ser fraturados (criofratura, freeze fracture) para fornecer detalhes da estrutura interna de membranas celulares.
  24. 24.  Microscopia Eletrônica de Varredura- fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células, tecidos e órgãos. Mostra somente uma visão de superfícies. O interior de órgãos pode ser analisado congelando células ou órgãos e em seguida fraturando-os para expor as suas superfícies internas.
  25. 25.  RADIOAUTOGRAFIA EM SECÇÕES DE TECIDOS- permite a localização de substancias radioativas em tecidos pelo efeito de sua radiação em emulsões fotográficas. Precursores- aminoácidos radioativos, nucleotídeos radioativos, açucares radioativos etc.
  26. 26.  CULTURA DE CELULAS E TECIDOS As células e os tecidos são cultivados em soluções de composição conhecida (sais, aminoácidos, vitaminas) as quais são frequentemente adicionados componentes dosoro. As células devem ser inicialmente separadas mecanicamente ou por meio de tratamento enzimático. Culturas primarias- células cultivadas em suspensão ou sobre uma placa de Petri ou sobre uma lamínula de vidro, superfícies sobre as quais elas costumam aderir e crescer sob forma de uma única camada de células. Transformação- oncogênes
  27. 27.  A cultura de células tem sido extensamente usada para o estudo do metabolismo de células normais e cancerosas e para o desenvolvimento de novos fármacos. Esta técnica também é útil para o estudo de microorganismos que só crescem no interior de células, como os vírus, micoplasma e alguns protozoários. Em citogenética, a determinação do cariótipo pode ser realizada pelo cultivo de linfócitos do sangue ou de fibroblastos da pele.
  28. 28.  FRACIONAMENTO CELULAR- processo físico pelo qual e usada forca centrifuga para separar organelas e componentes celulares em função de seus coeficientes de sedimentação. HISTOQUÍMICA E CITOQUÍMICA- métodos que identificam e localizam substancias tanto em cortes histológicos como em células cultivadas. Estes métodos normalmente originam substanciasinsolúveis coloridas ou eletro-densas, que permitem alocalização de átomos ou moléculas por microscopia de luz ou eletrônica.
  29. 29.  Muitos procedimentos histoquímicos são usados em diagnostico laboratorial. A reação de Perls para ferro, as reações de PAS- amilase para glicogenio e Alcian blue para glicosaminoglicanas são habitualmente aplicadas a biopsias de tecidos de pacientes em que se quer diagnosticar doenças em que se acumulam nos tecidos quantidades elevadas de ferro (por exemplo, hemocromatose, hemossiderose), glicogênio (glicogenoses), glicosaminoglicanas (mucopolissacaridoses) e esfingolipídios (esfingolipidoses).
  30. 30.  Marcadores- podem ser visto por meio d e um microscópio de luz ou eletrônico Os marcadores mais usados são: substancias fluorescentes átomos radioativos Moléculas de enzimas como a peroxidase metais (geralmente partículas de ouro).
  31. 31.  Imunocitoquímica- uma interação altamente especifica entre moléculas e aquela que ocorre entre um antígeno e seu anticorpo. HIBRIDIZACAO IN SITU -é excelente para averiguar se uma célula tem uma sequencia especifica de DNA
  32. 32.  Distorções e Artefatos Causados pelo Processamento dos Tecidos A Totalidade do Tecido- uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente todos os componentes das células e tecidos em um só preparado. Duas Dimensões e Três Dimensões- quando uma estrutura tridimensional e cortada em secções muito delgadas, as secções parecem ter só duas dimensões: comprimento e largura. Isto frequentemente conduz o observador a erros se ele não se conscientizar de que uma esfera seccionada se parece com um circulo e que um tubo seccionado se parece com um anel

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