1. CONTROLE BACTERIANO DE
Pesquisa
EFLUENTES
Controle biológico bacteriano e tratamento de efluentes através do uso de bacteriófagos
Mariana Roberta dos Reis Introdução que permitam a sua reutilização segu-
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC,
Sorocaba; Departamento de Microbiologia e ra sem causar processos de morbidade
Imunologia, Instituto de Biologia aumento populacional, jun- à saúde e/ou mortalidade.
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
marianarreis@aol.com
tamente com o crescimento A implantação de uma estação de
desordenado das cidades, tratamento de efluentes (ETE) tem
Elisabeth Pelosi Teixeira
Dra. Departamento de Saúde
tem levado, paulatinamente, ao des- por objetivo reduzir a carga
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC gaste qualitativo e ao consumo contaminante ou poluente das águas
epelosi@uol.com.br irreversível das fontes de abasteci- residuárias, de modo que o efluente
Wanderley Dias da Silveira mento, incluindo, aqui, as fontes final tratado possa retornar para o
Ph.D.Departamento de Microbiologia e Imunologia, aqüíferas para consumo, uso domésti- corpo d’água, sem provocar a degra-
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas. co e agricultura. O esgoto urbano bru- dação do meio e não causar riscos à
wds@unicamp.br to é resultante dos despejos domésti- saúde do homem (BORSOI et al.,
Ilustrações cedidas pelos autores cos e industriais, o qual lançado num 2002; Von SPERLING, 1996).
manancial contribui para sua degrada- O presente trabalho relata o uso
ção, afetando sua qualidade (JORDÃO de bacteriófagos (fagos líticos), vírus
et al., 1995). que lisam bactérias, como método
Assim, com a finalidade de pou- para a redução de número de unida-
par as fontes naturais, a água já utiliza- des formadoras de colônias (UFC) de
da por seres humanos para consumo bactérias potencialmente patogênicas
próprio, ou outras finalidades, deve para os seres humanos e presentes em
passar por processos de tratamento estações de tratamento de esgotos
(ETE), com o objetivo de minimizar
possíveis processos de morbi-mortali-
dade causadas por essas mesmas bac-
térias quando da utilização da água
para consumo.
A principal vantagem de utilizar
fagos líticos como controle bacterioló-
gico, e ferramenta complementar em
tratamento de efluentes nas ETEs resi-
de na propriedade que eles possuem
de se replicarem apenas na presença
de seu hospedeiro específico, levan-
do à lise celular bacteriana com produ-
ção de novos fagos, os quais mantêm
seu ciclo de lise enquanto existirem
células bacterianas disponíveis para
Gráfico: Mariana Roberta dos Reis sua replicação, o que deverá, teorica-
mente, levar a uma diminuição pro-
Figura 1: Curva de avaliação de morte celular bacteriana de Staphylococcus aureus gressiva dos possíveis contaminantes
(Sa), determinada através da contagem de UFC. A: Curva controle contendo apenas bacterianos presentes as ETEs (DAVIS
Sa. B: Curva Sa contendo fago não mutante. C: Curva Sa’ contendo fago mutante lítico
et al., 1973). Por outro lado, os mes-
obrigatório. Os dados são médias de 2 repetições ± desvio padrão da média.
mos fagos podem estar presentes den-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 27

2. tro do genoma de sua célula hospedei- Obtenção de fago lítico mutante pejo “in natura”, nos rios, tem conse-
ra, em estado quiescente ou profágico, obrigatório qüências danosas à saúde das popula-
e não levar à lise celular dele. Por esse Para isto, uma suspensão ções, ocorrendo, não raras vezes, uma
motivo, a obtenção e utilização de bacteriana contendo Staphylococcus relação entre manifestações de doen-
fagos mutantes que realizem apenas o aureus, com um bacteriófago em seu ças de transmissão fecal-oral e a exis-
ciclo lítico para posterior utilização nas interior, foi submetida ao tratamento tência de focos de contaminação. Tal
ETEs é um objetivo que deve ser com luz ultravioleta (260nm) (5% de situação, porém, pode ser minimizada
alcançado. sobrevivência de UFC/mL) e o com o tratamento de esgotos sanitári-
Como dentro dos resíduos das sobrenadante obtido, após filtração, os.
ETEs existem milhares de espécies novamente testado contra essa cultura Há várias opções disponíveis para
bacterianas diferentes, muitas das quais bacteriana, usando-se como controle tratamento de efluentes, que devem
potencialmente contendo um ou mais uma cultura contendo essa bactéria e ser avaliadas segundo critérios de via-
fagos específicos, este trabalho teve a suspensão do fago não-lítico obriga- bilidade técnica e econômica, além de
por objetivo selecionar fagos que pu- tório. A seguir, após nova filtração, o adequação às características topográfi-
dessem ser utilizados para o objetivo sobrenadante (300µL) foi adicionado a cas e ambientais da região. Depen-
acima e dentre esses, selecionar um 200µL da cultura bacteriana receptora dendo das necessidades locais, o trata-
para a obtenção de mutante que obri- e a mistura adicionada a 4mL de meio mento pode se resumir aos estágios
gatoriamente realizasse apenas o ciclo LA semi-sólido e, então, incubada a preliminar, primário e secundário (COS-
lítico. 37°C por 30min, para haver a interação TA, 2004).
do fago com a célula bacteriana. Esta No entanto, quando o lançamen-
Metodologia e resultados suspensão final foi, então, adicionada to dos efluentes tratados se der em
sobre uma placa contendo 15mL de corpos d’água importantes para a po-
Seleção de fagos meio LA (conforme metodologia des- pulação, seja porque deles se capta a
Para essa finalidade, suspensões crita por SAMBROOK et al., 1989, com água para o consumo, seja porque são
contendo material bruto de diferentes modificações). Após incubar a 37°C espaços de lazer, recomenda-se tam-
ETEs (industriais, hospitalares e durante a noite uma placa de lise (a bém o tratamento terciário caracteri-
municipais) foram coletados em que apresentou halo o mais translúcido zados pelo uso de hipoclorito de sódio,
condições de assepsia, filtradas em possível) foi retirada do ágar e adicio- ozonização, luz ultravioleta, etc.
membranas Millipore de 0,2µm e o nada a uma cultura bacteriana em fase (LINSLEY et al., 1992).
sobrenadante resultante mantido em exponencial de crescimento. Após A abundância e a importância
condições de refrigeração (4°C). Um cultivo (37°C) por 12 horas e ecológica dos vírus nos meios aquáti-
volume de 200µL dessas suspensões centrifugação (12.000rpm), o cos têm sido atestadas com o aumento
foi, a seguir, adicionadas a culturas sobrenadante foi novamente filtrado e do número de estudos voltados para
bacterianas líquidas purificadas mantido em estoque a 4°C. eles. Segundo TEDIASHVILI et al.,
(Shigella flexneri, Shigella 2003, os fagos apresentam um papel
sonnei, Klebsiella pneumoniae, Utilização do fago lítico mutante importante no controle da densidade
Salmonella typhimurium, Escherichia obrigatório no controle de e diversidade da população bacteriana
coli, Streptococcus pyogenes, células bacterianas específicas no meio. Eles também são considera-
Staphylococcus aureus) e mantidas Suspensões fágicas, não mutante dos indicadores naturais da população
em cultivo (37°C) por 12 horas. A e mutante, obtidas como descrito an- microbiológica do efluente.
seguir, os meios foram centrifugados e teriormente, foram, separadamente, Neste trabalho, procuramos obter
os sobrenadantes armazenados entre adicionadas em culturas contendo fagos que pudessem ser utilizados
4°C e 8°C, após filtração. A confirmação Staphylococcus aureus (1:1000) em como tratamento complementar, aos
de fagos específicos na cultura de cada fase exponencial de crescimento já disponíveis, para a diminuição do
uma das bactérias foi realizada através (5x106 UFC/mL) e alíquotas (100µL) número de bactérias potencialmente
do mesmo procedimento observando- retiradas, diluídas seqüencialmente, na patogênicas presentes em ETEs. Para
se agora, ou o não crescimento razão 1:10, e semeadas em placas de isso, a primeira etapa foi a obtenção
bacteriano, ou a diminuição da turbidez Petri contendo meio LA. Após cresci- de bacteriófagos a partir da água de
do meio de cultura líquido. A obtenção mento (37°C, 12h) as UFC/mL foram diferentes ETEs sendo obtidos fagos
de fagos purificados específicos foi determinadas. com capacidade de lise de todas as
realizada através da metodologia amostras bacterianas estudadas, a mai-
descrita por DAVIS et al., 1973 e a Resultados e discussão oria dos quais com especificidade para
observação do sobrenadante líquido uma determinada bactéria utilizada
através de microscopia eletrônica Assim, como há preocupação no como hospedeiro. A exceção a esse
(PALMER, 1988). Posteriormente, cada sentido de tornar pura a água captada comportamento foi um bacteriófago,
fago isolado em uma determinada em rios, fontes ou poços, antes de isolado em Shigella flexneri, que tam-
cultura bacteriana foi testado contra as servi-la à população, também há pre- bém apresentou capacidade de lise de
demais culturas para confirmar a sua ocupação quanto ao destino dos esgo- Shigella sonnei e Escherichia coli.
especificidade. tos sanitários, sabendo-se que o des- Existem muitos estudos com efei-
28 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004

3. tos da luz UV em diferentes microrga- literatura (NAKASHIMA et al., 1998) e D 1 2 1 % 2 0 -
nismos (ANGEHRN, 1984; que o uso deles em uma cultura celular %20Saneamento%20ambiental
MASSCHELEIN, 2002; OPPENHEIMER “in vivo” pode levar a uma diminuição .htm>. Acesso em: 16 jun. 2004.
et al., 1993). Lâmpadas UV emitem no número de unidades formadoras de DAVIS, B. D.; DULBECCO, R.; EISEN,
radiação num comprimento de onda colônias e, consequentemente, dimi- H. S.; GINSBERG, H. S.; Jr WOOD,
entre 240-260nm, comprimento de nuição do número de bactérias W. B. Microbiologia. São Paulo:
onda no qual o ácido nucléico absorve patogênicas presentes em uma deter- EDART, 1973. 4v. V.4: Virologia.
a energia (ANGEHRN, 1984). A luz UV minada ETE. JORDÃO, E. P.; PÊSSOA, C. A. Trata-
causa mutação através da formação de Dessa maneira, sugerimos que o mento de Esgoto Doméstico. 3ªed.
dímeros de pirimidinas nas bases uso de fagos líticos específicos pode Rio de Janeiro: ABES, 1995.
nitrogenadas existentes ao longo da ser obtido para qualquer tipo LEWIN, B. Genes. 3.ed. New York:
cadeia de DNA (MASSCHELEIN, 2002). bacteriano, inclusive aqueles John Wiley & Sons, Inc,1987. p.
Assim, o uso dessa luz pode causar patogênicos presentes no esgoto bru- 269–291.
mutação nos genes responsáveis pela to, e que o uso deles pode ser utilizado LINSLEY, R.K.; FRANZINI, J.B. Enge-
manutenção adequada do vírus no de maneira complementar àqueles já nharia de recursos hídricos. São
estado de profago e liberar vírus que preconizados em estações de trata- Paulo: McGraw-Hill, 1978. 798p
possuam apenas a capacidade lítica. mento de águas residuais. Outrossim, MASSCHELEIN, W. J. Ultraviolet light in
Dessa maneira, entre todos os suspensões contendo diferentes fagos, water and wastewater sanitation.
fagos específicos que foram isolados, para diferentes espécies bacterianas, Boca Raton: Lewis Publishers, 2002.
e com a finalidade de simplificar os poderiam ser utilizados para tal finali- NAKASHIMA, Y.; HASUWA, H.; KAKI-
resultados obtidos, utilizamos aqueles dade, levando a uma diminuição glo- TA, Y.; MURATA, K.; KUROIWA,
originários de Staphylococcus aureus bal de prováveis patógenos. A.; MIAKE, F.; WATANABE, K. A
para a irradiação com luz UV e obten- temperate phage with cohesive
ção de fagos líticos obrigatórios. Conclusão ends induced by mitomycin C tre-
Verificou-se que, após irradiação atment of Lactobacillus casei. Ar-
para a determinação da dose letal que Os resultados aqui obtidos de- chives of Virology, v.143, p.
levava à sobrevivência de 5% das monstram que o isolamento de fagos 1621-1626, 1998.
UFC/mL (7,75 x 105 UFC/mL), um específicos pode ser realizado a partir OPPENHEIMER, J. A.; LAÎNÉ, J.-M.; JA-
elevado número de placas de lise em de fagos presentes em águas residuais CANGELO, J. G.; BHAMRAH, A.;
cultura sensível (Staphylococcus obtidas a partir de estações de trata- HOAGLAND, J. E. Chlorine and UV
aureus). mento de esgotos. disinfection of tertiary effluent: a
No teste realizado “in vivo”, os A partir destes isolados de fagos comparative study of bacterial and
fagos mutantes líticos obrigatórios de podem ser obtidos fagos líticos obriga- viral inactivation and effluent by-
Staphylococcus aureus foram utiliza- tórios, de maneira prática, rápida e de products. Proceedings of the 66th
dos, sendo obtida uma diminuição do baixo custo. Annual Conference, Water Envi-
número de UFC/mL de 55,4% do cres- Os fagos líticos podem ser utiliza- ronment Federation, Anaheim, CA,
cimento bacteriano, em relação ao dos de maneira complementar aos 1993. p. 557-568.
controle A utilizado. métodos já existentes para a diminui- PALMER, E.L., MARTIN, M.L. Electron
Uma diminuição maior do núme- ção do número de bactérias patogênicas Microscopy in Viral Diagnosis. Boca
ro de UFC/mL pode não ter sido obtida presentes em uma determinada esta- Raton, Florida: CRC Pressionar, Inc,
devido à provável existência da pre- ção de tratamento, o que torna esse 1988. p. 77. 194 p.
sença de bacteriófagos integrados ao tratamento mais eficiente e, portanto, SAMBROOK, J.; FRITSH, E. F.; MANIA-
genoma de uma parcela da população a água a ser liberada dela com menor TIS, T. Molecular cloning: a labora-
da bactéria hospedeira, Staphylococcus potencial patogênico. tory manual; (Appendix A) Bacte-
aureus, o que torna essas bactérias rial Media, Antibiotics, and Bacteri-
imunes à lise fágica (LEWIN, 1987). Referências Bibliográficas al Strains. 2.ed. Cold Spring Harbor
Isso, porém, não inviabiliza nossos Laboratory Press, 1989. 3v. V.3.
resultados, pois diferentes tipos de ANGEHRN, M. Ultraviolet disinfection TEDIASHVILI, M.; CHANISHVILI, N.
fagos líticos obrigatórios, específicos of water. Aqua, 1984, n.2, p. 109- Experience and prospects of the
para a bactéria hospedeira, podem ser 115. use of bacteriophage in environ-
selecionados e utilizados com o pro- BORSOI, Z.; CAMISÃO, M. L.; LANARI, mental studies. In: International
pósito de provocar o aumento da lise N.; TORRES, S.; GOMES, S. M. Tra- Workshop, nov. 2003. Anais da
bacteriana, minimizando, assim, a pos- tamento de Esgoto: Tecnologias Wastewater hygienisation in cons-
sível presença de fagos em estado Acessíveis. Informe infra-estru- tructed wetlands, ponds and rela-
profágico. tura, Área de projetos de infra- ted systems, nov. 2003. p. 25. 45p.
Nosso trabalho demonstra que estrutura, n.16, nov. 1997. Von SPERLING, M. Introdução à quali-
fagos líticos obrigatórios podem ser COSTA, A. J. F. Saneamento ambiental. dade das águas e ao tratamento de
obtidos a partir de fagos não mutantes, Disponível em: <http:// esgotos. V.1. Belo Horizonte:
pré-existentes, como já descrito na federativo.bndes.gov.br/dicas/ UFMG, 1996. 240p.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 29