Apresentação do artigo "Diversidade de Lactococcus lactis revelada pelo sequenciamento de Amplicon direcionado do gene purR , comparações metabólicas e propriedades antimicrobianas em uma cultura inicial mista indefinida usada para fabricação de queijo macio"Sabrina Saltaji , Olivier Rué, Valérie Sopena, Sophie Sablé, Fatoumata Tambadou, Sandrine Didelot, Romain Chevrot "

1. CENTRO FEDERALDE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICADE MINAS GERAIS
PROGRAMADE PÓS-GRADUAÇÃO EMTECNOLOGIADE PRODUTOS E PROCESSOS
Diversidade de Lactococcus lactis revelada pelo sequenciamento de Amplicon
direcionado do gene purR , comparações metabólicas e propriedades antimicrobianas
em uma cultura inicial mista indefinida usada para fabricação de queijo macio
Sabrina Saltaji , Olivier Rué, Valérie Sopena, Sophie Sablé, Fatoumata Tambadou, Sandrine Didelot, Romain Chevrot
DOCENTE: FERNANDA BADOTTI
DISCENTE: BRENDA PALHARES DOS REIS VIEIRA
B E LO H O R IZ O N T E
2 0 2 2

2. Sumário
• Artigo
• Introdução
• Objetivo
• Metodologia
• Resultados e discussão
• Conclusão
• Referências bibliográficas

3. Artigo
Fator de
impacto: 4,350

4. Introdução
Produção de queijos de pasta mole

5. Introdução
Bactérias de ácido láctico
As BAL que compõe o leite cru são:
• Lactococcus lactis,
• Leuconostoc mesenteroides,
• Streptococcus spp. e
• Lactobacillus spp.
As subespécies L. lactis subsp. lactis e L. lactis
subsp. cremoris.

6. Introdução
Tecnologias de sequenciamento

7. Introdução
Bactérias patógenas e deteriorantes
• Placa de ágar EMB semeada com Escherichia coli.
•Meio ágar Hektoen em sua coloração original (placa da esquerda); HE
semeado com cepa de Salmonella (placa ao centro). Note a presença de
pigmento negro. HE semeado com cepa de coliforme fecal (placa à
direita).

8. Objetivos
•Conhecer a diversidade microbiana CIMI;
•Criar um acervo a partir da CIMI;
• Realizar as associações genótipo-fenótipo;
• Determinar o perfil do metabolismo de carboidratos;
•Avaliar a atividades antimicrobiana.

9. Materiais e métodos
Coleta de Amostras
• Aplicado durante a adição do coalho,
algumas horas após o enriquecimento
do leite com fermentos acidificantes.
Extração de DNA
• O DNA foi extraído com o DNeasy
PowerFood Microbial Kit,
• O DNA purificado foi armazenado a -
80°C

10. Sequenciamento de genes (SG) da microbiota CIMI
Sequenciamento
de genes
SG e Análise de
dados de 16S
rRNA
O pipeline FROGS foi usado para
recuperar as unidades
taxonômicas operacionais (UTOs)
As sequências de referência de
cada UTO foram lançadas contra
o banco de dados SILVA
SG PurR e Análise
de Dados
O pipeline DADA2 foi usado para
recuperar as sequências biológicas
de leituras (erros).
Comparada no banco de dados
NCBI usando o programa
BLAST.
Ampliação por PCR
Sequenciamento pela
plataforma Eurofins
Genomics usando
uma tecnologia
Illumina ® MiSeq.

11. Isolamento de bactérias lácticas (BAL) e não-BAL
Atmosfera aeróbica
• Temp.: 28°C
• Ágar BHI
• Ágar MRS
• Ágar M17
• Ágar MRS + 2% NaCl
• Ágar MRS + 4% NaCl
• Ágar MRS + 6,5% NaCl
• Ágar BHI + 6,5% NaCl
Atmosfera microaerofílica
• Temp.:28°C
• Ágar BHI
• Ágar MRS
• Ágar M17
Atmosfera aeróbica
• Temp.:22°C
• Ágar BHI
• Temp.:37°C
• Ágar MRS
• Temp.:44°C
• Ágar MRS

12. Identificação de Perfis Fenotípicos e Isolados de LAB
Perfil do Metabolismo de Carboidratos Bacterianos
• 2 bactérias isoladas aleatórias de cada condição (n=13).
• 49 testes bioquímicos com meio API 50 CHL.
MALDI-TOF MS Identificação Bacteriana
• Pela Eurofins Microbiologie Ouest (n=26).
Extração de DNA, Procedimento de PCR de Rotina e Sequenciamento de Gene de
rRNA 16S de Comprimento Completo
• Pela Eurofins Microbiologie Ouest.
• Comparada no banco de dados NCBI usando o programa BLAST.

13. Sequenciamento do Genoma e Análise de Dados
Extração de DNA de cultura pura
• 6 BAL isolados de L. lactis para associações genótipo-fenótipo.
• Extração: kit de sangue e tecido DNeasy
• Quantificação: NanoDrop ND-1000
Sequenciamento de genoma completo e anotação de genes
• Tecnologia de sequenciamento PacBio ® RS II e Illumina ® iSeq .
• As informações das vias relacionadas ao metabolismo de carboidratos foram identificadas a
partir daquelas descritas na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (EGGK).
• Mineração dos clusters do genes da produção de peptídeos antimicrobianos foi realizada usando
BAGEL4.

14. Atividade antimicrobiana
Número(s) de
Adesão
• Os dados do amplicon 16S e purR foram
depositados em DDBJ/ENA/GenBank sob
o número BioProject PRJNA615620.
• O projeto de genoma completo foi
depositado no DDBJ/ENA/GenBank sob o
número BioProject PRJNA615395.
Cepas bacterianas e
condições de
crescimento
• Cultivado duas vezes.
• Condições de crescimento específicas para
cada cepa indicadora.

15. Atividade antimicrobiana
•Bacillus cereus
•Bacillus subtilis
•Brochothrix thermosphacta
•Carnobacterium maltaromaticum
•Cronobacter sakazakii
•Escherichia coli
•Enterococcus faecalis
•Leuconostoc mesenteroides
•Listeria innocua
•Listeria ivanovii
•Listeria monocytogenes
•Listeria monocytogenes
•Mucor circinelloides
•Mucor racemosus
•Penicillium solitum
•Pseudomonas aeruginosa
•Pseudomonas fluorescens
•Staphylococcus aureus
•Staphylococcus aureus
•Salmonela ser. Enteritidis
•Salmonela ser. Typhimurium
•Yarrowia lipolytica
•Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica

16. Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Teste de mancha de ágar
• 5 microlitros de uma cultura de BAL em
placas de ágar BHI, deixa secar por 20 min;
• Cobre com 10 mL de ágar mole com
10 6 UFC/mL da cepa indicadora;
• Incubação à noite;
• Verificar os halos de inibição.
• Controle positivo: Lactobacillus sakei
Preparações de Sobrenadante Livre de
Células (CFS) e CFS Neutralizado (NCFS)
• Amostra coletada em intervalos de
crescimento;
• Os CFSs foram obtidos por centrifugação;.
• Os NCFs :pH do CFS ajustado para 7,0
para excluir o efeito antimicrobiano dos
ácidos orgânicos;
• Aquecimento a 100°C por 10 min para
inibir a atividade da enzima.

17. Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Ensaio de Difusão em Poços de Agar.
• O ágar BHI foi semeado com 10 6 UFC/mL de cepas indicadoras e vertido em
placas de Petri.
• Alíquotas de CFS ou NCFS não diluídas preenchem os poços de vidros nas placas
• Incubação a noite.
• Registro: Halos de inibição.
Efeito inibitório durante o co-cultivo
• Lote 1: co-inoculação de S. aureus + BAL isolado selecionado;
• Lote 2: co-inoculação de S. ser. Typhimurium + BAL isolado selecionado.
• As atividades antimicrobianas: ensaio de difusão em poço de ágar.

18. Resultados e discussão
Análise da diversidade microbiana das CIMI
Análise de sequências
de fragmentos de genes
de rRNA 16S
Um gênero dominante, Lactococcus sp.,
abrangendo 99,9% de abundância relativa,
foi identificado para cada região do gene 16S
rRNA
Análise de sequências
de genes purR
Análise de
sequenciamento de
genoma completo

19. Análise de Sequência de Genes PurR
Abundância (%)
ASV_1 99,86
ASV_2 0,13
ASV_3 0,005
ASV_4 0,005
ASV_5 0,002
Contagem de matriz de variantes de sequência de amplicon (ASVs) (%)
determinada com análise do gene purR .

20. Análise de
Sequência de
Genes PurR
Dendrogramas mostrando
semelhanças de sequência de
cepas de L. lactis com base
em uma análise de
agrupamento das variantes de
nucleotídeos de amplicon
purR (A) ou variantes de
aminoácidos (B).
A
B

21. Análise de sequenciamento de genoma completo
.
O valor ANI é usado para estimar a distância genética entre isolados..
A subespécie cremoris possui um valor de ANI abaixo de 95%.
A identidade ANI foi >99,8% para todos os genomas de L. lactis,
Sugerindo que todos pertencem ao grupo de subespécies de lactis .

22. MALDI-TOF MS e Análise de Sequenciamento Genético
de rRNA 16S de Comprimento Completo
• Foram 4 identificações de espécies:
• Lactococcus lactis (L) ( n = 18/26),
• Lactococcus raffinolactis (R) ( n = 1/26),
• Enterococcus faecalis (E) ( n = 5/26) e
• Staphylococcus warneri (S) ( n= 2/26).
• A análise dependente de cultura mostrou semelhanças na diversidade da CIMI e
concordou com estudos independentes de cultura para a identificação de L. lactis

23. Carboidrato A Grupo ( n = 13) a
Grupo B ( n = 2) b
Grupo C ( n = 2) c
Grupo D ( n = 1) d
ATCC 19435 e
ATCC 19257 f
IL1403h _
Origem da cepa Leite cru Leite cru Leite cru Leite cru Leite Creme Laticínios
Ao controle - - - - - - -
D-ribose + + + + + - +
L-arabinose - - - - - - -
D-xilose + - + + + - -
D-galactose + + + + + - +
D-glicose + + + + + + +
D-frutose + + + + + + +
D-manose + + + + wg _
+ +
D-manitol - + - + - - -
D-sorbitol - + - - - - -
Arbutina + + + + + - +
Salicina + + + + + - +
D-celobiose + + + + + - +
D-maltose + + + + + - +
D-lactose + + + + + + W
D-melibiose - - - - - - -
D-sacarose - + + + - - -
D-trealose + + + + + - +
D-rafinose - - - - - - -
Amido - - - - - - -
D-tagatose - + - - - - -

24. Características Metabólicas e Funcionais
das Cepas CIMI
Grupos
fenotípicos
de
L.
lactis
Grupo (A)
L1 a L6, L10 a L13 e L15 a
L17 ( n = 13)
Grupo A (L1, L2, L3), Consumo da D-xilose
Grupo (B)
L7 e L8 (n = 2)
Grupo B (L8),
Consumo da D-tagatose, D-
sorbitol* e D-sacarose*
Grupo(C)
L14 e L18 ( n = 2)
Grupo C (L14) e
Consumo da D-xilose e D-
sacarose*
Grupo (D)
L9 ( n = 1)
Grupo D (L9).
Consumo da D-xilose e D-
sacarose*

25. Resultados e discussão
• O metabolismo celular dos Lactococcus resumem em duas possíveis vias
catabólicas para a utilização da lactose:
• (i) hidrólise da lactose para dar α-D-glicose e D-galactose realizada por uma β-
galactosidase , e
• (ii) a conversão em lactose 6-fosfato (Lac-6P) por uma lactose
fosfotransferase.
•Todos os genomas analisados ​​possuíam uma enzima chave para a degradação da
L-arabinose, embora os perfis fenotípicos mostrassem uma incapacidade de
crescer em arabinose.
•A porcentagem de carboidratos utilizada pelas bactérias isoladas foi ligeiramente
maior (33% a 45%) em comparação com cepas do tipo L. lactis (29%).

26. Resultados e discussão
•O processo de pseudogenização progressiva (inativação de genes) ligado à sua
especificação de nicho atual.
• A L. lactis isolados vieram de um ambiente de fazenda antes de serem
introduzidos no leite cru e depois no UMSC
• As bactérias isoladas da CIMI foram progressivamente domesticadas, uma vez
que não podiam mais crescer em uma variedade de carboidratos derivados de
plantas devido à pseudogenização ou inserções de transposons em genes.

27. Atividades antimicrobianas
Ensaios
(n = 1616)
N= 34 bactérias
isoladas apresentou
atividade
antimicrobiana
contra até 5 cepas
indicadoras
R.: Os isolados 14 e 15.
Para as 5 cepas indicadoras
( S. ser. Typhimurium CIP
104115, S. aureus DSMZ
13661, S. aureus CIP 76.25, E.
faecalis CIP 103.015 e L.
innocua CIP 80.11).
A atividade
antimicrobiana do
isolado 14 de L.
lactis foi estudada em
ensaios de co-cultivo
contra as duas cepas
indicadoras: S.
aureus DSMZ 13.661
ou S. ser. Typhimurium
CIP 104115

28. Atividades antimicrobianas
CFS testado
S. ser. Typhimuri
um CIP 104115
Lactobacillus
Sakei CIP 104494
S. aureus DSMZ
13661
L. inócua
CIP 80.11
L. lactis IL1403 d
L. lactis isolado
14
8,0 ± 0,7 a 12,0 ± 0,7 8,0 ± 0,0 24,0 ± 0,7 13,0 ± 1,4
S. ser. Typhimuri
um
CIP 104115
/ b / / / /
Isolado 14
+ S. ser. Typhimur
ium CIP 104115
11,0 ± 0,0 14,0 ± 1,4 ND c 22,0 ± 1,4 15,0 ± 2,12
S. aureus DSMZ
13661
/ 10,0 ± 2,12 / / /
Isolado 14 + S.
aureus DSMZ
13661
ND 11,0 ± 1,4 14,0 ± 0,0 18,0 ± 0,7 17,0 ± 0,7

29. Atividades antimicrobianas
A ferramenta baseada na web BAGEL4 foi usada para minerar agrupamentos de genes de
metabólitos secundários dentro de todo o genoma L. lactis L3 (isolado 14).
O gene é conhecido por estar envolvido na produção da bacteriocina lactococina B (LcnB).
O LcnB afeta a permeabilidade da membrana, dissipando seu potencial e seu gradiente de pH
causado pelo vazamento de íons. Em cepas de L. lactis que carregam a proteína de imunidade, o
LcnB é inativo
O isolado 14 inibiu o crescimento de L. lactis IL1403, uma cepa livre de plasmídeo sensível à
bacteriocina. Esses resultados sugeriram que o isolado 14 poderia produzir um peptídeo
antimicrobiano próximo ao LcnB.

30. Conclusão
•Cinco variantes de L. lactis foram identificadas e cinco perfis de metabolismo de carboidratos foram
destacados no gênero Lactococcus.
• Essas cepas de Lactococcus diferem em suas propriedades fenotípicas das cepas comumente usadas
como iniciadores industriais.
• Além disso, algumas L. lactis isolados apresentaram atividade antimicrobiana detectada por métodos
culturais.
•Essas bactérias poderiam atuar como agente de biocontrole quando combinadas com outros
procedimentos da chamada tecnologia de barreiras.
•Além disso, considerando as características da cultura e sua relação com a qualidade do produto,
estudos adicionais podem ser úteis para determinar seus efeitos na aptidão tecnológica e nas
propriedades sensoriais do queijo.

31. Referências bibliográficas
https://omelhordeparis.com.br/confira-5-queijos-tipicamente-franceses/
https://pt.dreamstime.com/desenhos-animados-infographics-da-produ%C3%A7%C3%A3o-de-
queijo-image101748586
https://www.google.com/imgres?imgurl=https%3A%2F%2Fwww.milkpoint.com.br%2Fimg%2F
artigo%2F73129%2F%3Fw%3D1200%26vs%3D20112019092814&imgrefurl=https%3A%2F%
2Fwww.milkpoint.com.br%2Fcolunas%2Fclaucia-fernanda-souza%2Fbacterias-acidolacticas-e-
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https://neobio.com.br/blog/o-sequenciamento-de-dna-a-revolucao

32. Referências bibliográficas
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/10/reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr.html
https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/24343/5/Manual%20de%20bacteriologia%20e%2
0de%20enteroparasitos.pdf
https://pt.dreamstime.com/imagens-de-stock-ilustra%C3%A7%C3%A3o-da-f%C3%A1brica-de-
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SALTAJI, S. et al. Lactococcus lactis Diversity Revealed by Targeted Amplicon Sequencing of purR Gene,
Metabolic Comparisons and Antimicrobial Properties in an Undefined Mixed Starter Culture Used for Soft-
Cheese Manufacture. Foods, v. 9, n. 5, 1 maio 2020.
http://biologiemarine.com/___fiches/APIpdf/API%2050%20CHL%20Medium-_07486_-_G_-_50410.pdf
https://www.scielo.br/j/eins/a/B5YjmWMZs8TrYqYDP7dnJsJ/?lang=pt&format=pdf

33. Obrigada!