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![Sinalização Celular
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ativado, duas moléculas de acetilcolina devem se ligar a esses sítios e, dessa forma, o canal
se abre quase que instantaneamente, permitindo a passagem de íons (Rang e Dale, 2007).
Os canais controlados por voltagem abrem-se quando a membrana celular é
despolarizada. Essa abertura (ativação) induzida pela despolarização da membrana é de
curta duração, mesmo quando a despolarização é mantida. Os canais mais importantes
nesse grupo são os canais seletivos para sódio, potássio e cálcio.
Figura 3 – Estrutura do receptor canal. Figura 4 - Esquema de abertura do canal.
Retirado de Squire e col., 2003. Retirado de Squire e col., 2003.
Os canais controlados por ligantes são ativados através da ligação de um
mensageiro químico extracelular a um sítio na molécula do canal. Os receptores desse tipo
controlam os eventos sinápticos mais rápidos do sistema nervoso. A maior parte dos
neurotransmissores excitatórios, como acetilcolina, glutamato, ácido gama-amino butírico
(GABA) e ATP agem dessa maneira e causam aumento na permeabilidade ao Na+
e K+
.
Alguns canais controlados por ligantes respondem a sinais intracelulares e não
extracelulares, tais como: (i) canais de potássio ativados por cálcio, se abrem,
hiperpolarizando a célula, quando ocorre um aumento da [Ca2+
]i; (ii) canais de potássio
sensíveis a ATP, se abrem quando a concentração intracelular de ATP cai. Esses canais
são distintos daqueles que medeiam os efeitos excitatórios de ATP extracelular; (iii) existem
ainda outros canais que respondem a ligantes intracelulares, como canais de potássio
sensíveis a diacilglicerol, cujas funções ainda não estão bem esclarecidas. Dependendo do
íon para o qual o canal é seletivo a alteração no potencial de repouso da célula poderá atuar
de forma diferente, podendo levar à despolarização celular, como é o caso de alguns
subtipos de receptores de acetilcolina e glutamato, que são canais de sódio ou cálcio; ou
dificultando uma eventual resposta de despolarização a um estimulo excitatório, como é o
caso de GABA e glicina, que são canais de cloro (Squire e col., 2003).
Os receptores canais de glutamato são responsáveis pelo fenômeno de potenciação
de longo termo (LTP), plasticidade sináptica e neurodegeneração. O influxo de íons através](https://image.slidesharecdn.com/fisiologiacomparada2010-130430160457-phpapp02/85/Fisiologia-comparada-USP-2010-41-320.jpg)
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Respirômetro de Volume Constante de Warburg
O Respirômetro de Volume Constante de Warburg foi amplamente usado por Otto
Warburg e colaboradores de Berlim e foi o primeiro descrito por Joseph Barcroft e John
Haldane em 1902. A câmara respirométrica é acoplada a um manômetro líquido em U e a
um braço lateral repleto de absorvedor de gás carbônico (Fig. 6). O manômetro em U aqui
possui como pressão de referência a própria pressão atmosférica, diferente do respirômetro
de Gilson, descrito mais adiante. É comum o uso do fluido de Brodie como o líquido do
manômetro (23g de cloreto de sódio, 5g de tauroglicocolato de sódio, 500mL de água).
Neste sistema o volume do recipiente onde fica o animal e a temperatura exata do
momento que foi determinado o volume precisam ser conhecidos para realizar os cálculos:
O2=h [( Vf [ 273.15 / T ] + Vq x b ) / P ]
(consumo em µL O2)
onde h é a altura do menisco no manômetro, Vf é o volume de gás livre (mL) da câmara
somado ao volume de ar dentro do manômetro até a altura do menisco descontado o valor
do volume do animal medido, T é a temperatura em graus Celsius, Vq é o volume em mL de
todos os líquidos na câmara, b é a solubilidade do gás medido no líquido da câmara, e P é a
pressão atmosférica por mililitro do fluido manométrico (geralmente fluido de Brodie).
Este sistema respirométrico é extremamente difícil de ser usado e é muito instável. O
manômetro usa como a pressão de referência a pressão atmosférica que pode mudar com a
altitude ou com a condição climática (p.e. chuva), podendo incutir erro na medição. Outro
fator de instabilidade é a diluição dos gases do ar interno na câmara na solução aquosa de
KOH, o que pode alterar a medição também. Parte desses problemas foram solucionados
pelo sistema respirométrico de Gilson que veremos a seguir.](https://image.slidesharecdn.com/fisiologiacomparada2010-130430160457-phpapp02/85/Fisiologia-comparada-USP-2010-233-320.jpg)
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Respirometria Coulométrica
A respirometria coulorimétrica foi descrita pela primeira vez por N. T. Werthessen em
1937. Ela baseia-se, como na respirometria fechada, no princípio de constância de volume
e pressão do gás encerrado em um recipiente respirométrico, associado à produção
eletrolítica de oxigênio. Esse sistema de grande precisão resolve o problema de alterações
nas condições do ar interno á câmara respirométrica, porém é pouco utilizada.
O funcionamento é simples: oar de uma câmara respirométrica fica ligado a um
recipiente que contém solução saturada de sulfato cúprico. Como na respirometria fechada,
o gás carbônico produzido pelo organismo medido é absorvido do ar por ascarite ou solução
de KOH. Conforme o volume de ar da câmara diminui, a solução de sulfato cúprico sobe e
encosta no anodo, fechando o circuito. Assim que a eletrólise vai liberando oxigênio,
restabelece a concentrações de oxigênio, o volume de ar da câmara aumenta e empurra a
solução de sulfato cúprico para baixo, desligando o circuito novamente (Fig. 8).
Usando o montante de eletricidade liberada ou consumida, medido em coulombs,
desta reação de eletrólise obtemos a produção de oxigênio em quantidades muito precisas.
Através da fórmula:
nLO2 = Q[Vm/(4F)]
onde Q é a carga de eletricidade, em coulombs, descarregada na solução saturada; Vm é o
volume molar de oxigênio em CPTP; e F é a constante de Faraday (96.485 coulombs /mol).
Figura 8 – Esquema simplificado de um sistema coulorimétrico. Todo o sistema é normalmente
mantido em temperatura constante. Conforme o organismo consome oxigênio, libera gás carbônico
que é retirado do ar pelo ascarite, diminuindo o volume de ar da câmara respirométrica. Isto permite
que o nível de solução de sulfato cúprico suba pelo tubo e atinja o anodo, iniciando a eletrólise. Com
o avançar da reação eletrolítica, o oxigênio produzido preenche a câmara respirométrica novamente
fazendo o nível de solução de sulfato cúprico baixar e desligar o sistema eletrolítico.](https://image.slidesharecdn.com/fisiologiacomparada2010-130430160457-phpapp02/85/Fisiologia-comparada-USP-2010-237-320.jpg)
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Fisiologia comparada USP 2010
Este capítulo apresenta os principais métodos científicos para gerar conhecimento, com foco na fisiologia comparativa. Aborda o método indutivo e o hipotético-dedutivo, além de revisar o processo completo de pesquisa, desde a formulação de perguntas até a comunicação dos resultados. O objetivo é fornecer uma visão básica do método científico para auxiliar os alunos em seus primeiros trabalhos de pesquisa.
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- 2.
- 3. Comissão Organizadora Amanda deMoraes Narcizo Camila Helena de Souza Queiroz Camila Lopes Petrilli Cláudia Emanuele Carvalho de Sousa Diego Jose Belato y Orts Felipe Viegas Rodrigues Kelly Dhayane Abrantes Lima Leopoldo Francisco Barletta Marchelli Marco Antônio Pires Camilo Lapa Maria Nathália de Carvalho Magalhães Moraes Marina Marçola Pereira de Freitas Tatiana Hideko Kawamoto Coordenador: Prof. Dr. Márcio Reis Custódio VII Curso de Inverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” http://www.ib.usp.br/cursodeinverno Realização Patrocínio
- 5. Apresentação VII Curso deInverno - IB/USP Pág. i APRESENTAÇÃO A idéia da criação do Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa surgiu em 2002, quando alunos da pós-graduação do Departamento de Fisiologia Geral do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo – USP, ansiavam a criação de um espaço que possibilitasse alternativas de aprendizado complementar. Naquele momento de inquietude e vontade discente, a decisão foi de empenho em realizar um curso no período de férias e oferecê-lo a graduandos e recém-graduados que almejassem ingressar na pós-graduação em Fisiologia, ou mesmo para aqueles que se interessassem pelo tema de uma forma geral. Além disso, na última década, percebemos uma preocupação crescente em descentralizar o desenvolvimento concentrado na região Sudeste do país e atingir áreas mais carentes tanto em pesquisa quanto em desenvolvimento humano. Em defesa deste conjunto de idéias e ações que a Comissão Organizadora do Curso de Inverno busca sempre ampliar o alcance do curso, colaborando cada vez mais efetivamente na construção de um país com menos desigualdades. Sendo assim, o curso é voltado para alunos originários das diversas áreas do conhecimento que tenham interesse em Ciências Fisiológicas, mais especificamente em Fisiologia Comparativa. Seu principal objetivo é promover discussões de conhecimentos fundamentais para uma boa formação em Fisiologia, assim como proporcionar uma vivência no dia-a-dia da pesquisa do Departamento de Fisiologia do Instituto de Biociências - USP. Este livro visa complementar os conteúdos discutidos em sala de aula, proporcionando uma fonte adicional de consulta para os participantes. O livro é composto de nove unidades que abrangem os mais variados temas dentro da Fisiologia Comparativa, os quais apresentam desde teorias básicas até as mais novas discussões da atualidade. Desejamos uma boa leitura a todos! Comissão Organizadora VII Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa Universidade de São Paulo 5 a 23 de Julho de 2010
- 6. Mapa Conceitual Pág. iiVII Curso de Inverno - IB/USP MAPA CONCEITUAL Na tentativa de sempre melhorar a qualidade das aulas e a comunicação dos pós- graduandos, a edição 2010 do “Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa” foi organizado em módulos conforme delineamento sugerido por um mapa conceitual, o qual mostra a interligação entre os diversos assuntos da Fisiologia e aponta as relações existentes entre os temas que serão abordados no decorrer do curso. Assim sendo, a partir dele, os módulos deste ano foram criados de acordo com as proximidades de cada tema. Desta maneira, podemos oferecer aos alunos participantes uma base mais sólida e coesa a cerca da Fisiologia Comparativa, e ao mesmo tempo transmitiremos uma boa noção da diversidade de temas abordados no Departamento de Fisiologia. Mapa Conceitual mostrando as interligações existentes nos mais diversos temas abordados no Departamento de Fisiologia Geral do Instituto de Biociências da USP, os quais serão apresentados durante as aulas no Curso de Inverno: Tópicos em Fisiologia Comparativa 2010.
- 7. Sumário VII Curso deInverno - IB/USP Pág. iii SUMÁRIO Unidade 1 Método Científico Aplicado a Estudos em Fisiologia Comparativa Capítulo 1 O que é ciência e como praticá-la pág. 03 Capítulo 2 Formulando perguntas em fisiologia comparativa pág. 09 Capítulo 3 Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenho experimental e a estatística inferencial pág. 13 Capítulo 4 O Fim da Picada: Comunicando Ciência pág. 17 Glossário pág. 21 Bibliografia pág. 22 Unidade 2 Sinalização Celular Capítulo 5 Comunicação celular: entendendo a ritmicidade endógena pág. 23 Capítulo 6 Fisiologia celular do plasmodium durante a fase assexuada pág. 41 Capítulo 7 RNAi: ouvindo a voz do silêncio pág. 49 Bibliografia pág. 66 Unidade 3 Neurociências Capítulo 8 História da neurociência pág. 79 Capítulo 9 Princípios básicos em fisiologia neural pág. 89 Capítulo 10 Fisiologia sensorial pág. 103 Capítulo 11 Neurofisiologia da visão pág. 115 Capítulo 12 Causa e função pág. 121 Capítulo 13 Percepção pág. 127 Capítulo 14 Memória e seus aspectos evolutivos pág. 139 Capítulo 15 Navegação espacial pág. 153 Capítulo 16 Neurobiologia das emoções pág. 163 Capítulo 17 Neurofisiologia da linguagem pág. 179
- 8. Sumário Pág. iv VIICurso de Inverno - IB/USP Capítulo 18 Neurofisiologia da música pág. 187 Bibliografia pág. 194 Unidade 4 Metabolismo Capítulo 19 Metabolismo e Temperatura: Conceitos e Implicações pág. 205 Capítulo 20 Medindo a chama da vida pág. 217 Capítulo 21 Ectotermia: um acesso de baixo custo à vida pág. 235 Capítulo 22 Termorregulação em endotérmicos: febre e anapirexia. “Ana” o quê? pág. 247 Capítulo 23 Metabolismo energético em câmera lenta: mecanismos de depressão metabólica sazonal pág. 257 Capítulo 24 Custos e benefícios da reprodução: papel dos lipídios pág. 269 Capítulo 25 A ecofisiologia no cenário das mudanças climáticas globais pág. 279 Bibliografia pág. 286 Unidade 5 Neuroendocrinologia Comparada Lista de abreviações pág. 301 Capítulo 26 Neuroendocrinologia comparada: análise comparativa entre o encéfalo e a hipófise de peixes e mamíferos pág.305 Capítulo 27 Neuroendocrinologia comparada: o encéfalo e a hipófise de anfíbios, répteis e aves pág. 323 Capítulo 28 Sistema neuroimunoendócrino pág. 337 Bibliografia pág. 348 Unidade 6 Ecotoxicologia Aquática Capítulo 29 Metal não essencial: o cádmio e seus efeitos pág. 361 Capítulo 30 Transporte de Metais Essenciais em Organismos Aquáticos: o cobre e o zinco pág. 371
- 9. Sumário VII Curso deInverno - IB/USP Pág. v Capítulo 31 Efeitos da toxicidade de metais no metabolismo de organismos aquáticos pág. 381 Capítulo 32 Alterações neuroendócrinas resultantes da exposição a metais pág. 395 Bibliografia pág. 407 Unidade 7 Fisiologia Comparada de Invertebrados Marinhos: Trocas Gasosas, Digestão e Sistema Imune Capítulo 33 Trocas gasosas em invertebrados marinhos pág. 427 Capítulo 34 Adquirindo energia: formas de alimentação e digestão em inverte- brados marinhos pág. 435 Capítulo 35 Sistema Imune de Invertebrados marinhos: mecanismos, funções e similaridades pág. 455 Bibliografia pág. 467 Unidade 8 Fundamentos de Toxinologia Capítulo 36 Co-evolução entre peçonhas e seus alvos pág. 473 Capítulo 37 Produtos naturais e sua função como defesa química pág. 483 Capítulo 38 Invertebrados marinhos: toxinas e seus mecanismos de ação pág. 493 Capítulo 39 Lepidópteros: aspectos biológicos e toxinológicos pág. 501 Capítulo 40 Raias – biologia e envenenamento pág. 511 Capítulo 41 Serpentes peçonhentas do Brasil: biologia, fisiologia e epidemiologia pág. 519 Bibliografia pág. 535
- 10. Sumário Pág. vi VIICurso de Inverno - IB/USP Unidade 9 Quantificação e Análise de Dados Capítulo 42 Quantificação de Fenômenos Fisiológicos pág. 547 Bibliografia pág. 564
- 11. Unidade 1 Método CientíficoAplicado a Estudos em Fisiologia Comparativa Coordenador: Agustín Camacho Guerrero Laboratório de Herpetologia agustin.camacho@usp.br Este capítulo tem três objetivos. A) Apresentar aos leitores os principais métodos usados para gerar conhecimento científico, B) Mostrar como a fisiologia comparativa pode valer-se de dois destes métodos: o método indutivo e o hipotético-dedutivo, C) Revisar o processo de geração de conhecimento, desde o levantamento de perguntas científicas até a comunicação dos resultados de um projeto de pesquisa, passando por apresentar as bases do desenho experimental e a análise estatística. O fim último deste texto e as aulas associadas é que os alunos tenham uma visão básica e estruturada do método científico. Com esta visão, espero que lhes seja mais fácil aprender no futuro sobre temas mais específicos (desenho experimental, estatística, comunicação da ciência, etc). No final do capítulo, existe um glossário que define termos importantes em negrito. Os termos estão na ordem em que são encontrados durante a leitura, para facilitar uma consulta inmediata. Por que ler este texto? Infelizmente, muitos cursos em biologia colocam as disciplinas de método científico como optativas, em lugar de inserir este tipo de preparo, ao menos nas disciplinas obrigatórias da grade curricular. Deste modo, muitos alunos não têm um preparo mínimo para planejar, executar projetos científicos, nem comunicar os resultados obtidos. Como conseqüência, os primeiros trabalhos de um aluno perdem em qualidade, diminuindo também suas possibilidades de obter bolsas no futuro. Este capítulo pretende mostrar alguns conceitos básicos e dicas para auxiliar aos alunos nos seus primeiros encontros com o trabalho de pesquisador. Durante as aulas relacionadas a este módulo veremos estes conceitos da forma mais didática possível, mas neste capítulo tem informações e dicas úteis que não serão explicadas na aula.
- 12. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 2 Julho/2010 Todos os capítulos revisados pelos profs Dr. Pedro Ribeiro e Dr. Pedro Luis Bernardo da Rocha Capítulo 1 O que é ciência e como praticá-la pág. 03 Agustín Camacho Guerrero Capítulo 2 Formulando perguntas em fisiologia comparativa pág. 09 Agustín Camacho Guerrero Capítulo 3 Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenho experimental e a estatística inferencial pág. 13 Agustín Camacho Guerrero Capítulo 4 O Fim da Picada: Comunicando Ciência pág. 17 Agustín Camacho Guerrero Glossário pág. 21 Bibliografia pág. 22
- 13. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 3 O que é ciência e como praticá-la. Agustín Camacho Guerrero Laboratório de Herpetologia agustin.camacho@usp.br O que é ciência? Uma bonita forma de começar a preparar-nos é conhecer a etimologia da palavra que definirá nosso trabalho, talvez pelo resto das nossas vidas. A palavra ciência provém do latim “scientia” proveniente do verbo “scire = saber”, este está relacionado com o verbo, também latim, “scindo = dividir”. Existem várias definições de ciência, mais ou menos completas, seja com ênfase nos seus objetivos ou nos métodos que usam. Uma definição bastante completa é: “1. The systematic observation of natural events and conditions in order to discover facts about them and to formulate laws and principles based on these facts. 2. The organized body of knowledge that is derived from such observations and that can be verified or tested by further investigation. 3. Any specific branch of this general body of knowledge, such as biology, physics, geology or astronomy.” Academic Press Dictionary of Science & Technology. Neste módulo, seguiremos uma visão de ciência como busca e comunicação de conhecimento, o mais confiável possível, sobre a natureza. Métodos conceituais de obtenção do conhecimento. Desde séculos antes de Cristo, filósofos, empiristas e estatísticos, tais como Aristóteles, Bacon, Bayes, Fisher, Popper, Underwood e Jaynes, vêm aprimorando os métodos conceituais de obter conhecimento do mundo natural, de forma a obter mais conhecimento e com maior confiabilidade. Assumo que um passo necessário para sermos bons cientistas passa por conhecer os diferentes modos de obtenção de conhecimento. A continuação, lhe introduzirei aos métodos mais conhecidos e utilizados. Deste modo, espero justificar um esquema unificado de obtenção de conhecimento que lhe facilite a assimilação de conceitos apresentados em futuros cursos de estatística e delineamento experimental. Vamos lá: No século IV a. c., Aristóteles definiu o raciocínio demonstrativo, ou lógica aristotélica, em seis obras conhecidas coletivamente como Organon. De acordo com Aristóteles, existem termos gerais (Ex. os homens) e termos particulares (Ex. Socrates) que se referem a subconjuntos dos termos gerais. Segundo este método, estes elementos podem ser identificados e, relacionando estes através de construções lógicas (silogismos), é possível derivar conhecimento novo e necessariamente certo (inferências). Nestas construções, a combinação de dois ou mais enunciados verdadeiros (Ex. todos os homens
- 14. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 4 Julho/2010 são primatas; Sócrates é um homem) permitem inferir um novo conhecimento, também verdadeiro (então Sócrates é um primata). O sistema lógico inventado por Aristóteles, nos permite até hoje combinar observações consideradas certas para fazer crescer nosso conhecimento. Porém, Aristóteles não criou um sistema formal para a determinação da veracidade ou generalidade dos termos, fazendo com que esta determinação fosse, durante muito tempo, feita com base no conhecimento prévio e subjetivo dos naturalistas. Em 1620, Francis Bacon rompeu com a tradição da lógica aristotélica propondo evitar que prévias doutrinas intercedam nas nossas observações. Para Bacon, só era possível aumentar nosso conhecimento através da experimentação e das observações. O conhecimento gerado permitiria, segundo ele, explicar de forma cautelosa, situações relativamente similares. Produzir explicações sobre grupos de casos gerais com base no que sabemos de casos particulares é definido por ele como indução. Para Bacon, este conhecimento deveria gerar novos experimentos e ser testado em diversas situações. Ele defendia que os cientistas deveriam ser céticos acima de tudo, e não aceitar explicações que não possam ser verificadas pela observação e experiência. Bacon, entretanto, não clarificou quantas nem como deviam ser feitas as observações para assumir um conhecimento como certo. Em 1670, Bayes elaborou um método lógico de atribuir uma probabilidade a afirmações geradas por indução. Este método é conhecido como lógica probabilística indutiva. Assume que a probabilidade de uma hipótese ser verdadeira pode ser calculada multiplicando: A) nossa expectativa de que a hipótese seja certa, expressada em forma de probabilidade prévia, vezes B) um valor de verossimilhança (likelihood) obtido a partir de novas observações (Bayes 1763). Desta forma, a probabilidade bayesiana fornece uma medida de quanto é razoável acreditar em uma hipótese usando toda a informação de que dispomos (Jaynes 2003). Um problema com este método é que as probabilidades prévias podem mudar subjetivamente com o pesquisador, e isto afeta ao resultado final. Outro problema é exposto na continuação. Karl Popper (1934) enunciou o Método hipotético-dedutivo, chamado também probabilismo ou falsificacionismo. Segundo este método, não é possível derivar probabilidades para asserções geradas por indução (Popper 1959) (ex. o simples fato de que todos os corvos que vi até agora são pretos, não permite calcular a probabilidade de que o próximo corvo que eu veja será preto, pois não conheço quantos corvos existem no mundo). Para Popper, o conhecimento deve estar justificado de forma lógica. Deste modo, ele defende que só podemos justificar de forma lógica a crença em uma teoria, em quanto previsões derivadas logicamente desta estejam sobrevivendo a testes com base em observações. Segundo este autor, a validade de uma teoria pode ser testada de quatro formas diferentes: 1) Determinando se as conclusões de uma teoria contradizem-se entre
- 15. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 5 elas (Para este autor, você pode considerar “conclusões de uma teoria” sinônimo de previsões, predições ou hipóteses). 2) Verificando a estrutura lógica da teoria, para determinar se esta é empírica ou é uma tautologia; 3) Comparando com outras teorias para saber se o fato de superar nossos testes suporia um avanço científico; 4) Testar empiricamente as conclusões. Para testar as conclusões, Popper propõe testar aquelas que vão mais de contra com a teoria e que possam ser mais severamente testadas. Um dos problemas principais apontados a este método é que não gera crescimento da certeza relativa nas diferentes teorias, por considerar-se que sempre existirão infinitas possíveis teorias competindo para explicar cada fenômeno. Outros autores tem defendido o uso da verificação para aumentar nossa certeza sobre teorias (Ex. Sober 1999 e Lloyd 1987, citados por Lewin-koh et al. 2004). Apesar do problema lógico apontado por Popper, vários autores baseiam-se no procedimento de “verossemelhança máxima” popularizado por Fischer (Aldrich 1997) para defender que a verificação de certas hipóteses em várias instâncias (ex. uma relação entre taxa de ventilação e percentagem de O2 no fluxo sanguíneo dos pulmões foi observada em vários vertebrados) permite obter confiança objetivamente mensurável sobre predições feitas para novas observações (Ex. relação entre a taxa de ventilação e percentagem de O2 no torrente sanguíneo de um novo vertebrado que ventila). A representação matemática destas relações é comumente chamada de modelagem. Onde os modelos podem ser considerados representações matemáticas que descrevem ou relacionam variáveis. Em geral, podemos observar que os métodos de obtenção de conhecimento desde Bacon valem se de concepções que representam o que pensamos do mundo real (Ex. teorias, modelos, hipóteses) e seu contraste com observações do mesmo (também representadas em forma de variáveis, amostras, etc). Na literatura, podemos encontrar uma diversidade de significados para estes conceitos em função do autor e a área da ciência (Suppes 1960). Pessoalmente, opino que para que grupos de conceitos sejam úteis e mais facilmente ensináveis estes devem ter significados específicos e estar relacionados entre eles de forma lógica. Por isto, neste capítulo combinei a relação entre modelo e teoria proposta por Suppes (1960) e a relação entre modelo e hipótese proposta por Underwood (1997). Desta forma estes conceitos ficam hierárquica e logicamente relacionados, e seus significados são aceitáveis desde os diferentes modos de obtenção de conhecimento (compare com Jaynes 2003, durante sua apresentação de raciocínio plausível, uma abordagem verificacionista da obtenção de evidência). Assim, é possível inserir-los num processo unificado de obtenção de conhecimento científico que combina teoria e observação. O mapa de conceitos na figura 1 representa tais relações.
- 16. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 6 Julho/2010 Sistemas biológicos Teorias Modelos Hipóteses (=predições) Variáveis dos que se derivam relacionam ou descrevem representados por compostas por explicam predizem valores sob determinadas circunstancias Figura 1 - Relações lógicas entre conceitos centrais ao processo de obtenção de conhecimento. Mapa de conceitos baseado nas propostas de Suppes (1960) e Underwood (1997). O que é Fisiologia Comparativa? Em 1950, Prosser listou alguns objetivos da fisiologia comparativa como disciplina. Estes foram: 1) Descrever como os organismos obtêm seus requerimentos no ambiente onde moram. 2) Prover bases fisiológicas para entender a ecologia. 3) Chamar a atenção sobre animais particularmente bons para estudar processos fisiológicos. 4) Encontrar generalizações derivadas do uso de distintas espécies animais em estudos fisiológicos. Um campo com grande desenvolvimento da fisiologia comparativa é a fisiologia evolutiva, que busca entender a evolução dos parâmetros fisiológicos (Garland & Carter 1994). Uma vez que as técnicas moleculares têm acelerado nosso conhecimento das relações filogenéticas entre as espécies, muitos cientistas tentam desvendar processos evolutivos através da comparação de características em linhagens de espécies com filogenias conhecidas (Wiens, 2008). Este campo da fisiologia comparativa nos proporciona um exemplo de como dois ou mais métodos de obtenção do conhecimento podem ser combinados (Fig. 2). Imagine que queremos saber se, em lagartos, morar em hábitats abertos provoca um aumento da taxa
- 17. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 7 metabólica com relação a morar em florestas. Para isto, poderíamos comparar espécies de área aberta com espécies de floresta. Assim, poderíamos obter que espécies de áreas abertas têm uma maior taxa metabólica (Fig. 2, esquerda). Entretanto, as espécies são elementos que apresentam relações filogenéticas. Imagine que estas fossem representadas pelo gráfico A, veríamos que as espécies de área florestada pertencem à linhagem da esquerda e as de área aberta à linhagem da direita. Poderíamos ter certeza que é o tipo de hábitat quem faz aumentar a taxa metabólica? Teríamos mais certeza se nossa hipótese fosse representada por B? taxametabólica floresta área aberta sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp6 sp7 sp8 sp5 sp6 sp7 sp8sp1 sp2 sp3 sp4 sp5 sp1 sp7 sp2sp6 sp2 sp8 sp4 B A Figura 2. Comparação hipotética da taxa metabólica entre espécies de lagartos de áreas de floresta e de área aberta. Os cladogramas A e B mostram diferentes relações filogenéticas entre as espécies comparadas. Sob a hipótese de parentesco A, as espécies de cada tratamento são aparentadas, implicando em que a taxa metabólica mais baixa pode ser devida a viver em floresta ou a ser simplesmente uma característica compartilhada do grupo. Sob a hipótese de parentesco B, a menor taxa metabólica não pode mais ser explicada pelo parentesco, pois em todos os pares de espécies mais aparentadas a que mora na mata tem a taxa metabólica mais baixa que a que mora em um hábitat aberto. Hoje em dia, métodos indutivos (análise bayesiana) e verificacionistas (análise da verossimilhança máxima) estão entre os mais usados para escolher dentre hipóteses de relações filogenéticas (Amorim 2002). Por outro lado, tanto métodos falsificacionistas (Ex.Teste de Fisher) quanto verificacionistas nos permitiriam testar de maneira objetiva se a taxa metabólica aumenta em função do tipo de habitat, com base em amostras da taxa metabólica das espécies referidas. Deste modo, os produtos dos diferentes métodos de obter conhecimento podem ser combinados dentro de uma disciplina científica. Por exemplo, na fisiologia comparativa. Você concorda com esta forma de proceder, ou opina que só podemos confiar em um modo de obtenção de conhecimento? Aqui não é possível
- 18. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 8 Julho/2010 estender-se mais sobre este assunto, mas lhe recomendo que consulte Sober (2008) antes de decidir-se.
- 19. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 9 Formulando perguntas em fisiologia comparativa Agustín Camacho Guerrero Laboratório de Herpetologia agustin.camacho@usp.br Buscando trabalho: como levantar uma pergunta a responder. Centremo-nos agora sobre o seu trabalho: fazer ciência. Você sempre deverá começar com uma pergunta que, para ter certeza de que vale a pena respondê-la, deverá ter surgido do conhecimento do estado da arte da disciplina de interesse. Quando realizamos perguntas baseadas sobre conhecimento levantando por outros pesquisadores, as chances de gerar um maior avanço científico se multiplicam. “Levante-se sobre os ombros dos gigantes” diria Issac Newton. É necessário pensar duas vezes antes descrever um aspecto da fisiologia de uma espécie ou grupo de espécies sob o pretexto único de que “nunca foi estudado”. Isto pode estar escondendo o problema de que não sabemos o que é mais relevante saber sobre nosso objeto de estudo (Peters, 1987). Existem várias ferramentas em internet e nas bibliotecas para encontrar este conhecimento (Web of Science, Biological Abstracts, Zoological Records, Google Acadêmico etc.). Através destas ferramentes podemos procurar artigos ou livros que falem sobre nosso tema de interesse. É importante uma cuidadosa seleção de palavras chave, para encontrar o grupo de artigos que tratam o tema de nosso interesse (uma opção: use os conceitos relacionados na sua hipótese de estudo). Uma vez conseguidas algumas referências devemos procurar o material. Nas universidades públicas brasileiras o portal de periódicos da CAPES garante acesso a vários jornais científicos on-line. Em são Paulo, a Fapesp ainda fornece acesso ao site Jstor, com artigos mais antigos. “O sistema COMUT de bibliotecas brasileiras permite, mediante prévio pagamento, a solicitação de xérox ou arquivos ”.PDF” de quaisquer artigos ou separatas que se encontrem numa biblioteca brasileira. Por último, você pode pedir diretamente ao autor ou conseguir na internet do seu site pessoal, ou site do laboratório onde trabalha. Exija da sua universidade maior acesso a revistas científicas e participe da solicitação de livros na biblioteca da sua unidade! Em seguida, leia organizadamente o material bibliográfico e busque mais entre as referências bibliográficas destes trabalhos. As perguntas podem surgir como hipóteses que refutam as previsões centrais da teoria comumente aceita sobre um determinado tema, ou bem como a necessidade de dados sobre aspectos fisiológicos de determinadas espécies ou grupos que a complementam.
- 20. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 10 Julho/2010 Como ser objetivo: Transformação da pergunta em um gráfico Uma vez que tenhamos uma pergunta e confiamos em que esta tem relevância suficiente para investir o esforço necessário, deveremos formulá-la da maneira mais clara possível. Isto é fundamental para: A) determinar o que queremos medir exatamente, desenhar nossas observações de modo a evitar que estas nos confundam; B) fazer testes estatísticos que nos permitam calcular, de maneira objetiva, confiança sobre a resposta indicada pelas nossas observações e C) determinar se os custos para responder esta pergunta são altos demais como para tentar responde-la. Uma pergunta clara é aquela que pode ser expressa como uma previsão, ou hipótese, Ex. “a testosterona estimula o comportamento agressivo na piranha?” ou “a taxa de crescimento dos girinos é mais alta em presença de Iodo na água?” Um indício de que a pergunta está bastante clara é que você pode ver nos dois exemplos, é que podemos transformar a pergunta em hipótese só tirando o ponto de interrogação. Levantar uma pergunta clara sobre o mundo implica necessariamente que possamos representá-la em um gráfico cartesiano (Magnusson e Mourão, 2004) (ou tal vez em uns poucos, caso responder sua pergunta precise de algumas sub-perguntas). Fazer uma representação gráfica dos nossos objetivos ajuda a esclarecer quais os tipos de variáveis devemos e podemos medir. Ainda, ao facilitar a exposição dos nossos objetivos e resultados esperados a outras pessoas (Cleveland, 1984), permite que as outras pessoas realizem sugestões ou críticas mais importantes antes de começar todo o trabalho (Magnusson e Mourão, 2004). Os eixos do gráfico devem representar as partes de nossa pergunta. Os fatores ou variáveis independentes serão representados sempre no eixo horizontal e as variáveis dependentes ou de interesse são representadas sempre no eixo vertical (Cleveland, 1984). Agora estamos em condições de decidir se usaremos variáveis contínuas ou categóricas para representar nossos fatores e variáveis de interesse. Variáveis contínuas representam características da natureza atribuindo-lhes números reais, enquanto que variáveis categóricas dividem estas variáveis sob critérios subjetivos para representá-las 4. Desenho das observações que respondem à pergunta Quadro 1. Esquema básico do processo de trabalho científico. 1.Leitura e observações prévias 2. Identificação da lacuna de conhecimento 3. Emissão da pergunta cuja resposta preenchea lacuna 5. Execução e análise das observações 7. Interpretação 8. Comunicação de resultados e conclusões.
- 21. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 11 (etiquetas, categorias). Entre os exemplos mais comuns de variáveis contínuas estão: comprimento de onda, peso, comprimento, concentração, etc. como variáveis categóricas podemos citar cores, sexo, tratamento. As variáveis contínuas proporcionam mais informação, enquanto as categóricas são mais simples de entender e manejar. O melhor tipo de variável vai depender essencialmente da sua pergunta e dos recursos disponíveis. Os tipos de variáveis escolhidas determinarão o tipo de gráfico utilizado. Entre os gráficos mais informativos e fáceis de entender estão os gráficos de nuvens de pontos, gráficos de dispersão, ou scatter plots (Magnusson e Mourão, 2004). Podemos encontrar dois tipos básicos, o primeiro tem variáveis categóricas no eixo horizontal, o segundo usa variáveis contínuas no eixo horizontal (Fig. 3). O CHUMBO NA ÁGUA INFLUENCIA A TAXA METABÓLICA DOS GIRINOS? muito chumbo pouco chumbo concentração de chumbo na água A B taxametabólica taxametabólica Figura 3. Exemplos de gráficos de dispersão. A) gráfico com fator categórico. B) Gráfico com fator contínuo (modificado de Magnusson e Mourão, 2004). Como mostra a Fig. 3, quando categorizamos variáveis podemos perder informação (Magnusson e Mourão, 2004). Se na pergunta anterior o pesquisador tivesse escolhido comparar duas concentrações de chumbo, não teria detectado o efeito do chumbo sobre o crescimento dos girinos, mesmo quando realmente existe uma relação entre as variáveis. Por outro lado, as categorias podem ser mais didáticas e fáceis de manejar. Por isto é necessário estar seguro sobre qual informação se quer obter para decidir sobre que tipo de variável usar.
- 22. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 12 Julho/2010
- 23. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 13 Evitando confundir-nos: aspectos fundamentais do desenho experimental e a estatística inferencial. Agustín Camacho Guerrero Laboratório de Herpetologia agustin.camacho@usp.br Agora que já sabemos qual é nossa pergunta e como representá-la, deveremos realizar observações que a respondam. Entretanto, um dos maiores problemas para responder perguntas sobre sistemas naturais é que estes são afetados por múltiplos fatores. Estes são fatores cujo efeito se mistura com o do nosso fator de estudo, de maneira que pode ser impossível saber se a variação observada na variável dependente é derivada de nosso fator ou destes fatores (Hurlbert, 1984). Por exemplo, um experimentador poderia determinar que a secreção de saliva é controlada pela presença de alimentos na boca, uma vez depositados alimentos na boca de um animal e medindo variações no volume de saliva. Entretanto, se ele não tiver o cuidado de administrar alimentos sem que o animal os veja ou os cheire, a secreção de saliva poderia ser provocada pela visão ou cheiro destes antes que pela sua presença na boca do animal. Para um cientista, é crucial aprender a enxergar e evitar fatores que confundam suas conclusões de maneira não desejada ou oculta. O desenho experimental representa nossa decisão de quantas observações necessitamos e como as distribuímos para evitar que fatores de confusão, influenciem em nossa resposta (Quinn e Keogh, 2002). Erros cometidos durante o desenho amostral podem fazer com que o efeito de fatores inadvertidos seja indistinguível do efeito dos teus fatores de estudo. Para evitar confusões ao comunicar-se com colaboradores durante a fase de planejamento é conveniente aprender claramente os seguintes conceitos: Unidade amostral, repetição ou réplica: elas são cada uma das observações que gera uma resposta a sua pergunta (são os pontos nos gráficos); Universo amostral: é aquela parte da natureza sobre a qual se quer obter informações por meio de observações e a qual se aplicam nossas conclusões. O que significa testar uma hipótese? Como vimos antes, para avançar em ciência derivamos hipóteses a partir de modelos considerados válidos cuja rejeição/aceitação com base em observações implicaria no refinamento ou rejeição das teorias que possuímos sobre o mundo. Testar uma hipótese é mesmo isto: contrastar os valores das nossas observações com os valores que esperaríamos para ela (No falsificacionismo, compararíamos com os valores esperados caso nossa hipótese não fosse correta. No verificacionismo, compararíamos as observações com diferentes possibilidades teoricamente justificadas).
- 24. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 14 Julho/2010 Frequentemente, queremos realizar algum de dois tipos de testes: A) se os valores de nossa variável de interesse estão relacionados com uma ou mais variáveis independentes (fatores), ou B) Se os valores de nossa variável de interesse feitas em duas ou mais situações diferentes (tratamentos) são iguais ou diferentes (Fig.4). variação provocada pelo fator ruído fator variável dependente tratamento 1 tratamento 2 ruído variação provocada pelo fator A B variável dependente Figura 4. “Scatter-plots” mostrando a distribuição da variação em dois tipos básicos de análise: A) análise da relação entre duas variáveis e B) comparação do efeito de dois tratamentos sobre uma variável. Você pode estar-se perguntando: “para que toda esta complicação?” A resposta é a seguinte: como normalmente só conseguimos observar uma parte da variação de nosso sistema de estudo, é possível que o resultado de nosso experimento seja esperado pelo acaso. Os testes estatísticos nos permitem estimar o quanto é seguro aceitar a resposta a nossa pergunta (= houve/não houve relação; houve /não houve diferença, que hipótese suporta melhor os dados), em função de como a variabilidade está partilhada nos dados que representam nossas observações. Uma forma comum de fazer isto é distribuir-se a variação encontrada em tal conjunto de dados em variação provocada por um fator (efeito) e a variação não devida a este fator (ruído) (Fig. 4). Neste caso, a finalidade de um experimento é avaliar se a variação provocada pelo fator é, uma vez isolados possíveis fatores de confusão, maior do que o ruído. Associado a este tipo de experimento, um teste falsificacionista compararia a distribuição de freqüências observadas com a distribuição de freqüência teórica (=hipótese): esperada no caso de que o ruído seja maior que o efeito. Um teste verificacionista compararia a distribuição de freqüências observadas com as distribuições de freqüências teóricas para os dois casos possíveis: que o efeito seja maior ou vice-versa.
- 25. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 15 Repetição, pseudorepetição e confiança. Lembra do problema no final do capítulo 1? Quando um fator altera os valores de nossas repetições, de modo que faz com que seu valor esteja relacionado, as repetições são chamadas de pseudorepetições. Aumentar o número de repetições nos permite aumentar nossa confiança no resultado, mas isso não acontece com as pseudorepetições, apesar de que aumentar o número de pseudorepetições pode nos dar uma falsa sensação de confiança. Para entender a relação entre fatores de confusão, confiança e pseudorepetição, leia o seguinte exemplo: Imagine que você quer ir “bonito(a)” a uma festa. Em que caso você se sentiria com maior confiança sobre as opiniões: depois de perguntar a sua mãe? Depois de perguntar a sua mãe, avós e tias? Depois de perguntar a um(a) colega, ou depois de perguntar a várias meninas não muito próximas? Como pode ter deduzido, perguntar a suas avós e tias depois de perguntar a sua mãe não vai trazer tanta confiança, pois é provável que vão dizer que você está muito bonito(a). Na opinião de cada uma delas está embutido o fator de confusão “parentesco” (que, vamos lá, é importante neste caso!). Agora, se você pergunta a um(a) colega, e sua resposta é que você está “muito bonito(a)”, você poderia ainda pensar que “ele(a) quer te agradar”. Finalmente, se a resposta deste(a) colega) concordar com a de outros(as) colegas não relacionados(as) com ele(a), sua confiança em que você está bonito(a) aumentará muito! Cair na pseudorepetição é acreditar que repetições aumentaram nossa confiança sobre a resposta a nossa pergunta quando estas, na realidade, estão relacionadas por um fator de confusão. Busque sempre respostas independentes para suas perguntas! Provocam pseudorepetição aqueles fatores que não fazem parte do estudo e que fazem com que os valores de nossas observações não sejam independentes entre eles. Tipos gerais de pseudo-repetição incluem: espacial= as observações tem valores relacionados por causa da sua posição no espaço, temporal= quando o fator que relaciona os valores das observações é o tempo, filogenética= provocada por relações de origem comum entre as observações e técnica= quando é um elemento do equipamento ou procedimento experimental que está relacionando os valores obtidos nas observações. Obtenha informações mais detalhadas e mais exemplos em Hulbert (1984) e Magnusson e Mourão (2004). Existem outros aspectos do desenho de um experimento. Por exemplo, decidir quantas observações serão necessárias, se estas serão dispostas aleatória ou sistematicamente, e como serão feitos os controles. Explicar isto está fora do tempo disponível para este módulo, mas todos estes passos são críticos para o sucesso do seu trabalho. Lhe recomendo que leia a maior quantidade de literatura possível sobre desenho experimental e estatística antes de começar a coletar seus dados. Comece pela tabela de
- 26. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 16 Julho/2010 Magnusson e Mourão (2004), pag. 4. Parafraseando a Peters (1987): Não fazer isto “porque você não teve tempo” facilmente acabará em que todo o esforço e dinheiro público investido não sirvam para nada.
- 27. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 17 O Fim da Picada: Comunicando Ciência. Agustín Camacho Guerrero Laboratório de Herpetologia agustin.camacho@usp.br Pense por um segundo no momento no qual você terminará seu experimento. Foi um caminho árduo: você teve que ler vários artigos que não entendia bem ou com os quais nem concordava para levantar uma pergunta não respondida até agora. Passou tempo lendo, pensando e discutindo o projeto com outras pessoas que, às vezes, não lhe entendiam bem. Suas idéias sofreram críticas, você teve que esperar longas burocracias (licenças, solicitação de fundos) e repetir seu experimento várias vezes, resolvendo inúmeros problemas (animais que morrem antes de obter os dados, infra-estrutura falha, falta dinheiro, segurança, etc.). Conseguiu imaginar? Com certeza você vai lembrar-se deste parágrafo depois do seu mestrado... Bom, se você não tem cuidado no que vem agora, tudo isso pode não ter servido de nada. A valia dos cientistas se mede grandemente a través da qualidade e quantidade de artigos científicos que publicam. Para isto, uma grande dose de experiência é necessária. Recomendo que você a procure em seu orientador e lendo artigos nas revistas onde pretendam publicar. Assim mesmo, busque textos (Ex. referências neste capítulo, manuais de redação de jornais científicos) e faça cursos especializados no tema. A continuação, veremos algumas dicas básicas para estruturar textos científicos. Estas dicas estão baseadas no livro de Peters (1984), e você deve dominá-las desde o começo. Repassaremos aqui as partes de um relatório de pesquisa, as relações lógicas entre elas e alguns elementos básicos que devem conter. Partes e estrutura de um relatório de pesquisa. Um relatório de pesquisa deve ser tão claro, preciso e curto quanto seja possível. Basicamente, consta de 7 partes: título, resumo, introdução, material e métodos, resultados, discussão, agradecimentos e referências. Veja dicas úteis sobre o título, agradecimentos e referências na tabela 1. Iremos nos estender mais nas seções de resumo, introdução, material e métodos, resultados e discussão. O resumo se compõe normalmente de um parágrafo que demonstra a relevância e os objetivos do estudo, e explica de forma sucinta os métodos empregados e os principais resultados e conclusões. Dentro da introdução devem ficar claros: A) o problema que vamos abordar e sua relevância B) o estado da arte sobre o problema, mostrando a lacuna de conhecimento que pretendemos preencher e porque precisa ser preenchida e C) as decorrências dos possíveis
- 28. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 18 Julho/2010 resultados de nosso trabalho. Por último, os objetivos devem aparecer da forma mais clara possível. Concretamente, em forma de hipótese a ser testada. O “material e métodos” deve conter uma explicação clara dos métodos empregados para alcançar o objetivo declarado no fim da introdução. Desta forma, as técnicas, o desenho experimental e as análises devem aparecer explicados e justificados de forma que os leitores sejam capazes de: A) entender como alcançam o objetivo escolhido B) Repeti-lo C) perceber possíveis fraquezas no delineamento. Se evitarmos mostrar claramente nosso desenho experimental pode ser que rejeitem nosso relatório na revista que o queremos publicar. Pior ainda, podemos enganar aos nossos leitores. A seção de “resultados” deve dar toda a informação necessária para responder nossa pergunta inicial e que outros possam avaliar se a respondemos mesmo ou não. Isto implica em descrever as observações feitas, estabelecendo as relações que foram estatisticamente significativas e as que não foram. Os dados, quando numerosos, devem ser apresentados em forma de tabelas. Os gráficos devem expor a parte mais importante dos nossos resultados (nossa pergunta e as observações que a respondem) e informar sempre o número de repetições. Se nos nossos resultados, os gráficos não representam as partes de nossa pergunta, a evidência gerada para respondê-la parecerá fraca a vista dos outros (Magnusson, 1966). Tanto tabelas quanto gráficos devem ter uma legenda curta e auto-explicativa, e serem numerados, de forma que possam ser referidos no texto. Dados apresentados em tabelas e gráficos devem ser explicados também no texto, mas evitando redundância. Na discussão, devemos expor como nossos resultados se relacionam com a hipótese que pretendíamos testar, reconhecendo as fraquezas que puderem comprometer os resultados. Em seguida, mostrar a consistência (ou inconsistência) dos nossos resultados com os resultados de outros trabalhos levantados na introdução, mostrando quais as implicações dos nossos resultados sobre a lacuna de conhecimento levantada. Por último, este é o lugar onde se deve apontar, curtamente, futuros experimentos ou hipóteses testáveis que permitam avançar no entendimento do problema abordado. Se o relatório tem vários objetivos, estes devem seguir a mesma ordem na introdução, material e métodos, resultados e discussão. A fim de facilitar a interpretação do leitor. Veja uma lista de verificação básica para identificar problemas em seu relatório de pesquisa (Tab.1). Busque críticas, seja crítico e ajude à ciência progredir. Einstein dizia que se você não consegue explicar seu trabalho a seu avô, é porque você não entende bem o que está fazendo. Agora, eu digo a você que, explicando corretamente para ele, até seu avô poderia fazer críticas imprevistas e acertadas sobre o
- 29. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 19 seu trabalho. A comunidade científica deve ajudar-se a través de visão crítica e sentido construtivo. Lembre-se que em ciência, tratamos com assuntos que, via de regra, são complicados. Isto faz com que todos nós cometamos erros. Para evitar erros em seu experimento, a melhor saída é apresentar seu projeto a pessoas com visão crítica. Se estas pessoas conseguem entendê-lo perfeitamente, poderão julgar se foram convencidas ou não pelos seus argumentos. Encontrar falhas nos aspectos do desenvolvimento lógico do trabalho de um colega pode ser de grande ajuda para ele, antes que invista grande esforço e dinheiro em um projeto mal planejado. Assim mesmo, podemos evitar que um trabalho confunda a comunidade científica através da geração de evidências ou argumentos que permita mostrar que este está errado. Considerações finais. Terminou este capítulo que pretendia mostrar-lhe um pouquinho do que vem pela frente. A melhor forma de enfrentar os próximos anos de preparação é você que deve planejar. A lista de referências que segue é uma seleção da literatura que fez muita diferença na minha própria formação (alguma delas chegou um pouco tarde). Espero que lhe ajude.
- 30. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 20 Julho/2010 Tabela 1: Lista de verificação na redação de um relatório de pesquisa. No título O titulo representa os elementos da sua pergunta? E o universo de estudo? Na introdução: A lacuna de conhecimento está clara? Esta se deriva logicamente do estado da arte da disciplina? Os objetivos buscam preencher esta lacuna? Os conceitos mantêm o significado ao longo do texto? Os objetivos buscam testar ou verificar uma hipótese? Nos métodos: Há pontos importantes para julgar a validade do trabalho que não foram explicados? Está claro para que serve cada seção dos métodos? As medidas realizadas e os procedimentos adotados estão claramente justificados? No caso de várias hipóteses, as análises estão redigidas na mesma ordem que os objetivos? Nos resultados: Um gráfico de dispersão representa a resposta a nossa pergunta principal? O número de observações está claro no gráfico? Existe redundância entre a informação mostrada no texto e os dados apresentados nos gráficos e/ou tabelas? No caso de vários objetivos, os resultados foram apresentados na mesma ordem que as análises dos métodos? Os dados mostrados permitem julgar se as análises foram feitas corretamente? Na discussão Foram discutidos problemas que possam ter interferido na resposta? Os resultados de estudos comparados com o nosso são mesmo comparáveis? As conclusões e sugestões derivam logicamente dos resultados? Mostraram-se novas hipóteses para avançar no entendimento do tema abordado? Nos reconhecimentos As pessoas/organizações que prestaram a ajuda ou licenças mais fundamentais estão presentes? Nas referências Todas as citações, e só as que estão no texto, aparecem na seção referencias?
- 31. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 21 Glossário Etimologia: parte da gramática que estuda da história ou origem das palavras. Lei científica: relação tão demonstrada empiricamente que é assumido que sempre vai ser observada em determinadas condições. Princípio científico: pode ser considerado sinônimo de lei científica Epistemológico: relativo ao estudo do funcionamento da ciência. Silogismos: arranjos de três proposições lógicas onde a última se deduz necessariamente das duas anteriores Inferência: conclusão, seja esta tomada sobre uma população, a partir de uma amostra da mesma, ou bem tomada a partir da combinação lógica de duas premissas verdadeiras (Ex: Se as premissas de que todos os homens tem coração e que Sócrates é um homem são verdadeiras, então podemos inferir que Sócrates tem coração) Casos gerais e particulares: Para Aristóteles e Bacon, são duas categorias que mostram generalidade de aplicação de um conceito. Indução: Raciocínio ou forma de conhecimento pelo qual passamos do particular ao universal, do especial ao geral, do conhecimento dos fatos ao conhecimento das leis. Probabilidade prévia: estimação subjetiva da probabilidade de um evento, prévia a um experimento. Verossimilhança: Dado um conjunto de dados observados, a verossimilhança valoriza a plausibilidade de um descritor hipotético deste conjunto, sobre outro possível descritor. verossimilhança é proporcional à probabilidade de observar os dados sendo um determinado descritor verdadeiro. Teoria: explicação sobre um fenômeno. Para Popper, deve ser um conjunto de enunciados. Diferencia-se de lei porque a teoria não precisa ter sido demonstrada amplamente com dados empíricos. Conclusões, previsões, predições ou hipóteses: uma proposição aceitável do ponto de vista de uma teoria ou um modelo, mas ainda não conferida. Modelo: tem variados significados dependendo do contexto, porém a maioria pode ser considerada como “representação simplificada”. Dentro do processo de geração de conhecimento um modelo pode ser considerado como uma representação de relações entre variáveis acorde com a teoria da que forma parte tal modelo. Teoria empírica: Segundo Popper, aquela teoria que pode ser testada. Tautologia: uma afirmação lógica onde as premissas são iguais à conclusão. (ex. estes animais não são aquáticos, logo eles não moram na água) Filogenia: representação de relações de parentesco entre espécies ou grupos de espécies. Caráter ancestral: característica considerada original para um grupo de espécies. Teste: prova, ensaio, exame.
- 32. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 22 Julho/2010 Tratamento: aqui tratado como manipulação. Fatores ou variáveis independentes: elemento ou circunstância que contribui a produzir um estado em uma variável influenciada por ele. Variáveis dependentes ou de interesse: variável cuja variação estamos interessados em explicar, sendo influenciada pelos fatores. Efeito: influencia de um elemento sobre outro. Ruído: variação não devida ao fator. Pseudorepetições: observações cujos valores estão afetados por um fator de confusão. Bibliografia Aldrich, J. 1997. R. A. Fisher and the Making of Maximum Likelihood 1912-1922. Statistical Science.12;162-176. Amorim, D. S. (2002) Fundamentos de sistemática filogenética. Editora Holos, Ribeirão Preto, Brazil, 154 pp. Aristóteles (350 A.C). Prior Analytics (livro 1). Trad. Por A.J. Jenkinson. Disponível em: http://ebooks.adelaide.edu.au/ (Maio 2009). 59 pp. Bayes, T. (1763) An Essay towards solving a Problem in the Doctrine of Chances. Philosophical Transactions of the Royal Society of London 53, 370–418. Cleveland, W. S. (1987) Graphs in scientific publications. American Statistician 38: 26-19. Francis Bacon. (1620) Novum Organum.Trad por J. Spedding (1858). Disponível em: http://en.wikisource.org/wiki/Novum_Organum (Maio 2009). Jaynes, E. T. (2003) Probability Theory: The Logic of Science. Cambridge University Press, Cambridge. Disponível em: http://www-biba.inrialpes.fr/Jaynes/prob.html (maio 2009). Lewin-Koh, N., Taper, M.L, Subhash R.L. 2004. A brief tour of statistical concepts. The nature of scientific evidence, statistical, philosophical and empirical considerations(eds. Taper, M.L, e Subhash R.L.). The university of Chicago Press. 567p. Magnusson, W. E. (1996). How To Write Backwards. Bulletin of Ecological Society of America 77, 88- 88. Magnusson, W. E.; Mourão, G. (2004) Statistics without Math. 1. ed: Editora Planta / Sinauer Associates. Londrina. 136 pp. Morris C. (1992) Academic Press Dictionary of Science & Technology. Morris Books, Escondido, California, USA. 2342 pp. Peters, R. H. (1991) A Critique for Ecology. Cambridge University Press, New York 366 pp. Popper, K. R.(1959). The logic of scientific discovery. First English edition by Hutchinson & Co. 545 pp. Quinn G.P.; Keogh M.J. (2002) Experimental design and data analysis for biologists. Cambridge University Press; Cambridge. 557pp.
- 33. Método Científico Aplicadoa Estudos em Fisiologia Comparativa Julho/2010 Pág. 23 Huey, R. B. (1987) Reply to Stearns: Some acynical advice for graduate students. Bulletin of the Ecological Society of America 68: 150-153. Scheiner, S. M.; Willig, M. R. 2008. A general theory of ecology. Theoretical_Ecology. 1:21–28. Sober, E. 2008. Evidence and Evolution: The Logic Behind the Science, Cambridge UP, 392pp. Stearns, S.C. 1987. Some modest advice for graduate students. Bulletin of the Ecological Society of America 68: 145-150. Suppes, P. 1960. A comparison of the uses and the meaings of models in mathematics and physics. Technical report Nº 33. Proceedings of the colloquium “La notion et Ie role du modele dans les sciences mathematiques, naturelles et sociales”. North Holland press. Underwood, A. J. 1997. Experiments in ecology: their logical design and interpretation under analysis of variance. Cambridge university press. 522 pp. Underwood, A. J.; Chapman M. G. e Connell. S. D. (2000) Observations in ecology: you can’t make progress on processes without understanding the patterns. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 250, 97-115. Wiens, J. J. 2008. Systematics and herpetology in the age of genomics. Bioscience 58, 297–307.
- 34. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 24 Julho/2010
- 35. Unidade 2 Sinalização Celular MariaNathália de Carvalho Magalhães Moraes Laboratório de Fisiologia Comparativa da Pigmentação nathalia.moraes@usp.br A sobrevivência dos organismos multicelulares depende de uma rede elaborada de comunicação inter e intracelular, que coordena o crescimento, a diferenciação e o metabolismo das células em diversos tecidos e órgãos. Neste módulo, serão abordados os aspectos da evolução da multicelularidade e os mecanismos básicos da transdução de sinais, bem como a contextualização desses mecanismos dentro de patologias, como é o caso da malária. Além disso, será apresentada a técnica do RNAi (RNA de interferência) como ferramenta de estudo para a fisiologia, com destaque para as vias de transdução do sinal em diversos modelos.
- 36. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 26 Julho/2010 Capítulo 5 Comunicação celular: entendendo a ritmicidade endógena pág. 27 Maria Nathália C. Magalhães Moraes Revisado por Dra Ana Maria de Lauro Castrucci Capítulo 6 Fisiologia Celular do Plasmodium durante a fase assexuada pág. 41 Laura Nogueira da Cruz Revisado por Dra. Célia R. S. Garcia Capítulo 7 RNAi: ouvindo a voz do silêncio pág. 49 Maísa Costa Revisado por Dr. Daniel Carneiro Carrettiero Bibliografia pág. 66
- 37. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.27 Comunicação Celular: Entendendo a Ritmicidade Endógena Maria Nathália de Carvalho Magalhães Moraes Laboratório de Fisiologia Comparativa da Pigmentação nathalia.moraes@usp.br Evolução da Multicelularidade O grande passo obtido através da evolução da unicelularidade para a pluricelularidade certamente foi a capacidade de comunicação entre as células, por meio da evolução a partir de uma única célula, a qual desempenhava todas as funções necessárias para o organismo, para um conjunto de células especializadas proporcionando interações entre elas (Ben-Shlomo e col., 2003). Os ancestrais dos organismos multicelulares seriam simples agregados de seres unicelulares, que formavam estruturas designadas colônias. Inicialmente todas as células da colônia desempenhavam a mesma função. Contudo, ao longo do tempo algumas das células da colônia especializaram-se em determinadas funções. A diferenciação celular, relacionada com a função especifica acentuou-se no decorrer da evolução, originando os verdadeiros seres multicelulares. Neste processo foram surgindo diferentes tipos de células, que mais tarde originaram tecidos, os quais levaram ao aparecimento de órgãos. A especialização celular permitiu uma melhor utilização da energia, levando a uma diminuição da taxa metabólica, além de uma maior independência em relação ao ambiente. Para que as células pudessem sincronizar as tarefas e perceber informações do ambiente, foi necessária a especialização de células para percepção do ambiente (receptores sensoriais), centros integradores dessas informações (sistema nervoso) e efetuadores de ajustes homeostáticos (sistema muscular, endócrino e exócrino) (Isoldi e Castrucci, 2007). Para garantir o sucesso e a diversificação da vida, foi necessário o aparecimento de estruturas de ligação e principalmente de comunicação entre as diferentes células. Nos organismos multicelulares, a manutenção da homeostase é dependente de um processamento continuo de informações através de uma complexa rede de células. Além disso, para que o organismo responda a constantes mudanças do ambiente, sinais intracelulares devem ser transduzidos, ampliados e finalmente convertidos para uma resposta fisiológica adequada (Pires-da-Silva e Sommer, 2003). Muitos hormônios, neurotransmissores, quimiocinas, mediadores locais e estímulos sensoriais exercem seus efeitos sobre as células através de ligação a diferentes classes de receptores. Esses transdutores altamente especializados são capazes de modular a sinalização de várias vias que levam a diversas respostas biológicas (Cabrera-Vera e col., 2003). A maioria das
- 38. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 28 Julho/2010 famílias de receptores evoluiu com o advento da multicelularidade e com a necessidade de um comportamento coordenado do organismo (Ben-Shlomo e col., 2003). Alvos para ação dos mensageiros químicos Os mensageiros químicos intercelulares devem atingir células alvo, que possam interpretar os sinais. Para que as células interpretem esses sinais devem apresentar elementos que reconheçam esses mensageiros, os chamados receptores, que mudam sua conformação quando os mensageiros se ligam a eles. A ligação mensageiro-receptor inicia uma cascata de sinalização que irá evocar a participação de diversos segundos mensageiros, ativando múltiplas vias de sinalização. Cada classe de receptor ativa segundos mensageiros específicos, os quais amplificam o sinal e desencadeiam respostas intracelulares específicas para o sinal inicial. Os princípios moleculares nos quais a transdução do sinal se baseia são representados por associações específicas de proteínas e sua fosforilação ou desfosforilação, onde a fosforilação de alvos protéicos leva geralmente a mudanças imediatas em sua configuração e atividade. Deste modo, o balanço entre fosforilação e desfosforilação é determinante para a transdução do sinal intracelular. Ainda, os receptores podem evocar tipos diferentes de efeitos celulares. Alguns deles são muito rápidos em escala de milissegundos, enquanto os efeitos produzidos por hormônios esteróides, por exemplo, ocorrem dentro de algumas horas ou dias (Fig. 1) (Rang e Dale, 2007). Os mensageiros químicos extracelulares podem ser classificados de acordo com a distância que percorrerão do local de sua síntese até a célula alvo, bem como o tipo de inter-relação entre a célula produtora e a célula alvo. Os sinalizadores secretados pela própria célula produtora e que atuam em células adjacentes próximas são chamados de parácrinos, enquanto os sinalizadores que atuam na própria célula produtora são conhecidos como autócrinos, além dos sinalizadores que são lançados na corrente sanguínea, cuja célula alvo encontra-se distante, os quais são chamados de hormônios. Os sinalizadores parácrinos produzidos por células nervosas são denominados neurotransmissores, os quais são lançados na região entre neurônios, entre neurônios e fibra muscular ou entre neurônios e glândula exócrina ou endócrina; essa região é conhecida como fenda sináptica. Os ligantes podem ainda ser classificados quanto à sua solubilidade, em hidrossolúveis e lipossolúveis. Os hidrossolúveis são incapazes de atravessar a membrana celular, e dessa forma, devem ser reconhecidos por receptores localizados na membrana. Já os compostos lipossolúveis apresentam alta afinidade química pela membrana podendo, portanto, atravessar a membrana e atuar dentro das células, chegando muitas vezes ao núcleo, dessa forma sendo reconhecidos por receptores intracelulares (Isoldi e Castrucci, 2007).
- 39. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.29 Figura 1 – Relação receptor e tempo de ação. Adaptado de Rang e Dale, 2007 Interação molécula-receptor Existe uma diferença importante entre agonistas e antagonistas. Agonistas e antagonistas são poderosas ferramentas que permitem a caracterização de estruturas e funções de subtipos de receptores (Squire e col, 2003). Os agonistas ativam os receptores, enquanto os antagonistas podem se combinar com os mesmos sítios, porém sem causar ativação desse receptor, e dessa forma bloqueando o efeito dos agonistas. A ocupação de um receptor por uma molécula de um ligante pode ou não resultar na ativação desse receptor. A ativação do receptor ocorre através da ligação da molécula de tal modo que desencadeie uma resposta tecidual. A ligação e ativação representam duas etapas distintas da geração de uma resposta mediada por um receptor, que é iniciada por um agonista. A tendência de um ligante se ligar aos receptores é dada através de sua afinidade. Os ligantes com alta potência geralmente apresentam alta afinidade pelos receptores e, consequentemente, ocupam uma porcentagem significativa dos receptores, mesmo em baixas concentrações (Rang e Dale, 2007). Tipos de receptores Segundo a estrutura molecular e a natureza do mecanismo de transmissão, os receptores são agrupados em quatro superfamílias, a saber: (1) superfamília tipo 1 - receptores-canal (ou ionotrópicos), receptores de membrana que formam o próprio canal
- 40. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 30 Julho/2010 iônico; (2) superfamília tipo 2 - receptores acoplados à proteína G (GPCRs ou 7-TM ou metabotrópicos), receptores de membrana acoplados a sistemas efetores intracelulares por meio de proteína G; (3) superfamília tipo 3 – receptores enzimáticos, receptores de membrana com domínio intracelular de proteína quinase (em geral, tirosina quinase, fosfatase e outras) e (4) superfamília tipo 4 - receptores reguladores da transcrição de genes (ou receptores nucleares ou receptores intracelulares), receptores solúveis no citosol (Fig. 2). Figura 2 - Tipos de famílias de receptores Superfamília tipo 1: receptores-canal Os íons são incapazes de penetrar na bicamada lipídica da membrana celular, e só podem atravessá-la com a ajuda de proteínas transmembrânicas na forma de canais ou transportadoras. Os receptores do tipo canal são compostos por 4 ou 5 subunidades (α, β, γ, δ) combinadas para formar um canal iônico através da membrana (Fig. 3). Cada subunidade consiste de 4 segmentos transmembrana (TM) referidos como TM1-TM4. Na ausência de um neurotransmissor, esses canais iônicos permanecem em estado fechado e são impermeáveis aos íons. A ligação do neurotransmissor induz uma rápida mudança conformacional que abre o canal, permitindo o fluxo dos íons (Fig. 4). As mudanças na corrente da membrana resultante da ligação do ligante ao canal ionotrópico são geralmente mensuradas numa escala de milissegundos. O fluxo iônico cessa quando o transmissor se dissocia do receptor ou quando o receptor se torna dessensibilizado (Squire e col., 2003). O primeiro receptor dessa família a ser clonado, foi o receptor nicotínico da acetilcolina (nAchR), o qual é usado como modelo para o estudo da estrutura dos receptores ionotrópicos. Sua estrutura pentamérica (2α, β, γ, δ) possui dois sítios de ligação à acetilcolina, cada um na interface das duas subunidades α. Para que o receptor seja
- 41. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.31 ativado, duas moléculas de acetilcolina devem se ligar a esses sítios e, dessa forma, o canal se abre quase que instantaneamente, permitindo a passagem de íons (Rang e Dale, 2007). Os canais controlados por voltagem abrem-se quando a membrana celular é despolarizada. Essa abertura (ativação) induzida pela despolarização da membrana é de curta duração, mesmo quando a despolarização é mantida. Os canais mais importantes nesse grupo são os canais seletivos para sódio, potássio e cálcio. Figura 3 – Estrutura do receptor canal. Figura 4 - Esquema de abertura do canal. Retirado de Squire e col., 2003. Retirado de Squire e col., 2003. Os canais controlados por ligantes são ativados através da ligação de um mensageiro químico extracelular a um sítio na molécula do canal. Os receptores desse tipo controlam os eventos sinápticos mais rápidos do sistema nervoso. A maior parte dos neurotransmissores excitatórios, como acetilcolina, glutamato, ácido gama-amino butírico (GABA) e ATP agem dessa maneira e causam aumento na permeabilidade ao Na+ e K+ . Alguns canais controlados por ligantes respondem a sinais intracelulares e não extracelulares, tais como: (i) canais de potássio ativados por cálcio, se abrem, hiperpolarizando a célula, quando ocorre um aumento da [Ca2+ ]i; (ii) canais de potássio sensíveis a ATP, se abrem quando a concentração intracelular de ATP cai. Esses canais são distintos daqueles que medeiam os efeitos excitatórios de ATP extracelular; (iii) existem ainda outros canais que respondem a ligantes intracelulares, como canais de potássio sensíveis a diacilglicerol, cujas funções ainda não estão bem esclarecidas. Dependendo do íon para o qual o canal é seletivo a alteração no potencial de repouso da célula poderá atuar de forma diferente, podendo levar à despolarização celular, como é o caso de alguns subtipos de receptores de acetilcolina e glutamato, que são canais de sódio ou cálcio; ou dificultando uma eventual resposta de despolarização a um estimulo excitatório, como é o caso de GABA e glicina, que são canais de cloro (Squire e col., 2003). Os receptores canais de glutamato são responsáveis pelo fenômeno de potenciação de longo termo (LTP), plasticidade sináptica e neurodegeneração. O influxo de íons através
- 42. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 32 Julho/2010 do canal aberto é conseqüência da liberação de glutamato do neurônio pré-sináptico e da despolarização da membrana do neurônio pós-sináptico, essa mudança de voltagem da membrana expele íons Mg2+ que estavam bloqueando o canal, fazendo com que este permita o influxo de cálcio e a geração de oxido nítrico e/ou espécies reativas de oxigênio (Kloda e col., 2007). Superfamília tipo 2: receptores acoplados a proteínas G Os receptores da família tipo 2 são de origem antiga, sendo os primeiros receptores a emergirem entre os organismos unicelulares. O papel central desses receptores em organismos multicelulares é refletido por suas divergentes estruturas e funções. A ligação do mensageiro ao receptor acoplado a proteína G (GPCRs) induz uma mudança conformacional no receptor, o qual recruta e ativa diferentes proteínas G, as quais estimulam a geração de adenosina 3’,5’ monofosfato (AMPc), fosfoinositídeos, diacilglicerol e outros segundos mensageiros. Em termo, esses segundos mensageiros disparam eventos como ativação de cascatas cinéticas e fosforilação de fatores citosólicos e transcrição de fatores nucleares (Brivanlou e Darnell, 2002). Os estímulos extracelulares que ativam os GPCRs incluem luz, íons, nucleotídeos, lipídeos, esteróides, aminoácidos modificados, peptídeos e hormônios glicoprotéicos (Ben-Shlomo e col., 2003) Estrutura da proteína G A interação de hormônios, neurotransmissores ou glicoproteínas com os receptores 7TM na superfície da célula induz uma mudança conformacional do receptor que ativa a proteína G – composta das subunidades α, β, γ – no interior da célula. No estágio inativo GDP liga-se à subunidade Gα. (Fig. 5). Quando a proteína G é ativada, o GDP é liberado, e o GTP liga-se à subunidade Gα e assim ocorre a dissociação do complexo Gα-GTP do complexo Gβγ. Dessa forma tanto Gα-GTP quanto Gβγ encontram-se livres para ativar seus efetores, como por exemplo canais iônicos ou enzimas (Pierce e col., 2002). A duração do sinal é determinada pela taxa de hidrólise do GTP da subunidade Gα e subseqüente reassociação de Gα-GDP com Gβγ (Hamm, 1998). A cinética da ativação da proteína G através dos GPCRs tem sido descrita recentemente. Baseado em observações de que a atividade GTPásica de proteínas G isoladas é mais baixa do que sob condições fisiológicas, postulou-se a existência de mecanismos que aceleram a atividade GTPásica. Vários efetores tem sido apontados como promotores da atividade GTPásica da subunidade α da proteína G. Recentemente, uma família de proteínas chamadas “reguladoras da sinalização da proteína G” (proteína RGS), capaz de aumentar a atividade GTPásica da subunidade α da proteína G foi identificada (Wettschureck e Offermanns, 2005).
- 43. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.33 Classicamente, as proteínas G são divididas em quatro famílias baseadas na similaridade de suas subunidades α: Gαi/0, Gαs, Gαq e Gα12/13 (fig. 7) (Cabrera-Vera e col., 2003; Pierce e col., 2002). Cada família consiste de vários membros que frequentemente mostram padrões de expressão específicos. Membros de uma família são estruturalmente similares e frequentemente compartilham algumas de suas propriedades funcionais. Figura 5 - Mecanismo de ação do receptor acoplado a proteína G. A interação do ligante exógeno com o receptor de membrana promove a ativação do receptor e sua interação com a proteína G intracelular. O acoplamento do receptor a proteína G faz com que ocorra uma mudança de GDP para GTP na subunidade Gα. Gα-GTP então se dissocia do complexo Gβγ e do receptor. Ambas subunidades estão livres para modular a atividade de uma grande variedade de efetores intracelulares. O sinal é finalizado quando a γ-fosfatase do GTP é removida pela intrínseca atividade GTPásica da subunidade Gα, levando a ligação do GDP a Gα. A reassociação de GDP com Gα completa o ciclo. Após ativação do receptor acoplado a proteína Gs, adenililciclase (AC) é ativada pela subunidade α da proteína Gs passando a sintetizar AMPc, como representado na figura 6 (Isoldi e Castrucci, 2008). Existem 9 tipos de adenililciclases conhecidas em mamíferos, as quais podem ser ativadas pelo complexo cálcio/calmodulina, outras inibidas por baixas concentrações de cálcio ou por calcineurina (uma proteína fosfatase dependente de ca2+ ) ou pela fosforilação de proteínas quinases II dependentes de Ca2+ /calmodulina (CAMK II). Em alguns casos, a subunidade α da proteína G inibe a adenililciclase (Gi), promovendo assim uma diminuição dos níveis de AMPc, ou pode ainda ligar-se a canais modulando-os e dessa forma não exercendo função reguladora sobre adenililciclase (Schwartz, 2001). Para estudar as funções das proteínas Gi tem sido muito utilizada uma toxina extraída do Clostridium botulinum (toxina de pertússis ou PTX) a qual é capaz de ribosilar ADP dessas proteínas
- 44. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 34 Julho/2010 tornando-as incapaz de interagir com o receptor. Dessa forma o tratamento com PTX resulta em um desacoplamento do receptor com a proteína Gi (Wettschureck e Offermanns, 2005). Figura 6 – Representação esquemática da via de sinalização intracelular envolvendo adenililciclase. Depois de formado, o AMPc liga-se a proteínas quinases dependentes de AMPc (PKAs). Na sua forma inativa, a PKA é formada por duas subunidades reguladoras (R), e duas subunidades catalíticas (C). Ativação da PKA ocorre através da ligação do AMPc nas subunidades (R), e subsequente liberação da subunidade (C). Após ativação, PKA pode atuar em diferentes substratos e desencadear uma variedade de respostas. Na ausência de AMPc, a subunidade (C) volta a inibir a PKA pela reassociação com a subunidade (R). As subunidades C livres são capazes de fosforilar o fator de transcrição CREB, levando a célula a um aumento da transcrição de genes específicos. CREB liga-se a regiões do gene que contêm um elemento de resposta ao AMPc (CRE) e sob fosforilação inicia a cascata de expressão de genes (Schwartz, 2001).
- 45. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.35 Figura 7 - Representação esquemática da cascata de sinalização evocada por proteínas G. As setas em vermelho representam inibição de um componente da via, e as setas em verde a ativação. A subunidade Giα inibe adenililciclase, promovendo a diminuição de AMPc. A subunidade Gsα ao contrario de Giα promove aumento do concentração de AMPc. A subunidade Gqα ativa a produção de DAG e IP3, e dessa forma IP3 atua em receptores do reticulo promovendo liberação do cálcio. A família da proteína Gq é uma das mais bem caracterizadas entre as proteínas G (ver fig. 8). Quando a proteína Gq é estimulada, promove a ativação da enzima fosfolipase Cβ (PLCβ). Uma vez ativada, a PLCβ promove a catálise do fosfolipídio de membrana 4,5- bisfosfato de fosfatidilinositol, gerando 1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). IP3 difunde-se da membrana para o interior da célula, onde se ligará aos receptores de IP3 (IP3R), que são canais de cálcio existentes na membrana do reticulo endoplasmático ou sarcoplasmático. Essa ligação promove a abertura desses canais de cálcio e a conseqüente liberação dos estoques desse íon para o citoplasma. Em muitos tipos celulares, a liberação de cálcio dos estoques intracelulares induz a abertura de canais de cálcio da membrana celular, promovendo assim um influxo de cálcio do meio extracelular para o interior da célula. O DAG permanece na membrana podendo promover ativação da proteína quinase C (PKC) desencadeando assim uma cascata de fosforilação, ou ainda, podendo ser clivado, gerando ácido araquidônico, o qual dá inicio à via de síntese de eicosanóides como as prostaglandinas (Isoldi e Castrucci, 2007).
- 46. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 36 Julho/2010 Figura 8 – Representação esquemática da via de sinalização intracelular envolvendo a participação da fosfolipase C. Existe ainda uma superfamília de proteínas G, referidas como proteínas G monoméricas (são formadas somente pela subunidade α), ou Ras. Essas proteínas Ras estão envolvidas em uma variedade de processos celulares, incluindo proliferação, diferenciação, migração, maturação e apoptose. A ativação de Ras sob estimulação de GPCRs e receptores de fatores de crescimento é regulada pela mudança do fator nucleotídeo de guanina, o qual estimula uma mudança na atividade de GDP/GTP resultando na ligação do GTP em seu estado ativo à proteína (Schaafsma e col., 2008). As proteínas Ras processam sinais vindos de receptores tirosina quinase e GPCRs, para o interior das células, afetando a transcrição gênica (Schenk e Snaar-Jakelska, 1999). Superfamília do tipo 3: receptores enzimáticos São encontrados quatro receptores com diferentes domínios enzimáticos: tirosina quinase, serina/treonina quinase, tirosina fosfatase, guanililciclase. Os receptores do tipo serina/treonina apresentam como ligante o fator de crescimento transformante beta (TGFβ). Esses receptores se apresentam em dois sub-tipos, os receptores do tipo I e II, os quais são classificados de acordo com suas propriedades estruturais e funcionais. O domínio citoplasmático do receptor tipo II é constitutivamente ativo e este fosforila o receptor tipo I em resíduos serina e treonina em resposta à ligação do mensageiro extracelular. O receptor tipo I ativado tradicionalmente fosforila proteínas SMAD citoplasmáticas, dessa forma ativando a transdução do sinal para o núcleo. As proteínas SMAD ligam-se ao DNA reprimindo ou estimulando a transcrição de genes e, desse modo, essa cascata de
- 47. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.37 sinalização de TGF-β pode representar um papel chave na patogênese de várias doenças incluindo o câncer (Wright e col., 2009). As proteínas tirosina quinase foram identificadas em 1980 como as maiores representantes no câncer resultando na investigação desses receptores como alvos terapêuticos. (Levitzki, 2003). Receptores tirosina quinase (RTK) são glicoproteínas transmembrânicas que são ativados pela ligação de ligantes cognatos e transduzem o sinal extracelular para o citoplasma através da fosforilação do resíduo de tirosina no próprio receptor (autofosforilação) (Hubbard e Till, 2000). Os RTKs ativam numerosas vias de sinalização dentro da célula, levando a proliferação, diferenciação, migração, ou mudanças metabólicas. A família dos RTKs inclui os receptores de insulina e muitos fatores de crescimento, tais como fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os RTKs consistem de uma porção extracelular que se liga aos ligantes polipeptídicos, uma hélice transmembrânica e uma porção citoplasmática que possui tirosina quinase com atividade catalítica (Fig. 9). A grande maioria de RTKs é monomérica e dimeriza-se na presença do ligante. A ativação do receptor pelo ligante leva à ativação da porção quinásica do receptor, resultando em autofosforilação e fosforilação de substratos SHC, o que culmina com a ativação da proteína G monomérica Ras. Nas vias de sinalização de receptores monoméricos, a cascata de MAP quinases (MAPK) é recrutada, resultando na ativação de fatores de transcrição como CREB, c-Fos e Elk-1, envolvidos na transcrição de genes relacionados à proliferação celular. Em adição aos RTKs, existe uma ampla família de tirosina quinases citosólicas não receptoras (NRTKs), as quais incluem Src, Janus Kinases (Jaks), Ab1 (Fig 10). Os NRTKs são componentes das cascatas de sinalização disparadas por RTKs e por outros receptores de superfície como receptores acoplados a proteína G e receptores do sistema imunológico (Hubbard e Till, 2000). Em contrapartida, os receptores tirosina fosfatase, quando ativados por ligantes, desfosforilam proteínas celulares. Esses receptores têm sido implicados na angiogênese e na adesão celular (Isoldi e Castrucci, 2007). Os receptores guanililciclases (GC) são ativados por um hormônio peptídico denominado peptídeo atrial natriurético (ANP), o qual possui um importante papel na regulação da homeostase cardiovascular, através da manutenção da pressão arterial. As ações dos peptídeos natriuréticos são mediadas por sua ligação a três tipos de receptores. Os receptores NPR A e B (receptor peptídico natriurético A e B) são guanililciclases que aumentam a concentração intracelular de GMPc e ativam proteínas quinases dependentes de GMPc. A ativação dos receptores NPRC resulta na inibição da atividade da adenililciclase (Woodard e Rosado, 2008)
- 48. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 38 Julho/2010 Figura 9 – Receptores tirosina quinase. Via de sinalização envolvendo a participação das MAP quinase. Figura 10 – Via de sinalização dos receptores tirosina quinase, envolvendo a participação das tirosinas quinases citosólicas.
- 49. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.39 Superfamília do tipo 4: receptores reguladores da transcrição de genes A família de receptores reguladores da transcrição de genes ou receptores nucleares (NR) compreende fatores de transcrição de uma grande família de genes, incluindo receptores de hormônio da tireóide (TH), esteróides, retinóides, vitamina D, colesterol entre outros. Os receptores nucleares são bem difundidos e representam importante papel no desenvolvimento, metabolismo, homeostase e doenças (Togash e col., 2005). A ativação dos receptores nucleares ocorre através de ligantes lipofílicos, fosforilação e interação com outras proteínas. Estes podem ativar ou reprimir genes alvos pela ligação direta ao elemento responsivo ao DNA como homo- ou hetero-dímeros ou pela ligação de outras classes de fatores de transcrição ligados ao DNA. Essa atividade tem sido relacionada à formação de complexos com moléculas que parecem servir como co-ativadoras ou co-repressoras, causando modificação local da estrutura da cromatina para regular a expressão desses genes alvo (Hart, 2002). Os receptores nucleares representam uma classe evolutiva altamente conservada de fatores de transcrição em mamíferos, e podem ser classificados de acordo com o tipo de hormônio que se liga a eles. Desse modo os receptores são divididos em: esteróides (glicocorticóides, mineralocorticóides, andrógenos e estrógeno), derivados de esteróides (vitamina D3), não esteróides (hormônios da tireóide, retinóides, prostaglandinas) e receptores para os quais não foi encontrado ainda um ligante específico (receptores órfãos). A diferente classificação é baseada no modo de ligação ao elemento responsivo ao DNA, e assim são classificados dentro de quatro grupos, dependendo de sua habilidade para se ligar à sequência de DNA e dimerizar: (1) os receptores esteróides são associados com a proteína de choque térmico (“shock heat” hsps). A ligação do hormônio leva a mudança conformacional, dissociação da proteína hsps e ligação a sequências do DNA como homo- dímeros. Deste modo o papel do hormônio é induzir a ligação ao DNA; (2) a segunda classe representa os receptores tais como hormônios da tireóide, retinóides, prostaglandinas e vitamina D3. Membros dessa classe são ligados ao DNA na ausência do hormônio. A ligação do ligante ao receptor leva a mudança conformacional do domínio de ligação ao hormônio e conseqüente ativação transcricional. Os receptores dessa classe são predominantemente ligados ao DNA como hetero-dímeros; (3) os receptores órfãos que podem se ligar ao DNA como formas monoméricas; (4) ou como dímeros (Tenbaum e Baniahmad, 1997). Em geral, os receptores nucleares possuem em comum três domínios: um variável domínio amino-terminal de ligação ao promotor, um domínio de ligação ao DNA altamente conservado (DBD), e um domínio c-terminal menos conservado, de ligação ao ligante (LBD), como apresentado na figura 11 (Ribeiro e col., 1995). O motivo de ligação ao DNA é
- 50. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 40 Julho/2010 essencial para o reconhecimento do elemento responsivo pelo receptor. O motivo de ligação consiste de 66 aminoácidos contendo dois motivos em dedos de zinco. Quatro resíduos de cisteína altamente conservados são requeridos para coordenar a ligação dos íons Zn2+ (Ribeiro e col., 1995; Tenbaum e Baniahmad, 1997). O LBD confere especificidade na ligação ao ligante e possui um número de funções reguladas por essa ligação. Essas funções incluem a liberação do receptor do complexo hsps, translocação para o núcleo, homodimerização, heterodimerizção e ativação transcricional (Ribeiro e col., 1995). Figura 11 – Estrutura dos receptores nucleares. O esquema apresenta os diferentes domínios dos receptores nucleares. Modificado de Rang e Dale, 2007.
- 51. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.41 Fisiologia Celular do Plasmodium durante a fase assexuada Laura Nogueira da Cruz Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do Plasmodium laurancruz@gmail.com Malária Malária é uma das mais importantes infecções por protozoários no mundo causando morte de mais de 2 milhões de pessoas anualmente (Who, 2005). A Africa subsaariana concentra 90% dos casos, no entanto mais de 40% da população mundial está sob risco da doença, principalmente os habitantes das regiões tropicais e subtropicais do globo (Fig. 1) onde ocorre a distribuição geográfica do mosquito do gênero Anopheles (A. darling, no Brasil e A. gambiae, na África), que transmite as espécies infectantes humanas P. falciparum, P. malariae, P. vivax e P. ovale, sendo as três primeiras espécies encontradas no Brasil. P. falciparum é o parasita que mais causa morte por malária no mundo ocorrendo em maior incidência na África. No Brasil, a maioria dos casos é de P. vivax (Who, 2005). É importante lembrar que a malária pode ser muito mais antiga que a humanidade e existem quase 100 espécies de plasmódios, 22 dos quais infectam macacos e 50 parasitam aves ou répteis (que tiveram seu apogeu nos períodos Permiano e Triássico, quando os insetos hematófagos já existiam). Plasmódios de roedores e aves são freqüentemente utilizados, no laboratório, como modelos experimentais. Entender a complexa biologia do parasita é fundamental para o desenho de novas e mais eficientes drogas e desenvolver novas estratégias para combater a epidemia. Figura 1: Potencial mundial de transmissão de malária. (Fonte : http://en.wikipedia.org/wiki/File:Malaria_geographic_distribution_2003.png)
- 52. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 42 Julho/2010 Combate à malária Nos últimos cinqüenta anos muitas pesquisas foram realizadas fomentando o desenvolvimento de drogas sintéticas antimalaricas. A mais importante dessas foi a cloroquina que possui baixa toxicidade, baixo custo e necessidade de ser aplicada apenas uma vez por semana. Atualmente, no entanto, um grande problema no combate à malária deve-se ao aumento da resistência dos parasitas a cloroquina, derivados de cloroquina e a grande maioria de antimaláricos introduzidos (Olliaro e col., 1996). Para inibir o aparecimento de resistência a WHO recomenda que o tratamento utilize pelo menos o combinado de 2 anti-maláricos. A incidência da malária, no Brasil, por exemplo, aumentou cerca de 10 vezes nos últimos 30 anos, sendo que hoje 99% desses casos ocorrem na Amazônia Legal (FNS, 2002), área endêmica do país, composta pelos estados do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins. Nos Estados fora da Amazônia Legal, o risco de transmissão local é pequeno ou inexistente e a quase totalidade dos casos de malária registrada é importada da Amazônia Legal ou de outros países, principalmente da África Limitações da quimioterapia no controle da malária demonstram a necessidade de novas drogas, preferencialmente contra novos alvos (McKerrow e col., 1993; Rosenthal, 1998), pois apesar de todas as pesquisas e informações adicionais o número de casos de malária vem aumentando e uma vacina eficiente provavelmente não estará disponível no futuro próximo (Hoffman, 1996). Além disso, os esforços para controlar o mosquito Anopheles tiveram pouco sucesso (Alonso, 1991). Atualmente o que pode ser feito são medidas de profilaxias para pessoas que se dirigem a áreas de maior transmissão. O regime profilático consiste em prescrição médica dos medicamentos antimaláricos de acordo com as espécies de Plasmodium predominantes, grau de risco da infecção da área de destino, perfil de resistência ás drogas e avaliação dos efeitos colaterais associados ao uso das mesmas (Farias, 2005) A quimioprofilaxia deve ser iniciada uma semana antes da viagem, para avaliação dos efeitos colaterais, e prolongada por quatro semanas após a saída da área endêmica, a fim de sustentar a ausência dos parasitas na corrente sangüínea, mesmo após a sua transição pelo estágio hepático, período de incubação que pode levar á formação de formas latentes do parasita, responsáveis por recaídas. Contudo, apesar das medidas preventivas, febre no período de dois meses após o curso da quimioprofilaxia ainda pode ser originada pela infecção. Outro propósito da profilaxia se estender por um tempo depois da visita a área de risco é para evitar que se importe doença para a origem do viajante.
- 53. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.43 Trabalhos recentes mostram que o controle com telas mosquiteiras impregnadas com inseticida ajuda no combate da malaria. (Chouaibou e col., 2006). A malaria caiu na década de 50 pelo esforço combinado da cloroquina e do DTT, que combatia o mosquito! Ciclo de vida O Plasmodium é um parasita eucarioto unicelular, de vida intracelular obrigatória, que mede 1,6 X 1,0 uM e pertence ao filo Apicomplexa. Possui um ciclo de vida caracterizado pela sucessão de várias formas especializadas de desenvolvimento Em vertebrados, a infecção se inicia pela picada do mosquito Anopheles, fêmea, que retira 3 a 4 microlitros de sangue, enquanto injeta saliva contendo alguns esporozoitos. Uma vez na corrente sanguínea, os esporozoitos invadem os hepatócitos e se desenvolvem para o estágio assexuado de merozoito. Durante este período a infecção é assintomática e cada esporozoito forma 30,000 merozoitos. Estes são liberados diretamente na corrente sangüínea e invadem os eritrócitos (Sturn e col., 2006). Na corrente sangüínea amadurecem passando pelos estágios de anel, trofozoito e esquizonte. Por um processo ainda desconhecido, alguns merozoitos não invadem os eritrócitos e se diferenciam em gametócitos, a forma infectante do mosquito (Garcia, 2001). Para o fechamento do ciclo, o mosquito – onde ocorre o ciclo sexual do parasita - terá que picar o vertebrado que tem gametocitos presentes na circulação. Estes, após o ciclo no mosquito formarão os esporozoitos que migrarão até a glândula salivar e serão transmitidos ao hospedeiro vertebrado (Fig. 2). Figura 2: Ciclo de vida da malária (Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Malaria).
- 54. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 44 Julho/2010 O ciclo intraeritrocítico é, portanto, o responsável por toda manifestação clínica na malária, sendo na ruptura do eritrócito infectado e conseqüente liberação do parasita para infecção de novas células que ocorrem febre e tremedeira, típicas da doença (Hawking, 1970). Dependendo da espécie de parasita, estes sintomas ocorrem em intervalos distintos – 3 ou 4 dias para P. falciparum e P. vivax, respectivamente (Garcia, e col., 2001) (Tab. 1). Função da melatonina A transição do estágio intraeritrocítico, bem como o processo de invasão in vivo e a produção de gametócitos são processos altamente sincronizados (Garcia, 2001) e na maioria mamíferos estudados seguem ciclos múltiplos de 24h (Tab. 1) Tabela 1- Período do ciclo intraeritrocítio de diversas espécies de Plasmodium (Modificado de Garcia, e col., 2001). Parasita Hospedeiro vertebrado Período do ciclo intraeritrocítico P. knowlesi primata 24h P. cathemerium pássaro 24h P. vinckei roedor 24h P. chabaudi roedor 24h P. berghei roedor 24h P. yoelii roedor 18h P. gallinaceum galinha 36h P. falciparm homem 48h P. vivax Homem 48h P. cynomolgi Primata 48h P. coatneyi Primata 48h P. malariae Homem 72h P. inui Pássaro 72h P. brasilianum Primata 72h No caso do desenvolvimento intraeritrocítico do Plasmodium, os processos de divisão celular e expressão gênica específicas de cada estágio são de extrema importância. Foi demonstrado por Hotta e col., (2000) que o hormônio melatonina é capaz de sincronizar o desenvolvimento do Plasmodium in vivo e in vitro. Quando se mantém parasitas em cultura,
- 55. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.45 a sincronia é perdida, um dos fenômenos que sugeriram que o hospedeiro tem papel fundamental no estabelecimento do ritmo. (Hotta e col., 2000). A melatonina tem um largo espectro de atuação (vertebrados, plantas e protozoários) podendo ser sintetizada em vários tecidos, porém sua síntese rítmica é confinada primariamente à glândula pineal. Este hormônio é sintetizado a partir de serotonina, que está presente em grande quantidade na glândula pineal. É interessante observar ainda que os precursores da melatonina, que são devirados do triptofano, têm o mesmo efeito da melatonina tanto no ciclo celular do Plasmodium quanto na mobilização de Ca2+ de estoques intracelulares (Beraldo e col., 2005). Hotta e col., (2000) consideram que a melatonina é capaz de ativar a cascata da fosfolipase C que, por sua vez, ativa a via de inositol 1,4,5-triposfato (IP3) e libera Ca2+ do retículo endoplasmático (RE), nos estágios trofozoitos do Plasmodium. Homeostasia e sinalização por cálcio Variações na concentração de cálcio intracelular exercem papel fundamental em muitos processos biológicos de células eucarióticas, como organização do citoesqueleto, divisão e diferenciação celular (Berridge, 2003). As células eucarióticas possuem mecanismos para manter a homeostasia de Ca2+ estes incluem uma bomba de cálcio na membrana plasmática, no retículo endoplasmático além de trocadores em organelas intracelulares e na membrana plasmática (Passos e Garcia, 1997; Garcia e col., 1998). Especificamente, para o parasita da malária foi demonstrado a existência de 2 compartimentos de Ca2+ : um é o clássico retículo endoplasmatico (Passos and Garcia, 1997, Varoti e col., 2003) e o outro é um compartimento ácido (Garcia e col., 1998, Varotti e col., 2003). Sabe-se que para Plasmodium falciparum o Ca2+ extracelular é indispensável no processo de invasão do eritrócito pelo parasita e estudos fisiológicos mostram envolvimento da sinalização de Ca2+ no processo de maturação do parasita. (Garcia, 1999, Gazarini e col., 2003). Como qualquer célula eucariótica, o citoplasma do eritrócito possui baixa concentração de cálcio (menor que 100 nM ), sendo que o ambiente extracelular encontrado pela maior parte das células eucarióticas situa-se ao redor de 1 mM. A ausência de Ca2+ extracelular é normalmente incompatível com as funções normais da célula e sua sobrevivência. Dentro deste contexto, nosso laboratório demonstrou que o parasita resolve o problema de pouco Ca2+ no meio em que sobrevive, através da invaginação da membrana citoplasmática do eritrócito, pois no momento da infecção forma o vacúolo parasitóforo (VP)
- 56. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 46 Julho/2010 e inverte a polaridade da Ca2+ ATPase da membrana (bombeando ativamente Ca2+ para o interior do VP). Desta forma pode manter o ambiente de alta concentração de Ca2+ necessário ao desenvolvimento do parasita (Gazarini e col., 2003). Enzimas proteolíticas Enzimas proteolíticas possuem um importante papel no ciclo de vida de todos os protozoários medicamente importantes como leshmania, toxoplasma, giardia e plasmodium (Rosenthal,1999). Várias proteases de protozoários foram identificadas e caracterizadas sendo utilizadas pelos protozoários em diferentes funções tais como: invasão de células e tecidos do hospedeiro, degradação de mediadores da resposta imune e hidrólise de proteínas para suprir necessidades nutricionais do parasita (Rosenthal,1999). As proteases podem ser classificadas em quatro classes (Neurath 1989; Barrett, 1994), sendo três delas (serine, cisteina e aspartil proteases), assim denominadas pela existência de sítio de aminoácido chave e a metaloprotease , pela necessidade do íon metálico para catálise. Sabe-se ainda que para a invasão dos eritrócitos por merozoitos e ruptura pelos esquizontes maduros, são necessárias proteases do parasita, pois durante estes eventos proteínas do citoesqueleto do eritrócito precisam ser hidrolizadas e algumas proteínas do parasita são proteolicamente processadas (Klemba, 2002). Outra importante função das proteases inclui a degradação da hemoglobina que é utilizada como uma fonte de amino ácido livre pelo parasita (Scheibel e Sherman, 1988). O conteúdo da hemoglobina em eritrócitos infectados diminui 25-75% durante o ciclo de vida do parasita eritrocítico (Ball e col., 1948; Groman, 1951; Roth e col., 1986), a concentração de aminoácido livre é maior nos eritrócitos infectados do que nos não infectados e a composição dos aminoácidos de eritrócitos infectados é semelhante à composição de aminoácidos da hemoglobina. Peptídeos fluorescente para determinar atividade de proteases Recentemente foram desenvolvidos peptídeos sintéticos, com seqüências específicas de aminoácido capazes de penetrar na célula e emitir fluorescência quando clivado pela protease (Fig. 3). Dependendo da especificidade da seqüência peptídica e das proteases pode-se então determinar atividades e funções proteolíticas. Em estudos realizados com P. chabaudi utilizou-se este quelante interno fluorescente de peptídeos (IQF) e microscopia confocal para demonstrar-se que
- 57. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.47 melatonina induz atividade das thiol protease em uma forma cálcio-dependente (Farias et al, 2005). Estas proteases estão localizadas predominantemente no citoplasma do parasita e sua atividade pode também ser induzida por agentes que aumentam o cálcio citosolico como tapsigardina (inibidor específico da Ca2+ ATPase do retículo endoplasmático), nigericina (ionóforo K+ /H+ ) e ionomicina (ionóforo Ca2+ /H+ ) (Farias et al, 2005). Figura 3: Representação esquemática do mecanismo de funcionamento dos substratos quelante interno fluorescente de peptídeos (IQF).(Modificado de Carmona et al, 2009).
- 58. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 48 Julho/2010
- 59. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.49 RNAi: ouvindo a voz do silêncio Maísa Costa Laboratório de Neurotransmissão e Regulação da Pressão Arterial maisa.bio@hotmail.com Introdução O termo “silenciamento gênico” refere-se a uma série de mecanismos por meio dos quais a expressão de um ou mais genes é regulada negativamente. O silenciamento é considerado uma modificação epigenética. Modificações epigenéticas na expressão gênica são características herdáveis que não podem ser explicadas por alterações na seqüência de DNA, e que podem resultar na repressão (silenciamento gênico) ou ativação (ativação gênica) da expressão do gene (Vaucheret e col., 2001). Até o final da década de 1980, somente modificações na estrutura da cromatina ou de proteínas eram classificadas como epigenéticas (Lewin, 1998). Entretanto, durante a década de 1990, um grande número de fenômenos de silenciamento gênico que ocorriam em nível transcricional e pós- transcricional foram descritos em plantas, fungos, animais e protozoários, introduzindo o conceito de silenciamento de RNA (RNA silencing) (Baulcombe, 2000; Matzke e col., 2001). Logo após os primeiros estudos com plantas transgênicas resistentes a vírus (Lindbo & Dougherty, 1992), percebeu-se que o silenciamento de RNA representava um sistema ancestral de defesa contra vírus e retrotransposons (Lindbo e col., 1993b). Atualmente, sabe-se que este constitui também um mecanismo eficiente de regulação gênica, que atua principalmente no controle de genes envolvidos no desenvolvimento do organismo e na manutenção da integridade do genoma (Denli & Hannon, 2003). O componente unificador dos diferentes processos de silenciamento de RNA já estudados em diversos organismos é o RNA de fita dupla (dsRNA). A presença desse tipo de molécula pode induzir a degradação de RNAs mensageiros (mRNA) homólogos, um processo conhecido como silenciamento gênico pós-transcricional (posttranscriptional gene silencing, PTGS) em plantas e RNA- interferência (RNA interference, RNAi) em animais. Componentes da maquinaria de PTGS e RNAi também estão envolvidos no processamento e funcionamento de microRNAs, uma classe de pequenos RNAs com função regulatória, que foram originalmente identificados como responsáveis pela repressão da tradução em Chaenorhabditis elegans (Hutvagner e col., 2000). Descobertas recentes sugerem que o silenciamento de RNA está envolvido em vários tipos de modificações genômicas e de cromatina, incluindo metilação do DNA genômico (Wassenegger e col., 1994), formação de heterocromatina (Kennerdell e col., 2002) e eliminação de DNA (Mochizuki e Gorovsky, 2004a). Estas descobertas indicam que os mecanismos de silenciamento de RNA controlam a expressão a nível transcricional e
- 60. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 50 Julho/2010 pós-transcricional, e que a maquinaria de silenciamento pode operar nos compartimentos nuclear e citoplasmático. Apesar de algumas diferenças nos mecanismos, similaridades evidentes sugerem que o silenciamento de RNA constitui um sistema conservado entre diferentes organismos. A clonagem e caracterização de diversos genes que codificam componentes do sistema em Arabidopsis thaliana, C. elegans, Drosophila melanogaster, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Tetrahymena thermophila, camundongos e humanos, apóiam essa hipótese (Denli & Hannon, 2003). Entretanto, o mecanismo apresenta particularidades em cada um desses organismos, conforme verificado pela identificação de componentes específicos ou que não estão presentes em todos eles. Histórico O fenômeno, atualmente denominado silenciamento de RNA, foi observado pela primeira vez em plantas transgênicas por dois grupos independentes de pesquisadores (Napoli e col., 1990; Van Der Krol e col., 1990). Estes pesquisadores tinham como objetivo criar petúnias transgênicas, cujas flores apresentassem uma coloração mais intensa. A estratégia escolhida consistia em superexpressar o gene que codifica a chalcone sintase (CHS), uma enzima chave na biossíntese de antocianinas. Para isso foi introduzida uma cópia extra do gene Chs sob controle do promotor 35S do Cauliflower mosaic virus (CaMV). Entretanto, ao contrário do esperado, as diferentes linhagens transgênicas obtidas possuíam padrões distintos de variegação floral, incluindo linhagens que apresentavam flores totalmente brancas, ou seja, sem pigmento. A análise molecular das linhagens transgênicas comprovou que a introdução da cópia extra havia efetivamente bloqueado a biossíntese de antocianinas, inibindo, simultaneamente, a expressão do gene endógeno pré-existente e da cópia introduzida. A inibição da pigmentação das flores foi diretamente correlacionada com uma redução específica no acúmulo de mRNA do gene Chs. O fenômeno foi denominado co-supressão, pois a introdução de um transgene levou ao silenciamento simultâneo do próprio transgene e do gene endógeno homólogo (Napoli e col., 1990; Van Der Krol e col., 1990). Fenômeno semelhante foi relatado no fungo N. crassa, no qual foi denominado quelling (Cogoni e col., 1996; Romano & Macino, 1992), e em animais (Drosophila e C. elegans), nos quais foi denominado RNAi (Fire e col., 1998). Alguns anos após a descrição da co-supressão, um fenômeno semelhante foi observado por pesquisadores que tentavam engenheirar plantas transgênicas resistentes a vírus. Plantas de tabaco foram transformadas com o gene que codifica a proteína capsidial do potyvírus Tobacco etch virus (TEV) (Goodwin e col., 1996; Lindbo e Dougherty, 1992; Lindbo e col., 1993b) ou a replicase do potexvírus Potato X virus (PVX) (Mueller e col., 1995). Em ambos os casos, esperava-se que o excesso de proteína viral afetaria a
- 61. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.51 replicação do vírus, interrompendo o seu ciclo de infecção. A princípio, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentavam-se resistentes e outras não. Curiosamente, as linhagens resistentes eram aquelas cujas plantas não produziam, ou produziam em pequena quantidade, os RNA mensageiros (mRNAs) e as proteínas virais, enquanto nas linhagens suscetíveis as plantas expressavam grande quantidade de mRNA e proteína transgênicos (Goodwin e col., 1996; Mueller e col., 1995). A análise da taxa de transcrição dos transgenes em plantas resistentes e suscetíveis comprovou que a introdução dos transgenes virais conferia resistência por meio do silenciamento gênico postranscricional de seqüências homólogas (Mueller e col., 1995). A replicação de vírus com genoma de RNA também pode disparar eficientemente o mecanismo de silenciamento. A indução de PTGS por vírus foi confirmada com a observação de que genes endógenos ou transgenes eram silenciados após a infecção com vírus recombinantes contendo parte da seqüência do gene ou transgene. O mecanismo de indução de silenciamento por meio da replicação de vírus foi denominado virus-induced gene silencing (VIGS) (Kjemtrup e col., 1998; Kumagai e col., 1995; Ratcliff e col., 2001; Ruiz e col., 1998). A primeira evidência direta de que dsRNA pode levar ao silenciamento foi obtida em C. elegans. Utilizando a técnica de expressão de moléculas anti-senso para inibir a expressão gênica, foi demonstrado que moléculas com polaridade senso eram tão eficientes para a inibição quanto moléculas com polaridade anti-senso (Guo & Kemphues, 1995). O paradoxo foi resolvido quando se demonstrou que o dsRNA é o indutor de silenciamento, e que o silenciamento nos experimentos com moléculas senso fita simples era devido à presença de uma pequena quantidade de dsRNA contaminante nas preparações in vitro de RNA fita simples (Fire e col., 1998; Montgomery e Fire, 1998). A especificidade do mecanismo de silenciamento de RNA foi explicada com a identificação de pequenos RNAs de 21-25 nucleotídeos (nt), de orientação senso e anti- senso, que apresentavam homologia com o RNA silenciado e que estão associados ao processo (Hamilton e Baulcombe, 1999). Esses pequenos RNAs, atualmente denominados small interfering RNAs (siRNAs), foram primeiramente observados em plantas, sob diferentes sistemas de indução de silenciamento (introdução de um transgene com homologia a um gene endógeno, introdução de um transgene sem homologia com gene endógeno, e VIGS) (Hamilton e Baulcombe, 1999). Além de explicar a especificidade do sistema, o acúmulo de siRNAs em ambas as orientações sugeriu que a formação de dsRNA ocorre antes da degradação do mRNA. Estudos adicionais em Drosophila demonstraram que os siRNAs são resultado da clivagem de dsRNA injetado na célula, e que servem como “guia” para direcionar a degradação de mRNAs homólogos (Bernstein e col., 2001; Zamore e col., 2000). Oligonucleotídeos
- 62. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 52 Julho/2010 sintéticos de 21 a 25 nt foram suficientes para induzir RNAi in vitro (Elbashir e col., 2001a) e in vivo (Elbashir e col., 2001b), na ausência de dsRNA. A geração dos siRNAs a partir de dsRNA foi elucidada em trabalhos com Drosophila, onde uma ribonuclease do tipo RNAse III (endonuclease com afinidade por dsRNA) foi parcialmente purificada em associação a fragmentos de RNA de aproximadamente 25 nt, cuja seqüência correspondia à de dsRNA de indivíduos nos quais RNAi encontrava-se ativo (Hammond e col., 2000). Essa RNAse III, denominada “Dicer”, produz siRNAs a partir de moléculas relativamente curtas de dsRNA (aprox. 250 nt) em um processo dependente de ATP, e os siRNAs servem como guia para a degradação de mRNAs homólogos em um complexo ribonucleoprotéico denominado RISC (RNA induced silencing complex) (Bernstein e col., 2001; Hammond e col., 2000). A enzima Dicer é conservada evolutivamente, com homólogos presentes em fungos, plantas e animais superiores. A conservação funcional desta família de proteínas e seu requerimento para RNAi veio com a demonstração de que Dicer de humanos também cliva dsRNAs em siRNAs (Bernstein e col., 2001) e que mutantes de C. elegans em ortólogos a Dicer (DCR-1) não ativam o sistema de RNAi induzido por dsRNA (Grishok e col., 2001; Ketting e col., 2001; Knight e Bass, 2001). A caracterização do complexo RISC foi iniciada em Drosophila com a identificação da proteína AGO2, pertencente à família de proteínas Argonauta (Hammond e col., 2001). AGO2 foi co-purificada com o RISC e co-imunoprecipitada com Dicer. Estudos subseqüentes demonstraram que proteínas Argonauta também são componentes do RISC em mamíferos, fungos, nematóides, protozoários e plantas (Carmell e Hannon, 2004; Martinez e col., 2002). Recentemente, foi demonstrado que AGO2 de humanos possui atividade de RNase III, consistindo provavelmente na proteína Slicer, que media a clivagem do mRNA alvo após sua associação ao siRNA no complexo RISC (Liu e col., 2004; Meister e col., 2004; Okamura e col., 2004). A existência de um fator difusível dominante envolvido na sinalização sistêmica do silenciamento foi demonstrada inicialmente em N. crassa (Cogoni e col., 1996). Heterocárions contendo núcleos apresentando genes silenciados e não silenciados exibiam o fenótipo silenciado. Analogamente, em C. elegans, RNAi pode ser disparado em todo o organismo injetando-se dsRNA na cavidade bucal ou por meio da ingestão de bactérias expressando dsRNA (Timmons e col., 2001). Este fator é dominante, pois em cruzamentos entre indivíduos silenciados ou não, toda a progênie é silenciada (Grishok e col., 2001). Em plantas, PTGS foi transmitido com 100 % de eficiência a partir de porta-enxertos silenciados a enxertos não silenciados contendo o transgene homólogo, mas não a enxertos que não possuíam o transgene homólogo, indicando que o sinal é específico em termos de seqüência (Palauqui e col., 1997). A natureza deste sinal sistêmico ainda não está totalmente esclarecida. Inicialmente foi proposto que, devido à especificidade de
- 63. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.53 seqüência, este fator seria pelo menos em parte, um RNA (Vaucheret e Fagard, 2001). Recentemente, a análise bioquímica de extrato de floema de abóbora levou à caracterização de uma proteína que se liga seletivamente a pequenos RNAs de fita simples (Cucurbita maxima phloem small RNA binding protein 1 - CmPSRP1). Estudos de microinjeção forneceram evidências de que CmPRSP1 pode mediar o movimento de pequenos RNAs de 25 nt fita simples, mas não de moléculas de RNA fita dupla, apoiando a hipótese de que o sinal sistêmico contém uma proteína de ligação a pequenos RNAs (mas não necessariamente siRNAs) (Yoo e col., 2004). Evidências sobre o envolvimento da maquinaria de RNAi/PTGS no desenvolvimento de diferentes organismos vieram com a descoberta de uma nova classe de pequenos RNAs, os micro RNAs (miRNAs). Inicialmente, foi demonstrado que o gene Lin-4, conhecido por controlar o tempo de desenvolvimento do estágio larval de C. elegans, não codificava nenhuma proteína, e sim um par de pequenos RNAs, um com aproximadamente 22 nt e o outro com 16 nt (Lee e col., 1993). Estes pequenos RNAs eram complementares a várias regiões da região 3’ não-traduzida (3’NTR) do gene Lin-14, propondo-se que eles mediam a repressão de Lin-14 por pareamento na região 3’NTR, inibindo o processo de tradução. Sete anos depois da descoberta de Lin-4, foi descoberto um segundo gene, Let-7, que também codifica um pequeno RNA de 22 nt envolvido no desenvolvimento de C. elegans (Reinhart e col., 2000; Slack e col., 2000). Devido ao papel de ambos no controle do desenvolvimento, foram denominados de small temporal RNAs (stRNAs) (Pasquinelli e col., 2000). Pouco tempo depois foram clonados diversos genes que codificam pequenos RNAs em Drosophila, C. elegans, Arabidopsis e humanos (Lagos- Quintana e col., 2001; Lau e col., 2001; Lee e Ambros, 2001; Llave e col., 2002b). Os produtos destes genes eram estruturalmente semelhantes aos stRNAs lin-4 e let-7: possuíam aproximadamente 22 nt e eram potencialmente processados por Dicer a partir de um precursor com capacidade de adquirir estrutura secundária em forma de grampo. Entretanto, em plantas, diferente dos stRNAs lin-4 e let-7, eles não interferem com o processo de tradução. Nos casos em que o alvo desses pequenos RNAs já foi identificado, comprovou-se que ocorre pareamento entre o pequeno RNA e a região codificadora do mRNA alvo, e que esse pareamento gera uma região de dsRNA que é clivada pelo complexo RISC (Grishok e col., 2001). O termo “microRNA” (miRNA) foi introduzido para se referir a todos os pequenos RNAs originados a partir de um transcrito endógeno processados por uma RNase III tipo Dicer (Hutvagner e col., 2001). Atualmente, acredita-se que os miRNAs possuem papel fundamental na regulação gênica pós-transcricional, com papel em processos como a proliferação celular, apoptose, sinalização e diferenciação. A primeira evidência de que dsRNA pode induzir alterações na cromatina foi a observação de que a infecção de plantas por viróides levava à metilação de seqüências endógenas que possuíam homologia com o genoma do viróide
- 64. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 54 Julho/2010 (Wassenegger e col., 1994). A esta observação seguiu-se a descoberta de que dsRNA apresentando seqüências homólogas a regiões promotoras era capaz de induzir silenciamento gênico, neste caso em nível transcricional, por meio da metilação desta seqüência (Mette e col., 2000). A ligação entre RNAi e remodelamento da cromatina veio com a descoberta das proteínas polycomb, cromoproteínas relacionadas com a repressão transcricional por favorecer a formação de heterocromatina, e com a formação de estruturas fechadas de cromatina que criam padrões estáveis e herdáveis de expressão gênica envolvidas em RNAi em C. elegans e Drosophila (Akhtar e col., 2000; Tabara e col., 1999). Uma relação mais direta entre RNAi e silenciamento transcricional veio com trabalhos em S. pombe, onde foi demonstrado que as proteínas homólogas a Dicer e Argonauta são requeridas para o silenciamento de regiões centroméricas (Volpe e col., 2002). No início de 2004, foi purificado um complexo induzido por RNA requerido para o início da formação de heterocromatina em S. pombe, denominado RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing). O complexo RITS inclui a proteína Argonauta AGO1 e pequenos RNAs homólogos a regiões centroméricas processados pela Dicer. Sua existência sugere que RNAi é um mecanismo que atua tanto em nível transcricional como pós-transcricional (Verdel e col., 2004). O mecanismo do silenciamento de RNA Estudos genéticos demonstraram a existência de três vias de silenciamento de RNA (Xie e col., 2004) (Fig. 1). Estudos com proteínas supressoras de silenciamento codificadas por vírus demonstraram que estas vias podem se sobrepor em alguns pontos (Dunoyer e col., 2002). A primeira via é a de silenciamento citoplasmático via siRNAs, que está envolvida na degradação de RNA viral interferindo, ou mesmo bloqueando, o ciclo de infecção. O dsRNA pode originar-se da transcrição de um gene endógeno, de um transgene, ou de um intermediário da replicação de vírus com genoma de RNA. Em vírus com genoma de DNA, dsRNA pode ser formado por meio do anelamento de transcritos sobrepostos complementares (Baulcombe, 2004). A segunda via é a de silenciamento de mRNAs endógenos via miRNAs. Os miRNAs regulam a expressão gênica negativamente por meio do pareamento de bases específicos a mRNAs alvo, resultando na clivagem do mRNA ou na repressão de sua tradução (Baulcombe, 2004). A terceira via é nuclear e está associada à metilação de DNA e à formação de heterocromatina. Uma importante função para esta via é provavelmente proteger o indivíduo de desorganizações genômicas causadas por transposons (Baulcombe, 2004).
- 65. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.55 Figura 1- Modelo para o silenciamento de RNA, indicando as três vias atualmente conhecidas. A. Silenciamento pós-transcricional de genes endógenos ou transgenes via siRNas. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada a partir da transcrição de um transgene senso, de um transgene anti-senso ou de um transgene em repetição invertida. O dsRNA é provavelmente transportado para o citoplasma, onde é degradado pela enzima DCL-2 (em plantas), gerando os siRNAs. Os siRNAs são incorporados ao complexo RISC, que irá degradar os mRNAs citoplasmáticos que possuam identidade com a seqüência do siRNA. Os vírus ativam essa via produzindo dsRNA durante sua replicação. B. Silenciamento pós-transcricional de genes endógenos via miRNAs. Os miRNAs são transcritos a partir de genes que produzem um RNA precursor com estrutura secundária em forma de grampo. A enzima DCL-1 (em plantas) processa o precursor no núcleo, gerando o miRNA. O miRNA é transportado para o citoplasma e incorporado ao complexo RISC. C. Silenciamento transcricional via siRNAs. Essa via é ativada por meio de dsRNA produzido após a transcrição de transposons ou de seqüências endógenas arranjadas na forma de repetições diretas. O dsRNA é processado pela
- 66. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 56 Julho/2010 enzima DCL-3 (em plantas), e os siRNAs resultantes são incorporados ao complexo RITS. Esse complexo atua no DNA genômico, resultando na metilação de seqüências homólogas ao siRNA ou na formação de heterocromatina. (Modificado de Zerbini e col., 2005). As três vias do silenciamento de RNA requerem grupos de proteínas relacionas em plantas, fungos, animais e protozoários, sugerindo a existência de um mecanismo ancestral comum a estes organismos e às três vias, embora com diferenças significativas (Zamore, 2002). Estudos genéticos e bioquímicos demonstraram que o silenciamento de RNA é um processo gradual com pelo menos quatro etapas: iniciação, amplificação, sinalização sistêmica e manutenção. Na etapa de iniciação, o dsRNA é processado em siRNAs com aproximadamente 21-24 nt. Esta clivagem requer ATP e é mediada por Dicer em Drosophila, DCR1 em C. elegans e DICER-LIKE 1 (DCL1) em Arabidopsis (Bernstein e col., 2001; Knight e Bass, 2001; Schauer e col., 2002). Dicer possui um domínio de RNA helicase na região amino-terminal, um domínio central PAZ (Piwi, Argonaute e Zwilli) de ligação a RNA, dois domínios catalíticos, um ou dois domínios de ligação a dsRNA e um domínio de função desconhecida (Carmell e Hannon, 2004). O modelo para a clivagem de dsRNA mediada por Dicer propõe que a enzima atua como um dímero antiparalelo, formando dois centros catalíticos que geram os siRNAs de 22 nt (Blaszczyk e col., 2001). S. pombe, C. elegans e vertebrados possuem somente uma Dicer, envolvida nas vias de silenciamento mediadas por siRNAs e miRNAs (Bernstein e col., 2001; Grishok e col., 2001; Hutvagner e col., 2001; Ketting e col., 2001; Knight e Bass, 2001; Volpe e col., 2002). Em Drosophila, foram identificados dois parálogos de Dicer que atuam em pontos diferentes do mecanismo: Dicer1 é requerida para o processamento dos precursores de miRNAs, enquanto Dicer2 está envolvida no processamento de dsRNAs longos (Lee e col., 2004c). Em Arabidopsis, a família gênica que codifica proteínas homólogas a Dicer possui quatro membros. DCL1 processa os precursores de miRNAs (Park e col., 2002; Xie e col., 2004). DCL2 é provavelmente requerida para a produção de siRNAs derivados de vírus, embora o mutante dcl2 tenha apresentado somente uma redução transiente nos níveis de siRNAs em plantas infectadas com o Turnip crinkle virus, dentre vários vírus testados (Xie e col., 2004). Experimentos adicionais serão necessários para comprovar o papel de DCL2. DCL3 produz siRNAs derivados de retroelementos e de transposons e é requerida para o silenciamento de cromatina. Os siRNAs resultantes do processamento via DCL3 estão associados a transposons e são um pouco mais longos (24 nt) do que os siRNAs resultantes do processamento mediado por DCL1 (21 nt) (Hamilton e col., 2002; Xie e col., 2004). Até o presente, ainda não foi estabelecida a função de DCL4.
- 67. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.57 O siRNA de fita dupla derivado do processamento de dsRNA por Dicer se associa à proteína R2D2, que contém domínios de ligação a dsRNA (Liu e col., 2003). A função de R2D2 é discriminar qual das duas fitas do siRNA será incorporada ao RISC (Tomari e col., 2004). A fita incorporada será aquela cujo terminal 5’ se anela com menor energia específica ao terminal 3’ da fita complementar. O RISC direciona a clivagem seqüênciaespecífica de mRNAs complementares (Hutvagner e Zamore, 2002). Todos os complexos RISC já caracterizados possuem pelo menos uma proteína da família Argonauta (Hammond e col., 2001; Hutvagner e Zamore, 2002; Martinez e col., 2002; Mourelatos e col., 2002; Verdel e col., 2004). A família de proteínas Argonauta consiste no maior grupo de proteínas especificamente envolvidas no silenciamento de RNA. O número de parálogos identificados em diferentes organismos varia de um em S. pombe (Verdel e col., 2004) a mais de vinte em C. elegans (Carmell e col., 2002; Grishok e col., 2001). Em Arabidopsis foram identificados dez membros (Morel e col., 2002), em Drosophila foram identificados cinco (Williams e Rubin, 2002) e em humanos oito membros (Sasaki e col., 2003). Em humanos foi demonstrado que o domínio Piwi presente em Dicer media interações proteína-proteína entre proteínas Argonauta e Dicer, o que poderia facilitar a incorporação dos siRNAs ao RISC (Doi e col., 2003; Pham e col., 2004). Diversas evidências sugerem que as diferentes proteínas Argonauta não são funcionalmente redundantes em um determinado organismo. Análises genéticas em Arabidopsis demonstraram que AGO1 está envolvida nas vias de silenciamento mediadas por siRNAs e miRNAs (Fagard e col., 2000; Kidner e Martienssen, 2003), enquanto AGO4 está envolvida em direcionar modificações na cromatina (Zilberman e col., 2003). O complexo RISC possui atividade catalítica que cliva especificamente o mRNA alvo sem afetar o siRNA guia. A subunidade catalítica é denominada Slicer, e foi demonstrado que mutações em AGO2 de mamíferos inibem a capacidade de clivagem do RISC, indicando que AGO2 é a própria proteína Slicer (Liu e col., 2004). Funções biológicas associadas ao silenciamento de RNA A primeira função biológica proposta para o silenciamento de RNA foi estabelecida em plantas durante estudos sobre a resistência derivada do patógeno. A observação de que plantas recuperadas de uma primeira infecção viral tornavam-se resistentes à reinfecção pelo mesmo vírus, devido à ativação e manutenção do silenciamento, levou à hipótese de que o silenciamento de RNA seria uma resposta adaptativa de defesa contra vírus (Al-Kaff e col., 1998; Covey e col., 1997). Evidências adicionais foram obtidas com a observação de que plantas mutantes defectivas para o silenciamento são hipersensíveis à infecção por alguns vírus (Morel e col., 2002), e pela descoberta de proteínas virais com capacidade de suprimir o silenciamento em plantas (Anandalakshmi e col., 1998; Brigneti e col., 1998;
- 68. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 58 Julho/2010 Kasschau e Carrington, 1998) e animais (Li e col., 2002). Além da defesa contra infecção por vírus, o silenciamento de RNA também está envolvido na proteção contra a transposição de DNA. Em C. elegans e Chlamydomonas reinhardtii, indivíduos com mutações em componentes da via de RNAi apresentam uma taxa mais elevada de transposição (Ketting e col., 1999). Outro indicativo dessa função foi a detecção de siRNAs derivados de retrotransposons em Trypanossoma brunei, indicando que o intermediário de dsRNA produzido durante o ciclo de transposição pode ser processado pela enzima Dicer (Djikeng e col., 2001). A função do silenciamento de RNA na defesa contra vírus e transposons levou à sugestão de que o mecanismo funcionaria como um “sistema imune” do genoma. De forma análoga ao sistema imunológico presente em aves e mamíferos, o silenciamento de RNA é específico contra elementos exógenos, a resposta pode ser amplificada e desencadeia uma resposta massiva contra um invasor (nesse caso, uma molécula de ácido nucléico) (Plasterk, 2002). Apesar da falta de evidências diretas, outra função proposta para o mecanismo é a de remoção de RNAs aberrantes não funcionais do núcleo ou do conjunto de mRNAs celulares (Tijsterman e col., 2002). O papel do silenciamento de RNA foi consideravelmente ampliado com a descoberta dos miRNAs, estabelecendo-se o envolvimento do mecanismo na regulação pós- transcricional de genes endógenos. Atuando de forma análoga aos siRNAs, os miRNAs são processados pela Dicer (Lee e col., 2003b) e estão associados ao RISC (Martinez e col., 2002), anelando-se ao mRNA alvo e formando uma região de dsRNA, o que leva à degradação do mRNA e conseqüente regulação negativa da expressão gênica. A maioria dos miRNAs já identificados em plantas possui como alvo mRNAs que codificam fatores de transcrição, particularmente aqueles envolvidos na regulação de genes que controlam o desenvolvimento (Kasschau e col., 2003; Rhoades e col., 2002). Em animais, os mRNAs controlados por miRNAs estão envolvidos em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo o controle da apoptose (Brennecke e col., 2003), o metabolismo de lipídeos (Xu e col., 2003), a supressão de tumores e a resistência a estresses oxidativos (Lewis e col., 2003). Descobertas recentes sugerem que o silenciamento de RNA está envolvido na formação da cromatina e/ou reorganização genômica, incluindo a formação de heterocromatina em S. pombe e a eliminação de grandes fragmentos de DNA do genoma de Tetrahymena thermophila (Hall e col., 2002; Taverna e col., 2002; Volpe e col., 2002). Caráter sistêmico do silenciamento de RNA Uma característica marcante do silenciamento de RNA é seu caráter sistêmico. As primeiras suspeitas sobre a existência de um “fator difusível” vieram da observação de que
- 69. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.59 heterocárions de N. crassa contendo núcleos silenciados e não silenciados apresentavam o fenótipo silenciado (Cogoni e col., 1996). Estudos adicionais em plantas (Palauqui e col., 1997), C. elegans (Fire e col., 1998) e Drosophila (Dzitoyeva e col., 2001) demonstraram que o silenciamento não é restrito às células iniciais, sugerindo a existência de um sinal sistêmico que é propagado a partir da célula onde o mecanismo foi inicialmente ativado e que ativa o mecanismo em tecidos distantes. A existência do sinal sistêmico foi claramente demonstrada em experimentos de enxertia entre plantas transgênicas silenciadas e não silenciadas (Palauqui e col., 1997). Nesses ensaios foram utilizados três transgenes distintos: os genes endógenos Nia e Nii, que codificam respectivamente as enzimas nitrato redutase e nitrito redutase, e o gene exógeno uidA, que codifica a enzima β-glucuronidase (GUS). O silenciamento foi sempre transmitido de porta-enxertos silenciados para enxertos não silenciados que expressavam o mesmo transgene, mas não para enxertos expressando transgenes distintos. Os mesmos resultados foram obtidos nos três sistemas, indicando que o sinal sistêmico não é uma característica específica de um gene em particular. Em todos os casos o silenciamento do enxerto foi específico, ou seja, as seqüências silenciadas foram as mesmas que encontravam-se silenciadas no porta-enxerto. Esta especificidade de seqüência sugere que o sinal sistêmico possui um ácido nucléico em sua composição. A transmissão do silenciamento também ocorreu quando porta-enxertos silenciados foram fisicamente separados do enxerto por um segmento de caule de 30 cm de planta não-transformada, indicando a propagação a longa distância do sinal. A propagação sistêmica do silenciamento também foi demonstrada em ensaios onde plantas transgênicas de Nicotiana benthamiana não silenciadas para GFP foram silenciadas pela introdução de uma segunda cópia do transgene. Nestes experimentos, folhas de N. benthamiana não silenciadas foram agroinoculadas (Voinnet e Baulcombe, 1997) ou bombardeadas com uma cópia extra de GFP (Voinnet e col., 1998). O silenciamento foi inicialmente detectado nos tecidos inoculados/bombardeados, e subseqüentemente nas folhas superiores (não inoculadas) da planta. Observações semelhantes foram realizadas em C. elegans. A expressão de GFP foi silenciada em células da linhagem germinativa e em células somáticas alimentando-se indivíduos com dsRNA homólogo a GFP ou cultivando-se indivíduos em solução contendo bactérias expressando dsRNA (Timmons e Fire, 1998; Timmons e col., 2001). O mecanismo pelo qual o silenciamento é propagado a partir da célula inicialmente silenciada ainda não é totalmente compreendido. Estudos em C. elegans identificaram um gene requerido para o transporte do sinal sistêmico entre tecidos, porém totalmente dispensável para iniciar ou manter o silenciamento. Este gene, denominado Sid1 (systemic RNA interference deficient), codifica uma proteína transmembrana que se localiza na
- 70. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 60 Julho/2010 periferia celular (Winston e col., 2002). Para determinar a função da proteína SID1, os autores utilizaram células S2 de Drosophila, capazes de ativar normalmente o mecanismo de silenciamento, porém incapazes de propagar o silenciamento sistemicamente. Estas células foram transformadas com dois plasmídeos, o primeiro codificando luciferase e o segundo codificando formas funcionais ou não funcionais de SID1. As células foram imersas em uma solução contendo diferentes concentrações de dsRNA homólogo a luciferase por 48 horas e a atividade de luciferase foi medida. As células que expressavam SID1 funcional apresentaram uma taxa de silenciamento 105 vezes maior de as células transfectadas com plasmídeos expressando SID1 não funcional, mesmo na presença de altas concentrações de dsRNA. Esse resultado indica que SID1 facilita o transporte de dsRNA para o interior da célula. Além disso, foi demonstrado que o transporte de dsRNA mediado por SID1 não é sensível a baixas concentrações de ATP e baixas temperaturas, sugerindo que ocorre de forma passiva (Feinberg e Hunter, 2003). O transporte passivo poderia ocorrer nos dois sentidos, ou seja, SID1 pode ser responsável pela saída do sinal sistêmico da célula inicialmente silenciada. Em plantas, acredita-se que o sinal sistêmico seja capaz de se mover célula-a-célula via plasmodesmas (Himber e col., 2003; Lucas e col., 2001) e a longa distância via floema (Klahre e col., 2002; Mallory e col., 2003). Entretanto, não se sabe de que forma (ativa ou passiva) o transporte ocorre. Uma hipótese atrativa é a de que os siRNAs fazem parte do sinal sistêmico, pois eles possuem comprimento longo o suficiente para garantir a especificidade, estão consistentemente associados ao silenciamento e são pequenos o suficiente para movimentar-se célula-a-célula via plasmodesmas, além de serem suficientes para induzir o silenciamento de RNA em Drosophila, C. elegans, e em células de mamíferos (Mlotshwa e col., 2002). Entretanto, existem duas evidências contrárias à hipótese de que os siRNAs estejam associados ao sinal sistêmico. Estudos com HC-Pro, uma proteína viral supressora de silenciamento, demonstraram que em plantas onde o silenciamento foi suprimido por HC- Pro não ocorre acúmulo de siRNAs, entretanto a capacidade de produzir ou enviar o sinal sistêmico não é afetada (Mallory e col., 2001). Além disso, em C. elegans, indivíduos mutantes no gene Rde-4, essencial para que o silenciamento ocorra, produzem siRNAs de forma deficiente, porém o silenciamento sistêmico não é afetado (Parrish e col., 2000). Trabalhos de caracterização de siRNAs produzidos durante o silenciamento de RNA demonstraram a existência de duas classes de siRNAs em plantas transgênicas silenciadas para GFP: uma classe de siRNAs “longos” (24-26 nt) e outra de siRNAs “curtos” (21-22 nt). Curiosamente, os siRNAs derivados de retroelementos endógenos são exclusivamente da classe dos siRNAs longos. Os siRNAs longos são dispensáveis para a clivagem seqüência- específica do mRNA alvo, entretanto estão correlacionados com o silenciamento sistêmico e
- 71. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.61 com a metilação de DNA. Essas observações sugerem que os siRNAs curtos estão envolvidos no processo de incorporação ao RISC e clivagem dos mRNAs alvos, enquanto os siRNAs longos estariam envolvidos na sinalização sistêmica e na etapa nuclear de metilação do DNA (Hamilton e col., 2002). Entretanto, essa hipótese ainda não foi comprovada, e, dessa forma, a natureza precisa do sinal sistêmico permanece desconhecida. Um estudo detalhado do extrato de floema de plantas de abóbora (Cucurbita maxima) demonstrou a presença de uma população de pequenos RNAs provavelmente envolvidos no processo de sinalização sistêmica, pois uma análise comparativa de seqüência identificou possíveis alvos destes pequenos RNAs. Experimentos realizados com plantas transgênicas silenciadas e infectadas por vírus confirmaram a presença de siRNAs derivados do transgene ou do vírus no extrato do floema. Uma análise bioquímica desse extrato levou à identificação de uma proteína que se liga seletivamente a pequenos RNAs de fita simples, denominada CmPSRP1 (C. maxima Phloem Small RNA Binding Protein 1), sugerindo que esta proteína é parte da maquinaria envolvida no silenciamento sistêmico (Yoo e col., 2004). MicroRNAs MicroRNAs (miRNAs) constituem uma classe de pequenos RNAs de 21-24 nt envolvidos na regulação da expressão gênica em eucariotos. A presença de miRNAs já foi detectada em S. pombe, Drosophila, camundongos, humanos e plantas (Lagos- Quintana e col., 2003; Lee e Ambros, 2001; Llave e col., 2002b). Os miRNAs atuam de forma análoga aos siRNAs regulando negativamente mRNAs alvos, porém diferenciam-se destes pela origem e pela natureza do mRNA alvo. Os siRNAs são derivados do próprio mRNA alvo transcrito a partir de um transgene, vírus, transposon ou gene endógeno. Os miRNAs são processados a partir de transcritos endógenos que não codificam proteínas e possuem como alvo mRNAs endógenos. O número de genes que codificam miRNAs está estimado em 0,5-1% do número total de genes do genoma em questão. C. elegans e Drosophila possuem aproximadamente 100 a 140 genes que codificam miRNAs, enquanto seres humanos possuem de 200 a 255. Pelo menos 0,2 % do genoma de Arabidopsis codifica miRNAs. Esta representatividade relativa é comparável à de outras famílias gênicas envolvidas na regulação gênica como, por exemplo, a de fatores de transcrição que se ligam a DNA (Nakahara e Carthew, 2004). A maioria dos genes que codificam miRNAs são conservados entre espécies relacionadas e aproximadamente 30 % são altamente conservados, com ortólogos em vertebrados e invertebrados, sugerindo uma conservação evolutiva com base
- 72. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 62 Julho/2010 em sua função biológica. Embora miRNAs estejam presentes em plantas e animais, ainda não foram descritos miRNAs ortólogos nos dois reinos (Bartel, 2004). A maioria dos genes que codifica miRNAs se localiza em regiões intergênicas, sugerindo que são transcritos a partir de unidades transcricionais independentes (Lau e col., 2001; Lee e Ambros, 2001). Inicialmente acreditava-se que os miRNAs eram transcritos pela RNA polimerase III, pois ela transcreve a maioria dos pequenos RNAs como os tRNAs e o snRNA U6. Entretanto, diversas evidências indicam que os miRNAs não são transcritos pela RNApol III. Os transcritos que geram miRNAs são um pouco mais longos do que os demais RNAs transcritos pela enzima, e possuem seqüência internas com mais de quatro uracilas seguidas, o que seria o sinal de término da transcrição para a RNApol III (Lee e col., 2002). Além disso, um grande número de transcritos quiméricos contendo miRNAs e transcritos adjacentes têm sido encontrado em bibliotecas de EST, e muitos destes ESTs possuem cauda poli A e são ocasionalmente processados, sugerindo que são transcritos pela RNA polimerase II (Smalheiser, 2003). Por fim, a inserção de elementos enhancer que respondem à RNApol II em Drosophila induz a expressão do miRNA Bantam (Brennecke e col., 2003). De fato, foi demonstrado que os transcritos primários (nucleares) que geram os miRNAs (denominados pri-miRNAs) possuem estrutura de capa na extremidade 5’ e cauda poli-A na extremidade 3’, características de transcritos de genes da classe II. Além disso, o tratamento de células humanas com α-amanitina a concentrações que inibem a RNApol II suprime o acúmulo de pri-miRNAs, e ensaios de imunoprecipitação de cromatina demonstraram que a RNApol II está fisicamente associada ao promotor de alguns miRNAs (Lee e col., 2004b). Aproximadamente um quarto dos genes que codificam miRNAs em Drosophila estão localizados em introns, preferencialmente na mesma orientação do mRNA, sugerindo que são transcritos a partir do promotor do gene e processados a partir dos introns, de forma análoga a diversos snRNAs (Aravin e col., 2003). O alvo desses miRNAs é o próprio mRNA processado, o que sugere um cenário regulatório onde a expressão coordenada do miRNA e de seu mRNA alvo é desejada (Lim e col., 2003a). Outros miRNAs estão agrupados no genoma em um arranjo e padrão de expressão que produz um pri-miRNA “policistrônico”, capaz de gerar vários miRNAs distintos após a finalização do processamento (Fig. 2) (Lau e col., 2001). Apesar da maioria dos genes que codificam miRNAs em plantas, C. elegans e humanos estar organizada de forma isolada (Lim e col., 2003a; Lim e col., 2003b), mais da metade desses genes em Drosophila está organizada em agrupamentos (Aravin e col., 2003). Embora a presença de miRNAs em plantas e animais sugira que esta classe de RNAs não codificantes está envolvida na regulação da expressão gênica desde pelo menos o último ancestral comum destas linhagens (Reinhart e col., 2002), existem algumas
- 73. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.63 diferenças importantes na biogênese e no modo de ação entre os miRNAs de plantas e animais. A estrutura em forma de grampo predita para o pri-miRNA em plantas é muito mais variável em comprimento e tipicamente mais longa do que em animais (Reinhart e col., 2002). Além disso, plantas requerem uma complementaridade perfeita entre o miRNA e o mRNA alvo, em contraste com miRNAs em animais que são imprecisamente complementares ao alvo (Hutvagner e Zamore, 2002). A comparação entre alvos de miRNAs em plantas e animais indica três diferenças adicionais. Os sítios de complementaridade dos miRNAs de plantas estão localizados sempre na região codificadora do mRNA alvo, enquanto que em animais podem se localizar na região codificadora ou, preferencialmente, na região 3’ não traduzida. Além disso, em plantas existe apenas um sítio de complementaridade entre determinado miRNA e seu mRNA alvo, enquanto que em animais podem existir sítios múltiplos de complementaridade (Reinhart e col., 2000; Rhoades e col., 2002; Slack e col., 2000). Por fim, os miRNAs de plantas atuam predominantemente degradando o mRNA alvo (Carrington e Ambros, 2003), com uma única exceção conhecida até o presente, o miRNA172, que regula a expressão do gene APETALA2 em Arabidopsis reprimindo a tradução sem afetar a estabilidade do mRNA (Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004). O oposto é observado com os miRNAs de animais, que predominantemente reprimem a tradução de seus mRNAs alvos sem afetar sua estabilidade (Olsen e Ambros, 1999). Somado à ausência de conservação entre os genes que codificam miRNAs em plantas e animais, estas diferenças sugerem que esses genes evoluíram independentemente após a divergência dos dois reinos (Bartel, 2004). O modelo atual para a biogênese de miRNAs em animais (Fig. 2) propõe que a maturação dos miRNAs ocorre em duas etapas. A primeira etapa consiste na clivagem nuclear do pri-miRNA, que libera um intermediário com estrutura secundária em forma de grampo com aproximadamente 60-70 nt, denominado pre-miRNA (precursor miRNA) (Lee e col., 2002). Esta clivagem é realizada pela RNase III Drosha, que cliva ambas as fitas do pri- miRNA em sítios próximos à base da estrutura em forma de grampo, gerando um premiRNA com um fosfato em sua extremidade 5’ e 2 nucleotídeos protundentes na extremidade 3’ (Lee e col., 2003b). O pre-miRNA é transportado de forma ativa do núcleo para o citoplasma pelo complexo Ran-GTP/Exportina-5 (Lund e col., 2004; Yi e col., 2003). A clivagem nuclear define a extremidade 5’ do miRNA, que é a mesma do pre-miRNA. A extremidade 3’ é processada no citoplasma pela enzima Dicer (Hutvagner e Zamore, 2002; Ketting e col., 2001). Nesta etapa, a Dicer atua de forma idêntica à clivagem de dsRNA no processo de silenciamento de RNA. Inicialmente ocorre o reconhecimento da região de fita dupla do pre- miRNA, provavelmente por afinidade da enzima com o fosfato 5’ e os 2 nt protundentes na extremidade 3’. Em seguida ocorre a clivagem, liberando um miRNA de fita dupla com aproximadamente 21-25 pares de bases, contendo fosfatos nas extremidades 5’ e dois
- 74. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 64 Julho/2010 nucleotídeos protundentes nas extremidades 3’ (Hutvagner e Zamore, 2002). De acordo com este modelo, a especificidade da primeira clivagem determina a posição correta da segunda clivagem do pre-miRNA, definindo assim ambas as extremidades do miRNA (Lee e col., 2003b). Figura 2. Processos nucleares e citoplasmáticos envolvidos na biogênese de microRNAs (miRNAs) em plantas e animais. Os miRNAs são transcritos, em ambos tipos de organismos, a partir de genes que produzem um RNA precursor com estrutura secundária em forma de grampo, denominado pri-miRNA. Em plantas, o pri-miRNA é processado pela enzima DCL-1 no núcleo, gerando um intermediário com aproximadamente 60-70 nt denominado pre-miRNA. O pre-miRNA é subseqüentemente processado, provavelmente pela mesma enzima, gerando o miRNA. Em animais, o pri-miRNA é processado no núcleo pela enzima Drosha, gerando o premiRNA. O pre-miRNA é transportado de forma ativa do núcleo para o citoplasma pelo complexo Ran-GTP/Exportina-5. No citoplasma, o pre-miRNA é processado pela enzima Dicer, gerando o miRNA. Em plantas e animais, o miRNA citoplasmático é incorporado ao complexo RISC, que irá degradas os mRNAs endógenos que apresentam homologia com a seqüência do miRNA. Em plantas, os miRNA também atuam no núcleo, via incorporação a um complexo RISC nuclear. (Modificado de Zerbini e col., 2005).
- 75. Sinalização Celular Julho/2010 Pág.65 Em plantas o processamento parece ser um pouco diferente. Não são detectados pre-miRNAs, mesmo em plantas mutantes para DCL1, a proteína homóloga à Dicer envolvida na biogênese de miRNAs (Reinhart e col., 2002). A localização nuclear de DCL1 sugere esta realiza o papel funcional de Drosha (Papp e col., 2003). DCL1 (ou outra enzima ainda não identificada) realiza também a segunda clivagem, correspondente à clivagem citoplasmática em animais, antes da exportação para o citoplasma. O acoplamento da primeira e segunda clivagens no núcleo pode explicar a ausência de pre-miRNAs em níveis detectáveis em plantas (Bartel, 2004). Não existem dados conclusivos sobre o transporte do miRNA de fita dupla do núcleo para o citoplasma em plantas. Um ortólogo à exportina-5 denominado HST1 (Hasty 1) foi identificado em Arabidopsis, sugerindo que esta proteína está envolvida no transporte núcleo/citoplasma. Embora o processamento de miRNAs não tenha sido testado em mutantes hst1, estas plantas apresentam alterações morfogenéticas e redução no acúmulo de alguns miRNAs, sugerindo que a via biossintética dos miRNAs é afetada (Bollman e col., 2003). Após o transporte núcleo/citoplasma, o modo de ação dos miRNAs é bastante semelhante às etapas do silenciamento de RNA mediado por siRNAs. Os miRNAs foram inicialmente encontrados em associação com um complexo ribonucleoprotéico denominado miRNP (miRNA ribonuclein complex), que em humanos inclui a proteína Argonauta eIF2C2, a helicase GEMIN3 e GEMIN4 (Martinez e col., 2002; Mourelatos e col., 2002). O miRNA let- 7 de humanos se associa a eIF2C2 e é capaz de guiar a clivagem sítio-específica de um RNA alvo artificial 100 % complementar ao Mirna (Hutvagner e Zamore, 2002). Desta forma, sugeriu-se que o complexo miRNP corresponde ao RISC, que direciona a clivagem de mRNAs no mecanismo de silenciamento de RNA (Hutvagner e Zamore, 2002). Somente uma das fitas do miRNA de fita dupla é incorporada ao RISC. Quando isso ocorre, a outra fita é degradada. Estudos para determinar qual das fitas é incorporada no RISC mostraram que a fita incorporada é aquela que possui o terminal 5’ com pareamento de bases mais instável (Schwarz e col., 2002). Em plantas, o acúmulo de miRNAs é dependente dos genes Hen1 e de Hyl1, além de Dcl1. A proteínas HEN1 e HYL1 possuem sinal de localização nuclear, sugerindo que elas atuam em uma etapa nuclear da biogênese de miRNAs (Park e col., 2002). HEN1 é uma dsRNA metilase (Anantharaman e col., 2002) e HYL1 se liga especificamente a dsRNA (Lu e Fedoroff, 2000), portanto podem estar envolvidas em marcar e direcionar os miRNAs de fita dupla que devem ser incorporados ao RISC. Uma vez incorporado ao RISC, o miRNA vai direcionar a clivagem específica de mRNAs complementares ou reprimir sua tradução (Zeng e Cullen, 2002). Em plantas, a grande maioria dos miRNAs cujos alvos já foram identificados atuam via clivagem específica (Rhoades e col., 2002). Em animais, a maioria dos miRNAs possui complementaridade a
- 76. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 66 Julho/2010 vários sítios na região 3’ não traduzida de mRNAs alvos e acredita-se que atuam inibindo a tradução. Entretanto, foi demonstrado que o miRNA mir-196 direciona a clivagem do seu mRNA alvo, Hoxb8, em camundongos (Yekta e col., 2004). Quando o miRNA direciona a clivagem, esta ocorre precisamente da mesma forma que a clivagem direcionada por siRNAs, ou seja, entre o décimo e o décimo primeiro nucleotídeo pareado do miRNA (Hutvagner e Zamore, 2002). Após a clivagem do mRNA alvo, o miRNA permanece intacto e pode direcionar o reconhecimento e a clivagem de outro mRNA alvo (Hutvagner e Zamore, 2002). Existe atualmente um grande número de miRNAs identificados em plantas e animais (Rhoades e Bartel, 2004; Llave e col., 2002b; Rhoades e col., 2002). Em vários casos, os alvos desses miRNAs foram identificados e comprovados por meio de análises computacionais (Rhoades e col., 2002). Entretanto, a validação definitiva de um mRNA alvo requer estudos nos quais sua suposta seqüência de reconhecimento seja alterada de modo a impedir o anelamento do miRNA, verificando-se um subseqüente aumento na concentração do mRNA alvo (Baulcombe, 2004). A identificação dos mRNAs alvos dessa forma demonstrou que os miRNAs estão predominantemente envolvidos na regulação de genes relacionados ao desenvolvimento de órgãos e tecidos, incluindo diversos fatores de transcrição (Bartel, 2004). Alguns exemplos incluem o miRNA-JAW, que regula a expressão do fator de transcrição TCP envolvido na morfogênese de folhas (Palatnik e col., 2003), o miRNA159, que regula a expressão do fator de transcrição MYB33 envolvido no balanço de reguladores de crescimento (Palatnik e col., 2003), o miRNA 165/166 que regula a expressão de três fatores de transcrição da classe envolvidos na diferenciação das faces adaxial e abaxial de folhas (Emery e col., 2003), o miRNA172, que regula a expressão do fator de transcrição APETALA2 envolvido na morfogênese floral (Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004), e o miRNA164, que regula a expressão de vários fatores de transcrição da classe NAC, envolvidos em diversos aspectos da diferenciação de órgãos vegetativos e reprodutivos (Mallory e col., 2004). Além disso, a expressão de genes relacionados com a própria maquinaria do silenciamento de RNA, como AGO1 (Vaucheret e col., 2004) e DCL-1 (Xie e col., 2003) é regulada por miRNAs. Bibliografia Akhtar, A.; Zink, D. e Becker, P.B. (2000). Chromodomains are protein-RNA interaction modules. Nature 407:405-9. Anandalakshmi, R.; Pruss, G.J.; Ge, X.; MAarathe, R.; Mallory, A.C.; Smith, T.H. e VANCE, V.B. (1998). A viral suppressor of gene silencing in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95:13079-84.
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- 84. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 74 Julho/2010 Reunhart, B.J.; Weinstein, E.G.; Rhoades, M.W.; Bartel, B. e Bartel, D.P. (2002). MicroRNAs in plants. Genes & Development 16:1616-26. Rhoades, M.W.; Reinhart, B.J.; Lim, L.P.; Burge, B.; BARTEL, B. E Bartel, D.P. (2002). Prediction of plant microRNA targets. Cell 110:513-20. Ribeiro, R. C, Kushner, P. J., Baxter, J. D. (1995). The nuclear hormone receptor gene superfamily. Annual Review of Medicine, 46, 443-453. Romano, N. e Macino, G. (1992). Quelling: Transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Molecular Microbiology 6:3343-53. Rosenthal, P. J. (1998). Proteases of malaria parasites: new targets for chemotherapy . Emerging Infectious Diseases, 4, 49-57. Rosenthal, P. J. (1999). Proteases of protozoan parasites. Advances in Parasitology, 43, 105-159. Roth, E. F., Brotman, D. S., Vanderberg, J. P. and Schulman, S. (1986). Malarial pigment-dependent error in the estimulation of hemoglobin content in Plasmodium falciparum-infected red cells: implications for metabolic and biochemical studies of the erythrocytic phases of malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg, 35, 906-911. Ruiz, M.T.; Voinnet, O. e Baulcombe, D.C. (1998). Initiation and maintenance of virus-induce gene silencing. Plant Cell 10:937-46. Sasaki, T.; Shiohama, A.; Minoshima, S. e Shimizu, N. (2003). Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome. Genomics 82:323-30. Schaafsma, D., Roscioni, S. S., Meurs, H., Schmidt, M. (2008). Monomeric G-proteins as signal transducers in airway physiology and pathophysiology. Cellular Signalling, 20, 1705-1714. Schenk, P. W., Snaar-Jagalska, B. (1999). Signal perception and transduction: the role of protein kinases. Biochimica et biophysica acta, 1449, 1-24. Schwartz, J. H. (2001). The many dimensions of cAMP signaling. Proceedings of the national academy of Science, 98, 13482-13484. Schwarz, D.S.; Hutvagner, G.; Haley, B. e Zamore, P.D. (2002). Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Molecular Cell 10:537-48. Slack, F.J.; Basson, M.; Liu, Z.; Ambros, V.; Horvitz, H.R. e Ruvkun, G. (2000). The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell 5:659-69. Smalheiser, N.R. (2003). EST analyses predict the existence of a population of chimeric microRNA precursor-mRNA transcripts expressed in normal human and mouse tissues. Genome Biology 4:403. Squire, L. R, Bloom, F. E., McConnell, S. K., Roberts, J. L., Spitzer, N. C., Zigmound, M. J. (2003). Fundamental Neuroscience. 2a edição, Ed.Academic Press, 225-258. Scheibel, L. W. and Sherman, I. W. (1988). Plasmodium metabolism and related organellar function during various stages of life-cycle: Proteins, lipids, nucleic acids and vitamins.In: Malaria: Principles and Practice of Malariology. (Wernsdorfer, W.H. and McGregor, I., eds.) pp.219-252; Edinburgh: Churchill Livingstone. Sturn, A., Amino, R., Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A., Krueger, A., Pollok, J., Menard, R., Heussler, V. (2006). Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science, 313,1287-1290.
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- 86. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 76 Julho/2010 Xie, Z.; Johansen, L.K.; Gustafson, A.M.; Kasschau, K.D.; Lellis, A.D.; Zilberman, D.; Jacobson, S.E. e Carrington, J.C. (2004). Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biology 2:E104. Xie, Z.; Kasschau, K.D. e Carrington, J.C. (2003). Negative feedback regulation of Dicer-Like1 in Arabidopsis by microRNA-guided mRNA. Current Biology 13:784-9. Yi, R.; Qin, Y.; Macara, I.G. e Cullen, B.R. (2003). Exportin-5 mediates the nuclear export of pre- microRNAs and short hairpin RNAs. Genes & Development 17:3011-16. Yoo, B.C.; Kragler, F.; Varkonyi-Gasic, E.; Haywood, V.; Archer-Evans, S.; Lee, Y.M.; Lough, T.J. e Lucas, W.J. (2004). A systemic small RNA signaling system in plants. Plant Cell 16:1979- 2000. Zamore, P.D.; Tuschl, T.; Sharp, P.A. e Bartel, D.P. (2000). RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101:25-33. Zeng, Y. e Cullen, B.R. (2002). RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA 8:855-60.
- 87. Unidade 3 Neurociências ¹Leopoldo BarlettaMarchelli leopoldo.barletta@gmail.com ²Breno Teixeira Santos breno.santos@gmail.com ¹Felipe Viegas Rodrigues rodrigues.fv@gmail.com ¹Laboratório de Neurociência e Comportamento ²Laboratório de Fisiologia Teórica O entendimento atual sobre origem, funcionamento e capacidade do sistema nervoso é resultado do esforço de múltiplas áreas do conhecimento, denominadas genericamente por neurociências. Esta ampla área inclui disciplinas como neuroanatomia (estudo da estrutura do sistema nervoso), neurofisiologia (estudo do funcionamento de células nervosas e conjuntos de células nervosas), neuropsicologia (estudo dos processos cognitivos e suas relações com anatomia e fisiologia) e até mesmo a engenharia (modelagem analítica e computacional de versões simplificadas de células neurais, chegando a simulação de redes de milhares de neurônios). Baseado no conhecimento de todas essas disciplinas, apresentaremos as neurociências desde seus primórdios até o conhecimento atual. Abordaremos as principais funções cognitivas no estudo das neurociências como atenção, percepção, ação, memória e emoção, empregando o conceito de modularidade do funcionamento do sistema nervoso. Também abordaremos modelos de processos biofísicos e métodos de análise quanti/qualitativa da dinâmica neural, mas utilizando os conhecimentos da engenharia, que busca obter estruturas teóricas básicas que delineiam o funcionamento global desses sistemas.
- 88. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 78 Julho/2010 Capítulo 8 História da neurociência pág. 79 Camile Maria Costa Corrêa Revisado por Dr. Gilberto Fernando Xavier Capítulo 9 Princípios básicos em fisiologia neural pág. 89 Renata Pereira Lima Revisado por Dr. Gilberto Fernando Xavier Capítulo 10 Fisiologia sensorial pág. 103 Felipe Viegas Rodrigues Revisado por Andreas Betz e Daiane Gil Franco Capítulo 11 Neurofisiologia da visão pág. 115 Antônio Carlos da Silva Revisado por Dr. Carlos Arturo Navas Capítulo 12 Causa e função pág. 121 Dr. Pedro Leite Ribeiro Capítulo 13 Percepção pág. 127 Felipe Viegas Rodrigues Revisado por Arnaldo Cheixas-Dias Capítulo 14 Memória e seus aspectos evolutivos pág. 139 Leopoldo Barletta Marchelli Capítulo 15 Navegação espacial pág. 153 Cyrus Villas-Boas Capítulo 16 Neurobiologia das emoções pág. 163 Bárbara Onishi Capítulo 17 Neurofisiologia da linguagem pág. 179 Rodrigo Collino Revisado por Dr. Gilberto Fernando Xavier Capítulo 18 Neurofisiologia da música pág. 187 Felipe Viegas Rodrigues Revisado por: Dr. Pedro Leite Ribeiro Dr.Leonardo Henrique R. G.de Lima Bibliografia pág. 194
- 89. Neurociências Julho/2010 Pág. 79 Históriada Neurociência Camile Maria Costa Corrêa Laboratório de Neurociência e Comportamento camile.mc.correa@gmail.com Introdução Como pensamos? Como interpretamos a nossa realidade? De que forma situamo- nos no mundo e desenvolvemos nossa identidade, nossas relações, crenças e loucuras? Como nos emocionamos, sonhamos e experienciamos consciência? Como foi possível desenvolvermos filosofia, ciência e artes? Haveria uma chave para entender os mistérios da vida mental? Atualmente, nosso conhecimento entende o cérebro como órgão responsável pelo comportamento e pelas faculdades mentais. Também aprendemos que fenômenos eletroquímicos são os responsáveis pelo funcionamento do sistema nervoso. No entanto, esses conhecimentos são relativamente recentes e durante muitos séculos as crenças sobre a maneira de funcionar do cérebro foram radicalmente diferentes das professadas hoje. Investigar o tratamento histórico dessas questões permite vislumbrar de que maneiras a humanidade vem formulando perguntas fundamentais sobre os aspectos daquilo que tradicionalmente identificamos como mente: sua existência, essência, localização, estrutura e função. Todos os passos, dos mais intuitivos aos mais rigorosos do ponto de vista experimental, constituem juntos os alicerces do conhecimento que hoje relacionamos à neurociência. A mente nas antigas civilizações Sabe-se que as civilizações antigas exerciam uma produção cultural muito rica. Há registros de povos primitivos que praticavam religiões e acreditavam em entidades tais como alma e espírito. Interessantemente, além de estarem presentes no domínio do corpo, elas permeavam a própria natureza. Entretanto, essas culturas não contavam com o que hoje se conhece sobre fisiologia, fazendo com que as tentativas de localização da mente soassem simplesmente ilógicas, uma vez que as pistas das sedes para os fenômenos mentais eram intuídas a partir de observações cotidianas. Havia evidências de que a mente poderia estar dentro da cabeça ao perceber, por exemplo, que um trauma nessa região poderia causar alterações substanciais da percepção e do comportamento. Uma evidência da aposta nessa localização são os achados dos rituais de trepanação. A trepanação é uma técnica cirúrgica de abertura de uma ou mais fendas no crânio, com o provável intuito de afastar maus espíritos. Povos antigos, como os maias,
- 90. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 80 Julho/2010 (2000 a.C. – 900 d.C.) realizavam esse tipo de procedimento em pessoas acordadas, provavelmente acreditando que espíritos maus existentes no interior da cabeça seriam os responsáveis por patologias tais como epilepsia e o estado de coma e, uma vez feitas essas aberturas, os espíritos poderiam escapar, o que promoveria a recuperação e cura. Crânios com perfurações feitas em vida foram encontrados em sítios que datam de até 10.000 anos. Pela cicatrização, há indícios de que as pessoas sobreviviam a esse procedimento. Ora, alguns casos de coma eram devidos a um aumento da pressão intracraniana e essa cirurgia realmente promove alívio da hipertensão intracraniana podendo, em alguns casos, ter até valor terapêutico. Cadáveres dessa forma foram encontrados em quase todas as civilizações do mundo e, mesmo povos modernos, como os da Oceania, ainda praticam essa laboriosa e arriscada cirurgia. Uma segunda questão tão intrigante quanto a localização diz respeito à forma como mente e corpo viriam a se influenciar. Se uma mente existe e se ela está no corpo, qual o mecanismo de interação dessa mente com esse corpo? Um outro indício, documental, de que há muito se associava o cérebro à mente é o Papiro Cirúrgico de Edwin Smith, americano que adquiriu a relíquia em 1862. Considerada o tratado científico mais antigo conhecido, foi escrito no Egito e data, embora não haja consenso, de 1600 a.C. Lá estão descritos 30 casos de referências diretas ao cérebro. Descrições anatômicas, traumatológicas e clínicas, com detalhes sobre o que acontecia com um trauma de guerra, provocando epilepsia, convulsões, paralisia, problemas sensoriais e até alteração do sistema nervoso autônomo nas pessoas que haviam sido vítimas dessas lesões. Abordagens Filosóficas Pioneiras Foi na Antigüidade Grega, com o florescimento intelectual em Atenas, por volta de 400-300 anos a.C., que começou a surgir o pensamento sistematizado sobre algumas perguntas relativas à mente. (Consenza, 2002). Na cultura ocidental, Alcmaeon de Crotona (século V a.C.) foi possivelmente o primeiro a localizar no cérebro a sede das sensações. Para ele, os nervos ópticos, que seriam ocos, levariam a informação ao cérebro, onde cada modalidade sensorial teria seu próprio território de localização. Ainda no século V a.C., Demócrito, Diógenes, Platão e Teófrasto punham no cérebro o comando das atividades corporais. Também entre os gregos, Herófilo (335-280 a.C.), que dissecou e escreveu sobre o cérebro, foi o primeiro a descrever suas cavidades, os ventrículos cerebrais, associando-os às funções mentais. Essa idéia, como veremos, teve enorme importância na “neurofisiologia” dos séculos que se seguiram. Os filósofos gregos Alcaemeon e Demócrito acreditavam que a sede da mente era o
- 91. Neurociências Julho/2010 Pág. 81 cérebro.Para eles, a constituição interna dos nervos era oca e seriam estas as estruturas responsáveis por transmitir uma espécie de fluido vital, chamado espírito animal, base da mente, da alma e até da alma imortal. Na filosofia ocidental dois nomes entraram em intenso debate. Hipócrates - o pai da medicina - e Aristóteles, pai das ciências do conhecimento natural, cujas idéias foram propagadas até a idade moderna. Hipócrates (460-379 a.C.) acreditava que o cérebro era a sede da mente, dos sentimentos e das emoções; ele seria a estrutura responsável pelos sonhos, terrores noturnos e problemas mentais. "Deveria ser sabido que ele é a fonte do nosso prazer, alegria, riso e diversão, assim como nosso pesar, dor, ansiedade e lágrimas, e nenhum outro que não o cérebro. Na época não havia conhecimento sistematizado sobre a anatomia cerebral, pois não se praticavam dissecações. As declarações hipocráticas eram, portanto, fruto de intuições filosóficas baseadas na observação clínica de que o cérebro seria a sede de tudo o que hoje se acredita que seja (juízo, emoções, sentimentos etc.) Porém, esse conhecimento dos hipocráticos sofreu uma regressão com Aristóteles, (384 a.C. - 322 a.C)., para quem a sede dos referidos fenômenos estava no coração. Seus argumentos eram simples: o coração hospeda a razão por ser quente e ativo, enquanto o cérebro serve para resfriar o sangue, por ser frio e inerte. Ora, quando se experiencia uma emoção forte, ela é sentida no coração, pela ativação simpática. Diz-se que o coração está pesado, que se gosta de alguém “de coração” ou até mesmo que se sabe algo de cor; do latim, decorado. Acreditava-se, inclusive, que até a memória estaria no coração. Na época, associou-se erradamente o efeito à causa, quer dizer, a emoção está no cérebro, a sua expressão está no coração. Porém, Aristóteles não era experimentador, era um filósofo, pensava essencialmente de acordo com a lógica. O médico romano Galeno (130-200) foi importante na história da neurociência porque foi o primeiro a refutar o que disse Aristóteles. Para aquele, não haveria sentido em afirmar que o cérebro tivesse a função de esfriar as paixões do coração. Pela dissecação de animais ele destinou muita atenção às meninges e às cavidades encefálicas (contrastantes com a massa, amorfa, cerebral) fazendo com que se buscasse relacionar os ventrículos com a mente. Os ventrículos pareciam ser estruturas-chave na procura pela sede da mente por serem espaços destacados, cheios de líquidos, e, uma vez que ainda era forte a idéia vinda dos gregos de que a mente seria intermediada pelo espírito animal, várias pistas indicavam que aqueles ventrículos cheios de fluido fossem a sua sede. Esse conceito de Galeno foi apropriado durante toda a Idade Média pela ciência médica. Acreditava-se, por especulação puramente teórica, que havia três células dos ventrículos no cérebro. A primeira célula (anterior) seria responsável pela sensação e
- 92. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 82 Julho/2010 percepção (nervos ligando os órgãos dos sentidos ao ventrículo 1). A segunda célula seria a responsável pelo juízo, pensamento e razão (ventrículos laterais; faculdades nobres, fluido resfriado e o refugo seria filtrado pelo sangue). Já a terceira seria a responsável pela memória, e utilizada pelos outros dois ventrículos para o funcionamento cerebral. Leonardo da Vinci, grande anatomista, também fez desenhos dos ventrículos cerebrais. Até aqui, tem-se uma teoria da mente que, embora não se baseasse na fisiologia, não deixava de apresentar uma certa consistência interna. A idéia dos fluidos vigeu durante muitos séculos. Foi apenas a partir da Renascença que houve mudanças mais pronunciadas, pelo conhecimento mais detalhado sobre a anatomia do cérebro. (Consenza, 2002). O anatomista Vesalius, (1514-1564) escreveu o livro “Da Estrutura do Corpo Humano” em que ele, através das dissecções que realizava em seres humanos e em outros animais, notou que estes (inclusive asnos e jumentos) também tinham ventrículos. Observou-se que o espaço ventricular nos homens e em outros primatas era praticamente do mesmo tamanho, ao contrário do restante do cérebro que, no homem, mostrava diferenças. Dessa forma, seria lógico pensar que os aspectos intelectuais superiores, tão peculiares a nós, estariam não nos ventrículos, mas em outras partes do cérebro. Contudo, continuou-se a acreditar que os ventrículos cerebrais eram um local de armazenamento dos espíritos animais, de onde eles partiriam para, através dos nervos, atingir os órgãos sensoriais ou de movimento. Assim, a teoria da localização ventricular perdurou por muito tempo. Descartes e o mecanicismo No século XVII, o filósofo, matemático e naturalista René Descartes (1596-1650) especulava sobre a natureza do sistema nervoso, sobre de que maneira ele funcionaria como a base da mente. Ele propôs o mecanismo da ação reflexa, fenômeno que ocorre quando, ao encostar-se num estímulo nocivo, como o fogo, retira-se o membro de forma rápida e involuntária. Descartes propôs que o estímulo, ao atingir o pé, seria transmitido pelos nervos até o cérebro, sendo que essa transmissão seria conduzida de forma hidráulica. Assim, o aquecimento provocaria um aumento do fluxo do fluido (espírito animal) para o cérebro, que iria aos ventrículos, até a glândula pineal, (reguladora desse fluxo), voltando até o nervo motor, de forma a inchar o músculo tal qual um fole que promoveria, finalmente, o movimento do membro. (Consenza, 2002). Note-se que o modelo físico do cérebro na época era hidráulico, seguindo a tecnologia disponível na época. Descartes comparou as fontes do jardim de Versailles, da realeza francesa, cujos mecanismos eram hidráulicos, com a própria complexidade do
- 93. Neurociências Julho/2010 Pág. 83 sistemanervoso. Descartes fez uma série de desenhos, puramente especulativos, mostrando a estrutura fibrosa do cérebro humano; e ele especulava que a glândula pineal regulava o fluxo do espírito animal dentro do cérebro como se fosse uma válvula. Há desenhos do encéfalo inflado e desinflado; correspondendo ao estado de vigília e de sono. Ele argumentava que os fluxos iriam se acumulando durante o dia e inchando o cérebro e, à noite, a pineal (válvula) entrava em funcionamento e isso promovia o sono. Nessa época almejava-se chegar ao conhecimento pela via da razão pura, da dialética, do exame da lógica das palavras e do conhecimento, em detrimento da experimentação. O início dos experimentos Em fins do século XVIII (1780, 1790) inaugurou-se realmente a era científica. Na física, com Galileu Galilei, e na ciência biológica com outros dois italianos: Luigi Galvani e Alessandro Volta. Esses dois cientistas foram pioneiros no estudo experimental do sistema nervoso. A seguir são elencados quatro conceitos que, nos séculos XVIII e XIX, permearam o início da era científica em neurociência (Consenza, 2002). 1. A eletricidade animal: a idéia de que “espíritos animais” percorriam os nervos, cuja origem remonta ao pensamento grego, permaneceu corrente até o Século XVIII, quando ficou demonstrada a natureza elétrica na condução nervosa, destacando-se para isso o trabalho de Luigi Galvani; 2. A localização de áreas cerebrais: o conhecimento de que determinadas partes do cérebro apresentam diferentes funções. Têm início as tentativas de aliar forma e função para mapear faculdades cerebrais: ações motoras, percepções sensoriais etc.; 3. A doutrina neuronal: uma especialização da doutrina celular. Cientistas descobriram através do microscópio que as células não eram somente elementos estruturais, mas os elementos funcionais de todos os organismos. 4. A teoria da Evolução: a partir da segunda metade do século XIX até hoje se firma como o conceito mais revolucionário nas ciências biológicas; foi proposto por Charles Darwin, cientista e naturalista inglês. No final do século XVIII, Luigi Galvani (1737-1798) notou que, ao amarrar as pernas de um sapo a uma grade metálica, submetendo-as a uma descarga, as pernas se contraíam. Na época, os modelos físicos também estavam em transformação. Uma hipótese
- 94. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 84 Julho/2010 seria a de que a eletricidade pudesse ser o fluido animal, a base do espírito vital. Aliado a essa descoberta, o magnetismo fez com que o paradigma hidráulico fosse banido da neurociência, que gradativamente passou a adotar o modelo elétrico. Galvani fez uma série de experimentos elegantes, demonstrando que a origem da eletricidade não era externa, mas interna, do próprio tecido animal. A partir daí foram conduzidos os estudos sobre as propriedades de comunicação no sistema nervoso. Os conceitos fundamentais sobre o papel do tecido cerebral para as funções nervosas também se desenvolveram no século XIX. Theodor Schwann (1810-1882), que descreveu a bainha de mielina, foi quem primeiro propôs que todo o corpo seria formado por células. Sua teoria teve ampla aceitação para todos os tecidos, com exceção do sistema nervoso, em relação ao qual se acreditava que as células eram contínuas, formando um grande sincício. Somente com a descoberta das técnicas de impregnação das estruturas nervosas pela prata (método de Golgi) foi possível uma observação mais acurada, resultando nos trabalhos de Santiago Ramón y Cajal (1852-1934) que, já em 1889, argumentava que as células nervosas eram elementos isolados. Em 1891 Wilhelm von Waldeyer (1836-1921) cunhou o termo “neurônio” para designar a unidade anatômica e funcional do sistema nervoso.(Consenza, 2002). Finalmente veio a descoberta, por Charles Scott Sherrington (1857-1952), dos espaços existentes nas junções entre células nervosas ou entre estas e as células musculares. Sherrington chamou essas estruturas de “sinapses”. Frenologia e a localização cerebral O médico alemão Franz Gall (1758-1828) propôs que o cérebro seria composto de muitos sub-órgãos particulares, cada um deles relacionado ou responsável por uma determinada faculdade mental. Ele propôs que o desenvolvimento relativo das faculdades mentais em um indivíduo levaria a um crescimento ou desenvolvimento de sub-órgãos responsáveis por eles. Assim, a forma externa do crânio refletiria a forma interna do cérebro, cuja observação poderia ser usada para diagnosticar faculdades mentais. (Sabbatini, 1997). Embora não fosse experimentador, Gall propôs esse modelo em boa fé, por observações feitas em centenas de crânios de pessoas normais, sentenciados, doentes mentais etc. Apesar de ter proposto uma teoria sem fundamentação científica, teve o mérito de chamar a atenção da ciência para o localizacionismo, para o fato de que haveria um mapeamento das funções cerebrais em relação à sua estrutura. Esse movimento levou a uma série de estudos baseados em informações clínicas, principalmente pela incidência de tumores ou de lesões em seres humanos, que tornava possível correlacionar alterações estruturais a disfunções comportamentais. O médico francês Pierre Broca mostrou que havia no cérebro uma área responsável
- 95. Neurociências Julho/2010 Pág. 85 pelalinguagem falada. Ele estudou um paciente afásico (capaz de emitir somente o som de uma palavra) e, quando da morte desse paciente, pela realização de necrópsia, foi descoberta uma lesão, originada pela sífilis, numa área muito pequena, restrita ao hemisfério esquerdo. Chegou-se à conclusão de que aquela área era a responsável exclusiva da elaboração da linguagem. Essa idéia foi a primeira comprovação científica de que tal mapeamento pudesse realmente existir. Novos Paradigmas Na esteira de transformações, toda a ciência sofreu o impacto da revolução paradigmática proposta por Darwin, pesquisador que violou conceitos profundos na época; até então Deus teria criado o ser humano de maneira exclusiva, à parte do Reino Animal, sendo que não fazíamos parte dessa cadeia por sermos nobres, superiores. Darwin mostrou que éramos parte desse ambiente em evolução e, mais ainda, que à medida que os organismos têm necessidade de se adaptar às mudanças no ambiente, eles desenvolvem tecidos (cerebrais e não cerebrais) para se adaptar àquela circunstância. A existência de vários fenômenos naturais, inclusive o papel do sistema nervoso, passa a ser considerada resultado da evolução pela seleção natural. Ainda um conceito fundamental na época é o de homeostase. Claude Bernard, um fisiologista francês da segunda metade do século, propôs um conceito do meio interno: a estabilidade, a temperatura corporal, a quantidade de determinados elementos sangüíneos, fluidos corporais ou intracelulares, tudo deve se manter constante para que seja possível a vida. Assim, os organismos desenvolveram formas extremamente sofisticadas (hormonais e neurais) de manter esse equilíbrio interno a despeito de mudanças no ambiente. O cérebro, o sistema endócrino, o sistema imune, funcionavam como isoladores do organismo em relação ao ambiente, a exemplo do processo regulatório da homeotermia. De forma análoga os próprios fenômenos mentais fariam igualmente parte dos mecanismos de homeostasia, indicando que até os comportamentos sofisticados como os das faculdades da mente humana fossem vistos como resultados da evolução, como táticas selecionadas para manter o equilíbrio. Por exemplo, no frio, os mecanismos bioquímicos promotores da homeotermia podem não ser suficientes, o que nos leva a desenvolver roupas, casas, ou migrar para clima mais quente (utilização de faculdades mentais). Finalmente a doutrina neuronal foi proposta/adaptada por dois cientistas: Ramón y Cajal (espanhol) e Camilo Golgi (italiano), que estudaram com grande detalhe a estrutura microscópica interna do sistema nervoso e descobriram que essas células pareciam se comunicar entre si através de processos fibrosos (axônios e dendritos) e que não havia continuidade entre elas. O conceito de sinapse foi desenvolvido posteriormente, como visto, por Sherrington.
- 96. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 86 Julho/2010 O começo da psicologia experimental A partir dessa época assistiu-se ao surgimento dos primeiros estudos de aprendizagem e memória; o conceito de reflexo condicionado, que foi elaborado por Ivan Pavlov, seria produto do funcionamento neuronal. Ele e Eric Kandel receberam o prêmio Nobel, este último por sua contribuição para desvendar os mecanismos e as bases celulares e moleculares do aprendizado. A partir daí vivemos uma revolução das técnicas advindas do conhecimento acumulado. Esse saber teve repercussões práticas, como o surgimento da psiquiatria científica e a mudança conceitual que passou a considerar as doenças como disfunções do cérebro e o conseqüente uso de conhecimentos psicológicos e fisiológicos na terapia. Os sintomas não eram mais devidos à possessão ou falta de caráter, mas atribuíveis a desordens biológicas. Jean Marie Charcot, psiquiatra francês, juntamente com Pinel, foram responsáveis pelas mudanças de atitude com relação à doença mental. Charcot é conhecido pelo estudo dos fenômenos histéricos, vistos não mais como falhas de caráter de mulheres que apresentavam essa neurose, mas como fruto de fenômenos biológicos subjacentes. O estudo da histeria influenciou o médico vienense Sigmund Freud, criador da psicanálise, que também procurou dar um embasamento neurológico à teoria. O desenvolvimento de medicamentos e de cirurgias foram marcantes na história da neurociência, como a lobotomia pré-frontal, uma técnica cirúrgica utilizada por décadas, muitas vezes sem motivo, desenvolvida pelo médico português Egaz Moniz (prêmio Nobel da década de 40) para tratamento de pacientes psicóticos. Já na década de 50 investiu-se na terapia medicamentosa, a intervenção química como alternativa de tratamento seguro e efetivo das psicoses, fazendo com que o conhecimento gerado pelas pesquisas se traduzisse também em intervenções sociais. O Futuro da pesquisa do cérebro. Entender o que nos faz humanos recruta, há milênios, desde idéias místicas, passando pelo conhecimento filosófico, e modernamente contando também com as metodologias científicas. O avanço dessas pesquisas alimenta a visão que a humanidade faz sobre a sua própria vida mental. Ao propormos uma divisão didática das idéias no tempo, percebemos que é possível agrupar a evolução do conceito sobre estrutura e funcionamento do sistema nervoso. A história é sempre um recurso precioso para o estudo do movimento das idéias. Olhando retroativamente, assistimos ao surgimento de uma determinada proposição, medimos seu impacto imediato ou tardio, seu declínio, seu retorno em outro tempo sob condições diferentes ou sua rejeição definitiva pela falta de evidências. (Kristensen et al. 2001)
- 97. Neurociências Julho/2010 Pág. 87 Amente é uma definição que tenta resgatar a essência do ser humano. A essência de uma pessoa emerge da existência de funções mentais que nos permitem pensar e perceber, amar e odiar, aprender e lembrar, resolver problemas, comunicar, criar e destruir civilizações. Essas expressões são intrinsecamente relacionadas ao funcionamento cerebral. Além disso, sem o cérebro, a mente não pode existir; sem a manifestação do comportamento, a mente não pode ser expressa. A evolução humana é notável na medida em que foi marcada por vários pontos de viragem cultural. Exemplos disso foram as peculiares descobertas do fogo, do abrigo, das ferramentas, da linguagem, que exigia uma combinação de fatores genéticos e mudanças culturais. Com o surgimento da consciência, incluindo um sentido de si mesmo e uma sensação de continuidade com o passado e futuro, o homem começou a olhar sobre seus próprios ombros e a questionar acerca das suas próprias origens. Quem sou? De onde vim? Para onde vou? As revoluções científicas transformam nossa visão de mundo. Ironicamente, apesar do conhecimento detalhado de quase tudo no universo, em todas as escalas imagináveis (o sistema solar, galáxias distantes, os buracos negros, os átomos, moléculas, a teoria das cordas, DNA, hereditariedade, os mecanismos da vida etc.), ainda não sabemos quase nada sobre o órgão que fez todas essas descobertas. O conhecimento das funções do cérebro permanece tão primitivo como o nosso conhecimento do resto do corpo humano um ou dois séculos atrás. Como podemos propor a consciência ambiental, a higiene do meio, o equilíbrio do ambiente; se não cultivamos a nossa própria vida interior"? Apesar do acúmulo de grandes quantidades de conhecimento sobre o cérebro (cerca de 10.000 documentos são apresentados a cada ano na Sociedade para reuniões de Neurociência), mesmo as perguntas mais básicas sobre nossas mentes permanecem sem resposta. O que é a vontade? Quem é o “eu”? Como explicar o sentimento de uma única pessoa que perdura no tempo e no espaço? O que é a consciência? (Ramachandram, 2003). Apesar de vislumbrarmos as correntes de pensamentos, percebemos que, ao longo do tempo, a integração entre as idéias pode ser árida. A ciência da mente depende da conversa integrada entre experimentos controlados e o esforço teórico, articulados criticamente. O entendimento atual sobre origem, funcionamento e capacidade do sistema nervoso é resultado do esforço de múltiplas áreas do conhecimento, denominadas genericamente por neurociências. A neurociência cognitiva assume o conceito de modularidade do funcionamento do sistema nervoso, investigando funções como percepção, atenção, memória, emoção, ação etc, por essa ser considerada uma estratégia de abordagem coerente, além de didática. “Não mais estamos restritos a inferir sobre as funções mentais simplesmente a partir da
- 98. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 88 Julho/2010 observação comportamental. Como resultado, a neurociência durante as próximas décadas pode desenvolver os instrumentos necessários para testar o mais profundo de todos os mistérios biológicos – as bases biológicas da mente e da consciência”. (Kandel, 2003). Portanto, ao elaborar as perguntas devidas, realizando os experimentos devidos, pode-se começar a responder a estas perguntas que, até agora, continuam a ser a preocupação dos filósofos. Ao entendermos a natureza humana baseada no entendimento de nós mesmos, não sobram limites a serem alcançados. Sabemos muito pouco sobre o cérebro, por isso temos de manter uma mente aberta e estar preparados para surpresas.
- 99. Neurociências Julho/2010 Pág. 89 Princípiosbásicos em fisiologia neural Renata Pereira Lima Laboratório de Neurociência e Comportamento renata.plim@gmail.com No sistema nervoso, neurônios nunca funcionam isolados; eles estão organizados em circuitos que processam tipos específicos de informações. O sistema nervoso parece organizado em grupos de circuitos, i.e., módulos, cujas funções servem a um propósito comportamental específico. Desta maneira, sistemas sensoriais como a visão ou audição adquirem e processam informações a partir do ambiente, o sistema motor permite que o organismo responda a tais informações através da geração de ações. Há, entretanto, um grande número de células e circuitos que estão entre estas mais ou menos bem definidas aferências e eferências. Eles são coletivamente referidos como sistemas de associação e são responsáveis pelas mais complexas funções. Além destas amplas distinções, os neurocientistas têm convencionalmente dividido o sistema nervoso dos vertebrados, sob o ponto de vista anatômico, em componentes centrais e periféricos (Fig. 1). O sistema nervoso central (SNC) compreende o encéfalo e a medula espinal. O sistema nervoso periférico (SNP) inclui fibras de neurônios que conectam os receptores sensoriais na superfície do corpo ao SNC e a porção motora, que consiste em axônios de nervos motores que conectam o encéfalo e a medula espinal aos músculos esquelético, viscerais, cardíaco e glândulas. Embora o arranjo dos circuitos que compõem estes sistemas varie grandemente de acordo com suas funções, algumas características são comuns entre eles. As conexões sinápticas que definem um circuito são tipicamente realizadas numa densa malha de dendritos e terminais axonais. A direção do fluxo de informação em um circuito particular é essencial para se entender sua função. Células nervosas que transmitem informações em direção ao sistema nervoso central são chamadas de neurônios aferentes; já as que transmitem informações para fora do encéfalo e da medula espinal (ou Figura 1. Arranjo anatômico do sistema nervoso em humanos. Em azul o sistema nervoso central (SNC) e em amarelo, o sistema nervoso periférico (SNP) (retirado de Bear, 1996).
- 100. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 90 Julho/2010 para fora do circuito em questão), são chamadas de neurônios eferentes. Células nervosas que participam somente no aspecto local do circuito são chamadas de interneurônios. Estas três classes – neurônios aferentes, neurônios eferentes e os interneurônios – são os constituintes básicos de todos os circuitos neurais. De modo geral, podemos classificar os circuitos como: Convergentes: aqueles nos quais um grupo de neurônios recebe uma aferência (entrada) de um neurônio pré-sináptico e o circuito tende a se tornar concentrado. Para demonstrar este tipo de circuito, imagine que tenhamos os neurônios A, B e C e que cada um deles possua uma entrada diferente. Estes neurônios se projetam para um neurônio D e este se projeta para outro neurônio E, realizando uma eferência (saída). Circuitos convergentes são responsáveis, por exemplo, pela interpretação dos estímulos sensoriais (Fig. 2, à esquerda). Divergentes: são os circuitos que funcionam de maneira oposta aos circuitos convergentes. Em vez de concentrar as aferências, estas se projetam separadamente para diferentes neurônios. No caso do circuito divergente, o neurônio A possui uma aferência e se projeta para os neurônios B, C e D. A característica básica de um circuito divergente é o fato de que um único neurônio iniciará respostas de maneira crescente em outros neurônios. Tais circuitos são encontrados nos sistema motores e sensoriais (Fig. 2, centro). Reverberantes: o sinal de aferência é transmitido ao longo de uma série de neurônios e cada um destes fará sinapses com neurônios de uma porção da via previamente percorrida. O impulso reverbera sendo enviado ao longo do circuito continuamente até que um neurônio seja inibido. Então, uma aferência no neurônio A se projeta para o neurônio B, que se projeta para o neurônio C e então para o D e este se projeta de volta para o neurônio A (ou para o B) e o ciclo se repete até que um neurônio (que pode ser tanto A, quanto B, C ou D) seja inibido. Circuitos reverberantes estão envolvidos no ciclo de sono-vigília, atividades motoras, memórias de longa duração, etc (Fig. 2, à direita). Figura 2. Esquema representativo dos modelos de circuitos. À esquerda, o modelo de circuitos convergentes, no centro o modelo divergente e o reverberante à direita. Além disto, circuitos podem funcionar paralela ou serialmente. No funcionamento paralelo, sinais aferentes são processados em vias distintas e as informações são
- 101. Neurociências Julho/2010 Pág. 91 analisadasde maneira analítica concomitantemente no tempo. Por exemplo, o sistema visual funciona em vias paralelas que processam a informação neural de forma simultânea e integrada. Sinais representando cores, movimento, forma e localização, por exemplo, são processados simultaneamente em diferentes regiões do encéfalo. Atividades concomitantes (e sincronizadas) nas vias visuais dorsal e ventral (que são anatomicamente distintas) são responsáveis pela percepção unitária da imagem. No funcionamento serial, os resultados dos processamentos de um circuito são necessários para que o próximo circuito possa contribuir para o processamento total. Isto é, um neurônio estimula outro neurônio, que por sua vez estimula outro neurônio e assim por diante. Um exemplo clássico de processamento serial é o arco reflexo, em que há produz uma reação involuntária rápida, na maioria das vezes inconsciente, que protege o organismo. Tal reação é originada a partir de um estímulo externo que gera uma resposta antes mesmo do indivíduo tomar conhecimento da existência do estímulo periférico e, conseqüentemente, antes deste poder comandá-la voluntariamente. Muitos reflexos motores são controlados por neurônios localizados na substância cinzenta da medula espinhal e do tronco encefálico (bulbo, ponte e mesencéfalo), independentemente da vontade, como por exemplo: • a retirada imediata da mão de uma panela muito quente; • extensão da perna após a percussão e estiramento do tendão patelar; • fechamento da pupila com o aumento da intensidade luminosa; • aumento da secreção gástrica com a chegada do alimento no estômago. Desta maneira, o ato reflexo é um mecanismo que gera uma reposta involuntária do organismo a um determinado estímulo (dor, estiramento, aumento da intensidade luminosa, variações da pressão arterial etc). Ocorrendo um estímulo, a fibra sensitiva de um nervo aferente (ou sensitivo) transmite-o até a medula espinhal passando pela raiz posterior, ou ao tronco encefálico, por meio de um nervo craniano. Na medula ou no tronco encefálico o neurônio aferente comunica-se com o eferente diretamente ou por meio de interneurônios associativos, gerando, no neurônio motor, a atividade que leva à ação. Os axônios eferentes que levam essa ordem da medula (pela raiz anterior) ou do tronco encefálico (por um nervo craniano) constituem as fibras eferentes motoras ou vegetativas que levam a informação ao órgão efetor (músculo estriado esquelético, glândula, músculo liso ou músculo cardíaco) que, por sua vez, executará a resposta ao estímulo inicial. É importante ressaltar que o processamento serial é a maneira mais simples por meio da qual um circuito pode funcionar. Este tipo de processamento está envolvido nas respostas mais simples e estereotipadas. Durante o processamento de funções mais complexas, de modo geral, os circuitos envolvidos, além de processar informações de modo serial, funcionam concomitantemente em paralelo com outros circuitos de maneira sincronizada.
- 102. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 92 Julho/2010 Construção de Circuitos e sua Modificação pela Experiência A construção da circuitaria do sistema nervoso envolve processos ontogenéticos associados à interação do sistema com o ambiente. Assim, fatores químicos liberados por determinados neurônios em diferentes estágios do desenvolvimento ontogenético atraem projeções de outros neurônios intrinsecamente; paralelamente, essas projeções e conexões entre neurônios podem originar-se também em associação com a estimulação proporcionada pelo ambiente e/ou pela atividade de certos conjuntos de neurônios. Assim, os padrões macroscópicos básicos das conexões no sistema nervoso estabelecidas filogeneticamente podem ser microscopicamente alterados por padrões de atividade neuronal (isto é, experiência), modificando a circuitaria sináptica do encéfalo. A atividade neuronal gerada em decorrência de interações com o ambiente pré e pós-natal influencia a estrutura e a função do sistema nervoso, além da construção de sua circuitaria. A história de interação de um indivíduo com o ambiente, i.e., sua experiência acumulada, molda os circuitos neurais, determinando seu comportamento. Em alguns casos, as experiências funcionam primariamente como gatilhos que ativam alguns comportamentos inatos. Mais freqüentemente, entretanto, experiências desenvolvidas em períodos específicos no início da vida (referidos como períodos críticos) determinam um repertório comportamental no indivíduo adulto. Estes períodos críticos influenciam comportamentos diversos incluindo laços maternais, preferências sexuais e aquisição de linguagem, entre outros. Embora seja possível identificar conseqüências comportamentais de determinados estímulos que foram apresentados em períodos críticos para determinadas funções, suas bases biológicas ainda não estão completamente esclarecidas. Talvez o exemplo mais bem investigado relacione-se ao período crítico no estabelecimento da visão. Alguns estudos mostraram que a experiência é traduzida em padrões distintos de atividade neuronal que influenciam a função e a conectividade dos neurônios relevantes. No sistema visual (e em outros sistemas também) a competição entre aferências com diferentes padrões de atividade é um determinante importante na consolidação dos padrões de conectividade. Em um axônio aferente, padrões de atividade correlatos tendem a estabilizar as conexões. Quando padrões normais de atividade são rompidos (experimentalmente, em animais, ou patologicamente, em humanos) durante um período critico na infância, a conectividade no córtex visual é alterada, assim como a função visual. Se não é feita a manutenção destes padrões até o final do período critico, estas alterações estruturais da circuitaria nervosa dificilmente se restabelecem posteriormente. A conectividade nervosa estabelecida ao longo do desenvolvimento normal possibilita ao encéfalo armazenar vasta quantidade de informações que refletem a experiência específica daquele individuo. Como esperado, a construção dessa
- 103. Neurociências Julho/2010 Pág. 93 conectividadeque tanto influencia o desenvolvimento do sistema nervoso gera alterações maiores nos estágios iniciais de desenvolvimento. Assim, em um animal adulto, o sistema nervoso se torna gradativamente mais refratário a lições da experiência e os mecanismos celulares que medeiam as alterações da conectividade neuronal se tornam menos plásticos. Integração entre Circuitos I: o Modelo de Redes O conceito de que no córtex cerebral há domínios discretos dedicados mais ou menos exclusivamente a algumas funções cognitivas, tais como discriminação visual, linguagem, atenção espacial, reconhecimento de face, retenção de memória, memória operacional, etc., tem sido questionado devido à falta de evidências conclusivas que o apóiem. Em seu lugar, modelos de redes neurais têm sido apresentados como uma alternativa mais coerente com as evidências disponíveis sobre seu funcionamento. Em 1949, Donald Hebb hipotetizou uma forma de plasticidade sináptica proporcionada por uma continuidade temporal das atividades pré e pós-sinápticas. Além de acreditar que as conexões sinápticas eram as bases das associações mentais, ele foi além do simples conexionismo dos behavioristas. Primeiro, ele argumentou que uma associação não poderia ser localizada numa simples sinapse. Ao contrário, os neurônios estariam agrupados em “assembléias de células” e esta associação era distribuída nas suas conexões sinápticas. Segundo, Hebb rejeitou a noção de que a relação estímulo-reposta poderia ser explicada somente por um simples arco reflexo conectando neurônios sensoriais a neurônios motores. Assim, era necessário postular “um mecanismo central que explicasse o atraso existente entre o estímulo e a resposta que é tão característico do pensamento” (Hebb, 1949). Seguindo as idéias do neurofisiologista Lorente de Nó, Hebb acreditava que a estimulação sensorial poderia iniciar padrões de atividade neural que eram mantidas centralmente pela circulação em loops de feedbacks sinápticos. Tal “atividade reverberante” torna estes padrões possíveis para as respostas que são subseqüentes aos estímulos posteriores ao atraso. Em resumo, Hebb hipotetizou um “mecanismo com fundamentos duplos” da memória. A atividade neural reverberante era o fundamento da memória de curta duração, enquanto as conexões sinápticas eram o fundamento da memória de longa duração. Desta maneira, Hebb propôs que: “A persistência ou repetição de uma atividade reverberante tende a induzir mudanças celulares permanentes que promovem estabilidade no sistema” (Hebb, 1949, pág. XVII). Esta proposição pode ser precisamente colocada da seguinte forma: quando um axônio da célula A repetidamente ou persistentemente dispara, alguns processos de crescimento ou mudanças metabólicas acontecem em uma ou em ambas as células (A ou B) de tal modo que a eficiência de A, uma das células que estão agindo sob B, é aumentada.
- 104. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 94 Julho/2010 Além disto, Hebb hipotetiza uma função específica para esta “sinapse hebbiana”: a conversão da memória de curta duração em memória de longa duração pela estabilização de padrões de atividade reverberante. Uma vez que este padrão de atividade foi armazenado nas conexões sinápticas, ele pode ser resgatado repetidamente a partir da excitação de neurônios sensoriais ou a partir de outros padrões de atividade reverberante. A hipótese de Hebb foi verificada décadas depois com a descoberta da potenciação de longa duração, LTP (do inglês, long-term potentiation) (Fig. 3). A LTP é um estreitamento da conexão entre dois neurônios que resulta de uma estimulação simultânea de ambos e pode ser induzida experimentalmente aplicando-se uma seqüência de pequenos estímulos de alta freqüência na célula nervosa. Este estreitamento pode durar de minutos a horas (in vitro) ou de horas a dias ou meses (in vivo). Figura 3. Modelo representativo do funcionamento da Potenciação de Longa-Duração (LTP). Os receptores NMDA (vermelho) constituem a maquinaria molecular da aprendizagem. O neurotransmissor é libertado durante atividade basal e durante a indução de LTP (topo, à esquerda). A expressão de LTP pode dever-se à presença de mais receptores AMPA (receptores em amarelo, à esquerda, abaixo) ou à presença de receptores AMPA mais eficientes (à direita, abaixo) (disponível
- 105. Neurociências Julho/2010 Pág. 95 emwww.braincampaign.org - 09/06/2009). Pela eficiência aumentada da transmissão sináptica, a LTP aumenta a habilidade de dois neurônios, um pré-sináptico e outro pós-sináptico, de comunicarem-se através da sinapse. O mecanismo preciso para este aumento da transmissão ainda não é bem estabelecido, em partes porque a LTP é controlada por múltiplos mecanismos que variam de acordo com a região em que acontecem, a idade do animal em questão e espécie. Entretanto, nas formas de LTP mais compreendidas, a melhora desta comunicação é predominantemente feita através do aumento da sensibilidade das células pós-sinápticas em receber sinais das células pré-sinápticas. Estes sinais, na forma de moléculas de neurotransmissores, são recebidos por receptores presentes na superfície da célula pós- sináptica. Este aumento de sensibilidade é devido não somente ao aumento da atividade dos receptores já existentes na superfície, mas também por um aumento do número destes receptores. Interessantemente, a LTP compartilha muitas características com a memória de longa duração, o que faz dela uma candidata muito atrativa como um mecanismo celular do aprendizado. Por exemplo, a LTP e a memória de longa duração dependem da síntese de novas proteínas, possuem propriedades associativas e podem durar potencialmente vários meses. A LTP também pode responder por vários tipos de aprendizado, desde o relativamente simples condicionamento clássico presente em todos os animais, até respostas mais complexas, como a cognição observada em humanos. De acordo com essa concepção, a alteração estrutural leva ao armazenamento da informação podendo explicar o fenômeno da memória. Este modelo postula que todas as representações cognitivas consistem em redes de neurônios cuja atividade foi associada pela experiência (estímulos repetidos). Nesse contexto, pode-se assumir que memórias filogenéticas correspondem a redes que se consolidaram ao longo das gerações e não necessitam de experiência individual para serem funcionais, embora possam ser aprimoradas pela experiência individual. Se considerarmos que um neurônio tipicamente recebe informações de cerca de 104 neurônios e, por sua vez, projeta-se para outros 104 neurônios e, que o encéfalo humano contém pelo menos 1011 neurônios, isto significa dizer que pelo menos 1019 conexões sinápticas são formadas no cérebro. Entretanto, a complexidade de seu funcionamento é evidentemente maior, em particular quando se considera os arranjos seqüenciais pelos quais uma informação pode viajar ao longo de seqüências de neurônios. Quanto mais freqüentes as exposições a estímulos relevantes, mais fortes tornam-se essas conexões. Como conseqüência, a informação tende a ser arquivada de maneira relacional. Isso permite entender porque a recordação envolve, usualmente, categorias. Por exemplo, ao
- 106. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 96 Julho/2010 pedirmos para uma pessoa listar todos os animais de que se recorda, não raro a lista conterá animais agrupados por categorias de similaridade, ou seja, quadrúpedes, aves, animais aquáticos, invertebrados etc. O mesmo ocorre em relação a alimentos; a recordação também será categórica (frutas, verduras, legumes, carnes etc.). Isso ocorre porque o aumento de atividade eletrofisiológica em determinados circuitos neurais (que levam à recordação de uma dada informação) tende a estimular a atividade em circuitos relacionados. Assim, quando aprendemos que determinado estímulo se refere a um determinado conceito, estamos na verdade fazendo associações com conceitos que já conhecemos (associando nós de uma rede com outros). Então, quando visualizamos a imagem de uma maçã caindo, integramos todas as informações disponíveis (cor, forma, contexto, movimento) com os circuitos já consolidados previamente e que em algum momento foram associados ao conceito “maçã”. O mesmo vale para uma outra modalidade de estímulo, ou seja, um som específico que atribuímos como característico de um determinado animal, o cheiro de uma comida que está intimamente ligado com o seu sabor etc. Integração entre Circuitos II: Ação e Percepção Todas as formas de comportamento adaptativo requerem o processamento de um fluxo de informação sensorial e sua transdução em uma série de ações direcionadas a um objetivo. Desde a mais primitiva espécie animal, todo o processo é regulado por feedbacks externos (ambiente) e internos (Fig.4). Esse padrão de funcionamento torna o organismo apto a forragear, fugir de predadores, lutar e reproduzir-se. Figura 4. Uma das finalidades da percepção é permitir uma interação com o ambiente. Interações podem incluir andar de um lugar para outro, pegar um objeto, conversar com uma pessoa ou dirigir um carro. De modo circular, tais ações afetam diretamente nossa percepção do mundo. Esta interdependência entre ação e percepção é ilustrada pelo “Ciclo Percepção-Ação” da figura acima. A
- 107. Neurociências Julho/2010 Pág. 97 visãoque temos na integração sensório-motora é que em vários aspectos do comportamento, ações motoras e processos sensoriais estão conectados inseparavelmente e, desta forma, precisam ser estudados juntos. O sistema nervoso evoluiu, sobretudo nos mamíferos, de tal forma que uma grande complexidade estrutural e funcional foi alcançada não tanto pelas vias aferentes, responsáveis por canalizar as informações sensoriais, ou pelas vias eferentes, responsáveis por emitir as respostas motoras, mas por circuitos neurais que intermedeiam essas vias de entrada e saída. Os complexos circuitos neurais que se localizam entre as vias sensoriais e motoras são os principais responsáveis pela riqueza, flexibilidade e plasticidade de comportamentos observados. Isso se manifesta na enorme diversidade de estímulos que podem ser reconhecidos pelos sistemas sensoriais, na multiplicidade de graus de liberdade com que ações são organizadas pelos sistemas motores e, sobretudo, pela rica e plástica relação que se estabelece entre esses dois conjuntos. A progressiva elaboração dos circuitos neurais pode ser entendida como uma conseqüência da seleção de ações mais vantajosas (organizadas por circuitos “pré- motores”) em resposta à identificação seletiva de estímulos específicos (realizada por circuitos “perceptivos”), provavelmente pressionada por fatores ambientais. Podemos supor então que, ao tornar-se cada vez mais complexo, o funcionamento dos circuitos neurais que organizam a integração sensório-motora expressa aquilo que chamamos de “percepção”, “atenção”, “aprendizado”, “memória”, “ação” e, por fim, “consciência”. Esses rótulos estão longe, em sua maioria, de uma definição completa e consensual. Eles são, mais provavelmente, o resultado das limitações que ainda temos em compreender a essência do funcionamento do sistema nervoso, não se constituindo em entidades separadas e independentes da função neural. Desta forma, se considerarmos que a percepção do mundo, onde “perceber” algo, derivado do latim, significa “apoderar-se” dele, logo veremos que não há percepção sem que alguma forma de atenção esteja em jogo. E é só por meio da percepção atenta que temos de um estímulo que sentimos, de um evento que presenciamos ou de uma resposta que emitimos, que poderemos mais tarde nos lembrar desse objeto, desse evento ou dessa resposta, resgatando uma memória arquivada por meio de um processo de aprendizado. E, de forma um tanto óbvia, todo trabalho investido em se “apoderar” do mundo, “arquivá-lo” e “resgatá-lo”, seria inútil e sem sentido se não usássemos essa informação na organização e emissão de uma ação sobre o mundo, com ele interagindo de forma contínua e coerente, permitindo nossa permanência nesse mesmo mundo, apesar de seus constantes desafios. Percepção envolve Ação
- 108. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 98 Julho/2010 Perceber algo geralmente requer alguma ação por parte de quem esta percebendo. Freqüentemente temos que olhar (direcionar os olhos) para ver, fazendo uma varredura visual do ambiente até que o objeto de desejo seja encontrado. Da mesma forma, para um som ser audível, temos que direcionar nossos ouvidos em sua direção. Quando tocamos um objeto, ele é mais facilmente identificado se for explorado pelos nossos dedos. Todos estes exemplos demonstram que a percepção é um processo ativo que funciona para direcionar e otimizar o comportamento através do seu refinamento. Além disso, uma vez que um objeto tenha sido percebido, podemos decidir se iremos nos aproximar ou nos afastar. Ao ouvir um barulho podemos responder a ele ou ficar quieto. Ao identificar um objeto pelo toque podemos descartá-lo ou mantê-lo conosco. Em cada um destes casos nosso comportamento depende do que é percebido. A orientação da percepção por meio de uma ação induz uma distinção interessante entre os vários sentidos que tem a ver com a proximidade do observador em relação ao objeto percebido. Tocar e saborear algo requer um contato direto entre o observador e a fonte de estimulação. Cheirar também é um certo contato com a fonte de estímulação; substâncias químicas voláteis são diluídas conforme a distância da fonte aumenta; desta forma, o cheirar funciona mais eficientemente para substâncias que estão próximas. Em contraste, ver e ouvir,não dependem tanto deste contato. Os olhos e os ouvidos podem capturar a informação originária de fontes remotas, neste sentido eles funcionam como um radar. Eles permitem que o indivíduo faça contato perceptual com um objeto que não está próximo, eles estendem a percepção para um mundo além dos limites dos dedos e do nariz. Estes dois sentidos substituem o deslocamento até a fonte de estímulo, permitindo que o indivíduo explore a vizinhança. Organização e Hierarquia no Ciclo Percepção-Ação Em todo o sistema nervoso central, o processamento de seqüências de ações guiadas sensorialmente segue um fluxo a partir de estruturas geralmente posteriores (sensórias), em direção a estruturas anteriores (motoras), com feedbacks em todos os níveis. Assim, no nível cortical, a informação flui de maneira circular ao longo de uma série de áreas hierarquicamente organizadas e entre conexões que constituem o ciclo percepção- ação (Fig. 5). Ações automáticas e/ou muito freqüentes em resposta a estímulos sensoriais são integradas em níveis mais inferiores do ciclo, nas áreas sensoriais da hierarquia (perceptiva) e em áreas motoras da hierarquia (executiva). Comportamentos mais complexos, guiados por estímulos também mais complexos e distantes no tempo, requerem uma integração em níveis corticais mais superiores de ambas as hierarquias (perceptuais e executivas), basicamente áreas superiores de associação sensorial e córtex frontal anterior.
- 109. Neurociências Julho/2010 Pág. 99 Figura5. O substrato cortical do ciclo percepção-ação. Em azul está representado o lado da percepção no ciclo e em vermelho o lado da ação. Os retângulos vazios representam áreas intermediárias ou subáreas do córtex. As setas representam vias anatomicamente identificadas em macacos e ressaltam a conectividade recíproca entre os córtices posterior e anterior (retirado de Fuster, 2006). Para garantir as interações entre as duas hierarquias corticais, longas fibras cortico- corticais conectam recíproca e topologicamente as áreas da hierarquia perceptual com as áreas equivalentes executivas. Assim, áreas pré-motoras se conectam com áreas sensoriais associativas relativamente inferiores (áreas inferiores de ambas as hierarquias), enquanto áreas frontais anteriores se conectam com áreas associativas superiores do córtex posterior (áreas superiores). Do mesmo modo, há evidências anatômicas de conexões ordenadas descendentes do córtex frontal anterior ao córtex pré-motor e deste para o córtex motor. Em cada estágio deste processo em cascata na hierarquia executiva, a próxima ação de uma seqüência é determinada por dois tipos de influências: 1) o processamento dos aspectos globais da seqüência nas áreas frontais superiores e 2) os sinais sensoriais que estão ocorrendo naquele momento. A ativação progressiva de áreas frontais inferiores que processam a ação é cumulativa. Da mesma forma, as entradas sensoriais associativas do córtex posterior são progressivamente mais concretas e mais dependentes de um contexto espacial e temporal imediato. Sinais que necessitam ser processados em um contexto temporal mais amplo (episódico) requerem ações que dependem de uma integração temporal em graus mais elevados. Estes sinais são processados no córtex posterior e concomitantemente nas áreas superiores do córtex frontal anterior (rostral). Em ambos os córtices, os sinais são integrados simultaneamente com as informações prévias (as regras
- 110. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 100 Julho/2010 de uma determinada tarefa e as instruções eventualmente dadas) antes mesmo de serem enviados para o processamento em estágios inferiores da hierarquia frontal. Sendo assim, o córtex frontal anterior integra as mais elaboradas associações da informação sensorial que estão armazenadas em redes dos córtices sensoriais e motores. Se considerarmos que a execução de uma ação não se limita, em geral, a uma única oportunidade, temos uma grande vantagem ao construirmos representações perceptivas do mundo e guardá-las na memória, podendo usar essa informação em uma próxima oportunidade em que ações semelhantes sejam requeridas. Esse aprendizado permite um refinamento a longo prazo de nossas ações, fornecendo subsídios para ações mais complexas, mais integrativas e de maior alcance adaptativo. O Sistema de Neurônios Espelho Quando temos que explicar uma ação humana, a neurociência tem duas abordagens maiores: a sensório-motora e a ideomotora. Na abordagem sensório-motora, tudo começa com uma estimulação, e as ações são consideradas uma conseqüência desta estimulação. De modo inverso, na abordagem ideomotora, tudo começa com uma intenção, e as ações são consideradas como o meio de realizar estas intenções, isto é, as ações são vistas como o meio para determinados fins que seguem a intenção. Assim como vimos acima, existe uma sobreposição e uma dependência entre as percepções e as ações, tanto nos seus sistemas quanto nas respostas comportamentais. Desde modo, fica difícil imaginar que nossas ações sejam meras escravas de nossas percepções. Em uma situação em que uma pessoa observa as ações de outra pessoa, a abordagem ideomotora oferece uma predição muito consistente. Considerando o fato de sermos seres sociais, nós humanos passamos boa parte do nosso tempo observando as outras pessoas, tentando entender o que elas estão fazendo e por que. Esta “comunicação primitiva” é essencial para estratégias de sobrevivência e sociabilidade do indivíduo. Contudo, como reconhecemos e entendemos as intenções das outras pessoas? Quais as bases neurofisiológicas desta habilidade? A recente descoberta de neurônios espelho tem inspirado uma série de estudos em busca destas respostas. O reconhecimento de uma ação foi inicialmente concebido como baseado apenas no sistema visual (abordagem sensório-motora); isto é, numa análise dos componentes visuais da ação específica, do agente envolvido, do objeto ao qual a ação é direcionada e do contexto no qual ela está inserida. Assim, a interação de todos estes elementos identificados visualmente permitiria ao observador reconhecer e entender uma ação feita por outra pessoa. Uma hipótese alternativa admite que a observação de uma ação estimularia uma “representação motora interna” que envolveria as mesmas estruturas neurais envolvidas na
- 111. Neurociências Julho/2010 Pág. 101 execuçãoda ação observada; de acordo com esta concepção, embora nenhum movimento efetivo seja executado, a representação motora evocada pela observação permitiria o reconhecimento do significado do que é visto. Com a descoberta de que há ativação de neurônios na região do córtex pré-motor durante a observação de ações, os assim denominados “neurônios espelho”, e considerando que esta hipótese não exclui a possibilidade de que outro processo cognitivo, baseado na descrição do objeto e do movimento, possa participar desta função, esta hipótese motora vem ganhando cada vez mais adeptos. Todavia, tem sido proposto que os neurônios espelho formam um sistema que combina observação e execução – percepção e ação. Neurônios espelho são um grupo particular de neurônios cuja atividade aumenta durante a execução de uma ação motora particular ou da observação da mesma ação desempenhada por outro indivíduo. Sua descoberta ocorreu durante experimentos com macacos envolvendo o controle motor de ações desempenhadas com as mãos, como por exemplo, pegar/manipular um objeto ou alimento. Os descobridores destes neurônios, entre eles Giacomo Rizzolatti, implantaram eletrodos no córtex frontal inferior de macacos (área F5) e registraram a atividade dos neurônios individualmente enquanto os animais alcançavam pedaços de alimentos. Eles observaram que alguns destes neurônios (situados no setor superior da área F5), disparavam não somente quando o macaco pegava o alimento, como também quando ele observava outro indivíduo (macaco ou humano) desempenhando esta ação, como se a mesma tivesse sido “refletida” no seu córtex motor (Fig. 6). Estudos posteriores mostraram que pelo menos 10% dos neurônios envolvidos no controle motor de ações desempenhadas com as mãos são “neurônios espelho”. Estes estudos mostram que além do reconhecimento da ação motora por meio de informações visuais, o sistema de neurônios espelho lida com informações mais abstratas, a fim de reconhecer o objetivo final da ação. Esta resposta, baseada também em outras modalidades, isto é, auditiva, sugere que a atividade espelho depende da riqueza das experiências próprias do observador e de ações presentes em seu repertório motor (memória de planos motores). Entretanto, aparentemente, o reconhecimento do objetivo final de uma ação baseado em exposição prévia do observador só parece possível se houver dicas suficientes no ambiente acerca da intenção desse outro indivíduo. Isto é, uma ação implica em um agente e um objetivo. Conseqüentemente, o reconhecimento de uma ação implica no reconhecimento de um objetivo e, em outra perspectiva, o entendimento da intenção do agente: “João vê Maria pegando uma maça”. Vendo sua mão movimentando-se em direção à maça, ele reconhece o que Maria fará (pegará algo), e também reconhece que Maria quer pegar uma maça, isto é, o estímulo é ligado à intenção do agente.
- 112. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 102 Julho/2010 Desta maneira, o sistema de neurônios espelho oferece um modelo de integração entre percepção e ação bastante interessante. Através do reconhecimento de ações e, não apenas pelo sistema sensorial, mas também no próprio sistema motor do observador, ocorre uma integração online das informações recebidas do ambiente - a ação observada sendo executada por outra pessoa - e também entre informações presentes no sistema nervoso do observador - representação motora da ação observada. Figura 6. Experimento feito com macacos em que ele executa uma ação (pegar o amendoim) e também observa esta mesma ação sendo feita pelo experimentador. À direita está um esquema que exemplifica a atividade dos neurônios espelho nas duas situações (retirado de Rizzolatti,1996).
- 113. Neurociências Julho/2010 Pág. 103 FisiologiaSensorial Felipe Viegas Rodrigues Laboratório de Neurociência e Comportamento rodrigues.fv@gmail.com Introdução O sistema nervoso de qualquer organismo pode ser modelado em sua forma mais simples como um sistema que possui entrada de dados (células receptoras), nenhum ou algum processamento do sinal (interneurônios) e um sistema de saída (células efetoras) (Fig. 1). Figura 1 – Modelo simplificado do arranjo de um Sistema Nervoso. O arranjo mais simples possível é chamado arcorreflexo, em que uma única célula recebe o estímulo em um ponto do organismo e diretamente atua como uma célula efetora. Esse arranjo já permite uma série de respostas comportamentais úteis à sobrevivência. Eventualmente, modificou-se para um arranjo com duas células: uma receptora e outra efetora, formando um arcorreflexo monossináptico (e.g. reflexo patelar). Ressalta-se que a comunicação entre as duas células já poderia representar uma forma de modulação do sinal e, portanto, flexibilizar o comportamento (Eckert, 1983). Há ainda o arcorreflexo polissináptico, com pelo menos um interneurônio entre as células receptora e efetora. A existência do interneurônio nessa interface deu origem aos gânglios – acúmulos de corpos celulares no organismo. Em última instância, nosso cérebro é um gânglio (ou um grande conjunto deles). O mais complexo que se tem conhecimento. A rede neural mais simples em organismos vivos é aquela encontrada nos Celenterados. O arranjo das células nervosas é difuso, com cruzamentos desordenados de axônios, e sem preferência de direção do estímulo conduzido. Em alguns Celenterados há um início de organização em direção a arcos-reflexo monossinápticos, que é presente em todos os outros organismos multicelulares (com tecido verdadeiro). Apesar disso, os arcos- reflexo polissinápticos são mais comuns. As células receptoras, de agora em diante chamadas receptores sensoriais, são responsáveis por transduzir (isto é, transformar uma forma de energia em outra) o estímulo
- 114. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 104 Julho/2010 ambiental em um sinal elétrico que possa ser processado pelo encéfalo. Os receptores tendem a ser muito específicos e, em conjunto com o arranjo no qual estão dispostos em um órgão no animal, respondem preferencialmente a um tipo de estímulo. A luz parece ser a melhor forma de energia para se localizar e locomover no espaço – seu desenvolvimento se deu independentemente em diversos grupos animais. Ela tem excelentes propriedades direcionais e a maior velocidade de deslocamento conhecida, sendo muito fiel para retratar mudanças no ambiente; portanto, útil a presas e predadores. Por outro lado, animais com hábitos noturnos tiveram favorecimento de outros sistemas sensoriais, como, por exemplo, a ecolocalização de morcegos. Aqueles que dependem do sistema visual têm mecanismos de compensação das condições mínimas de luz. Gatos possuem um tecido refletivo na retina (chamado Tapetum lucidum), que faz com que a luz passe duas vezes por ela. Outros mamíferos, como os Tarsius, têm globos oculares extremamente grandes. É importante ressaltar que não há sistemas mais ou menos evoluídos, mas apenas aqueles mais adequados para um determinado ambiente. Nesse sentido, há animais que tem visão e audição pobres, sendo dependentes dos sentidos químicos para encontrarem presas (e.g.: cobras). Olfato e gustação parecem extremamente adaptativos para algumas funções, pois persistem em diversos grupos. Visão A faixa de luz visível pelos animais compreende-se do infravermelho até o ultravioleta (Fig. 2). O fato de nos mais diversos organismos a faixa de energia eletromagnética captada ser tão restrita deve-se aos comprimentos de onda acima (comprimento de onda maior) do vermelho não carregarem energia suficiente para um efeito apreciável e aqueles abaixo do violeta carregarem muita energia, a ponto de serem danosos para os tecidos (raios ultravioleta A e B são danosos à pele). Mecanismo de transdução Mesmo alguns organismos unicelulares apresentam resposta à luz – uma simples fototaxia (movimento em direção à luz). Mas mais do que gerar uma resposta intracelular Figura 2 – Faixa de luz visível (em destaque) utilizada pelos receptores dos organismos vivos. Comprimento de onda em nanômetros. Modificado de Carlson (2004).
- 115. Neurociências Julho/2010 Pág. 105 pelaestimulação luminosa, para que possamos enxergar, precisamos formar uma imagem representativa do ambiente que nos rodeia. Isso só é possível nos organismos multicelulares e na presença de olhos – órgãos especializados para captação de luz – os quais surgiram independentemente em diversos grupos animais. Apesar das diferenças no formato e no funcionamento, o mecanismo básico envolve a captação da luz e a estimulação de fotorreceptores específicos. A molécula fundamental para esse processo é uma combinação entre opsina (uma proteína) e um carotenóide. Todo fotorreceptor possui essa combinação em suas membranas. A combinação mais encontrada, tanto em vertebrados como em invertebrados, é entre opsina e Retinal (uma molécula derivada da Vitamina A). Essas moléculas se encontram em abundância nas dobras de membrana do receptor (uma a cada 5 nm em alguns receptores) e mudam sua conformação com a estimulação luminosa, provocando uma cascata bioquímica no interior da célula. Em última instância, há uma alteração da atividade eletrofisiológica do receptor, que é transmitida até o Sistema Nervoso Central (SNC). Os invertebrados mais bem estudados com respeito ao sistema visual são os insetos. Eles possuem olhos compostos por unidades individuais chamadas omatídeos, cada qual com um receptor sensorial. Este é formado por um dendrito central de uma célula chamada excêntrica, rodeado por 6 a 12 células retinulares, as quais enviam uma densa profusão de microvilos em direção ao dendrito da célula excêntrica, formando o rabdômero (Fig.3). A formação de imagem nesse tipo de olho se dá pela composição das diversas partes do campo visual captadas pelos diversos omatídeos, formando um mosaico. A quantidade de pigmentos visuais é bastante variável, com alguns crustáceos apresentando até oito diferentes pigmentos em seu sistema visual (Cronin, 2006). Os vertebrados reúnem todos os receptores em um mesmo local (a retina, Fig. 4A), abrigados por uma câmara com entrada de luz controlada e intermediada por uma lente, um arranjo que permite a projeção de uma imagem invertida sobre a retina. A maioria dos grupos possui dois tipos de receptores: cones e bastonetes (Fig. 4B). Poucas generalizações podem ser feitas quanto ao envolvimento desses receptores na visão de cores e outras propriedades de uma imagem (e.g. brilho), dado que as variações entre os grupos são grandes. O comprimento de onda que será absorvido em cada receptor é também bastante variável. A maioria dos primatas possui na retina dois Figura 3 – Representação de um omatídeo do olho composto de invertebrado. Modificado de Eckert (1983).
- 116. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 106 Julho/2010 tipos de cones (cada um com um pigmento) mais bastonetes (Casagrande e col., 2006). Alguns têm três tipos de cones, incluindo os humanos, e todos os primatas têm os cones concentrados na porção central da retina (fóvea), uma depressão formada pelo afastamento das camadas celulares superiores (Fig. 4B). A fóvea é o ponto de maior acuidade visual, sendo processado por quase 50% do córtex visual primário (V1) (Fig. 5), ainda que responda por menos de 1% do campo visual. Essa discrepância de valores é resultado da extrema fidelidade com a qual as imagens desse ponto do campo visual são tratadas. Conforme se afasta do centro da retina em direção à periferia, menos cones e mais bastonetes são encontrados, com virtualmente nenhum cone nas regiões mais periféricas, o inverso do centro da fóvea. Os bastonetes são mais sensíveis à luz do que os cones (podendo responder a apenas um fóton – o equivalente à luz de uma vela a 1 km de distância). Eles são extremamente importantes para a detecção de bordas e movimento. Semelhantemente, é pela maior acuidade visual dessas células que tendemos a enxergar imagens acinzentadas (ou simplesmente sem cor) em condições de pouca luz, como em um quarto escuro. A percepção de cores através dos cones se dá pela interação da estimulação dos três tipos de pigmento a todo instante, constituindo todas as tonalidades de cores que enxergamos. Neurônios com axônios longos, as células ganglionares (Fig. 4B), formam o nervo óptico que transmite a alteração da atividade eletrofisiológica resultante da estimulação dos fotorreceptores em direção ao V1 (Fig. 5). Esse caminho, porém, não é direto. Há um cruzamento de parte das fibras que se dirigem ao SNC (Fig. 6). As células ganglionares do hemicampo temporal em ambos os lados não se cruzam e seguem ipsilateralmente. As fibras do hemicampo nasal se cruzam no quiasma óptico e seguem para o lado contralateral. Dessa forma, toda a estimulação do lado direito irá para o córtex esquerdo e vice-versa. Figura 4 – (A) Olho em câmara de vertebrados. (B) Detalhe da fóvea no centro da retina, evidenciando algumas camadas celulares da retina. Modificado de Lent (2006).
- 117. Neurociências Julho/2010 Pág. 107 Figura5 - Córtex visual primário (V1), em vermelho, no córtex occipital do homem, do gato e do rato. Encéfalos fora de escala. Modificado de Bear e col. (1996). Note que há uma extensa área de sobreposição dos campos esquerdo e direito (Fig. 6). É ela quem permite a visão binocular, responsável pela visão em profundidade e criada pela proximidade entre os dois globos oculares (voltados, portanto, para um mesmo lado da cabeça), algo constante em animais carnívoros. Herbívoros, por outro lado, tem os olhos em lados opostos da cabeça, o que reduz sensivelmente a visão binocular, mas potencializa a visão em todas as direções, permitindo que esses animais percebam a aproximação de predadores independentemente do local para o qual eles estejam direcionados. Após o cruzamento no quiasma óptico, todas as fibras passarão pelo Tálamo, mais especificamente pelo Núcleo Geniculado Lateral (NGL). Esse núcleo tem seis regiões citoarquitetônicas muito bem definidas nos primatas. As duas camadas mais inferiores possuem neurônios com corpos celulares grandes e trazem as informações vindas dos bastonetes: é a camada magnocelular. As outras quatro camadas, chamadas parvocelulares, têm neurônios com corpo celulares pequenos e trazem informações vindas dos cones com pigmentos sensíveis à luz vermelha e verde. Entremeado nessas camadas, há células chamadas koniocelulares que trazem informações dos cones sensíveis ao azul. Após o estímulo passar pelo NGL, ele se dirige à V1, no córtex occipital, que tem um mapa retinotópico, isto é, tem uma região cortical para cada região na retina atendida por uma célula ganglionar. Lembrando que a região compreendida pela fóvea corresponde a Figura 6 – Cruzamento das fibras do nervo óptico e hemicampos contemplados em cada hemisfério cerebral. Modificado de Bear e col. (1996).
- 118. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 108 Julho/2010 quase 50% de V1, fica claro que a fidelidade entre célula ganglionar e receptor sensorial deve ser altíssima na fóvea (ou pelo menos na fóvea central – algo como 1:1) e que esse número deve ser bem reduzido nas regiões periféricas da retina, com cada vez mais células receptoras para cada célula ganglionar. Esse fato introduz o conceito de Campo Receptivo: a área da retina para qual uma célula ganglionar responde é maior quanto mais nos afastamos do centro da retina. Audição A cóclea é uma estrutura tubular enrolada sobre si mesmo com três câmaras internas chamadas escalas, preenchidas por líquidos de composições específicas (Fig. 7) (Carlson, 2005). O sistema auditivo humano está limitado a perceber freqüências entre 20 Hz e 20.000 Hz, devido a características implícitas à cóclea, mais especificamente, à membrana basilar dentro dela (Fig. 8), que não vibra com sons fora dessa faixa de frequências. Diferentemente da visão, o intervalo de frequências captado por outros animais não é semelhante. Infra-sons (freqüências abaixo de 20 Hz) são utilizados por tigres e elefantes como forma de comunicação, podendo ser feita a quilômetros de distância. No outro extremo, morcegos têm faixa de audição começando em 10.000 Hz e indo até cerca de 120.000 Hz. Os superagudos, freqüências acima de 10.000 Hz, têm comportamento extremamente direcional e reflexivo, características que se tornam ainda mais exacerbadas nos ultra-sons, freqüências acima de 20.000 Hz. Emitindo sons acima de 50.000 Hz, os morcegos podem perfeitamente voar no escuro total, conseguindo desviar dos obstáculos presentes em seu caminho. Eles utilizam-se do que chamamos de sonar: um mecanismo de ecolocalização baseado na percepção da posição de objetos no espaço pela geração de um som e recaptura do mesmo após reflexão. Mecanismo de transdução A energia sonora no ambiente chega até ao tímpano pelo canal auditivo, parte da Figura 7 - Representação do sistema auditivo humano. Modificado de Bear e col. (1996).
- 119. Neurociências Julho/2010 Pág. 109 orelhaexterna (Fig. 7). Essa energia, com todas as suas características de frequência e intensidade, é transmitida pelo tímpano aos ossículos da orelha média (martelo, bigorna e estribo), que farão a transmissão para a janela oval na cóclea, integrantes da orelha interna. A interação existente entre os três ossículos causa uma amplificação de até 1,6x na energia sonora que recebemos e a diferença de área entre o tímpano e a janela oval outra de 20x, resultando em um ganho em amplitude de 32x aproximadamente. A vibração transmitida à janela oval é então transferida para os líquidos internos da cóclea e para a membrana basilar. Como a cóclea é um tubo inextensível, a Janela Redonda funciona como uma válvula de escape, permitindo a movimentação dos líquidos internos e vibração nas membranas. Diferentes regiões da membrana basilar são mais sensíveis a freqüências distintas. Sons agudos – altas freqüências – são melhores percebidos no início dela. Sons médios, no meio, e sons graves – baixas freqüências – no final da cóclea. Tais constatações não significam que um som fará com que só aquela região vibre. Pelo contrário, todo som causará vibração por toda a membrana basilar, mas ela será muito pequena fora do ponto de ressonância, não alterando a atividade eletrofisiológica em outros pontos da membrana. O órgão de Corti é o responsável pela transdução da energia sonora em impulsos nervosos. Nele se encontram os receptores sensoriais (mecanorreceptores) que iniciam a despolarização que será conduzida ao córtex cerebral, inicialmente pelo nervo coclear (Fig. 8). A membrana tectorial no órgão de Corti é uma estrutura rígida e fixa. A vibração da membrana basilar acaba causando o deslocamento de todo esse órgão; os cílios dos mecanorreceptores, no entanto, não se deslocam por estarem imersos e fixos na membrana tectorial, movimentando-se em relação à célula e causando abertura ou fechamento de canais pelo estiramento da membrana celular e influxo de potássio e cálcio. Isso resultará em despolarização ou hiperpolarização dos receptores e a mensagem transmitida pelos neurônios bipolares que integram o nervo coclear será maior ou menor freqüência de disparos. Figura 8 – Representação esquemática do órgão de Corti. Modificado de Bear e col. (1996).
- 120. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 110 Julho/2010 As fibras nervosas que saem da cóclea fazem algumas sinapses no trajeto até o Córtex Auditivo Primário (A1), a mais importante delas no Núcleo Geniculado Medial (NGM) onde todas fazem sinapse (Fig. 9). Todas as fibras que saem do NGM chegam até A1, formando um mapa tonotópico da membrana basilar da cóclea com frequências graves mais anteriores e as agudas mais posteriores. Esse arranjo permite o que é chamado “Princípio de Localização”: uma determinada população de neurônios de A1 com sua atividade alterada indica fielmente uma determinada frequência de vibração na membrana basilar (Lent, 2006). Sistema Vestibular Associado às estruturas que permitem a audição, todos os vertebrados contam também com o sistema vestibular, com o qual podem perceber fenômenos de aceleração e postura corporal. Raramente mencionado, esse sistema deve ser considerado um sexto sentido dos organismos, tendo íntima relação com o sistema motor, permitindo correções posturais reflexas a estimulações bruscas e estabilização do olho durante a movimentação corporal (Graf, 2006). O sistema é composto na maioria dos vertebrados por três canais semicirculares para percepção de acelerações angulares (rotações) e os otólitos (sáculo e utrículo), para acelerações lineares (Graf, 2006) (Fig. 10). A presença de três canais semicirculares surge nos gnastomados, pela adição do canal horizontal, ausente nos agnatas. Figura 10 – Órgãos do equilíbrio no ouvido humano. Modificado de Bear e col. (1996). Figura 9 – Trajeto percorrido pelos impulsos nervosos provenientes da cóclea até o córtex auditivo primário no cérebro. Modificado de Lent (2006).
- 121. Neurociências Julho/2010 Pág. 111 Oscanais são completamente preenchidos por líquido e contém uma dilatação (ampola) com células ciliadas (mecanorreceptores) associadas a uma estrutura gelatinosa (cúpula). Os movimentos de rotação do organismo causam o deslocamento do líquido em relação ao canal, resultando em movimentação da cúpula e despolarização ou hiperpolarização das células ciliadas, como na cóclea. A maioria das projeções do nervo vestibular vai para um núcleo homônimo na medula; outras seguem diretamente para o cerebelo. Interessantemente, algumas projeções vão para os núcleos dos nervos cranianos que controlam o movimento ocular (nervos cranianos III, IV e VI). Essas projeções permitem o reflexo vestíbulo-ocular que corrige o movimento dos olhos enquanto andamos ou simplesmente movimentamos a cabeça, permitindo a formação de imagens estáveis na retina. Pessoas com lesão no nervo vestibular têm sérias dificuldades em enxergar enquanto se deslocam (Carlson, 2005). Somestesia O sistema somatossensorial permite perceber estímulos na pele através de uma diversidade de receptores sensoriais especializados: modificações nas terminações de neurônios unipolares que alteram sua atividade eletrofisiológica pela pressão, temperatura ou dor. Esses neurônios fazem conexões diretas com neurônios motores para permitir reflexos e evitar eventuais danos à pele (em última instância, ao organismo) – um arcorreflexo monossináptico como o reflexo patelar. As vibrissas de ratos e camundongos são também um órgão tátil, utilizado para se localizarem no ambiente e mais importantes do que os olhos, já que estes têm hábitos noturnos. Os estímulos somestésicos também são levados ao córtex cerebral via tálamo, formando um mapa somatotópico do organismo. Assim como na visão, algumas regiões são mais privilegiadas do que outras, como a ponta dos dedos, lábios e língua tendo os menores campos receptivos do sistema (e, portanto, as maiores áreas de processamento). O córtex somatossensorial faz parte do lobo parietal do cérebro humano, no giro pós-central (Fig. 5). Sentidos químicos Olfação As conexões neurais da via olfativa até o córtex sugerem que esse é um dos sistemas sensoriais mais antigos dos animais. É o único sistema que faz conexões diretas com o córtex cerebral (córtex olfatório), embora outras conexões neurais conduzam os estímulos recebidos também ao tálamo, além de conexões com o lobo frontal do neocórtex e o sistema límbico. São as conexões com o lobo frontal que provavelmente nos permitem ter consciência dos cheiros ao nosso redor e as conexões com o sistema límbico, os comportamentos ligados à homeostase e às emoções (Lent, 2006). O sistema olfativo é um bom exemplo de como o sistema sensorial mais importante a
- 122. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 112 Julho/2010 uma espécie dependerá das pressões seletivas. Cachorros não são capazes de enxergar em cores como nós enxergamos; por outro lado, são detentores de um olfato apuradíssimo, frequentemente sendo vistos farejando o chão atrás de algo que lhes interessa. Treinados, são hoje largamente utilizados para encontrar drogas em bagagens e pessoas soterradas em terremotos, sendo melhores que os humanos fazendo tais buscas visualmente. Tubarões também são fantásticos na detecção de odores, podendo perceber uma gota de sangue em dezenas de litros de água. O caso mais surpreendente, porém, é o das mariposas: os machos de algumas espécies são capazes de detectar concentrações de apenas uma molécula do feromônio de atração sexual da fêmea para até 1017 moléculas de ar. Isso se traduz em conseguir perceber uma fêmea a milhas de distância. Feromônios são moléculas intraespecíficas que servem à comunicação entre gêneros – resultando, em última instância, no acasalamento – e também à demarcação de território entre indivíduos. Fatos como a coincidência do ciclo menstrual entre mulheres que moram juntas (Weller e Weller, 1995), o reconhecimento do próprio odor em relação ao de outros indivíduos (Porter e col., 1986 apud Martins e col., 2005) e a preferência por odores do sexo oposto (Martins, 2005) trazem indícios fortes de que esse mecanismo também exista em humanos. Alguns desses exemplos nos mostram que nem sempre precisamos estar conscientes de um estímulo para responder ao mesmo. Gustação A gustação está presente na maioria dos vertebrados e depende de receptores específicos na língua, que detectam cinco qualidades: amargor, acidez, doçura, salinidade e umami. Há claras razões adaptativas para a seleção de tais receptores. Curiosamente, felinos não possuem receptores para doçura (Carlson, 2005). Os animais tendem a ingerir rapidamente tudo o que é doce ou salgado; doçura indica presença de açúcares, claramente um alimento. Já receptores para sal, indicam a presença de cloreto de sódio, extremamente importante para o equilíbrio eletroquímico do organismo. Por outro lado, substâncias amargas ou azedas serão evitadas. Acidez é um indicativo de decomposição, resultado da ação bacteriana. Já o amargor é um excelente indicativo da presença de alcalóides potencialmente venenosos produzidos por plantas. Umami é um sabor relacionado à presença de glutamato monossódico, substância naturalmente presente em carnes, queijos e alguns vegetais. Um sexto tipo de receptor poderia também detectar a presença de ácidos-graxos nos alimentos; de fato, trabalhos recentes indicam respostas celulares causadas pela presença de ácidos-graxos específicos (Gilbertson e col., 1997 apud Carlson, 2005). As vias neurais da gustação se dão através do núcleo posteromedial ventral do tálamo para a base do córtex frontal e para o córtex insular. Outras projeções se dão para a
- 123. Neurociências Julho/2010 Pág. 113 amígdalae hipotálamo. Sugere-se que a via hipotalâmica sirva para mediar efeitos reforçadores de sabores doces e salgados. Outros sentidos O repertório de estimulações físicas que servem à orientação não se limita àquelas que podemos perceber. Insetos conseguem se guiar pelo Sol mesmo quando há nuvens no céu impedindo luz direta. Isso é possível pelo arranjo dos microvilos no rabdômero do omatídeo (Fig. 3), formando um ângulo de 90° uns com os outros. A estimulação pela luz é até seis vezes maior nos microvilos que estão paralelos à orientação do vetor de polarização da luz. Alguns peixes têm células eletrorreceptoras que são modificações de células ciliadas da linha lateral. Essas células podem captar correntes elétricas produzidas por tecidos ativos de outros peixes próximos (e.g., coração) mesmo que eles estejam enterrados sob a areia do fundo do lago ou oceano, um mecanismo frequentemente utilizado por elasmobrânquios. Outros peixes são capazes de produzir uma corrente elétrica fraca, através de uma série de despolarizações sincronizadas das células de seu órgão elétrico. A corrente gerada flui da parte posterior para a anterior do peixe e qualquer material próximo que tenha uma condutividade diferente daquela da água causará uma alteração no campo elétrico, sendo detectado. A própria linha lateral de peixes e anfíbios é um órgão sensorial. Ela está ausente nos grupos superiores de vertebrados e é extremamente adaptativa ao ambiente em que esses organismos vivem. Por outro lado, o mecanismo receptor presente ao longo da linha lateral é uma célula ciliada como aquela descrita para os órgãos de audição e equilíbrio, sendo homólogo entre todos os grupos (Graf, 2006). Mais do que isso, as interrelações com outros mecanorreceptores podem ser traçadas até o nemátoda Caenorhabiditis elegans, passando pelas drosófilas e apontando para um desenvolvimento evolutivamente precoce desses receptores (Graf, 2006). Termorreceptores são extremamente importantes tanto em mamíferos, que precisam manter sua temperatura regulada, quanto em outros animais que dependem desse tipo de receptor para capturar presas. Cobras dos gêneros Crotalus e Sistrurus têm termorreceptores com altíssima sensibilidade, sendo capazes de detectar aumentos de temperatura tão pequenos quanto 0,002 °C, isto é, detectar um camundongo distante 40 cm se ele estiver 10°C acima da temperatura ambiente. O campo magnético terrestre também parece ser um estímulo utilizado por alguns animais para orientação e deslocamentos de longa distância; entre eles: aves migratórias, pombos-correio (uma variação do pombo-comum) e as tartarugas-marinhas. Há críticas à existência da magnetorrecepção, mas os experimentos que a refutam parecem apenas
- 124. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 114 Julho/2010 falhar em detectá-la e não invalidam a existência do mecanismo. Além disso, de fato, tais animais possuem partículas de magnetita inervadas na região do osso etmóide (crânio) (Freake e col., 2006). Eckert (1983) relata evidências de que ele possa existir em salamandras, enguias e até mesmo bactérias. Conclusões Os mecanismos sensoriais empregados pelos organismos são os mais diversos possíveis e produto das pressões seletivas que um ambiente pode gerar. Não há melhores órgãos e sistemas, mas apenas aqueles mais bem adaptados. A comparação entre grupos revela que algumas soluções são muito semelhantes, ainda que elas sejam análogas entre espécies. Estímulos como a luz, disponível na superfície terrestre globalmente, tornaram possível o desenvolvimento independente de órgãos receptores nos mais diversos grupos. É provável que outras formas de percepção de estímulos existam. A forma como percebemos o mundo também não é, necessariamente, a forma como outros animais com órgãos análogos ou mesmo homólogos o percebem, dado que a área cortical dedicada a um determinado sistema pode variar imensamente (Catania, 2006). Em última instância, qualquer observação comportamental merece uma postura cautelosa na busca de quais estímulos estão moldando um determinado comportamento.
- 125. Neurociências Julho/2010 Pág. 115 Neurofisiologiada visão Antônio Carlos da Silva Laboratório de Ecofisiologia Evolutiva acdsilva@gmail.com Introdução Desde a formação da Terra há bilhões de anos atrás a luz, provavelmente, tem exercido uma potente força de seleção sobre os organismos vivos. Os milhares de amanheceres e pores-do-sol desde o início da vida têm levado a evolução dos olhos que usam a luz para visão e outros fins, incluindo a navegação e noção de tempo. Um pássaro em uma manhã de primavera ouvindo o canto de outros machos competidores em busca de uma fêmea para acasalar, um lagarto do deserto buscando abrigo do sol escaldante, ou uma águia em seu vôo em busca de uma presa - em todos os exemplos, estes animais precisam de uma acurada informação sobre o que ocorre ao seu redor para decidirem o que fazer em seguida. A sua decisão poderá ser apropriada somente se a informação oferecida pelo meio ambiente for corretamente codificada e transformada em sinais que possam ser processados pelo sistema nervoso central. Origens evolutivos No caso da “visão”, embora os olhos apresentem uma variedade de formas, tamanhos, desenhos ópticos e localização corporal, todos eles fornecem informações similares a respeito de ondas e intensidade de suas fontes. Logicamente, os olhos podem ter uma origem monofilética, ou seja, de um único ancestral comum, ou podem ter uma origem polifilética, surgido mais de uma vez durante a evolução. Estudos filogenéticos relevaram que olhos evoluíram independentemente em diferentes grupos sistemáticos, o que nos leva a tentar compreender quais as soluções encontradas por cada grupo de animais durante o processo de evolução no qual resulta essa enorme diversidade ( Halder, 1995; Salviani-Plawen e Mayr, 1977). Estas estruturas (ex. ocelos, olhos compostos, olhos em câmara) que asseguraram aos organismos “captarem estímulos luminosos”, nos levam a relembrar Darwin em “como a seleção natural... pode produzir um órgão tão maravilhoso como o olho” (Darwin, 1859). Os olhos são suscetíveis de coletar o sinal luminoso e focar com lentes em células fotorreceptoras especializadas para converter fótons em sinais neurais. Existem alguns olhos sem pupila ou lentes (Nautilus), mas, por definição, todos os olhos requerem células especializadas para fototransdução. Três filos emergem do período Cambriano com olhos funcionais: Mollusca, Arthropoda e Chordata. Estas linhagens produziram essencialmente oito soluções ópticas
- 126. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 116 Julho/2010 para coletar e focar a luz. (Fig.1). Duas dessas soluções aparecem em Chordata, e uma delas é nominalmente usada como gradiente para um indíce de refração para produção de lentes. Figura 1 – Tipos de olhos. Modificado de Fernald, 2000. Fotorreceptores As unidades básicas do olho, as células fotorreceptoras, podem ser divididas em duas grandes classes, uma ciliar (conjunto de cílios sensíveis a luz) e um tipo microvilar (rabdomérico) o qual é constituído por um conjunto de células receptoras de luz, paralelas umas às outras, o exemplo mais comum é em olhos compostos de insetos que são formados por omatídeos (um pequeno sensor que distingue a claridade da escuridão) e este é formado de uma lente e um rabdoma (Halder, 1995). A estrutura ancestral que poderia ser chamada de precursora do olho – “foto-olho” – não tem bem esclarecido o seu surgimento na árvore evolutiva. Alguns pesquisadores argumentam que o foto-olho poderia ter surgido como duas pequenas estruturas compostas
- 127. Neurociências Julho/2010 Pág. 117 porcélulas fotorreceptoras e um pigmento celular, como observado em pequenas larvas ciliadas no poliqueta trocóforo (Fig. 2) (Gehring and Ikeo, 1999; Pichaud and Desplan, 2002). Em sua origem, o olho simples (ex. protozoário Euglena possui pequenas vesículas sensíveis a luz “eyes spot”) poderia ter realizado alguma forma primitiva de visão a qual teria a função de detectar a direção da luz para fototaxia e, além disso, poderia ter uma forma primitiva de relógio circadiano, que permitisse a oscilação do animal entre ciclos de claro e escuro (Gehring e Rosbash, 2003). Especializado, este órgão fotorreceptor primitivo providencia uma discreta informação à célula dermal sensível a luz. A localização de fotorreceptores em pequenas vesículas ou bolsas com pigmentos sensíveis a luz proporciona informação adicional como observado em Euglena, existem células sensíveis a luz no citoplasma que contém um pigmento vermelho-alaranjado responsável por essa percepção da luz. Alguns estudos sugerem que o olho do tipo ciliar é comum a vertebrados e o do tipo microvilar mais predominante em invertebrados (Land,1992; Fernald, 2000). Entretanto novas descobertas relacionando o gene “controlador principal” - homeobox, genes estruturais responsáveis por determinar qual a posição de determinadas estruturas dentro do organismo - têm revelado um terreno comum aos olhos de praticamente todos os animais multicelulares (Arendt, 2003). Durante a evolução do olho, tipos adicionais de células foram surgindo entre elas células dermais fotossensíveis. Aquelas que compõem as estruturas sensíveis à luz atingiram sua diversidade máxima na estrutura “olho em câmara” de vertebrados e cefalópodes, assim como nos olhos compostos de artrópodes (Arendt e Wittbrodt.,2001). Figura 2 – Foto ilustrativa (D. Arendt), Duas células - olho larval e protótipo pigmento-taça com olho fotoreceptores microvilares em Platynereis dumerilii (Polychaeta, Annelida, Lophotrochozoa). Ultra-estrutura larval 24 h (canto superior esquerdo), (canto superior direito) adulto (72 h) e (estrutura maior abaixo) olhos totalmente crescidos. Em amarelo: células fotoreceptoras microvilar; verde: células de pigmento.
- 128. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 118 Julho/2010 Todos os fotorreceptores sensíveis à luz utilizam um pigmento derivado da vitamina A e este pigmento está vinculado a uma proteína chamada Opsina. A informação luminosa ativa a opsina e causa uma mudança na conformação do pigmento fotossensível, o qual permite que a opsina se ligue a uma proteína G – uma molécula comum e versátil usado em muitos sinais de transdução por cascata intracelular. Estas semelhanças sugerem que todos os olhos têm um antepassado evolutivo comum (Arendt, 2001). Nos vertebrados, a pax6 – importante fator de transcrição no desenvolvimento de tecidos específicos – é exigida para a formação de praticamente todos os tipos de células da retina (Marquardt, 2001). Em Drosophila a pax6 é necessária para a formação de todo o disco dos olhos (Jang, 2003). Fotorreceptores microvilares são encontrados nos olhos compostos de artrópodes. Eles aumentam as suas superfícies apicais em numerosas dobras, nas quais a célula parece ter um achatamento, com a composição de cerdas finas e cerdas membranosas, apesar de a própria célula poder assumir muitas formas em espécies diferentes. A Transdução do sinal em fotorreceptores microvilares envolve ativação de fosfolipase C (PLC) e do inositol tri-fosfato (IP3). Um exemplo de como se dá a formação de imagem pode ser observado na Fig. 3 (Arendt, 2003; Arendt e Wittbrodt, 2001). Figura 3 – Representação da formação da imagem no (A) olho composto e no (B) olho em câmara. olho composto olho de vertebrados
- 129. Neurociências Julho/2010 Pág. 119 Fotorreceptoresciliares são comuns em vertebrados. Sua característica é um aumento da área superficial na membrana celular externa, uma modificação do cílio. A membrana ciliar é expandida e empacotada em dobras profundas de modo que a região de receptores da célula se parece com uma pilha de discos. Os fotorreceptores ciliares usam uma via diferente de sinalização, ativam uma fosfodiesterase (PDE) que muda a concentração de GMP cíclico na célula. Tanto o IP3 e o PDE existem em todos os animais, a diferença está na via que é utilizada nos diferentes fotorreceptores (Arendt e Wittbrodt, 2001). Conclusão As diferenças fundamentais de morfologia, desenvolvimento e estrutura dos fotorreceptores de diversos tipos de olhos encontrados no reino animal sugerem que os olhos surgiram independentemente pelo menos 40 vezes, especialmente ao compararmos as camadas da célula da retina que compõem o olho em câmara dos vertebrados (ganglionar, plexiforme interna, nuclear interna, plexiforme externa, nuclear externa, externa, epitélio pigmentar) (Fig. 4 do capítulo anterior). Os sistemas de transdução, por outro lado, são muito parecidos, desempenhando operações de detecção, amplificação e transmissão (Randall,1997). As evidências aqui levantadas nos mostram que existem relações importantes entre as estruturas básicas dos fotorreceptores e nos levam a refletir sobre o processo de evolução, onde cada grupo animal enfrentando pressões seletivas nos mais variados ambientes desenvolveu uma grande diversidade de tipos de olhos, cada um com sua peculiaridade, atendendo a condições necessárias a sobrevivência do indivíduo e, conseqüentemente, da espécie.
- 130. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 120 Julho/2010
- 131. Neurociências Julho/2010 Pág. 121 Causae Função Pedro Leite Ribeiro Laboratório de Ecofisiologia Evolutiva pedrolribeiro@gmail.com Apoiado numa trama de galhinhos de uma trepadeira, a uns 15 cm do solo, um ninho de tico-tico abriga um só filhote, na primeira semana de vida. Está sossegado, talvez dormindo, protegido do sol de verão pela folhagem acima. De repente, bem rápida, chega a tico-tico e habilmente pousa na beirada do ninho. Ato contínuo, o filhote se ergue, pescoço esticado para cima, o bico escancarado. A fêmea, agitada ou apressada, mete o bico goela adentro do pidão, retira-o e, girando o corpo, voa para trás, na direção de onde chegou. Não ficou nem um instante para descansar do sol dardejante de verão. Alguns minutos depois, ela chega de novo: mais uma refeição. Mais alguns minutos e a cena se repete. No entanto, ela não vai à exaustão total, e acaba descansando um pouco. O macho não apareceu por ali (Robert et al., 1961). A um metro dali, uns 15 cm abaixo da superfície do solo, enclausurada na câmara que construiu, uma saúva fêmea, conhecida popularmente pelos nomes de içá e tanajura, põe mais um ovo de alimentação. Não é um ovo normal, do qual eclode uma larva. É bem maior e é mole, em contraste com a casca dura dos ovos de procriação. Dobrando-se ventralmente, leva as mandíbulas até a abertura de seu ovipositor, de onde o ovo vem saindo, pinça-o com precisão, desdobra-se e o coloca delicadamente na boca de uma das várias larvas que estão todas juntas. Segura-o ali enquanto a larva vai sorvendo sua refeição (Autuori, 1940). Bem mais longe, uma outra fêmea, uma mulher, engata a primeira marcha em seu carro e parte para o shopping center. Na lista que leva na bolsa estão anotados vários itens, incluindo fraldas, mamadeira, chupetas, leite em pó e um carrinho de bebê. Enquanto dirige, ela pensa na lista, e faz cálculos de dinheiro. Fica preocupada e percebe que vai ter de pagar com o cartão de crédito. Ao pensar em cada item, aparece em sua mente a imagem de um bebê: ela sorri. Os esforços desmedidos que tantas fêmeas - e também alguns machos, de aves e outras classes de animais - fazem em favor de suas crias, em evidente desfavor de sua própria sobrevivência, recebem uma explicação simples da teoria da evolução. Elas estão cuidando da sobrevivência de seus genes. Foram selecionadas. Se as fêmeas de tico-tico ficassem descansando na sombra, evitando as fadigas da busca de comida para seus filhotes, seu dispêndio de energia seria muito menor e correriam menos riscos; porém, perderiam a prole. Seu cálculo da relação entre custos e benefícios não se completa no balanço energético de seus próprios organismos; ele inclui a descendência como parte
- 132. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 122 Julho/2010 decisiva da equação. Abandonando o ninho, as tico-ticos estariam melhor, precisariam de menos alimentos para si mesmas, mas não transmitiriam esse comportamento a qualquer descendente. O cálculo da formiga é um pouco diferente, mas essencialmente o mesmo. Fazendo o enorme esforço da fundação de um formigueiro, jejuando durante meses, vivendo de reservas, inclusive absorvendo seus músculos alares, ela não está trocando uma vida mais fácil pela procriação. Ela é incapaz de sair da câmara subterrânea onde se encerrou e buscar comida na superfície. E se não construísse a câmara, ficaria perambulando pelo solo até ser morta ou morrer de inanição (Autuori, 1942, 1941). Sua única chance de viver depende de conseguir que suas filhas dêem início a um novo formigueiro. A tico-tico teria uma ou duas novas oportunidades na mesma estação e outras mais no ano seguinte. Assim como fêmeas férteis dão origem a fêmeas férteis enquanto fêmeas estéreis não dão origem a nada, mães extremadas dão origem a mães extremadas, enquanto mães omissas não dão origem a ninguém; são pontos terminais de linhagens. A função do ovário e de todo o conjunto de órgãos e processos que resultam na produção dos ovos completa-se com o comportamento reprodutivo. A função de um órgão só se completa com o comportamento que o usa. O estudo funcional do comportamento é a busca de suas conseqüências para a sobrevivência e para a reprodução. É no exame do contexto adaptativo e dos efeitos do comportamento que podemos descobrir suas funções. Entendido o organismo como um sistema que está configurado para manter-se e reproduzir-se, com a manutenção subordinada à reprodução, é no entendimento do papel de cada comportamento que se dá o estudo funcional. Pois são estas, as funções, o alvo direto das pressões seletivas ao longo do processo de seleção natural. É comum que os estudantes de Psicologia e Biologia sintam certo mal-estar com o conceito de função por causa de sua proximidade com as idéias de meta, fim, finalidade, propósito e objetivo. Trata-se de um desconforto filosófico, em face do justo receio de adotar uma visão teleológica da evolução, como se o futuro pudesse determinar o passado. Tal inquietude, no entanto, decorre de um exame superficial do conceito de função. É claro que é uma tolice rematada conceber a evolução como um desígnio divino, algo como a realização de um projeto ou o desdobramento de um plano de alguma forma presente desde sempre. Uma das muitas notáveis propriedades da mente humana é a sua habilidade de decifrar as intenções por trás do comportamento alheio. Essa faculdade, tão adaptativa nas relações sociais, facilmente transborda de seu uso funcional levando-nos à ilusão de perceber intencionalidade e consciência onde elas não existem. Programando engenhosamente a movimentação de alguns pequenos círculos numa tela de computador, o leitor poderá demonstrar a um observador sua tendência a interpretar a movimentação como se houvesse um enredo de fugas e perseguições. Ora, ao aprender que o estudo científico não pode deixar-se contaminar ingenuamente pela subjetividade, o
- 133. Neurociências Julho/2010 Pág. 123 estudantepode hesitar quando se depara com o conceito de função. Contudo, é preciso entender que a Ciência pode adotar termos de uso corrente sem trazer suas conotações e implicações. A descoberta de que o canto do tico-tico tem a função de proteger seu território e seduzir as fêmeas não significa que ele tenha de seu comportamento a mesma consciência que tem um ser humano em situações análogas. Assim como não há erro conceitual em descrever as peças de um automóvel dizendo qual é o objetivo de cada uma delas, ou dizer que um robô procura e usa a tomada para recarregar, ou com o objetivo de recarregar sua bateria, assim também não há teleologia em reconhecer que a evolução criou organismos dotados de recursos que dão conta de sua manutenção e reprodução agindo como se estivessem sendo controlados pelas conseqüências de suas ações. O controle de suas ações, no entanto, aquilo que os leva a fazer o que fazem a cada momento, constitui um outro tipo de fenômeno, que devemos chamar de causas do comportamento. O que leva a içá a fazer cada um de seus movimentos são os estímulos do ambiente e de seu próprio corpo, seus hormônios e as programações de seu sistema nervoso. Portanto, a pergunta "por que a içá alimenta as larvas?" tem duas respostas, uma funcional e outra causal. A observação de que as larvas de formigas são inertes, incapazes de se alimentarem sozinhas, terá valor no plano funcional. Já a indagação "será que as larvas dão algum sinal de suas necessidades, ou a produção de ovos de alimentação obedece a um programa que independe do estado das larvas?" cabe no plano causal. Investigar se a quantidade de testosterona afeta a freqüência ou a intensidade do canto do tico-tico é um estudo causal. Já o efeito do canto sobre a preservação do território é uma questão funcional. Note-se que esse mesmo canto deve também ser entendido como estímulo que atinge os ouvidos dos machos rivais. Examinado dessa forma, em busca de como ele controla as ações dos rivais, por exemplo, fazendo-os mais ou menos agressivos, o canto está dentro de um estudo causal. Essa aparência de que funções se desenvolveram “para resolver determinados problemas” está relacionada ao fato de que o ambiente funciona de forma relativamente regular, possibilitando a seleção de programas genéticos, moldados ao longo de uma prolongada história adaptativa; embora presentemente gerem a sensação de finalidade na sua construção, podem ser explicados como fruto do acaso submetido à seleção, portanto, obra da adaptação. Niko Tinbergen, prêmio Nobel de 1973, organizou o estudo do comportamento em quatro tipos de resposta à pergunta por quê. A resposta causal, que tem, na maioria das vezes, o seu entendimento feito através de estudos de fisiologia, a funcional, cujo estudo é normalmente associado a questões relacionadas com ecologia, e mais duas que não serão aqui examinadas. Filogênese: por que esta espécie tem esse comportamento? Como evoluiu? Como se comportavam seus ancestrais? Quais foram as pressões seletivas que o moldaram? Ontogênese: o repertório comportamental de uma espécie não surge todo no
- 134. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 124 Julho/2010 recém-nascido. Como se dá seu desenvolvimento? Por que tal comportamento aparece em tal idade? Qual é o papel do aprendizado? O entendimento da diferença entre causa e função serve bem para evitar confusões conceituais. O esclarecimento da função de um comportamento não resolve o problema causal, mas é útil para gerar hipóteses sobre os fatores que atuam sobre ele. Existem mariposas que subitamente, em pleno vôo, deixam-se cair como se tivessem sido mortalmente feridas. Alguns segundos depois, antes de atingirem o solo, elas recobram seu vôo normal. A descoberta de que a função desse comportamento é protegê-la do ataque de morcegos leva-nos a buscar algum órgão receptor do ultra-som usado pelos morcegos em seu sistema de ecolocação. Em condições normais, no ambiente natural, os fatores causais e as funções têm um entrosamento admirável. A receptividade sexual acontece quando o organismo está pronto para a reprodução, apetites específicos quando ocorrem carências específicas, a sede quando falta água, e assim por diante. Sim, esse entrosamento torna-se admirável quando se apreende bem a noção de que uma função não produz por si só o comportamento correspondente. Não é óbvio que a falta de água leve o animal a beber. Entre a falta de água nos tecidos e as atividades de procurá-la e ingeri-la, é necessária a ação de fatores causais adequados, a começar pelo reconhecimento correto do objeto, ou seja, o animal deve engolir água e não areia ou flores. E deve tomá-la e não atacá-la com mordidas. A compreensão da diferença entre causa e função tem a virtude de problematizar o comportamento. Em condições anormais, seja no ambiente natural seja no laboratório, causas e funções podem desencontrar-se, revelando de forma dramática como é notável o entrosamento normal. Lesões do hipotálamo lateral tornam os ratos inapetentes a ponto de morrerem de inanição com comida abundante ao seu alcance. As vítimas humanas de anorexia entendem bem a diferença entre precisar de comida e ter fome. Drosófilas mutantes sem asas movem as patas traseiras como se as estivessem limpando. Alguns cães domésticos dão uma volta em torno do lugar onde estão prestes a deitar-se para dormir. Há pelo menos um caso bem documentado de cópula entre um chimpanzé e uma fêmea babuína. E temos também que estar preparados para encontrar comportamentos cuja função principal não é sua única função, como a sexualidade dos bonobos que, em condições normais no ambiente natural, inclui rotineiramente relações entre machos, entre fêmeas e entre adultos e jovens impúberes. Há alguns casos documentados de adoção interespecífica (Otoni et al., no prelo). No comportamento lúdico, tão comum em mamíferos, mas presente também em aves, os jovens fazem coisas de adultos, fora tanto do contexto funcional como do causal. Assim como nossa capacidade empática pode induzir-nos ao erro de antropomorfizar
- 135. Neurociências Julho/2010 Pág. 125 ocomportamento animal, os animais também têm seus transbordamentos motivacionais. Tais exceções não devem ofuscar o extraordinário ajuste entre causas e funções sem o qual não haveria manutenção nem reprodução. Dias antes daquela ensolarada manhã em que a tico-tico cuidava de buscar comida, ela vinha sendo furtivamente observada por uma fêmea de chupim. Se a percebesse, a tico- tico talvez tivesse ido embora, abandonando o ninho, para fazer outro em lugar mais seguro. Não a viu, e a chupim conseguiu botar um ovo junto aos seus. Por predação ou furados pela chupim, os ovos perderam-se todos, menos um, o da chupim. Foi vã toda a dedicação da tico-tico. Explorando o sistema causal da hospedeira, a chupim logrou desvirtuar a função do comportamento da tico-tico, em seu benefício. O parasitismo comportamental é uma lição fascinante acerca dos modos como o comportamento é controlado. A tico-tico vai continuar a cuidar do chupim como se fosse seu filho até sua independência, mas terá novas chances nos anos seguintes (Buzzetti, 2004). A içá que alimentava as larvas com ordem e precisão perdera a pequena porção de fungo que pegou do ninho onde nasceu e trouxe na bolsa infrabucal. Essa pelotinha de fungo era essencial. Ela ia depositá-la com todo o cuidado no chão da câmara, e depois meticulosamente alimentá-la com suas fezes e fazê-la prosperar. Sem esse jardim de fungo, seu esforço é vão. Ela continuará a alimentar as larvas, que se tornarão pupas e depois obreiras que vão cavar um túnel para cima e procurar alimento na superfície. Porém, sem fungo, o alimento será inútil e mãe e filhas não vão durar muito. Mesmo tendo perdido o fungo, a içá continuou a responder aos estímulos presentes. Não existe nenhuma possibilidade de a seleção natural operar e cancelar essa inércia comportamental. O bebê cuja lembrança fez sorrir a mulher que ia ao shopping center preocupada com a despesa não é seu filho. É filho de uma amiga, mãe solteira, que está sem dinheiro. O filho foi planejado. Ela tinha um bom emprego. Não queria casar-se e procurou um homem com o único fim de ter o filho. Perdeu o emprego e sua vida ficou complicada. A amiga, solidária, está feliz de poder ajudar. A complexidade do comportamento humano é um desafio para a análise de causas e funções. O comportamento da mulher que presenteia não parece ser um excesso de cuidados maternais. Lembra mais os comportamentos altruístas de fortalecimento de vínculos interpessoais, comuns em animais sociais. Já o comportamento da mãe, ao planejar o filho, parece inverter ou fundir a relação entre causa e função. Diferentemente de qualquer outro animal, ela conhece a relação entre a cópula e a gravidez e entre esta e o nascimento de uma criança. Mesmo que tivesse aversão ao ato sexual, ela poderia lançar mão da inseminação artificial. O filho, neste caso imaginário específico, não é a conseqüência desconhecida ou desconsiderada da atividade sexual. Isso foi assim, na pré-história, antes de nossos ancestrais descobrirem a relação entre sexo e procriação. No caso que estamos examinando, a reprodução, que normalmente reside no
- 136. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 126 Julho/2010 plano funcional, é uma causa dos comportamentos da mãe. Pode-se fazer uma analogia com o comportamento de busca de algo perdido, que muitos animais são capazes de fazer. Uma fêmea que se perca de seu filhote e saia a procurá-lo também constitui um caso em que a distinção entre causa e função fica reduzida ou anulada. A memória e a capacidade cognitiva permitem que um animal se comporte em relação a um objeto do qual não recebe qualquer estimulação. O comportamento nesse caso tem a função de encontrar o objeto que é também parte de suas causas. Em nós, humanos, a cultura trouxe alterações importantes tanto ao plano causal quanto ao funcional. Ela não destruiu os sistemas que operavam antes de sua origem. Ela os transformou em algo que ainda não conseguimos entender. Curiosamente, a cultura criou os recursos que nos permitem organizar o pensamento científico e com ele progredir no entendimento do que fazem os outros animais, mas não se revela facilmente a si mesma. As próprias causas e funções de seu desenvolvimento constituem um desafio difícil que ainda é objeto de debate entre os que se dedicam a elucidá-las. Com métodos de observação e experimentação cada vez mais refinados, biólogos e psicólogos vêm progredindo de modo acelerado no estudo do comportamento animal e humano. A pergunta "Por que esse animal está se comportando desse modo?" recebe respostas cada vez mais amplas e convincentes. Quando trocamos animal por ser humano nessa indagação, as respostas são mais hesitantes, porém o progresso é indiscutível, e as próximas décadas deverão proporcionar descobertas fascinantes (Lorenz, 1981).
- 137. Neurociências Julho/2010 Pág. 127 Percepção FelipeViegas Rodrigues Laboratório de Neurociência e Comportamento rodrigues.fv@gmail.com Percepção é um função do sistema nervoso central que depende do entendimento dos sistemas sensoriais, mas vai além destes. Entender percepção é entender não somente como percebemos alguma coisa (seja vendo, ouvindo ou sentindo estímulos), mas também por que percebemos e quais as implicações para com outros aspectos da cognição, como a memória ou a atenção. Falar em percepção é falar sobre os córtices associativos. Esse campo de estudo lida com dois problemas: (1) como todos os aspectos de um estímulo sensorial são entendidos e processados (cor, forma, movimento para visão; intensidade, timbre, altura para audição, por exemplo) e (2) qual a relação com outras funções da cognição, especialmente atenção e memória. Uma das principais diferenças entre a percepção e as sensações é a constância perceptual. Tome por exemplo a Fig. 1. Não importa qual a posição do carro mostrado na figura, sabemos que se trata do mesmo carro, apesar das quatro imagens serem distintas e provocarem estimulações diferentes nas porções iniciais do sistema visual. O mesmo princípio é verdadeiro para a percepção de uma mesma nota musical tocada por instrumentos diferentes. Embora as frequências produzidas por eles sejam diferentes, com alterações dos harmônicos que compõem o som resultante (dando a cada instrumento seu timbre), a percepção de uma determinada nota é mantida. A constância perceptual só é possível pela integração da informação sensorial com a informação de outras regiões encefálicas, inclusive (ou talvez principalmente) das memórias adquiridas ao longo da vida. Esse mecanismo depende, portanto, de aprendizado e ele é possivelmente uma particularidade da espécie humana. Experimente colocar um capacete de ciclismo (que cobre apenas a parte superior da cabeça) e aparecer diante do seu cachorro. Ele seguramente o estranhará. Por outro lado, o reconhecerá pelo cheiro e voz, o que o fará parar de hesitar após algum tempo. Humanos são únicos em sua capacidade de abstração, capazes de ver um tronco Figura 1 – A imagem na retina é imensamente diferente para os quatro desenhos. Ainda assim, perceptualmente logo nos damos conta de que se trata do mesmo carro. Retirado de Gazzaniga, Ivry e Mangun (2006).
- 138. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 128 Julho/2010 cortado em uma floresta e imediatamente pensar: “Que bom! Um banco para descansar!”. O interesse pelos mecanismos de percepção veio a partir de casos clínicos de lesões cerebrais, em geral por acidentes vasculares cerebrais (AVC), em que os pacientes tiveram comprometimento da percepção. Tais pessoas se tornaram incapazes de reconhecer objetos ou pessoas que antes lhes eram muito familiares. Uma investigação minuciosa evidencia que tais pessoas podem descrever em detalhes o que lhes é pedido, o que descarta problemas de memória. Mais do que isso, a estimulação por outra modalidade sensorial resulta em imediata identificação do objeto ou pessoa em questão, levando ao entendimento de que o problema é perceptual e, em geral, associado a apenas uma modalidade sensorial. Ao conjunto de sintomas de incapacidade de percepção é dado o nome agnosia. Vias perceptuais As lesões cerebrais que levam a problemas de percepção frequentemente são aquelas que ocorrem em áreas dos córtices parietal posterior, temporal inferior ou face lateral do córtex occipital. Essas regiões encontram-se na confluência das áreas sensoriais e, como já mencionado, são parte dos chamados córtices associativos, pois recebem aferências corticais das regiões sensoriais e integram aferências múltiplas para desempenhar funções cognitivas supramodais e comportamentais específicas. Algumas dessas regiões são neoformações em primatas e elas constituem a maior parte do córtex cerebral, particularmente no caso da espécie humana (Preuss, 2006). Visão O sistema visual é a modalidade mais estudada de todos os sistemas sensoriais conhecidos. No capítulo sobre fisiologia sensorial foi possível entender como se dá o processo de transdução do estímulo luminoso em sinal elétrico e como essa informação é levada até o córtex. Vamos elucidar agora como essa informação é manipulada e integrada com informações de outras regiões corticais para, de fato, entender como percebemos. A informação que chega até o córtex visual não para em V1, pelo contrário, essa informação continua avançando por diferentes regiões, adentrando os córtices temporal inferior e parietal posterior, passando por populações de neurônios especializadas no processamento de características específicas de um estímulo visual. Uma particularidade desse sistema sequencial é que a cada conjunto de sinapses que são realizadas a partir de V1, mais fibras vão convergindo na rede neural. Com esse arranjo, quanto mais adiante na sequência esteja uma população de neurônios, mais específica é sua função no processamento visual: enquanto aquelas no início da cadeia de processamento disparam para simples estímulos em forma de barra (com populações específicas para as diversas angulações possíveis dessa barra), há neurônios mais adiante nessa cadeia que só
- 139. Neurociências Julho/2010 Pág. 129 dispararãopara combinações dessas barras ou se o estímulo em questão tiver características de um móvel (Fig. 2). Apesar do arranjo sequencial, as evidências atuais apontam para um processamento em paralelo dessas diversas regiões. Casos clínicos de pacientes que tiveram um AVC em regiões muito específicas do encéfalo (nos córtices associativos) revelam a perda de percepção de algum componente da visão, como movimento ou cor, mas não de outras características, mesmo que estas sejam processadas mais adiante na sequência de processamento visual. O maior tempo de reação para detecção de um estímulo visual quando mais de uma característica precisa ser analisada em um teste perceptual (cor e forma, por exemplo) também reforça a ideia do processamento em paralelo. Se apenas uma das características for necessária para a detecção do estímulo, independente de qual delas, o tempo de reação é menor. Na Fig. 3 pode ser vista uma representação das diferentes regiões de processamento visual e o papel de cada uma delas na construção de um percepto visual. Vale ressaltar que o arranjo existente nos permite definir uma via dorsal e outra ventral de processamento. Através da via dorsal, podemos entender “onde” vemos um objeto, já que essa via nos trás informações sobre movimento e posição espacial de um objeto. Já a via ventral nos traz informações de “o quê” vemos, permitindo identificar características como cor e forma de um objeto. Figura 2 – Estrutura sequencial na organização dos córtices associativos do SNC. Quanto mais adiante na sequência, mais complexo é o estímulo para qual a população de neurônios irá responder. Modificado de Lent, 2006.
- 140. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 130 Julho/2010 Figura 3 – Vias paralelas de processamento do estímulo visual: via dorsal (córtex parietal posterior), para processamento de informações sobre localização espacial e movimento, e uma via ventral (córtex temporal inferior), para processamento de informações como cor e forma do objeto em questão. Retirado de Kandel e col. (2000). Evidências clínicas, mais uma vez, não deixam dúvidas de que essas vias colaboram de forma independente para a percepção de um objeto qualquer. Um paciente com lesão em regiões da via ventral poderá afirmar não existir uma caneta (objeto) sobre uma mesa diante dele. Apesar disso, se ele for instruído a imaginar um objeto sobre a mesa e demonstrar como seria o movimento para pegar esse objeto, esse indivíduo faria o movimento correto e até mesmo poderia pegar a caneta. A ativação de todas as regiões corticais é necessária para que possamos ter a “correta” percepção de um objeto à nossa frente; o uso de aspas justifica-se porque, falando-se em percepção, simplesmente não há “correto”, mas sim uma experiência pessoal que é fortemente influenciada pelas nossas memórias, emoções e a atenção deslocada a um dado estímulo do ambiente. Falaremos mais sobre isso nos tópicos seguintes. Audição O sistema auditório e seus córtices associativos adjacentes têm sido mais bem estudados nos últimos anos. Novos experimentos têm trazido evidências de que o processamento de diferentes características do som também ocorre em diferentes regiões corticais. Semelhantemente ao sistema visual, existem duas vias de saída para os córtices associativos: uma anteroventral, relacionada à percepção de características do som como timbre e tonalidade; e outra posterodorsal para a percepção de características espaciais e localização do estímulo. De fato, Bendor e Wang (2005) encontraram no córtex auditivo de saguis-comuns (na região anteroventral) neurônios capazes de perceber tons, isto é, que disparam para
- 141. Neurociências Julho/2010 Pág. 131 umadeterminada frequência e também para seus múltiplos. Essa relação entre frequências é exatamente aquela encontrada entre duas oitavas musicais. Essa população de neurônios provavelmente existe também em outras espécies de primatas, incluindo os humanos. É possivelmente pelo disparo desses neurônios que identificamos as notas semelhantes entre dois instrumentos musicais diferentes. Como no carro da Figura 1, é a constância perceptual para estímulos sonoros. Por outro lado (ou, melhor dizendo, por outra via...), morcegos são um exemplo brilhante do funcionamento da via posterodorsal e a capacidade de localização por estímulos sonoros. Acredita-se que eles sejam capazes de estabelecer um mapa do ambiente por onde se locomovem tão preciso quanto aquele que estabelecemos pela estimulação visual. Tentar imaginar algo como isso é quase impossível, mas, novamente, isto é apenas um reflexo da forma como percebemos o mundo. Seria como tentar imaginar como um cego (de nascença) percebe o mundo. Embora você provavelmente tenha pensado em fechar seus olhos e prestar atenção aos sons, cheiros e pressões (táteis) ao seu redor, isto não é o que um cego percebe do mundo. Para ele a estimulação visual nunca existiu, logo, perceber o mundo não é “ver” uma imagem preta e atentar às outras sensações. Para ele, são apenas as outras sensações. Há casos bem documentados de pessoas que conseguiram desenvolver a capacidade de se ecolocalizar (como os morcegos) para se locomover. Essas pessoas parecem criar mapas rudimentares do ambiente, precisos o suficiente para se locomoverem sem maiores problemas. Memórias atentas ao contexto Em diversos mamíferos, após um estímulo percorrer todos os circuitos necessários à sua percepção (ainda que de forma inconsciente), invariavelmente ele chegará à região anterior do lobo frontal (ou estruturas homólogas). Essa região está envolvida com memória operacional e atenção, especialmente no caso de primatas (e possivelmente em outros mamíferos), e é onde o estímulo será integrado com memórias passadas e, se o estímulo tiver maior relevância para o organismo (ou simplesmente se for um estímulo muito forte – como um ruído muito alto), ganhará maior processamento neural destes circuitos, resultando em um fenômeno que chamamos comumente de atenção. É interessante notar que a definição de qual estímulo receberá atenção em um dado momento também dependerá do contexto em que se encontra uma pessoa. Imagine- se na sua rotina diária no colégio alguns anos atrás. Você consegue se lembrar com que facilidade você percebia o sinal da sua escola soar perto do horário de ir embora? Ou mesmo quantos “alarmes-falsos” você tinha durante essa espera? Da mesma forma, círculos vermelhos não devem significar nada para você neste exato momento, mas eles
- 142. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 132 Julho/2010 terão muita importância quando estiver dirigindo para algum lugar. Essas diferenças sutis naquilo que percebemos são produto de ativação de circuitos de atenção e das memórias que acumulamos ao longo da vida. Ilusões e hemisférios cerebrais Ter memórias significa aprender sobre o ambiente que nos rodeia. Quando essas memórias são integradas com nossa percepção, não é raro que tenhamos uma visão distorcida daquilo que está diante de nós. Tome por exemplo a Fig. 4A. Qual das duas barras horizontais é maior? À primeira vista, todos dirão que a barra superior é maior. Apenas alguns, após uma análise mais cuidadosa, dirão que ambas tem o mesmo tamanho. Isso não significa que falhamos em enxergar. Apenas nos deixamos levar pelo aprendizado que tivemos em toda nossa vida: ao longo dos anos, vemos que linhas de mesmo tamanho parecem menores quanto mais distantes elas estão de nós. As barras convergentes na Fig. 4 criam a ilusão de algo que se distancia. Assim, percebemos as barras paralelas como sendo de diferentes tamanhos. Olhe a Fig. 4B e isso ficará ainda mais claro. (A) (B) Nosso treino para perceber formas geométricas nos faz enxergá-las até mesmo onde elas não existem. A Fig. 5 sugere o formato de um triângulo, mas sem todas as suas bordas esperadas, de fato. A figura é conhecida como Triângulo de Kanisa. Algumas pessoas chegam a dizer que ele é mais branco que as áreas em volta! A explicação direta é que nos acostumamos a enxergar com mais luz algo que está em primeiro plano. As ilusões de óptica não se resumem apenas a fenômenos mnemônicos (que dizem respeito à memória). Há também efeitos causados pelos próprios receptores sensoriais. Você provavelmente já se deparou com imagens como as que estão na Fig. 6. A estimulação de um determinado receptor retiniano para cor por um período prolongado leva à percepção da cor complementar correspondente, o que faz com que, ao olhar para um Figura 4 – Ilusão de Ponzo. As linhas paralelas em (A) parecem ter diferentes tamanhos, apesar de serem iguais. Em (B) uma possível explicação biológica para esse efeito. Figura 5 – Triângulo de Kanisa.
- 143. Neurociências Julho/2010 Pág. 133 fundoneutro (branco, preto ou qualquer tom de cinza), perceba-se cores trocadas na imagem. Figura 6 – Efeito de pós-imagem. Uma ilusão criada pelos receptores sensoriais quando superestimulados por uma determinada cor. Olhe fixamente por cerca de 30 segundos para qualquer um dos pontos pretos nas imagens e, em seguida, para uma parede branca. O que você vê? Essa questão torna-se extremamente importante quando pensamos em contraste. A percepção de uma cor em um determinado momento é influenciada não somente pela cor em si, mas pelas cores em volta da mesma. Quão diferentes são as cores dos quadrados “A” e “B” na Fig. 7? A resposta correta é: nada diferentes! Não há modificações! Isso acontece porque as cores ao redor da cor atentada influenciam a percepção da mesma. Figura 7 - Os quadrados “A” e “B” da figura são diferentes na cor? Não! Os quadrados não são diferentes! De forma mais ampla, somos influenciados por diferenças entre nossos hemisférios cerebrais. Apesar de estes trabalharem sempre em conjunto, com ativações bilaterais, diferenças sutis na ativação refletem certas dominâncias inter- hemisféricas que podem também resultar em diferenças na percepção. Testes com pacientes que sofreram um AVC e estudos com animais lesionados sugerem que o hemisfério esquerdo se encarrega primordialmente da percepção de detalhes de uma imagem, enquanto que o hemisfério direito se encarrega das características globais. Veja na Fig. 8 como estes pacientes desempenham em um teste simples de cópia de uma figura. Essas diferenças manifestam-se também na percepção de figuras com conteúdo ambíguo. O que você percebe à primeira vista na Fig. 9?
- 144. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 134 Julho/2010 Figura 8 – Desempenho de pacientes com hemisférios cerebrais paralisados em um teste de cópia de figura. Pacientes que tem apenas o hemisfério esquerdo funcionante, percebem os detalhes das imagens originais, mas perdem a forma global. Por outro lado, pacientes com apenas o hemisfério direito funcionante percebem a forma global, mas não se dão conta dos detalhes. Retirado de Lent, 2006. Sinestesia A sinestesia é um caso muito específico de percepção em que uma determinada modalidade sensorial gera a percepção de outra modalidade. Um dos eventos mais frequentes é a percepção secundária de cores após a estimulação primária por um grafema, seja um número ou uma letra (ou até mesmo palavras). A percepção induzida pelo estímulo primário é sempre muito específica e unidirecional (a estimulação pelo percepto induzido não gera a percepção do estímulo indutor pareado, isto é, se a palavra “casa” induz a percepção da cor amarela, o contrário não acontecerá). Um sinesteta pode repetir mais de centenas de pares de percepções com pouco ou nenhum erro. Frequentemente a percepção induzida é a de cores, seja por grafemas, como dito acima, ou por sons (palavras em geral); mas há relatos bem Figura 9 – O que você vê nesse quadro?
- 145. Neurociências Julho/2010 Pág. 135 documentadosde palavras gerando percepção de gostos, gostos gerando formas, cheiros para cores e, mais curiosamente, música (ou intervalos tonais ou simplesmente tons) para cores ou formas. As percepções secundárias de gostos e também cheiros são menos comuns, embora exista pelo menos um caso bem documentado de percepção secundária de gostos induzida por intervalos tonais (musicais). A mesma pessoa reporta possuir o caso mais comum de sinestesia entre tonalidades musicais e cores. A investigação sobre o fenômeno é ainda muito recente e algumas perguntas básicas sobre o assunto só agora começaram a ser respondidas. Em relação aos mecanismos neurais que possibilitam a sinestesia, duas proposições foram feitas: alterações estruturais e alterações funcionais. A Fig. 10 apresenta um resumo dos modelos de mecanismos possíveis. Figura 10 - Modelos de Sinestesia. Os modelos diferem na rota proposta de ativação cruzada (direta ou indireta) entre as regiões indutora e concorrente e nas diferenças subjacentes ao sinesteta (estruturais ou funcionais). Regiões em amarelo estão ativas (começando pela região indutora) e, em azul, inativas. Conexões excitatórias são mostradas como flechas e inibitórias como pontas em traço. Linhas pontilhadas representam conexões presentes estruturalmente, mas funcionalmente inativas. Modificado de Bargary e Mitchell (2008). As evidências de casos clínicos e fenomenologia da sinestesia apontam mais fortemente para alterações estruturais na conectividade cerebral, com ligações anormais entre as regiões indutora e induzida no cérebro de sinestetas (Bargary e
- 146. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 136 Julho/2010 Mitchell, 2008). Vale ressaltar que diferentes possuidores de uma mesma sinestesia (tons para cores, por exemplo) podem reportar associações diferentes para a cor induzida. Se um deles disser que um dó maior é azul, o outro poderá dizer: “Isto está errado!”. Não se sabe por que a indução de cores é muito mais frequente que a indução de outras percepções. Diferenças na manifestação da sinestesia ainda levaram à sugestão de uma classificação em dois tipos de sinestetas: (1) de ordem baixa e (2) de ordem alta (Ramachandran e Hubbard, 2003). Essa divisão leva em consideração o estágio de processamento em que ocorre o fenômeno perceptual. Sinestetas de ordem baixa tendem a ter o efeito de indução apenas com estímulos muito específicos, por exemplo: números escritos na língua de origem. Já os sinestetas de ordem alta têm o efeito de indução toda vez que o conceito que um determinado indutor sugere está presente. Tomando por base o exemplo anterior, nos sinestetas de ordem alta mesmo algarismos escritos em números romanos (que nada mais são do que letras) poderiam gerar a percepção induzida. A incidência da sinestesia na população mundial é de algo entre 1% e 4% (Simner e colaboradores, 2006), um valor bem diferente dos 0,05% anteriormente sugeridos. Estudos em primatas dão indícios de que essas conexões “anormais” estão naturalmente presentes no organismo durante a fase fetal e o período de lactância, mas após esse período essa hiperconectividade de regiões sensoriais tende a ser removida do cérebro. Isto ainda não fora comprovado em recém- nascidos humanos, mas observações comportamentais levam à sugestão de que há uma “confusão sinestésica” nas primeiras semanas de vida. A plena maturação perceptual e a segregação dos sentidos viriam apenas após alguns poucos meses de vida, portanto. De qualquer forma, não ouse afirmar que um sinesteta tem sentidos menos maduros ou perguntar a ele “como é viver assim?”. A resposta sempre presente após essa pergunta é: “Como você vive assim?!”. Concluir é um problema Uma das maiores questões ainda não respondidas com respeito à percepção é como geramos um percepto único das estimulações constantes à nossa frente se aspectos diferentes de um estímulo são processados em regiões distintas do córtex cerebral (e.g. cor, forma, movimento, etc., no caso da visão). É o chamado binding problem.
- 147. Neurociências Julho/2010 Pág. 137 Umadas possíveis explicações para a forma como geramos um percepto é a de que, pelo sequenciamento de neurônios no encéfalo, com cada vez mais neurônios se juntando em um próximo neurônio (e, consequentemente, complexando o estímulo processado), ao final do processamento, invariavelmente todas as informações sobre o estímulo estariam ali reunidas. A quantidade de regiões envolvidas e a divisão do processamento em duas vias (dorsal e ventral), porém, não favorece essa explicação. Parece mais plausível aos pesquisadores que o encéfalo forme um percepto único pela sincronização do disparo dos neurônios das diferentes regiões corticais, ainda que cada uma delas esteja envolvida no processamento de distintos aspectos de um estímulo apresentado. Essa explicação, porém, ainda carece de comprovações. O estudo de casos de sinestesia tem trazido algumas colaborações para aquilo que entendemos sobre percepção. Alguns sinestetas relatam a percepção de cores estranhas, diferentes de qualquer cor que eles já tenham visto em algum objeto ou lugar. Um deles chegou a chamar essas percepções sinestésicas de “cores marcianas”. Ramachandran e Hubbard (2003) atribuem essas cores estranhas à ligação cruzada (ou direta) de um córtex sensorial para outro, o que “desviaria” o processamento de estágios iniciais da percepção de cores. Segundo os autores, isso sugere que a experiência subjetiva da percepção de cores depende não só do processamento final, mas de todo o padrão de atividade neural que leva à formação de um percepto, incluindo as fases iniciais do processo. Estando certa ou não a sugestão dada por Ramachandran e Hubbard (2003), fica claro que ainda precisamos entender muito sobre os mecanismos pelos quais simplesmente percebemos o mundo que está ao nosso redor. Ou talvez um dia tenhamos a certeza de que, desde sempre, apenas representamos internamente o que é percebido externamente. Pelo menos é isso que os estudos sobre atenção e memória sugerem cada vez mais fortemente.
- 148. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 138 Julho/2010
- 149. Neurociências Julho/2010 Pág. 139 Memóriae seus aspectos evolutivos Leopoldo Barletta Marchelli Laboratório de Neurociência e Comportamento leopoldo.barletta@gmail.com Das propriedades que emergem da organização e funcionamento do sistema nervoso, a memória é tida como um dos resultados mais fascinantes. O que demonstra a presença de memória em um organismo é a capacidade que ele tem de alterar seu comportamento em virtude de experiências anteriores. Essa propriedade manifesta-se em humanos de diferentes maneiras, por exemplo, na execução habilidosa de uma ação motora, no relato de uma experiência de infância, na lembrança de locais específicos e pessoas conhecidas, aprendizagem de conceitos, ou no próprio uso da linguagem e suas regras. A grande capacidade de interagir com o meio e armazenar informações provenientes dele, permite que determinados organismos eventualmente aprendam sobre informações e regras ambientais relevantes (altamente informativas). Isso ocorre na medida em que o sistema nervoso reage a estímulos e às suas contingências espaciais (onde) e temporais (quando). Ainda sim, o sistema nervoso é capaz de detectar relações entre esses eventos e suas respostas, num processo de aprendizagem que tem como conseqüência a transformação de sua própria estrutura e funcionamento. Com o acúmulo de informações sobre experiências anteriores, organismos portadores de sistemas de memória passam a detectar regularidades e de certa forma prever o ambiente. Desta forma, podem relacionar grandes quantidades de informações passadas e presentes e selecionar quais receberão um processamento preferencial por meio do direcionamento da atenção. O fato de um organismo portar sistemas capazes de armazenar e processar determinadas informações confere a ele considerável vantagem adaptativa. Em função de experiências prévias podem flexibilizar o controle de seus comportamentos e gerar respostas mais adequadas às demandas ambientais. Isso lhes garante um repertório de soluções para os mais diversos problemas que a sobrevivência impõe Aspectos evolutivos e comportamentais Aos olhos da teoria proposta por Charles Darwin em 1859, sistemas biológicos são tidos como produtos da evolução por seleção natural, que pode favorecer o desenvolvimento de um sistema mais adaptado. Há de se ressaltar que todo o processo evolução das espécies, ocorre de maneira constante, lenta e gradual. Além de a seleção atuar sobre estruturas e mecanismos, ela age também selecionando comportamentos. Por exemplo, se um ambiente é relativamente simples e
- 150. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 140 Julho/2010 possui certa regularidade, a seleção natural pode favorecer indivíduos que sejam capazes de gerar “previsões” de tal ambiente e responder de maneira antecipatória. Neste caso esses indivíduos estariam então mais aptos para tal ambiente. Se, no entanto, a complexidade de tal ambiente aumentar, a imprevisibilidade pode tornar-se um problema. Indivíduos que tiverem um sistema mais flexível, capaz de obter e armazenar o máximo de informações relevantes sobre o ambiente, estarão mais aptos a reagirem prontamente a estímulos ambientais. Assim sendo, serão capazes de solucionarem problemas de maneira antecipatória quando um padrão regular puder ser identificado. O comportamento antecipatório baseia-se na combinação de informações temporais e espaciais. A habilidade de adquirir e armazenar tais conhecimentos pode favorecer a previsão de eventos e suas conseqüências que necessariamente determinam uma ação (resposta a esse evento). Uma vez gerada a previsão de um evento, artifícios antecipatórios possibilitam que planos de ação sejam elaborados antes mesmo da ocorrência desse evento. Em outras palavras, além de planejar uma ação antes de sua execução, fazendo uso de processos antecipatórios, o individuo pode responder a um estímulo de maneira antecipada. Do ponto de vista evolutivo, isso pode ser altamente vantajoso, pois isso possibilita avaliar consequências futuras de ações correntes, sem comprometer de algum modo a integridade do sistema no desempenho da ação. A evolução do sistema nervoso, sobretudo dos processos de memória, parece estar relacionada com a idéia do desenvolvimento de sistemas seletivos capazes de lidar com diferentes demandas ambientais que surgem ao longo vida do individuo. Tais demandas sugerem a existência de diferentes sistemas de memória, que podem ser caracterizados como especializações adaptativas que lidam com problemas específicos do animal no seu ambiente. Eventualmente adaptações que servem para a resolução de um dado problema, podem não ser tão efetivas assim para outros problemas também presentes no ambiente. No entanto, o surgimento de diferentes sistemas de memória, com regras de operações essencialmente diferentes, faz com que indivíduos possam lidar com uma grande variedade de problemas. Indivíduos capazes de identificar estímulos, prever o ambiente e gerar as “inferências” e respostas mais adequadas, se beneficiarão; estarão mais aptos para determinado ambiente. Portanto, a resolução de problemas e a emissão de comportamentos antecipatórios, ações essas baseadas em experiências anteriores, conferem ao repertório comportamental do organismo alto valor adaptativo. Uma vez que a emissão de determinados comportamentos diante de algumas situações traz ganhos adaptativos, parece razoável considerar que a memória seja um dos resultados de maior sucesso ao longo da evolução biológica. Suporte aos sistemas de memória
- 151. Neurociências Julho/2010 Pág. 141 Ofuncionamento dos sistemas de memória implica no armazenamento de uma quantidade substancial de informações sobre o ambiente, sobre suas regularidades e sobre os efeitos de ações anteriores. Essas informações ficam inteiramente armazenadas no sistema nervoso do indivíduo. Assim, os sistemas de memória são claramente dependentes da estrutura e do funcionamento do sistema nervoso, que por sua vez, possui bilhões de neurônios, células nervosas capazes de conduzir impulsos elétricos e processar informações. Além disso, as conexões entre os neurônios podem estar arranjadas de diversas maneiras para formar circuitos definidos. Levando em consideração tais possibilidades de combinação, é possível imaginar a complexidade dos substratos que armazenam informações no sistema nervoso. Basicamente o processamento neuronal recebe a informação, avalia e passar o sinal a outros neurônios. Uma mensagem passa de um neurônio para outro através de sinapses. Cada neurônio envia projeções para milhares de outros neurônios e, por sua vez, recebe projeções de outros milhares de neurônios. Por essa projeções passam sinais que ativam o sistema de diferentes maneiras. Quando muitos sinais sinápticos de entrada são transformados em um único sinal de saída, temos um processo de computação neural. Alguns desses sinais de saída podem provocar aumento da ativação de algumas vias e uma diminuição em outras, deste modo, sinais de entrada combinam-se de maneira a gerar informações muito mais elaboradas do que uma simples somação de sinais. É nesse momento que ocorre modulação do processamento de informações. Conectadas aos neurônios, há células especializadas para a recepção de informações ambientais (receptores sensoriais), que transformam diferentes formas de energia (e.g. luz, som, odores etc.) em potenciais elétricos, isto é, estímulos de diversas naturezas que se transformam em sinais elétricos, influenciando assim tanto a atividade elétrica quanto a química dos neurônios. Essas informações sensoriais, sob a forma de impulsos elétricos, são transmitidas por circuitos definidos do sistema nervoso, havendo circuitos neurais dedicados ao processamento preferencial de informações de cada uma das modalidades sensoriais, e outros circuitos responsáveis pela integração de informações de diferentes modalidades sensoriais. Aspectos fisiológicos da memória Pressupõe-se que a atividade eletrofisiológica, gerada por atividade espontânea, estímulos ambientais e respostas a esses estímulos, desencadeie processos que levam à alteração da conectividade entre células nervosas, alterando a transmissão de impulsos elétricos por esses circuitos neurais. Todas essas modificações provocadas em elementos constituintes do sistema nervoso caracterizam (representam) assim o armazenamento de informações, as memórias. Uma decorrência lógica dessa suposição é que seja possível
- 152. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 142 Julho/2010 detectar a ocorrência de alterações bioquímicas associadas à alteração da conectividade nervosa relacionada ao processo de formação de memórias. O conhecimento atual sobre memória é resultado do trabalho de inúmeros personagens. Gold e colaboradores (1970) expuseram ratos a uma câmara clara conectada, por uma porta tipo guilhotina, a uma câmara escura cujo assoalho é constituído de barras metálicas eletrificáveis. Os ratos rapidamente entram na câmara escura; após entrarem nessa câmara, levam um choque nas patas. Em uma etapa de teste, realizada 24 horas depois, os animais inseridos na câmara clara não entram na câmara escura (ver a barra vermelha da Fig. 1). Animais de um grupo controle, que não receberam choque nas patas no dia anterior, entram rapidamente na câmara escura (ver barra verde da Fig. 1). Em experimentos adicionais, depois do treinamento com choque nas patas, foram aplicadas correntes elétricas no sistema nervoso dos animais com diferentes intervalos de tempo entre o choque na pata e o choque eletroconvulsivo (ver Fig. 1 - esquerda). Observa-se que quanto menor o intervalo de tempo entre o choque nas patas e o choque no sistema nervoso, maior é o prejuízo de memória aversiva sobre o ambiente escuro. À medida que esse intervalo de tempo aumenta, menor é o efeito, como se o choque eletroconvulsivo perdesse sua efetividade para evitar sua consolidação. (ver Fig. 1 – direita: barras de cor laranja). Figura 1 – Experimento de Gold e colaboradores (1970). A organização temporal dos eventos (esquerda) e os resultados (direita): o tempo que os ratos submetidos aos diferentes tratamentos demoraram para entrar na câmara escura – quanto menor o intervalo de tempo entre o choque nas patas e o choque eletroconvulsivo menor é a lembrança do evento aversivo. Modificado de Pavão (2009), Xavier (2004) e Gold (1970). Outro experimento que trata de questões fisiológicas sobre a memória foi feito por Shashoua (síntese publicada em 1985). O experimentador prendeu um flutuador nas nadadeiras peitorais de peixinhos dourados para fazer com que os animais ficassem em posição desconfortável. Após longo esforço de cerca de 3 horas, alguns peixes voltaram à posição normal, apesar do flutuador (Fig. 2, treino inicial representado pela curva verde). Se Intervalo de tempo entre choque nas patas e choque eletroconvulsivo (S).
- 153. Neurociências Julho/2010 Pág. 143 oflutuador for removido e recolocado três dias depois, os animais realizam a tarefa mais rapidamente; i.e., os peixes retornam à posição normal em apenas 15 minutos, o que indica que eles aprenderam e retiveram a solução desse desafio (Fig. 2, curva azul) (para detalhes sobre esses experimentos, ver Helene e Xavier, 2007). Em outro teste, Shashoua (1985) injetou valina marcada com hidrogênio radioativo (valina-H*) no ventrículo encefálico de animais que ficaram por 4h com o flutuador, e valina marcada com carbono radioativo (valina-C*) no ventrículo de animais que não foram treinados. Os encéfalos dos animais dos dois grupos foram homogeneizados conjuntamente e as proteínas foram separadas por peso molecular. A maioria das proteínas presentes estava marcada tanto com valina-H* quando com valina-C*; porém, algumas delas estavam mais marcadas com valina-H*, indicando que elas foram incorporadas no cérebro dos animais que aprenderam a tarefa; essas proteínas foram denominadas ependiminas. Num terceiro teste, as ependiminas foram isoladas e injetadas em coelhos para produção de anticorpos específicos contra as ependiminas. Então, os anticorpos foram injetados no ventrículo encefálico de peixes que tinham acabado de aprender a tarefa de nadar com o flutuador; no teste de memória realizado 3 dias depois, esses peixes demoraram cerca de 3h para voltar à posição normal (Fig. 2, curva vermelha). Ou seja, esses animais comportaram-se como se nunca tivessem sido submetidos ao treinamento. Atualmente, as ependiminas são denominadas “moléculas de adesão celular” e estão diretamente relacionadas com o fortalecimento e formação de sinapses. Figura 2 – Experimentos de Shashoua (1985) envolvendo aprendizagem em peixes dourados. Flutuadores foram presos aos animais, que em ficavam em posição desconfortável (esquerda, acima). com treino de cerca de 180 minutos, ficavam em posição confortável (esquerda, abaixo) – curva verde. Em segundo momento, 3 dias depois, os flutuadores foram recolocados, e os animais demoraram cerca de 15 minutos para ficar na posição confortável, indicando que aprenderam essa habilidade – curva azul. Animais treinados tratados com anticorpos para proteínas envolvidas com a alteração de circuitos neurais apresentam desempenho similar a animais não tratados – os traços de memória foram apagados pelo tratamento. Modificado de Pavão (2009), Xavier (2004) e Shashoua (1985). Em conjunto, os resultados obtidos a partir de experimentos envolvendo choques eletroconvulsivos e síntese de proteínas sugerem que há dois processos envolvidos na
- 154. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 144 Julho/2010 manutenção da memória. Um deles, mais instável, é prejudicado pelo choque eletro- convulsivo, estando relacionado ao padrão de atividade eletrofisiológica dos neurônios (frequência de disparos, por exemplo). O outro, associado com produção de proteínas, parece envolver alterações estruturais nas sinapses, gerando circuitos alterados no sistema nervoso. Posteriormente ao experimento de Shashoua, muitos trabalhos com proteínas associadas aos processos de arquivamento de informação ao nível celular vêm sendo desenvolvidos. Muitas moléculas subjacentes à formação de memória já foram descobertas. Isso tem trazido importantes informações acerca das diferentes etapas e modalidades do processo de formação de memórias em nível celular, inclusive o envolvimento dessas proteínas na alteração plástica do sistema nervoso. Plasticidade neural O sistema nervoso possui a capacidade de se modificar estruturalmente e funcionalmente em decorrência de estímulos que de algum modo incidem sobre ele. Tal fenômeno denomina-se neuroplasticidade ou, simplesmente, plasticidade. Inerente ao funcionamento do sistema nervoso, a neuroplasticidade é uma característica marcante e constante da função neural. Muito dos processos cognitivos depende de tal propriedade. Parece haver dois tipos básicos de plasticidade sináptica, uma de curta duração e a outra de longa duração. A plasticidade sináptica de curta duração pode ser induzida rapidamente; parece não requerer síntese proteica e mantém-se por, no máximo, algumas horas. Esse tipo de plasticidade reflete alterações na força de sinapses pré-existentes, pela modificação de proteínas pré e pós-sinápticas. Diferentemente, a plasticidade sináptica de longa duração (que parece ter sido a modalidade principal investigada nos estudos de Shashoua) dura dias, meses ou anos, envolve processos de transcrição gênica e síntese de novas proteínas; esse tipo de plasticidade sináptica parece envolver a remodelação de sinapses existentes ou a formação de novas sinapses. Com base nessas e em outras características do sistema nervoso apresentadas até aqui, percebe-se que além de aumentar a capacidade de comunicação entre as diversas populações de neurônios, sua estrutura e funcionamento possibilitam a formação de memórias em decorrência de experiências vividas. As diferentes modalidades de arquivamento parecem envolver alguns tipos de alterações no sistema: (1) alterações transitórias na atividade eletrofisiológica (taxa de disparos) de populações de neurônios, que estariam ligadas ao arquivamento por curtos períodos de tempo; (2) alteração na facilidade com que a atividade eletrofisiológica é transmitida entre neurônios, relacionada com o arquivamento por períodos intermediários de tempo (que pode durar de minutos até meses); (3) alterações estruturais permanentes na conectividade neuronal que levam à formação de
- 155. Neurociências Julho/2010 Pág. 145 circuitosneurais, ou redes nervosas, cuja atividade representaria informações mantidas por um longo período de tempo, anos ou até mesmo uma vida inteira. Aquisição e manutenção da memória Donald Hebb (1949) baseou-se na plasticidade sináptica para afirmar que a transmissão de informações entre dois neurônios deveria ser facilitada e tornar-se estável quando ocorresse sincronia entre os disparos do primeiro e do segundo neurônio. Sendo assim, a transmissão de mensagens entre os neurônios poderia ser regulada: não seria um fenômeno rígido e imutável, mas sim algo modulável de acordo com as circunstâncias. Um importante elemento descrito inicialmente no hipocampo que atua na alteração de sinapses (portanto, na formação de memórias) é o fenômeno denominado potenciação de longa duração (LTP). Aparentemente, o hipocampo (e outras estruturas do lobo temporal medial) está envolvido em um processo de ativação repetitiva de circuitos envolvidos na representação da informação que determina alteração estrutural desses circuitos. Em outras palavras, estimulações breves e de alta freqüência em uma via excitatória que vai ao hipocampo produz um aumento de longa duração na intensidade das sinapses estimuladas. Trata-se de uma plasticidade sináptica específica que ocorre entre um neurônio pré e um neurônio pós-sináptico, assim como Hebb havia proposto. Acredita-se que a LTP seja um importante mecanismo envolvido no armazenamento de informações cuja natureza é essencialmente associativa. Tal mecanismo pode envolver a interação entre diferentes sinapses de um mesmo neurônio, permitindo que uma sinapse fraca se fortaleça pelo disparo concomitante com uma sinapse forte, tornando-as associadas. Sendo assim, a LTP é fundamental para o arquivamento de informações sobre eventos experienciados, pois gera uma facilitação na comunicação sináptica. Esse processo parece essencial para a retenção de informações sobre “o que” ocorreu, mas não sobre “como” desempenhar uma tarefa perceptomotora. Com o aumento na frequência de disparos das sinapses produzidas em decorrência de estímulos ambientais, ocorrem alterações na eficiência sináptica dos neurônios recrutados, de maneira a intensificar a comunicação dessas células. Uma vez que a comunicação sináptica seja facilitada, qualquer referência ao estímulo inicial já causa um disparo das células envolvidas. Com estímulos muito pequenos pode-se desencadear um processo efetivo de ativação neural. Estímulos ambientais e experiências geram atividade eletrofisiológica em conjuntos de neurônios. Como vimos, essa atividade pode levar à formação de novas sinapses ou à alteração das sinapses já existentes, o que permite estabelecer circuitos neurais envolvendo populações de neurônios cuja atividade, correspondente àquela gerada durante a experiência original, representa a experiência adquirida.
- 156. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 146 Julho/2010 A recordação de informações representadas internamente se dá pela ativação eletrofisiológica de populações de neurônios corticais. Isso decorre tanto estímulos que de alguma forma estão relacionados à experiência original, como por um ato de vontade para recordar aquela experiência. É curioso notar que os sistemas de memória permitem identificar estímulos muito específicos e responder a eles, mesmo quando estes não são apresentados em sua totalidade. Uma vez ativos, esses circuitos podem estabelecer novas conexões com outros circuitos ativos, ou contar com a adição de novos elementos em decorrência de novas experiências. Quanto mais frequentes as exposições a estímulos relevantes, mais fortes tornam-se as conexões. Como consequência, a informação tende a ser arquivada de maneira relacional. Isso permite entender porque a recordação envolve, usualmente, categorias. Tal fato ocorre porque o aumento de atividade eletrofisiológica em determinados circuitos neurais (que levam à recordação de uma dada informação) tende a estimular a atividade em circuitos relacionados. É importante ressaltar que os mesmos circuitos neurais associados à atenção, percepção, ação e outros processos cognitivos, são os que se alteram para a formação de memórias de diferentes tipos. Isso significa que, quando esses circuitos forem posteriormente mobilizados, o processamento das informações será diferente em relação às experiências anteriores, dado que o circuito vem sendo alterado a cada uma delas. Assim sendo, a percepção e as habilidades se alteram ao longo da história de vida. Além disso, estão profundamente associadas com os processos de memória. Redes neurais e memória Praticamente todas as regiões do sistema nervoso estão envolvidas de alguma forma no arquivamento de memórias de um tipo ou de outro. Em primatas, costuma-se atribuir uma grande importância ao neocórtex (a porção filogeneticamente mais recente do córtex) no arquivamento de informações. Esse tecido envolve sistemas de processamento modalmente específicos e sistemas de integração de informações de diferentes modalidades (denominados polimodais e supramodais). A maioria das experiências humanas inclui diferentes modalidades sensoriais, organizadas no tempo e espaço. Por exemplo: a partir de uma estimulação perceptual específica, o sistema nervoso mobilizaria um grupo de neurônios para representar o evento, por meio de sua atividade e conexões, produzindo uma espécie de "rede" de interconexões que se mantém em contínua reconstrução ao longo da vida. A formação de uma memória sobre esse evento envolveria o fortalecimento das conexões entre as células dedicadas a essa percepção, resultando num grupamento celular cujas conexões seriam mais eficientes. Depois do desaparecimento do estímulo gerador da atividade, "nós" da rede, quando
- 157. Neurociências Julho/2010 Pág. 147 ativados,excitariam ou inibiriam outros nós numa rica e complexa rede de conexões, de forma que representações seriam mantidas enquanto houvesse reverberação da atividade nervosa correspondente ao estímulo inicial. Nessa rede, uma dada população de nós disparando, provavelmente com níveis de atividade diferentes em várias regiões nervosas, representa uma determinada informação, enquanto a malha representa as ligações associativas das relações entre os nós; essas ligações podem variar em intensidade. Nesse sentido, um mesmo nó pode estar envolvido em representações distintas, já que a informação é representada pelo conjunto de disparos dos nós a ela relacionados e não por um nó individual. Isso nos sugere que processos de memória estariam baseados em um funcionamento sistêmico de determinadas populações de neurônios. Hebb (1949) propõe algumas previsões sobre o funcionamento da memória. Por exemplo, parece plausível pensar que estimulações parciais correspondentes à experiência original sejam capazes de regenerar a atividade em toda a rede, contribuindo para a lembrança completa da experiência original. Além disso, se dois eventos forem pareados no tempo supõe-se que haja a formação de redes tais que a estimulação da atividade do primeiro evento gera o padrão de atividade eletrofisiológica associada ao segundo evento, levando à sua previsão. Figura 3 - Esquema representativo de redes neurais de Hebb. Os pontos pretos são os neurônios e as linhas são as conexões. A rede tem uma organização inicial como representado em (A); ao receber um estímulo, é ativada (B); esse estímulo pode ser apresentado repetidas vezes, ou pode ter reverberado nessa rede, de modo que as conexões entre os neurônios são fortalecidas (C e D); então, um estímulo mais fraco ou mesmo incompleto, mas que mantenha algumas das características do inicial (D) é capaz de ativar a rede fortalecida (E). Modificado de Bear, 2002, e de Helene e Xavier, 2007. O autor sugere que haveria apenas três aspectos centrais que determinariam o funcionamento de um sistema neuronal: (1) a conexão entre neurônios é mais eficaz quanto maior for o grau de relação entre as porções pré e pós-sináptica; (2) grupos de neurônios que tendem a disparar conjuntamente irão formar agrupamentos celulares cuja atividade se mantém expressa mesmo após o fim do estímulo que gerou a atividade e; (3) cognição deriva da atividade sequencial destes agrupamentos celulares facilitados.
- 158. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 148 Julho/2010 Modularidade e os diferentes processos de memória A noção de que os sistemas de memória compõem um conjunto de habilidades mediadas por diferentes módulos do sistema nervoso, que funcionam de forma independente, porém cooperativa, parece atualmente bem difundida. Essa idéia parte do pressuposto de que a organização cognitiva se dá de forma modular, representada por sistemas paralelos de processamento de diferentes informações. Este conceito de modularidade de funções tem embasado investigações acerca dos processos de memória. Segundo essa ideia, o processamento de informações nesses módulos acontece de forma paralela e distribuída, possibilitando que um grande número de unidades de processamento influencie outras em qualquer momento no tempo, e que grande quantidade de informações seja processada concomitantemente. Muitas das evidências relevantes para o desenvolvimento de modelos de memória - correlações entre funções e módulos do sistema nervoso – derivaram de correlatos anatomofuncionais, isto é, estudos envolvendo dificuldades de memória em pacientes com danos cerebrais identificáveis. A partir de então foi possível chegar a definições de memória e modelos baseados na dupla dissociação entre memória de curta e longa duração. Inclusive os conceitos de dissociações entre os sistemas particulares da memória de longa duração foram também amplamente desenvolvidos. Um estudo que muito contribuiu para o desenvolvimento e formalização dos modelos de memória foi o caso do paciente H.M., descrito por Scoville e Milner (1957). Na ocasião, o paciente sofria de epilepsia intratável. O foco epiléptico, que se situava no lobo temporal medial (bilateralmente), foi removido cirurgicamente; isso resultou na remoção dos 2/3 anteriores do hipocampo e da amígdala, além de outras porções corticais. Após a remoção das estruturas, H.M. apresentou um quadro de amnésia anterógrada (era incapaz de formar novas memórias) e também retrógrada (eventos ocorridos pouco antes da cirurgia); porém, neste último caso a amnésia era temporalmente graduada. O prejuízo cognitivo de H.M. estava restrito à aquisição de memórias de longa duração; suas capacidades perceptuais se mantiveram, assim como seu QI, sua personalidade e a memória de curta duração. Mesmo apresentando alguns prejuízos de memória, H.M. ainda conseguia adquirir e reter diversas informações. Por exemplo, aprendeu a ler palavras invertidas, como se apresentadas por meio de um espelho e também novas habilidades motoras e cognitivas (ver Helene e Xavier, 2007). O paciente apresentava um bom desempenho nessas tarefas. Curiosamente, quando consultado sobre seu treinamento prévio, ele alegava nunca ter feito isso. Como dito anteriormente, o hipocampo atua em um processo de ativação repetitiva de circuitos envolvidos na representação da informação, uma espécie de reverberação da
- 159. Neurociências Julho/2010 Pág. 149 atividadeneural que resulta no arquivamento de informação. Essa reverberação seria essencial para o arquivamento das informações sobre “o que” ocorreu, mas não sobre “como” desempenhar uma tarefa perceptomotora. Trazendo esse conceito para o caso do paciente H.M, pode-se dizer que, embora o paciente seja capaz de adquirir uma habilidade motora, ele não é capaz de se recordar “que” já a praticou. Em suma, a natureza da informação “saber que” é diferente da natureza da informação sobre “saber como” (ver Helene e Xavier, 2007). Curiosamente, pacientes com doença de Parkinson (caracterizada por disfunções em estruturas nervosas denominadas gânglios da base) possuem um quadro oposto ao dos amnésicos (que, como visto, têm lesão no lobo temporal medial). Os pacientes com disfunções nos gânglios da base exibem dificuldades na aquisição de habilidades motoras e cognitivas, ao mesmo tempo em que são perfeitamente capazes de descrever verbalmente as experiências vivenciadas nessas situações de teste. Neste contexto, pacientes parkinsonianos exibem, por exemplo, prejuízo na aprendizagem da habilidade de leitura de palavras invertidas. Duplas dissociações, caracterizadas pelo prejuízo de desempenho em algumas tarefas concomitantemente ao desempenho normal em outras tarefas, são apontadas como evidência da existência de sistemas de memória distintos no sistema nervoso. Resultados de estudos como do paciente H.M. e pacientes parkinsonianos sugerem a existência de módulos de memória cujo funcionamento seria relativamente independente, embora possam cooperar entre si. Modelos de memória Baseados em estudos envolvendo duplas dissociações, Cohen (1984) e Squire e Zola-Morgan (1991) propuseram uma distinção para os sistemas de memória de longa duração segundo a qual haveria uma memória declarativa (ou explícita), usualmente prejudicada em pacientes amnésicos e preservada em pacientes cerebelares ou com disfunções nos gânglios da base, e uma memória de procedimentos (ou implícita), usualmente preservada nos pacientes amnésicos, mas prejudicada nos pacientes cerebelares ou com danos nos gânglios da base (Fig. 4). Em outras palavras, memórias que atualmente são denominadas memórias implícitas correspondem ao “saber como” (o que faz bastante sentido, pois é muito difícil declarar como se anda de bicicleta) e “saber que” são denominadas memórias explícitas.
- 160. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 150 Julho/2010 Figura 4 – Esquema da dupla-dissociação entre funções e áreas envolvendo os sistemas de memória de longa duração. (modificado de Helene e Xavier, 2007). Memória de longa duração A memória de longa duração se refere à retenção de informações por prolongados períodos de tempo. Sendo assim, ela pode ser dividida em dois tipos (ou módulos): memória explícita e memória implícita (Fig. 5). Tanto no caso das memórias explícitas como no caso das implícitas, o arquivamento de informações envolveria alterações sinápticas, como já descritas; porém, em cada caso, elas ocorreriam em diferentes regiões do sistema nervoso com diferentes regras de funcionamento. A memória explícita (ou declarativa) caracteriza a retenção de experiências sobre fatos e eventos passados e é passível de relato verbal, ou seja, possui um acesso consciente. Além disso, o arquivamento de informações pode se dar por associações arbitrárias que podem formar-se mesmo após uma única experiência. A memória implícita (ou de procedimentos) se expressa pelo desempenho habilidoso das atividades previamente treinadas. Sua aquisição é gradual e dependente de treino, ocorre de forma cumulativa. O conhecimento contido neste tipo de memória manifesta-se pela ativação das estruturas nervosas envolvidas no processo de aquisição. MEMÓRIA DE LONGO PRAZO SABER QUE SABER COMO Paciente H.M - amnésico PREJUÍZO Paciente H.M - amnésico PRESERVADO Paciente c/ doença de Parkinson - PRESERVADO Paciente c/ doença de Parkinson - PREJUÍZO Í
- 161. Neurociências Julho/2010 Pág. 151 Figura5 - Taxonomia dos sistemas de memória de longa duração. Modificado de Helene e Xavier, 2007. Memória operacional Baddeley e Hitch (1974) conceberam um modelo de memória denominado "memória operacional". Tal modelo refere-se a um arquivamento temporário e gerenciamento de informações para o desempenho de uma diversidade de tarefas cognitivas. Segundo os autores, memória operacional compreende um sistema de controle de atenção, a central executiva, auxiliado por dois sistemas de suporte responsáveis pelo arquivamento temporário e manipulação de informações, um de natureza vísuo-espacial e outro de natureza fonológica. Posteriormente, para lidar com a associação entre as informações mantidas nesses sistemas de apoio e promover sua integração com informações da memória de longa duração, Baddeley inseriu um quarto componente no modelo, denominado de retentor episódico, que corresponderia a um sistema de capacidade limitada no qual a informação evocada da memória declarativa tornar-se-ia consciente. A central executiva proporcionaria a conexão entre os sistemas de suporte e a memória de longa duração e seria o responsável pela seleção de estratégias e planos; sua atividade estaria relacionada ao funcionamento do lobo frontal, que teria a função de supervisionar informações a serem codificadas, armazenadas e evocadas concomitantemente ao seu ingresso no sistema (Fig. 6).
- 162. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 152 Julho/2010 Figura 6 - Modelo de memória operacional: três componentes propostos inicialmente por Baddeley e Hitch (1974). A área central executiva se refere ao componente de gerencia-mento atencional (a central executiva), enquanto as áreas laterais da figura representam as alças de manutenção de informações por curto período de tempo (adaptado de Baddeley, 1982). Ainda sim, a memória operacional estaria ligada ao desempenho de uma grande variedade de funções cognitivas, incluindo raciocínio lógico, resolução de problemas, imagética (relacionado ao treinamento imaginativo) e compreensão de linguagem. Considerações finais Em conclusão, a evolução filogenética teria atuado na seleção de sistemas neurais capazes de modificar-se gradualmente pelo desempenho de ações repetitivas (o exemplo mais típico seria o caso de habilidades motoras e perceptuais) de sistemas capazes de arquivar informações depois de uma única experiência, e de sistemas capazes de reter informações temporariamente, enquanto úteis. É provável que a seleção desses sistemas, com propriedades distintas, esteja relacionada ao fato de que memórias são especializações adaptativas que proporcionam vantagens seletivas para a solução de determinados tipos de problema; as propriedades que tornam um sistema eficiente para a solução de determinados tipos de problema (e.g., aquisição após uma única experiência de treino) o tornam incompatíveis com a solução de um problema de natureza diversa (e.g., aquisição de conhecimento pela mudança cumulativa e gradual de experiências). Assim, do ponto de vista evolutivo, a organização do sistema nervoso, inclusive dos diferentes módulos de memória, teria derivado da interação do organismo com demandas ambientais específicas, resultando em especializações adaptativas que permitem ao organismo lidar com problemas específicos.
- 163. Neurociências Julho/2010 Pág. 153 NavegaçãoEspacial Cyrus Villas-Boas Laboratório de Neurociência e Comportamento cyrusvb@gmail.com O debate sobre o hipocampo O hipocampo é uma das estruturas cerebrais mais estudadas na Neurociência. Ramón y Cajal (1968) data seus estudos como tendo começado em 1888 e cita os estudos de Schaffer em 1892 como tendo sido um marco em sua vida científica. Anatomicamente organizado em camadas, o hipocampo é claramente identificável como sendo diferente do córtex (Ramón y Cajal, 1968; Witter e col., 1989) (Fig. 1). Figura 1 – corte coronal do encéfalo de rato corado com cresil violeta, mostrando o giro denteado (DG) e o hipocampo (CA1 e CA3). Adaptado de Paxinos e Watson (2004). No rato, o hipocampo se localiza logo abaixo do córtex parietal, o que torna sua parte dorsal facilmente acessível por eletrodos e cânulas de infusão de drogas. Dois aspectos chave levaram o hipocampo a ser uma das estruturas mais estudadas da Neurociência: 1. Em ratos. Quando o animal se move livremente, as células piramidais do hipocampo apresentam uma correlação com o local em que o animal se encontra (O’Keefe e Dostrovsky, 1971). Essas células são chamadas de células de localização (place cells) e apresentam atividade em uma parte específica do ambiente, como veremos a seguir em detalhes. Centenas, se não milhares de experimentos, já analisaram a influência de diversos tipos de manipulações nas place cells. 2. Em primatas. Lesões do hipocampo e áreas corticais adjacentes em primatas (particularmente em humanos) causam uma profunda amnésia anterógrada, ou seja, a perda da capacidade de formar novas memórias a partir do momento em que houve a lesão
- 164. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 154 Julho/2010 (Scoville e Milner, 1957; Cohen e Eichenbaum, 1993). Entre os anos de 1953, quando fez uma operação experimental no lobo temporal, e 2008, ano de sua morte, o paciente H.M. não conseguia se lembrar (formar memórias do tipo declarativa) de nada o que havia acontecido, nem mesmo dos nomes dos médicos que encontrava diariamente (Cohen e Eichenbaum, 1993). Cada um desses efeitos observados no hipocampo vieram a formar uma teoria: (1) que o hipocampo guarda um mapa cognitivo do ambiente utilizado para navegação (O’Keefe e Nadel, 1978) (Fig. 2), e (2) que o hipocampo guarda memórias de eventos (do tipo episódicas) temporariamente até seu armazenamento no córtex (Cohen e Eichenbaum, 1993). Figura 2. – Esquema de representação do mapa cognitivo no rato. Adaptado de Eichenbaum (1999). Tipos de navegação Vamos começar nossa discussão sobre navegação espacial com a tarefa mais tradicional: o labirinto aquático de Morris (1981) (Fig. 3). Esse teste consiste de uma piscina cheia de água morna misturada com leite ou outra substância que torne a água opaca. Em algum lugar da piscina há uma plataforma na qual o rato pode subir para sair da água. Há várias versões desse teste, que incluem a plataforma visível ou, outras vezes, com uma pista que indica onde a plataforma está. Devido à sua simplicidade, esse teste é uma das ferramentas mais utilizadas para estudos de navegação e memória espacial. O labirinto de Morris é usado, entre outros, para estudos de lesões, infusões de drogas ou, em outras vezes, versões modificadas são utilizadas para o registro unitário da atividade neuronal de place cells, como veremos mais adiante.
- 165. Neurociências Julho/2010 Pág. 155 Figura3 – Labirinto aquático de Morris. O círculo indica a plataforma escondida ou não. O gráfico mostra o tempo despendido no labirinto para que o animal encontre a plataforma. O teste probe- memory não contém plataforma e o probe-sensorimotor é um teste de habilidade motora. Adaptado de Rodriguiz e Wetsel (2006). Há cinco possíveis estratégias que o animal pode utilizar para navegar no ambiente e, nesse caso, encontrar a plataforma escondida (O’Keefe e Nadel, 1978; Whishaw e Mittleman, 1986). São elas: Navegação randômica. Se o animal não tem informação prévia de onde a plataforma está, ele deve explorar o ambiente de forma randômica, aleatória. Navegação táxica. O animal pode achar uma pista em uma direção na qual possa sempre nadar. Navegação práxica. O animal pode executar um programa motor constante. Se, por exemplo, o animal inicia cada tentativa no mesmo local e a patforma também está no mesmo local, ele pode simplesmente utilizar-se desse tipo de navegação para chegar à plataforma. Navegação por rota. O animal pode aprender a associar uma direção a uma pista encontrada. Diz-se que a navegação por rota é uma junção das navegações táxica e práxica. Navegação por local. O animal pode aprender a localização da plataforma baseado em um conjunto de pistas. Ele pode aprender um mapa no qual a localização da plataforma é conhecida.
- 166. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 156 Julho/2010 Outros modelos foram propostos, porém são todos parecidos no que diz respeito às funções dos sistemas, ou seja, alguns modelos são simplesmente a fusão de dois ou mais tipos de navegação supracitados. Gallistel (1990) propõe um modelo no qual dois componentes são utilizados para que o animal se localize no ambiente: Piloting e Dead Reckoning. O piloting é um processo pelo qual o animal determina sua posição através de pistas externas, enquanto o dead reckoning é um mecanismo que utiliza pistas internas, como direção de movimento e velocidade, para atualizar a representação de acordo com essas pistas. Dessa forma, esse sistema permite que sejam usadas pistas internas e externas. Pistas externas são identificadas e usadas para traçar um mapa de acordo com algum conhecimento do ambiente, porém sem perceber a posição; as pistas internas permitem que o animal calcule sua posição em um tempo t de acordo com uma posição conhecida em t-to sem precisar de conhecimento sobre o ambiente. Qual é o papel do hipocampo na navegação espacial? Para navegar em um ambiente familiar, o animal deve usar uma representação consistente da posição de tempos em tempos. Para tanto, há um mecanismo fisiológico que é capaz de, utilizando-se das pistas externas e internas, gerar um mapa coerente do ambiente no qual o animal se encontra. As evidências sugerem que as place cells no hipocampo são muito bem adaptadas para lidar com esse tipo de informação. Potenciais de ação disparados por células piramidais do CA3 e CA1 do hipocampo, além de células do giro denteado e córtex entorrinal mostram que há atividade fisiológica relacionada ao local em que o animal se encontra em determinado ambiente. Os locais onde as place cells apresentam atividade são chamados de place fields (Fig. 4). Estudos em humanos mostram que o fluxo sanguíneo aumenta no hipocampo durante uma tarefa de localização espacial, tanto no ambiente real como em ambiente virtual (Ghaem e col., 1997; Maguire e col. 1998) e que lesões nessa região causam déficit severo em tarefas de navegação, possivelmente devido à perda extensiva de place cells. Essas células foram extensivamente estudadas em ratos (Olton et. al, 1978; McNaughton e col., 1983; Eichenbaum e col., 1990; Wiener, 1996) e foram também encontradas em macacos (Ono e col., 1993; Nishijo e col. 1997; Matsumura e col., 1999) e humanos (Ekstrom e col., 1994). Devido à grande correlação entre as taxas de disparo das place cells e as variáveis espaciais, diversos trabalhos foram feitos com a finalidade de explorar como essas mudanças podem interferir na atividade dessas células.
- 167. Neurociências Julho/2010 Pág. 157 Figura4 – Em cima, atividade neuronal em spikes/s de uma place cell enquanto um macaco se movimenta num espaço virtual. VR(W), VR e VR(N) são diferentes tamanhos de ambientes similares. VR(W) e VR têm pistas distais iguais, porém em posições diferentes. VR(N) é um ambiente similar a VR, porem com menor tamanho. mesmas posições. Embaixo, as rotas que os animais faziam para passar pelos pontos demarcados. Adaptado de Hori e col. (2005). As propriedades principais das place cells são: Quando as pistas distais são movidas, place fields também se movem proporcionalmente (Hori e col. 2005). Continuam a mostrar claros place fields quando uma pista é removida (Hori e col., 2005; Furuya e col., 2007). Continuam a mostrar place fields menores no escuro (Markus e col., 1994). Apresentam diferentes place fields em diferentes ambientes (Hori e col., 2005; Furuya e col., 2007) (Fig. 4, Fig. 5). Apresentam direcionalidade quando o animal navega em espaços pequenos e conhecidos, mas são não-direcionais quando o animal navega randomicamente. Estudos mais recentes realizados com macacos mostram que, apesar de estruturas homólogas não terem necessariamente as mesmas propriedades em diferentes espécies, no caso do hipocampo parece haver alguma similaridade nas funções relacionadas à navegação. No entanto, os estudos com place cells em macacos são geralmente realizados quando o animal se encontra preso a uma cadeira para macacos e, dessa forma, imóveis (Hori e col., 2005; Furuya e col., 2007). Em outros estudos, o animal é colocado em uma Spikes/s
- 168. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 158 Julho/2010 cadeira móvel (Ono e col., 1991), mas muitas vezes esse paradigma é substituído por uma forma de navegação espacial virtual similar a um water maze, no qual o animal controla um joystick para se movimentar no ambiente (Furuya e col., 2007). Nesse paradigma, no entanto, são as pistas que se movem em relação ao animal, e não o contrario. Porém, mesmo nesses experimentos pode-se ver uma clara atividade diferencial das place cells de acordo com o local em que o animal se encontra no ambiente virtual. Maguire e col. (2000) estudaram as propriedades espaciais do hipocampo em taxistas em Londres. Foi verificado que os taxistas, em relação ao grupo controle de não- taxistas, apresentavam maior atividade no hipocampo, além de uma parte posterior aumentada em relação à do grupo controle. Figura 5 – Atividade neuronal diferencial em 3 ambientes diferentes, porém com características similares. Em A., as pistas distais estão localizadas mais afastadas de onde o animal se movimenta. Em B., as pistas encontram-se próximas e em C., o ambiente todo é reduzido, mantendo-se as proporções de B. Adaptado de Hori e col. (2005). Outros sistemas de navegação espacial Além do hipocampo, há outros sistemas que parecem influenciar no processo de navegação espacial, tanto em ratos, quanto em primatas. Ambos os animais utilizam-se de múltiplos mapas simultaneamente para se localizarem. No entanto, esses sistemas não parecem ser suficientes para que haja uma navegação eficaz. Head direction cells Um dos sistemas que pode auxiliar a navegação é o de direção da cabeça (head direction system). Células com suas taxas de disparo refletindo a direção da cabeça foram descobertas em diversas estruturas do encéfalo do rato: pós-subículo (PoS; Ranck, 1984), núcleo anterior talâmico (ATN; Taube, 1995), núcleo mamilar lateral (LMN; Leonhard e col., 1996), núcleo lateral dorsal do tálamo (LDN; Mizumori e Wiliams, 1993) e, em menor
- 169. Neurociências Julho/2010 Pág. 159 quantidade,nos córtices parietal posterior e cingulado (PPC e PCC; McNaughton e col., 1994). As head direction cells apresentam uma única direção preferida de ativação, na qual sua atividade é máxima, diminuindo à medida em que o animal move a cabeça progressivamente para longe desse ponto. As taxas de disparo dessas células não são correlacionadas ao ângulo entre a cabeça e o corpo, mas sim à orientação da cabeça em relação ao ambiente. Como a direção preferida de ativação não se altera, a célula não pode codificar informações egocêntricas em relação a uma pista, mas sim informações alocêntricas em relação a uma direção de referência. As head direction cells geralmente são sensíveis à rotação de pistas distais (Taube, 1995), evidenciado pela alteração simultânea de duas ou mais células registradas simultaneamente. Alguns autores propõem uma forma de se interpretar as head direction cells como estando dispostas em um círculo, ou seja, em um arranjo de 360º. Cada região, ou cada população de células, agiria de forma a integrar a informação advinda das head direction cells vizinhas, sendo, dessa forma, esquematizadas em um anel de ativações. Esse sistema seria auxiliado por células intermediárias que recebem informações do sistema vestibular (Fig. 6). Muitas das áreas que contêm as head direction cells estão anatomicamente conectadas. O núcleo anterior dorsal do tálamo (AD) e o PoS estão diretamente conectados; PoS envia uma projeção ao LMN, que, por sua vez, se projeta para o AD. O LDN também se conecta com o PoS. O PPC recebe projeções do LDN e manda projeções para o PoS e para o córtex cingulado, enquanto o PCC se conecta diretamente com o ATN e PoS. Grid cells Como uma interface entre o hipocampo e o neocórtex, o córtex entorrinal apresenta também alguma atividade relacionada a memória e a localização. Estudos recentes mostram que o córtex entorrinal medial também apresenta neurônios com atividade relacionada a posicionamento (Fyhn e col., 2004). Essas células, denominadas grid cells, são assim chamadas por apresentarem um padrão de ativação independente de pistas do ambiente. Sua ativação se dá em diversos lugares do mesmo ambiente, diferentemente das place cells, seguindo um padrão triangular, ou seja, a célula dispara quando a posição do animal coincide com vértices de um grid triangular periódico que cobre toda a superfície do ambiente, com células diferentes tendo coordenadas de ativação diferentes ao longo do grid (McNaughton e col., 2006).
- 170. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 160 Julho/2010 Figura 6 – Modelo unidimensional de integração de sinal de acordo com a direção da cabeça do rato e a sua velocidade angular. a. Head direction cells arranjadas em círculo, para fins didáticos, de acordo com sua posição preferencial de disparo. Cada célula se conecta com as adjacentes. A influência de uma célua sobre a outra decresce como uma função da distância (linhas vermelhas e cinza), cores quentes representando maior taxa de disparos. b. A rotação nos sentidos horário ou anti-horário pode ser detectada por um grupo intermediário de células que recebe informações tantodo sistema vestibular quanto da orientação da cabeça por células imediatamente superiores a elas. Na ausência de movimento, as células das outras camadas estariam com ativação abaixo do limiar. Adaptado de McNaughton e col, 2006. Figura 7 - Modelo de integração de rotas. Adaptado de McNaughton e col. (2006).
- 171. Neurociências Julho/2010 Pág. 161 Osistema de grid cells, por ser menos específico do que o sistema de place cells, é tido como uma etapa anteiror à formação dos place fields no hipocampo propriamente dito, como se a informação final fosse passada ao hipocampo para a representação do ambiente. Dessa forma, acredita-se que o córtex entorrinal medial seja, junto com o sistema de head direction, um dos componentes principais para o processo de integração de rotas (dead reckoning), que é definida como a habilidade de retornar a um local de origem mesmo após ter feito um caminho tortuoso ou mesmo no escuro (Redish, 1997) (Fig. 7). Esse sistema não depende do uso de pistas externas do ambiente. No entanto, sabe-se que esse sistema acumula erros e imprecisões durante uma trajetória feita do escuro ou sob baixas condições de visibilidade. Os vários componentes desse sistema seriam utilizados para atualizar essas coordenadas antes de passar a informação para o hipocampo, onde a integração e utilização de pistas distais seria utilizada (Einevol e col., 2006) (Fig. 8). A importância evolutiva da memória episódica e da navegação espacial Como vimos, é muito difícil, ou quase impossível, dissociar navegação espacial de memória episódica, sendo a primeira apenas uma parte da segunda. Os resultados desses estudos mostram que o hipocampo deve ter uma função importante na formação de memórias do tipo episódica. A codificação de informações a respeito de lugares, certamente essencial para os processos evolutivos dos animais, é muito bem atribuída ao hipocampo nos vertebrados. Outra importante função atribuída a essa estrutura é a de codificar informação de como se chegar a lugares desejados, essencial para vários processos como busca de alimento, encontro de parceiros sexuais, localização dos melhores abrigos, etc. Da mesma forma, o conhecimento, ou a memória, de melhores épocas do ano para migração, onde se proteger do frio no inverno ou onde conseguir alimento nas estações que o precedem, em qual flor ou em qual horário conseguir mais néctar, entre outras questões adaptativas, são relacionadas ao hipocampo através dos processos de formação de memória episódica.
- 172. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 162 Julho/2010 Figura 8 – Modelo para a formação de place fields. (A) conexão entre grid cells do córtex entorrinal medial e place cells do hipocampo. Todas as place cells que contém um place field naquele ambiente recebem informação das grid cells com ativação similar. Place cells com campos de ativação menores (verde) recebem projeções da parte dorsal do córtex entorrinal, enquanto place cells com campos maiores (amarelo) são inervadas por células mais ventrais do cortex entorrinal. Interneurônios (vermelho) auxiliam na inibição e controle do sinal. As cores dentro dos place fields simbolizam as taxas de disparo. Cores quentes indicam altas taxas. (B) Os grids são construídos de acordo com três funções sinusóides com 120º de diferença entre eles. Adaptado de Einevoll (2006).
- 173. Neurociências Julho/2010 Pág. 163 Neurobiologiadas Emoções Bárbara Onishi Laboratório de Neurociência e Comportamento onishib@gmail.com O que é emoção? Medo, raiva, alegria, vergonha, tristeza e frustração são todos exemplos de emoções. De forma geral, emoção se refere a um estado mental associado a alterações fisiológicas e comportamentais eliciado por um evento externo ou interno de significância para o organismo. Uma das primeiras teorias sobre as emoções foi a levantada pelo psicólogo William James em 1884, em um artigo intitulado O que é a Emoção?. James sustentou a idéia de que as emoções são o resultado da percepção das alterações fisiológicas disparadas por eventos significativos. Por exemplo, ao nos defrontarmos com uma serpente numa mata apresentamos uma resposta de fuga, que é acompanhada por diversas alterações fisiológicas tal como aumento da pressão sanguínea e dos batimentos cardíacos, contração de diferentes músculos, aumento da sudorese, etc. Para James, essas sensações são as emoções. Se essas sensações pudessem ser eliminadas, as emoções não ocorreriam. Ou seja, segundo James, sentimos medo porque fugimos e não fujimos porque sentimos medo. A teoria de James ganhou destaque até meados de 1920, quando foi questionada pelos estudos do fisiologista Walter Cannon. Cannon sugeriu que as reações fisiológicas resultantes de emoções distintas podiam ser as mesmas. Por exemplo, alterações fisiológicas como aumento dos batimentos cardíacos e da sudorese e inibição da digestão estão presentes tanto num estado de medo quanto num estado de raiva. Portanto, se a teoria de James estivesse correta, duas emoções diferentes não poderiam estar associadas às mesmas reações fisiológicas. Ademais, Cannon observou que as alterações fisiológicas ocorrem, em geral, mais lentamente que as sensações de um estado emocional, i.e., em geral, sentimos as emoções antes mesmo de as mudanças fisiológicas a elas associadas ocorrerem. Estudos posteriores demonstraram que Cannon estava errado ao afirmar que o medo e a raiva compartilham as mesmas reações fisiológicas. Com o surgimento do pensamento behaviorista, por volta de 1910, o estudo da mente e, por conseguinte, o estudo das emoções, começou a ser considerado como não- científico. De fato, emoção era um típico exemplo dado pelos behavioristas de um tópico obscuro que deveria ser rejeitado pela comunidade científica. Por volta de 1950, a revolução cognitivista retomou a concepção de mente e surgiu, então, a ciência da cognição. Estudos sobre os mecanismos das emoções foram, então, retomados. Pesquisadores como Magda Arnold, Caroll Izard, Jaak Panksepp, Paul Ekman,
- 174. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 164 Julho/2010 Jeffrey Gray, Antonio Damasio, Richard Davidson, Edmund Rolls, entre outros contribuíram e têm contribuído com formulações teóricas sobre os mecanismos das emoções, mas a questão central levantada por James, O que é a Emoção?, ainda não tem uma resposta consensual. Por exemplo, Rolls e Gray propõem que emoções são estados eliciados por recompensas e punições. Quando um organismo emite respostas para a obtenção de um dado estímulo, nos referimos a este estímulo como recompensa. Quando, por outro lado, um organismo emite respostas de esquiva a um dado estímulo, nos referimos a este estímulo como punição. A codificação de um estímulo como recompensa ou punição seria um mecanismo do sistema nervoso na interface entre a percepção do estímulo e a produção de comportamentos e respostas autonômicas frente a ele. Esse mecanismo de atribuição de valor a estímulos do meio ambiente teria um valor adaptativo numa perspectiva evolutiva: respostas que garantem a obtenção de recompensas ou respostas que garantem a esquiva e eliminação de punições tendem a aumentar a chance de sobrevivência e o sucesso reprodutivo do indivíduo. Paul Rozin apresenta uma visão um tanto diferente, que não privilegia as respostas de aproximação e esquiva na definição de emoção. Para ele, emoções seriam estados mentais positivos ou negativos associados com alterações fisiológicas e comportamentais eliciados por estímulos com significância para o indivíduo. Segundo essa concepção, um organismo trabalha para manter ou aumentar um estado emocional positivo, e por outro lado, trabalha para reduzir, eliminar ou evitar um estado emocional negativo. Um bom exemplo que ilustra a diferença entre as visões “positivo-negativo” e “aproximação-esquiva” é a raiva, que apesar de ser um estado emocional negativo, está associada com uma resposta de aproximação, e não de esquiva. Apesar das fortes evidências contra a teoria de James, i.e., contra o papel das reações fisiológicas na produção das emoções, Damasio recentemente propôs uma hipótese bastante parecida com a teoria de James: a hipótese dos marcadores somáticos. Esse autor defende que depois que um estímulo com significância para um organismo é percebido, uma reação fisiológica (marcador somático) ocorre, a qual resulta numa sensação. Essa sensação é avaliada pelo organismo, contribuindo para a tomada de uma decisão, i.e., para a escolha de uma resposta frente ao estímulo. Esses foram alguns exemplos de hipóteses levantadas sobre os processos subjacentes às emoções. Apesar das diferenças entre elas, parece haver um consenso de que as emoções operam no sistema nervoso através de um mecanismo de atribuição de valor, seja a estímulos do meio ambiente ou às próprias sensações inerentes ao estado emocional. As emoções, de uma forma geral, são processos que facilitam a emissão de respostas apropriadas a eventos significativos ambientais e internos. Por exemplo, reações
- 175. Neurociências Julho/2010 Pág. 165 emocionaissão críticas para a emissão de respostas tais como evitar predadores e outras fontes de perigo, encontrar alimento e parceiros sexuais, apresentar cuidado parental, e engajar em comportamentos sociais adequados. Assim, também é consenso que as emoções são funções do sistema nervoso com alto valor adaptativo numa perspectiva evolutiva, atuantes para a sobrevivência do indivíduo e da espécie. Reações emocionais inatas e aprendidas Ao estudar comparativamente as expressões emocionais em seres humanos e em outros animais, particularmente as expressões corporais e faciais, Darwin observou semelhanças nas expressões emocionais entre indivíduos de uma mesma espécie e entre diferentes espécies de animais, o que o levou a propôr que muitas das expressões emocionais de um organismo são inatas ou herdadas, i.e., não são aprendidas pelo indivíduo. Darwin observou, por exemplo, que a ereção dos pêlos do corpo e os comportamentos de urinar e defecar em situações de grande perigo são muito comuns entre animais de diferentes espécies, como mostra a Fig. 1. Darwin descreveu uma série de outros exemplos comuns entre animais de diferentes espécies, como o comportamento de morder quando se está com raiva; a emissão de sons e a exibição de partes do corpo (como garras, ereção dos pêlos, batimento das asas, etc) em condições de perigo como meio de desencorajar o adversário de atacar; a emissão de sons, cheiros, posturas e exibição de partes do corpo como sinal de receptividade sexual, entre muitos outros. Darwin também observou que as expressões faciais mostram-se muito similares entre seres humanos de todo o mundo, indicando que elas independem da origem racial e da herança cultural do indivíduo. Também mostrou que mesmo indivíduos que não tiveram oportunidade de aprender os movimentos faciais e corporais com outras pessoas, como cegos de nascença e bebês muito novos, exibem normalmente expressões emocionais. Estudos mais recentes mostraram, por exemplo, que as expressões faciais de seres humanos produzidas por suas experiências gustatórias com diferentes sabores eliciaram padrões de expressões faciais altamente similares entre adultos e recém-nascidos com menos 16 horas de vida e que não haviam tido ainda sua primeira experiência alimentar (Steiner & Glaser, 1995). Além disso, um estudo com diferentes espécies de primatas não- humanos demonstrou que as expressões faciais eliciadas por diferentes sabores são similares entre as espécies para cada categoria de sabor, indicando homologia no que se refere aos processos subjacentes a essas expressões faciais entre grupos de primatas relacionados.
- 176. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 166 Julho/2010 Figura 1. Reações emocionais de animais de diferentes espécies perante situações de perigo. Note a ereção dos pêlos no gato e no cão, e das penas na galinha. (A) gato assustado com um cachorro; (B) galinha afastando um cão de sua ninhada; (C) cachorro aproximando-se de outro cachorro com intenções hostis. Modificado a partir de Darwin (1872). Uma função importante das expressões faciais e corporais é de comunicar emoções a outros indivíduos. Elas funcionam como um sinal preditivo da tendência de um indivíduo a se engajar em uma série de comportamentos em função das condições ambientais, incluindo as sociais. E nesse contexto, as expressões faciais e o seu reconhecimento pelos outros indivíduos do grupo exercem um papel chave na interação social. Gene Sackett (1966), ao estudar as expressões faciais de macacos que não haviam tido qualquer contato social prévio ao experimento, observou que esses macacos produziam expressões faciais e respostas comportamentais diante de fotografias de coespecíficos com diferentes tipos de expressão (e.g. expressão ameaçadora, de medo ou de alegria) similares a macacos que faziam parte de um grupo social. Este estudo demonstrou que a experiência social não era necessária para a produção de expressões faciais e comportamentos típicos de sua espécie produzidos diante de expressões faciais de coespecíficos. Isso indica que existe um componente inato tanto na produção de expressões faciais quanto no reconhecimento do conteúdo emocional das expressões. Entretanto, quando os macacos isolados foram inseridos em um grupo social, mostraram-se incapazes de reagir prontamente e apropriadamente a expressões faciais e comportamentos de outros macacos numa dinâmica social. A experiência social foi fundamental para os macacos previamente isolados aprenderem sobre mensagens emocionais num contexto social complexo e reagir apropriadamente a tais situações. De fato, as emoções estão sujeitas a aprendizagem e memória. Isto é, os animais são capazes de aprender a apresentar respostas emocionais a estímulos que outrora não eliciavam respostas emocionais reflexas, e de se recordar do conteúdo aprendido. Essa capacidade de aprendizagem e memória de natureza emocional resulta em flexibilidade na emissão de respostas emocionais frente às mudanças do meio ambiente, o que tem alto
- 177. Neurociências Julho/2010 Pág. 167 valoradaptativo. John Watson demonstrou experimentalmente esse tipo de aprendizagem em 1920 – o que veio a ser conhecido como o caso do pequeno Albert e o rato. Watson observou que um som alto e estridente induzido por uma martelada numa haste de metal eliciava choro no bebê Albert – o bebê apresentava um medo natural àquele tipo de som. Watson, em seguida, colocou um rato albino diante do bebê e observou que Albert tentava tocar no rato, não apresentando medo pelo animal. Imediatamente depois que o bebê tocou o rato, o pesquisador produziu um som estridente próximo ao bebê. Depois de alguns pareamentos entre o rato e o som, Watson observou que Albert passou a chorar na presença do rato. O bebê passou a sentir medo pelo rato, algo que não sentia antes. Watson demonstrou experimentalmente que reações emocionais são passíveis de aprendizado: indivíduos podem aprender a emitir respostas emocionais a novos estímulos. Ferramentas de estudo: abordagens comportamentais O procedimento experimental utilizado por Watson foi inicialmente descrito pelo fisiologista Ivan Pavlov, e em sua homenagem é conhecido por condicionamento Pavloviano (Fig. 2). Ao estudar a resposta de salivação reflexa de cães, Pavlov observou que os animais não somente salivavam na presença do alimento, mas também salivavam diante do pote onde a comida seria apresentada, e até mesmo diante dos sons produzidos na sua chegada ao laboratório – todos esses eram eventos que prediziam a liberação da comida aos cães. Pavlov, então, elaborou um experimento no qual pareou o som de uma campainha, que não eliciava a resposta de salivação nos cães, à apresentação de carne, que por sua vez naturalmente eliciava a salivação. Depois de realizar esse pareamento 60 vezes, Pavlov apresentou aos cães o som da campainha na ausência da liberação da carne, e mediu a quantidade de saliva produzida pelos animais. Ele observou que bastava o som da campainha para os animais salivarem. O condicionamento Pavloviano, também denominado condicionamento clássico, é uma ferramenta comportamental comumente utilizada no estudo de aprendizagem emocional em animais não-humanos e humanos, tanto envolvendo estímulos aversivos (“negativos”), como no caso do experimento idealizado por Watson, quanto envolvendo estímulos apetitivos (“positivos”), como no caso do experimento de Pavlov.
- 178. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 168 Julho/2010 Figura 2. Procedimento de condicionamento Pavloviano. Modificado a partir de Moreira & Medeiros (2007). O medo aprendido (ou medo condicionado) tem sido uma das reações emocionais mais amplamente estudadas pela neurociência. Sua investigação se faz comumente através do procedimento de condicionamento clássico aversivo. Nesta situação, a apresentação de um estímulo inicialmente neutro, por exemplo um estímulo sonoro, é pareado algumas vezes a um evento aversivo, geralmente um choque nas patas do animal. O som passa a eliciar respostas que tipicamente ocorrem na presença de perigo, como comportamentos defensivos (e.g., respostas de congelamento), respostas autonômicas (e.g., mudança de pressão arterial e batimentos cardíacos), respostas neuroendócrinas (e.g., liberação de hormônios das glândulas adrenais e da pituitária), entre outras. Em geral, toma-se a resposta de congelamento (ou “freezing”) como medida de medo condicionado em roedores. Os comportamentos relacionados ao condicionamento Pavloviano são chamados de comportamentos respondentes. Um comportamento respondente é aquele que é eliciado por um evento significativo do ambiente (e.g., o choro do bebê Albert perante ao rato albino, e o congelamento diante do estímulo sonoro condicionado), e prepara o organismo para enfrentar o evento em questão. Diferentemente, quando um organismo emite um comportamento para produzir uma consequência, chamamos este comportamento de operante. Por exemplo, o choro de um bebê para obter a atenção de seus pais é um comportamento operante: o bebê chora para a obtenção ou manutenção de um estímulo que lhe causa reações emocionais positivas – a atenção de seus pais. A estímulos desta natureza nos referimos como recompensas. A resposta de fuga de um animal para escapar de um predador também é um comportamento operante; neste caso, o animal emite uma
- 179. Neurociências Julho/2010 Pág. 169 respostade esquiva a um estímulo que lhe causa reações emocionais negativas. A estímulos desta natureza nos referimos como punições. Condicionamento operante é a situação de aprendizado de um comportamento operante, e é amplamente empregado no estudo das emoções. O procedimento de esquiva passiva (ou inibitória) é um exemplo de condicionamento operante aversivo, no qual a apresentação de um estímulo que produz uma reação emocional negativa aumenta a probabilidade de o animal emitir uma resposta de esquiva a este estímulo. Nesta situação comportamental, por exemplo, um rato é introduzido sobre uma estreita plataforma localizada acima de um assoalho de metal. O rato mostra uma tendência natural de descer da pequena plataforma para o assoalho da caixa. No entanto, toda vez que o rato toca o assoalho, recebe um choque nas patas. O tempo que o animal leva para descer da plataforma aumenta com o treino, indicando aprendizagem do condicionamento operante: o animal aprende a emitir o comportamento de permanecer sobre a plataforma para se esquivar de um perigo – o choque nas patas. Condicionamentos operantes apetitivos também são amplamente empregados no estudo das emoções. Neste caso, a apresentação de um estímulo que produz uma reação emocional positiva aumenta a probabilidade de o animal emitir uma resposta para a obtenção ou manutenção deste estímulo. Por exemplo, é comum a utilização de um procedimento no qual um rato é treinado a pressionar uma barra no interior de uma caixa para receber alimento. Outro exemplo é o procedimento de auto-estimulação elétrica. Neste caso, a estimulação elétrica em determinadas regiões do encéfalo funciona como recompensa, i.e., o organismo produz comportamentos para obter a estimulação. O fenômeno de auto-estimulação elétrica tem sido usado como ferramenta para o entendimento dos mecanismos de recompensa e punição no sistema nervoso. Em algumas regiões do encéfalo, a estimulação elétrica pode mimetizar os efeitos de recompensas naturais para um organismo, como os efeitos de comida para um animal com fome ou de água para um animal com sede. Até mesmo alterações de humor, como sensações de bem- estar ou de mal-estar relatadas por seres humanos, podem ser provocadas por estimulação elétrica em determinadas áreas do encéfalo. Não raro a técnica de apresentação de estímulos de natureza emocional, como por exemplo figuras e palavras com conteúdo emocional, é empregada nas pesquisas sobre emoções em seres humanos. Peter Lang e colaboradores (1995) criaram o Sistema Internacional de Figuras Afetivas (IAPS, do inglês, International Affective Picture System) que consiste em um conjunto de fotos de cenas de violência, de sexo, de cenas alegres ou neutras, entre outras, que evocam diferentes respostas emocionais. Centenas de indivíduos foram expostos a essas fotos e classificaram-nas quanto à valência e ao grau de alerta das reações emocionais que elas evocavam. Essas cenas e as suas respectivas classificações
- 180. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 170 Julho/2010 têm sido utilizadas em numerosos estudos que empregam a ferramenta de produzir reações emocionais em indíviduos. Algumas dessas cenas são mostradas na Fig. 3. Figura 3. Algumas cenas do Sistema Internacional de Figuras Afetivas (IAPS - International Affective Picture System). Modificado a partir de Lang et al. (1995). Bases Neurais Em 1878, o neurologista Paul Broca cunhou o termo “lobo límbico” para um conjunto de estruturas nervosas localizadas ao redor do corpo caloso, incluindo o córtex cingulado, o córtex na superfície medial do lobo temporal e o hipocampo, como mostra a Fig. 4. Figura 4. Lobo límbico definido por Broca. Modificado a partir de Bear et al. (2002). Mais tarde, em 1937, o neurologista James Papez propôs que as emoções seriam processadas por uma rede de circuitos neurais no cérebro que incluia o hipotálamo, o tálamo anterior, o córtex cingulado e o hipocampo (Fig. 5). Para Papez, a experiência emocional seria determinada pela atividade do córtex cingulado, e a expressão emocional pelo hipotálamo. Papez propôs que o córtex cingulado e o hipotálamo manteriam conexões bidirecionais indiretas entre si através do hipocampo e do tálamo anterior, de modo que a experiência emocional e a expressão emocional se relacionariam.
- 181. Neurociências Julho/2010 Pág. 171 Figura5. Circuito proposto por Papez. Modificado a partir de Bear et al. (2002). No início da década de 1950, o fisiologista Paul MacLean referiu-se ao circuito proposto por Papez como “circuito de Papez” e adicionou a ele a amígdala, o córtex orbitofrontal e parte dos núcleos da base propondo um sistema mais ampliado responsável pelas emoções no cérebro, que denominou “sistema límbico”, valendo-se do termo inicialmente empregado por Broca. O conceito de sistema límbico como a parte emocional do cérebro foi amplamente difundido e apesar da sua inconsistência, não é difícil nos depararmos com esse termo até os dias atuais. Fortes evidências mostram o envolvimento de algumas estruturas do sistema límbico em processamentos de ordem emocional, como a amígdala e o hipotálamo. Por outro lado, as pesquisas têm mostrado que outras estruturas do sistema límbico não desempenham papel importante neste tipo de processamento, como por exemplo, o hipocampo. Ademais, a idéia de um sistema único responsável pelas emoções no cérebro tem se mostrado inconsistente. Diferentemente, parece que diferentes circuitos neurais amplamente distribuídos no sistema nervoso estão envolvidos com diferentes situações emocionais ou aspectos do processamento emocional. Algumas estruturas do sistema nervoso têm sido fortemente relacionadas às emoções. Historicamente, a primeira sugestão de que a amígdala estaria envolvida na produção de comportamentos emocionais surgiu a partir das observações de Klüver e Bucy (1939). Esses autores mostraram que a ablação bilateral das porções anteriores do lobo temporal de macacos produziu um conjunto de comportamentos, denominado síndrome de Klüver-Bucy, cuja característica principal era o que os pesquisadores chamaram de cegueira psíquica, que compreendia a aparente perda da reação emocional a estímulos sensoriais, principalmente os visuais. Isto é, os animais podiam ver perfeitamente, mas os objetos pareciam ter perdido o seu significado “psicológico”; por exemplo, os macacos lesados
- 182. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 172 Julho/2010 levavam à boca objetos não comestíveis, tentavam copular com indivíduos do mesmo sexo ou de outras espécies, e perdiam o medo por cobras e pessoas. Mais tarde, outros estudos tentaram determinar que regiões específicas do lobo temporal tinham maior relevância na síndrome, e nesse sentido, o trabalho de Weiskrantz (1956) foi marcante por demonstrar que a ablação bilateral da amígdala em macacos levou a uma série de mudanças comportamentais que incluia mansidão, perda de responsividade emocional, exame excessivo de objetos, consumo de itens alimentares previamente rejeitados e aproximação de objetos previamente relacionados ao medo, que em muito se assemelhavam aos comportamentos observados por Klüver e Bucy. Weiskrantz (1956) também reportou que a ablação bilateral da amígdala em macacos resultou em prejuízo na aprendizagem da tarefa de esquiva ativa, em que o animal deve produzir uma resposta operante (de esquiva) na presença de um estímulo que sinaliza a pendência de um choque. Baseado nessas e em outras observações, Weiskrantz (1956) foi um dos primeiros a sugerir que a amígdala seria fundamental para que as representações de estímulos preditivos fossem associadas às propriedades afetivas de estímulos biologicamente significativos – idéia que é sustentada até hoje por numerosas evidências. Mais tarde, Jones e Mishkin (1972) sugeriram que muitos dos sintomas da síndrome de Klüver-Bucy seriam decorrentes do prejuízo neste tipo de aprendizagem (ver Rolls, 1992). Consistentes com esses achados e com essa interpretação estão os relatos do envolvimento da amígdala no medo condicionado (descrito acima), onde um estímulo (e.g., um som) prediz a ocorrência de um estímulo aversivo (e.g. um choque). Humanos e animais não-humanos com danos na amígdala não aprendem a apresentar medo diante do estímulo preditivo, diferente de indivíduos normais. De fato, do ponto de vista hodológico, a amígdala encontra-se em condições de associar representações sensoriais de um dado estímulo com as propriedades afetivas de um estímulo significativo. Depois de processadas e associadas na amígdala, essas informações podem modificar respostas autonômicas, endócrinas, somáticas e comportamentais por meio das diferentes áreas de projeção da amígdala. Estudos com seres humanos têm demonstrado que a amígdala exerce um papel fundamental no reconhecimento de expressões faciais de medo. Este envolvimento da amígdala se dá especialmente em se tratando de expressões faciais de medo, e não de outros tipos. Por exemplo, se solicitarmos a um paciente com dano amigdalar classificar uma expressão facial de medo numa escala de 1 (sem medo) a 6 (amedrontada), ele dirá 2 ou 3, ao passo que um indivíduo normal dirá 5 ou 6. O mesmo não ocorre para uma expressão facial alegre: ambos os sujeitos classificarão essa expressão dentro da mesma escala. Em seres humanos, a amígdala parece ser fundamental para a avaliação de somente poucos tipos de expressões faciais, e não parece importante para produzir expressões faciais apropriadamente. De fato, danos amigdalares em seres humanos
- 183. Neurociências Julho/2010 Pág. 173 provocamfracos prejuízos na interação social, o que não ocorre em animais não-humanos. Macacos com danos na amígdala, por exemplo, mostram graves prejuízos em responder a estímulos sociais e, em geral, são isolados do convívio social pelos outros indivíduos do grupo. Outra estrutura nervosa que tem sido sistematicamente descrita como envolvida em processamento emocional é o córtex orbitofrontal. Uma das primeiras evidências disso surgiu do famoso caso Phineas Gage. Phineas Gage, aos 25 anos, era o contramestre de uma equipe que trabalhava na construção de uma estrada de ferro. O trabalho de Phineas Gage era preparar dinamites para a explosão das rochas do terreno. Em setembro de 1848, um trágico acidente acometeu Gage. Uma explosão inesperada produzida por um erro no preparo de uma dinamite fez com que uma barra de ferro penetrasse pela bochecha de Gage saindo pelo topo frontal de sua cabeça. Gage se recuperou dos ferimentos produzidos pelo acidente, mas mostrou mudanças acentuadas em seu comportamento e personalidade. Antes do acidente ele era uma pessoa responsável e admirada pela eficiência, paciência e bom gerenciamento em seu trabalho e vida pessoal. Depois, tornou-se irresponsável, impaciente e grosseiro. Também não conseguia planejar ações para o futuro e executá-las; logo se perdia em outros planejamentos, que sempre abandonava. No entanto, ele não apresentava sinais de prejuízos de outras naturezas, tais como perda de inteligência, deficiências motoras ou de percepção. Gage parece ter perdido a habilidade de controlar suas respostas emocionais. Parece ter perdido também a habilidade de avaliar o significado dos eventos e tomar decisões apropriadas diante deles. O resultado disso foi que Gage logo foi demitido de seu emprego e seguiu uma vida sem direcionamento até sua morte, que se deu 13 anos mais tarde, fruto de uma forte crise epiléptica. O crânio de Phineas Gage e a barra de ferro que produziu o acidente foram preservados, e muitos anos mais tarde, Damasio e colaboradores (1994) reconstruíram a lesão de Gage com técnicas de neuroimagem confirmando o dano da porção ventromedial do córtex pré-frontal, como mostra a Fig. 6. A região acometida em Phineas Gage corresponde a uma parte do córtex orbitofrontal. O córtex orbitofrontal equivale à porção mais ventral do córtex pré-frontal e recebe este nome por estar posicionado imediatamente acima das órbitas. O córtex orbitofrontal é particularmente bem desenvolvido em primatas, incluindo seres humanos, e pouco desenvolvido em outros animais, tais como os roedores. Em seres humanos, lesão do córtex orbitofrontal resulta em euforia, irresponsabilidade e perda de afeto. Essas alterações se refletem na tendência a responder a determinados estímulos quando responder é inapropriado. Esta característica é evidente também em primatas não-humanos e em roedores com danos na mesma região. Por exemplo, macacos e ratos com lesão do córtex orbitofrontal exibem desempenho prejudicado em um teste comportamental denominado
- 184. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 174 Julho/2010 tarefa de reversão. Nesta tarefa, o animal é inicialmente recompensado por escolher um determinado objeto entre um conjunto de objetos diferentes. Em seguida, o reforçamento é revertido, ou seja, a escolha de um outro objeto e não mais do primeiro é que passa a ser recompensada. Animais com danos no córtex orbitofrontal continuam respondendo ao primeiro objeto depois da reversão, diferentemente de animais normais, que alteram a sua escolha para o objeto que passa a resultar em recompensa. De maneira similar, lesão do córtex orbitofrontal também leva a prejuízo em tarefas de extinção, nas quais a escolha de um objeto, que inicialmente era recompensada, passa a resultar em nenhuma recompensa. Animais com lesão do córtex orbitofrontal continuam respondendo mesmo quando as respostas não são mais reforçadas, diferentemente de animais normais, que param de responder. Sugere-se que a atividade do córtex orbitofrontal facilitaria a mudança de representações associativas antigas e a aquisição de novas associações pela amígdala (Schoenbaum et al., 2007). De fato, essas estruturas mantêm densas conexões bidirecionais entre si. Essas mudanças comportamentais resultantes de danos no córtex orbitofrontal têm sido relacionadas com a incapacidade de tomar decisões apropriadas observadas em seres humanos e outros animais com lesão nesta região. Figura 6. O crânio de Phineas Gage e a reconstrução da imagem do seu encéfalo trespassado pela barra de ferro. Modificado a partir de Gazzaniga et al. (2006). O núcleo accumbens, por sua vez, está envolvido com os estados afetivos ligados a recompensas prazerosas. Por exemplo, estudos eletrofisiológicos mostram que a ativação
- 185. Neurociências Julho/2010 Pág. 175 deneurônios do núcleo accumbens se dá pela apresentação de estímulos prazerosos como alimentos, oportunidade de contato sexual com outros indivíduos, e até mesmo drogas de abuso como anfetamina, heroína e cocaína. A ativação dessa região também se dá por estímulos reforçadores secundários, i.e., estímulos inicialmente neutros que passam a predizer a ocorrência das recompensas naturais. Evidências sugerem que as projeções dopaminérgicas para o núcleo accumbens estão envolvidas com a atribuição de valor de incentivo a recompensas. Por valor de incentivo entende-se o quanto um organismo deseja um determinado estímulo, ou seja, o quanto ele está disposto a trabalhar para obter aquele estímulo. Isso é diferente de valor hedônico, que se refere a quanto um organismo gosta de um determinado estímulo. A dopamina parece ser importante para o valor de incentivo, mas não para o valor hedônico das recompensas. Por outro lado, os neurotransmissores opióides parecem estar envolvidos com o valor hedônico. Por exemplo, a ativação de receptores opióides no núcleo accumbens por injeção de morfina aumenta a habilidade de uma solução adocicada eliciar reações afetivas positivas. Dentre outras regiões importantes para o processamento emocional encontram-se, por exemplo, o córtex cingulado, o hipotálamo lateral e estruturas do tronco encefálico. O córtex cingulado está envolvido com as sensações e antecipações de dor. Um dos tratamentos para dores intratáveis em seres humanos consiste na destruição do córtex cingulado, que por razões ainda não claras, também auxilia no tratamento de depressão e do transtorno obsessivo-compulsivo. Danos no hipotálamo lateral, por sua vez, eliminam comportamentos motivados, como por exemplo o comportamento de se alimentar, de beber, e o comportamento sexual. E consistentemente, a estimulação elétrica do hipotálamo lateral elicia esses tipos de comportamentos, além do comportamento maternal, do ataque predatório, do comportamento defensivo, entre outros. Finalmente, apesar de a visão tradicional sobre as funções do tronco encefálico colocarem-no numa posição meramente reflexiva, estudos recentes têm atribuído a ele importância para as experiências emocionais. Por exemplo, a sensação de dor é modulada pela substância cinzenta periaquedutal, enquanto que a sensação de prazer eliciada por um alimento é modulada pelo núcleo parabraquial da ponte. O núcleo tegmental peduncolopontino tem se mostrado importante para o valor reforçador de drogas de abuso como a morfina e a anfetamina. De fato, a capacidade de reagir a estímulos significativos do ambiente, função primordial das emoções, é tão fundamental para a sobrevivência e sucesso do indivíduo, que ela deve ter surgido muito cedo na história evolutiva dos vertebrados, quando a organização do sistema nervoso era dominada pelo tronco encefálico (Panksepp, 1998). A relação das emoções com outras funções cognitivas Conforme descrevemos acima, pacientes com lesão da amígdala se mostram
- 186. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 176 Julho/2010 prejudicados em apresentar respostas autonômicas de medo a um estímulo que prediz a ocorrência de um estímulo aversivo. Por exemplo, a paciente S.P., com dano bilateral na amígdala, foi apresentada à figura de um quadrado na tela de um computador por alguns segundos, a qual se seguia imediatamente um choque fraco no seu pulso. Pessoas normais mostram alterações na condutância da pele imediatamente após o recebimento do choque, indicando reação aversiva ao choque, e também mostram alterações na condutância da pele perante à figura do quadrado após alguns pareamentos, indicando o aprendizado do condicionamento aversivo. Entretanto, a paciente S.R. apesar de mostrar alterações na condutância da pele em resposta ao choque, não mostrou qualquer alteração diante do quadrado, demonstrando que não foi capaz de aprender o condicionamento aversivo. Apesar disso, a paciente foi capaz de relatar verbalmente que sabia que receberia um choque tão logo o quadrado fosse apresentado na tela do computador. Claramente esses dados demonstram uma dissociação entre o aprendizado explícito sobre um evento emocional e o aprendizado implícito sobre a mesma situação. Como foi discutido em capítulo anterior, o aprendizado explícito depende do funcionamento do hipocampo, e consistentemente, pacientes com lesão hipocampal, quando testados na mesma tarefa, apresentam alterações normais na condutância da pele perante ao quadrado, mas são incapazes de relatar sobre a associação existente entre o quadrado e o choque no pulso. De fato, as emoções têm um forte componente não declarativo ou inconsciente. O significado emocional de estímulos pode ser processado inconscientemente. Em um experimento clássico, Lazarus e McCleary (1951) reportaram a existência de reações emocionais a estímulos percebidos subliminarmente, ou seja, sem conhecimento consciente. Lazarus apresentou algumas letras na tela de um computador em períodos de tempo muito curtos (da ordem de milisegundos), de forma que não pudessem ser percebidas de forma consciente. Depois de alguns pareamentos de algumas letras com choques elétricos, Lazarus evidenciou que os sujeitos exibiam respostas autonômicas perante às letras condicionadas, mesmo sem nenhuma percepção consciente delas. Num teste chamado impressão emocional subliminar, idealizado por Murphy e Zajonc (1993), uma foto de um rosto com expressão sorridente ou furiosa era apresentada subliminarmente a um sujeito na tela de um computador, seguida de um estímulo-alvo, como por exemplo, um ideograma chinês. Zajonc evidenciou que quando os sujeitos eram questionados sobre suas preferências aos estímulos-alvo, relatavam preferência aos ideogramas associados às expressões sorridentes, e não às furiosas, indicando que os estímulos-alvo adquiriram um significado emocional em função de uma reação emocional ativada subliminarmente pelas expressões faciais percebidas inconscientemente. Interessantemente, a impressão emocional se mostrou mais eficaz quando as expressões faciais eram apresentadas de forma subliminar do que quando eram percebidas
- 187. Neurociências Julho/2010 Pág. 177 conscientementepelos sujeitos. Estes estudos mostram que as emoções são particularmente sensíveis a estímulos inconscientes. De fato, a percepção estritamente inconsciente de um estímulo e a sua influência nas reações emocionais não são passíveis de questionamento, ao passo que a percepção consciente de um estímulo possibilita algum controle sobre as reações emocionais que ela gera ou influencia. O significado emocional de um estímulo também pode ser aprendido declarativamente, e não só por meio de um procedimento implícito, como o condicionamento aversivo. Um exemplo é o fenômeno do medo instruído, no qual aprendemos a ter medo de algo por aprendizagem declarativa, mesmo sem nunca termos experienciado de fato o estímulo aversivo, ou seja, mesmo sem nunca termos sido condicionados aversivamente ao dado estímulo. Por exemplo, somos capazes de aprender a ter medo de tocar uma tomada porque fomos instruídos que podemos levar um choque elétrico se o fizermos, mesmo sem nunca termos tocado sequer uma tomada e recebido choque. A amígdala também se mostra importante neste tipo de aprendizagem emocional. A interação das emoções com o sistema de memória declarativa também se dá de uma outra maneira: as emoções podem intensificar nossas memórias declarativas. Isso fica claro pelo fato de experiências emocionais serem melhor recordadas do que experiências sem conteúdo emocional. Se nos propusermos a recordar alguns eventos que vivenciamos, é mais provável que nos recordemos de eventos de cunho emocional, como o falecimento de um ente querido, o primeiro namorado, etc. O processo de armazenamento de uma memória envolve inicialmente a codificação da representação da memória do evento em questão, seguido pela consolidação dessa memória, que é o processo pelo qual novas memórias tornam-se mais permanentes e resistentes à perda. O estado de alerta produzido por um evento emocional aumenta a atenção direcionada ao evento, o que faz melhorar a codificação da representação dessa memória. Além disso, a atividade do hipocampo é modulada pela amígdala melhorando o processo de consolidação da memória de um evento emocional. Numa perspectiva evolutiva, a melhora da memória para eventos significativos do ambiente tem um alto valor adaptativo, pois garante que a informação sobre esses eventos seja disponibilizada em ocasiões futuras, aumentando a probabilidade de sobrevivência e sucesso do indivíduo.
- 188. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 178 Julho/2010
- 189. Neurociências Julho/2010 Pág. 179 Neurofisiologiada Linguagem Rodrigo Collino Laboratório de Neurociência e Comportamento rodrigocollino@terra.com.br Introdução Dentro das ciências cognitivas, o estudo da linguagem tem ganhado grande atenção nas últimas décadas. É uma área que envolve diversos detalhes e grande complexidade, dado o emprego de técnicas desenvolvidas apenas recentemente (a partir da metade do séc. XX) em estudos neurocientíficos. Anteriormente a este período, as conclusões de médicos acerca da neurofisiologia da linguagem eram abstraídas somente através da análise da casos clínicos, advindos de acidentes que causassem danos a áreas específicas do cérebro, e que acabavam por desenvolver sequelas de cunho linguístico – na compreensão da fala, ou na produção de mesma, por exemplo. Retrocedendo mais ainda no tempo, pensava-se na Grécia Antiga que o controle da linguagem estivesse concentrado totalmente na língua do indivíduo. Assim, ao encontrar um indivíduo que, provavelmente devido a um acidende vascular cerebral (AVC), apresentasse dificuldades na dicção, era comum oferecer-lhe tratamento através de massagens em sua língua, na esperança de recobrar-lhe a fala. Atualmente, estudiosos da neurociência contam com instrumentos aguçados de avaliação da atividade cerebral, tais como fMRI, MEG, PET e ERP, a fim de correlacionar características da linguagem e regiões cerebrais específicas e seus respectivos padrões de ativação neuronal. Neste capítulo, vamos explorar algumas das maravilhas da linguagem produzidas pelo cérebro humano: o que a torna tão particular da espécie humana, sua lateralização e modularidade cerebral, distúrbios ocasionados pela falha em alguns de seus mecanismos, e como é possível o cérebro aprender e utilizar mais de uma língua para nossa comunicação. A Linguagem é exclusiva do Homem? Vivemos imersos neste complexo comportamento chamado linguagem; ouvimos, falamos, lemos e escrevemos quase que instintivamente e inconscientemente, sem pensar muito na ordem das palavras que emitimos, ou no som das sílabas que ouvimos. Bebês nascem e, em questão de 1 ou 2 anos, já entendem muito de sua língua-mãe e não levam muito mais tempo para se comunicarem fluentemente. Antes objeto de estudo apenas de linguistas, hoje a Linguagem passa também ao domínio de neurocientistas que procuram traçar sua ontogenia cerebral, e até mesmo encontrar semelhanças entre a nossa comunicação e aquela usada por outros animais. De certo, algumas espécies de animais se comunicam, como as aves, cães, lobos e primatas,
- 190. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 180 Julho/2010 mas até que ponto esta forma de comunicação pode ser equiparada à nossa? Será que alguma outra espécie poderia aprender a “linguagem dos homens”? Neste sentido, vários experimentos têm sido realizados, especialmente com chipanzés. Em um deles, tentou-se ensiná-los a aprender palavras em Inglês de elementos presentes em seu ambiente, e esperar que falassem ou ao menos entendessem o que lhes fora apresentado. Um dos resultados mais significativos deste experimento foi perceber que tais primatas possuem um sistema fonador diferenciado do nosso, o que limita enormemente a produção de nuances dos sons que podem ser emitidos pela espécie humana, e também que conseguiam compreender apenas 400 palavras aos 2,5 anos. Em outra tentativa de ensinar um chipanzé a comunicar-se, optou-se pela Linguagem de Sinais (ASL), e chegou-se à seguinte conclusão: até os 4 anos de idade, o chipanzé havia aprendido a sinalizar 160 palavras, e chegou até mesmo a produzir a composição “water bird” ao ver um cisne em um lago. Pois bem, comparando-se com crianças de nossa espécie, aos 4 anos de idade, elas já possuem um vocabulário de aproximadamente 3.000 palavras. Além disso, não é possível saber com certeza se a produção de “water bird” por aquele chipanzé representava uma alegoria ao cisne ou se, simplesmente, eram duas mensagens separadas – uma indicando a água em si, e a outra indicando o cisne. De modo muito diferente, a espécie humana parece ter sido selecionada com esta característica inata à linguagem: atualmente, no planeta, contam-se 10.000 idiomas e dialetos dentre todos os povos da raça humana. Além disso, casos de indivíduos que cresceram em total isolamento com a sociedade relatam o desenvolvimento de formas próprias de comunicação. Por fim, há algumas características que diferem a comunicação humana daquela encontrada em qualquer outra espécie animal. São elas: criatividade: a capacidade de gerar novas associações de palavras – ou até mesmo criar um novo dialeto; forma: uso de fonemas e sílabas para compor palavras, e emprego de regras sintáticas bem definidas para compor sentenças, tudo isso sem a necessidade de intrução formal, mas da aprendizagem implícita – experienciada em nosso dia-dia; conteúdo: não só as palavras, mas também gestos, expressões faciais e a entonação utilizadas carregam significado na comunicação humana. uso: a língua serve o propósito de meio de comunicação social e também para identidade própria (expressa nossos pensamentos e emoções). Assim, podemos dizer que nossa forma de comunicação é única e complexa dentre os seres vivos de nosso planeta. Surgem também algumas questões, de discussão atual no meio científico: esta capacidade única do ser humano reflete algum ajuste fino do cérebro primata para o propósito específico da linguagem? Ou tal capacidade dever-se-ia ao desenvolvimento de uma arquitetura neural completamente nova? Para melhor nos ajudar
- 191. Neurociências Julho/2010 Pág. 181 nabusca por respostas a estas perguntas, vamos agora olhar para dentro do centro da linguagem: o cérebro humano. Neuroanatomia da Linguagem Todos os aspectos da linguagem são comandados pelo cérebro: a captação de ondas sonoras provenientes da conversa entre duas pessoas é levada ao sistema nervoso central pelo nosso sistema auditivo; a produção da fala, envolvendo a articulação dos lábios e língua, também tem seu controle motor coordenado pelo cérebro; a leitura e a escrita, e até mesmo nossa linguagem corporal, intermediados pelos sistemas visual e motor, são orquestrados pelos 1,5 quilo de massa cinzenta que se encontra dentro de nossa caixa craniana. Cada uma destas funções linguísticas encontra-se sob responsabilidade de áreas neuroanatômicas bem definidas e localizadas, que serão ilustradas na Fig. 1 e Tab. 1: Tabela 1 - Relação de algumas estruturas cerebrais e seus respectivos papéis na linguagem. Estrutura neuroanatômica Função controlada Região temporo-superior posterior esquerda Compreensão da fala e escrita Região frontal inferior posterior esquerda Expressão oral e escrita Córtex auditivo primário Percepção de sons Região temporo-parietal esquerda Categorização de fonemas Córtex estriado e pré-estriado Visualização de palavras Córtex pré-frontal Iniciação e categorização de palavras Tálamo Interface semântico-lexical Percebemos, então, um fenomêno de lateralização cerebral no que se diz respeito ao controle da linguagem, determinando o hemisfério esquerdo como dominante. De fato, 99% das pessoas destras e 70% dos canhotos desenvolvem tal característica. O hemisfério Figura 1 – Principais áreas anatômicas do cérebro humano.
- 192. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 182 Julho/2010 direito também participa em características importantes da linguagem, tais como compreensão de respostas não-verbais, leitura de números, letras e palavras curtas, e conferir entonação, ritmo e prosódia à lingua falada. O centro de compreensão prosódica também localiza-se no hemisfério direito (córtex posterior). Hoje é possível “ver” o cérebro em funcionamento através de procedimentos como PET e fMRI. Vários experimentos tem sido feito envolvendo linguagem e mapeamento cerebral. Na Figura 2 estão representados resultados obtidos quando da ativação cerebral em função de diferentes usos da linguagem: Portanto, podemos prever que danos em determinada porção do tecido cerebral podem afetar uma característica específica da linguagem. São diversas as disfunções decorrentes de AVC, conhecidas como afasias (difunções na produção ou compreensão da fala), alexias (disfunções na leitura) e agrafias (disfunções na escrita). As mais conhecidas são as afasias de Broca, de Wernicke e de Condução. A afasia de Broca afeta o conteúdo da expressão oral e escrita.Geralmente é decorrente de lesões na região fronto-posterior esquerda, produzindo alterações no paciente equivalentes a uma “fala telegráfica”: substantivos são usados apenas no singular, verbos sem flexão, levando até mesmo a uma total quebra na sintaxe da frase (p.e., “Senhoras e senhores, por favor dirijam-se à sala de jantar”, seria produzido por um destes pacientes como “senhora, senhor, sala”). A afasia de Wernicke não prejudica a produção, mas sim a compreensão da fala e da escrita. Devido a esta dificuldade de compreensão, sua fala fica afetada por uma fluência em excesso, com abundância de palavras e frequentes trocas de assunto dentro do mesmo trecho discursivo, produzindo uma espécie de “vazio” na fala. Geralmente é resultado de lesões na região temporo-posterior superior esquerda. A afasia de Condução ocorre quando o fascículo arqueado (região parietal esquerda), que interliga as regiões de Broca e Wernicke, é rompido. Seus principais sintomas são dificuldades na repetição de frases e palavras e na nomeação de objetos, e troca de letras durante a escrita. Figura 2 – Níveis relativos de fluxo sanguíneo representado por cores. Vermelho indica os maiores níveis, e níveis progressivamente menores são indicados por laranja, amarelo, verde e azul. Retirado de Posner e Raichie, 1994.
- 193. Neurociências Julho/2010 Pág. 183 Existemtambém disfunções da linguagem observadas por lesões no hemisfério direito do cérebro: indivíduos que utilizam um único tom de voz na linguagem após lesão no córtex frontal direito, e indivíduos que não conseguem realizar compreensão prosódica após lesão no córtex posterior direito. Há, ainda, aqueles distúrbio linguísticos sem lesões vasculares ou mecânicas aparentes, apontando apenas para um componente genético. A dislexia, por exemplo, envolve grandes dificuldades em processos fonêmicos, ocasionando atrasos no aprendizado de leitura e grafia incorreta de palavras. Estudos recentes apontam para um possível correlato anatômico da dislexia: indivíduos disléxicos apresentam tamanho levemente reduzido do hemisfério esquerdo, com grupos de neurônios “mal-posicionados” no planum temporale esquerdo – o que sugere um atraso na migração daquelas células durante o desenvolvimento. Existe, ainda, uma dificuldade em processar estímulos sensoriais (visuais ou auditivos) de forma rápida por parte de indivíduos disléxicos, quando comparados à população normal. O Cérebro Bilíngue Comunicar-se, portanto, parece pertencer ao acervo biológico do homem, herdado geneticamente de nossos ancestrais; em nossa espécie, há um instinto para o desenvolvimento da linguagem – apesar dos possíveis problemas ou deficiências no decorrer do percurso. E quanto à comunicação em duas línguas? Como está preparado o nosso cérebro para aprender dois ou mais idiomas, e processá-los a nível neural? Existem populações neurais específicas para cada idioma, ou que se complementam no processamento de mais de um idioma? Aqui, devido à modularidade cerebral - já conhecida não apenas para diferentes funções cognitivas do ser humano (como memória, motricidade, visão, olfato), mas também para diferentes características linguísticas, temos novamente que discernir entre as várias habilidades envolvidas também na comunicação bilíngue: percepção de fonemas estrangeiros, aquisição de um léxico e de estruturas próprias da língua em questão, articulação da fala e compreensão auditiva a uma velocidade adequada para interação com nativos daquela língua, entre outras. Experimentos em eletrofisiologia têm privilegiado as questões linguísticas que envolvem aquisição e uso do léxico e da gramática em uma ou mais línguas (Perani & Abutalebi, 2005), enquanto outros se propuseram a abordar a percepção fonêmica, destacando-se entre estes Kuhl (2000), Stager & Werker (1997) e Rivera-Gaxola . (2001), apontando para padrões de organização neural no córtex auditivo primário de crianças e adultos. A plasticidade neural particularmente em crianças é algo notável e aceito tanto pela comunidade científica como pela sociedade leiga em geral, a qual percebe a facilidade
- 194. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 184 Julho/2010 e velocidade de aprendizado de novas tarefas – em especial, a aquisição de outro idioma. Mehler e Christophe (2000) sugerem que recém-nascidos já discriminam entre dois idiomas estrangeiros, ao passo que, curiosamente, bebês aos dois meses de idade não o fazem mais. Isso parece indicar haver um período ótimo para esta percepção, após o qual ela deixa de existir. Ainda assim, percebe-se que a facilidade em aprender uma outra língua (o chamado período crítico) continua até aproximadamente quando se inicia a puberdade (Stromsworld, 2000), caracterizando ao longo do desenvolvimento infantil algumas janelas de oportunidade - períodos em que a aquisição de habilidades específicas seriam favorecidas por fatores genéticos, hormonais e de plasticidade neural. Os primeiros estudos utilizando-se de indivíduos bilíngues demonstraram que adultos que haviam aprendido duas línguas simultaneamente na infância apresentaram uma região em comum para processamento de ambas as línguas, ao passo que aqueles adultos que haviam aprendido duas línguas em momentos distintos de sua vida apresentavam regiões corticais também distintas quando utilizando cada um dos idiomas (Fig. 3): Figura 3 – Resultados de fMRI mostrando centros de ativação da linguagem para a fala em dois idiomas, em dois indivíduos adultos, sendo o da esquerda uma situação de aprendizado tardio do idioma, e o da direita, de aprendizado simultâneo de duas línguas. Retirado de Kim , 1997. Outro importante estudo neste campo provou que não somente a idade, mas também o nível de proficiência (ou domínio) do idioma influi na representação cerebral. Estudos com fMRI encontraram maior densidade de massa cinzenta na região temporo- parietal esquerda do cérebro daquelas pessoas que haviam aprendido mais precocemente duas línguas e que possuíam maior grau de proficiência. (Mechelli, 2004). Isto equivale a dizer que quanto mais cedo alguém é exposto a um idioma estrangeiro, maior a quantidade de conexões entre neurônios naquela região cerebral específica envolvida no processamento daqueles idiomas. De fato, tomado de um ponto de vista neurobiológico, nascemos prontos para aprender qualquer idioma. Uma criança que nasce na Coréia vai aprender coreano tão bem quanto uma criança que aprende italiano por ter nascido na Itália, embora estas duas línguas possuam sotaques e alguns sons de vogais e consoantes próprios, diferentes entre
- 195. Neurociências Julho/2010 Pág. 185 elas.Nosso cérebro, nos primeiros anos da infância, não faz distinção entre japonês e inglês, português e alemão, ou quaisquer outras línguas entre si. É somente após alguns meses de vida que nosso sistema nervoso central começa a privilegiar os sons mais freqüentes ao nosso meio, e por consequência, a não mais reconhecer fonemas estrangeiros que não fazem parte do sistema de sons a que a criança está sendo exposta (Fig. 4). Daí vem a dificuldade que muitos adultos encontram em, primeiro, perceber auditivamente e, depois, em pronunciar determinados fonemas estrangeiros – como nas palavras bad e bed, em inglês, para os brasileiros, ou como nas palavras avô e avó, em português, para os povos de língua espanhola. Conclusão e Perspectivas O campo da neurociência se abre cada vez mais para estudos da linguagem. Processos que envolvem desde a aquisição de uma língua, passando pelo seu processamento, distúrbios, anomalias, codificação gênica, representação mental, e chegando até o fenômeno do bilinguismo, todos ainda reservam perguntas que têm ajudado em nossa construção do conhecimento acerca desta fascinante área. Podemos apontar como perspectivas para o futuro algumas linhas de estudo: Interação entre linguagem e sistemas de memória; Ontogenia, prevenção e reabilitação de afasias e dislexias; Melhor compreensão do papel de estruturas subcorticais no processamento linguístico; Organização do léxico de duas ou mais línguas na memória; Neurofisiologia da aquisição e processamento de duas ou mais línguas em diferentes idades e níveis de proficiência. Figura 4 – Linha do tempo para percepção de sons da fala em bebês, de 0 a 12 meses de idade. Retirado de Kuhl, 2004.
- 196. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 186 Julho/2010
- 197. Neurociências Julho/2010 Pág. 187 Neurofisiologiada música Felipe Viegas Rodrigues Laboratório de Neurociência e Comportamento rodrigues.fv@gmail.com Introdução A música é uma forma de arte e expressão humana presente mundialmente (Hauser e McDermott, 2003; Gray e col., 2001; Tramo, 2001), irrestrito a gênero, classe social, língua ou idade. Freqüentemente tratada apenas como uma manifestação cultural, um alvo de pesquisa “não-essencial” (Zatorre, 2003), essa distribuição global gera indícios de que a música é mais do que isso. Ainda assim, não há uma explicação clara e consensual de suas vantagens adaptativas (Pinker, 1998). A física por trás da música A grande maioria dos sons encontrados na natureza, senão todos, assim como notas musicais, são complexos, formados pela composição espectral de ondas senoidais (isto é, por mais de uma freqüência). A composição de várias ondas produz um som muito específico, que carrega uma “assinatura sônica” do corpo que a produz. É o seu timbre. Se tal som tem período definido (chamado som musical) ele possuirá uma freqüência fundamental, igual à freqüência da senoidal de menor comprimento de onda na composição espectral. As outras ondas envolvidas naquela composição são chamadas de harmônicos e são múltiplos da freqüência fundamental. É justamente a composição espectral de seus harmônicos que dá a cada som seu timbre. A uma composição qualquer é dado o nome série harmônica. Notas musicais são uma classificação subjetiva de freqüências sonoras ao longo do nosso espectro de audição. Elas estão baseadas em uma tonalidade, a qual é um atributo perceptual do som, o que se contrapõe à freqüência, que é um atributo físico (Bendor e Wang, 2006). É por isso que nem todos os povos utilizam o mesmo Sistema de Afinação para compor suas notas musicais (ver Porres, 2007), isto é, diferentes culturas utilizam em suas músicas diferentes instrumentos musicais com diferentes conjuntos de notas musicais. Apesar das diferenças interculturais, há algumas particularidades nos sistemas de afinação; uma característica sempre presente, independente do sistema de afinação utilizado é a repetição de notas ao longo do espectro de audição, isto é, por mais que escutemos sons distintos, um mais grave e outro mais agudo, eles ainda soam muito semelhantes (e são considerados a mesma nota musical). Portanto, ao longo do espectro de audição, temos um determinado conjunto de notas (definido de acordo com o sistema de
- 198. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 188 Julho/2010 afinação utilizado) se repetindo em intervalos regulares. A esse fenômeno dá-se o nome oitavas musicais. É possível explicar neurofisiologicamente esse fenômeno. Base dos mecanismos neurais da música em humanos Além do arranjo já descrito no primeiro capítulo deste módulo, temos populações de neurônios específicas para a percepção de freqüências fundamentais. Bendor e Wang (2005), estudando o córtex de sagüis, encontraram em A1 neurônios capazes de disparar potenciais de ação não apenas para um único som complexo, mas também para seus múltiplos. Exemplificando: a mesma população de neurônios que dispara para sons com freqüência fundamental de 440 Hz, dispara também para sons com fundamental em 110, 220, 880, 1.760, 3.520 Hz e etc. Uma dada população pode disparar inclusive na ausência da freqüência fundamental, quando apenas os outros harmônicos da composição espectral daquele som estão presentes. Essa descoberta colabora para o entendimento de como o sistema nervoso processa informações para a percepção de timbre, conceito, que apesar da extrema relevância (bebês recém-nascidos são capazes de reconhecer o timbre da voz de suas mães) (Trehub e Hannon, 2006), ainda não tinha o mecanismo fisiológico que o descrevia completamente compreendido. É o disparo dessas populações de neurônios que permite que nós associemos vozes diferentes (devido ao espectro de frequências específico das cordas vocais de cada pessoa) como semelhantes, quando a fundamental envolvida é a mesma: tais neurônios disparam para sinalizar essa fundamental. Estes mecanismos perceptuais nos mostram dois fatos importantes: (1) a percepção de tons musicais está na base do mecanismo fisiológico que propicia a audição em humanos (e, provavelmente, também em outros organismos); (2) fazemos a classificação de notas musicais de acordo com aquilo que nosso cérebro está apto a perceber e não por pura subjetividade. Convencionamos chamar todo som com freqüência fundamental de 440 Hz de “Lá”. Mas também assim chamamos seus múltiplos (as oitavas) porque temos uma mesma população de neurônios disparando potenciais de ação para todos eles, em última instância, fornecendo ao ouvinte a percepção de tais sons são iguais em alturas diferentes. Música para quê? Os mecanismos anteriormente descritos, no entanto, não justificam por si só a existência de música globalmente. Enfim, para que existe música? Há vantagens evolutivas nela? Diversos autores já tentaram responder a essa pergunta (Gess, 2007; Masataka, 2007; Hauser e McDermott, 2003; Benítez-Bribiesca, 2001; Gray e col., 2001; Tramo, 2001;
- 199. Neurociências Julho/2010 Pág. 189 Wrighte col., 2000; Pinker, 1998; Clark, 1879, Darwin, 1874; para citar alguns) e não há consenso nas respostas. O autor Steven Pinker estabelece uma proposta bem abrangente, baseada em seis pontos principais, para tentar responder à questão. Ele ousa dizer: “Eu suspeito que a música seja um ‘bolo de queijo’ auditivo, uma confecção rara artesanalmente construída para agradar os pontos sensíveis de pelo menos seis de nossas faculdades mentais” (Pinker, 1998 - pág. 534). O primeiro aspecto levantado por Pinker é a própria fala. O autor defende que a letra presente nas músicas faz com que ela ative circuitos neurais “emprestados”, em particular, da prosódia. Achados mais recentes, relacionando música e linguagem, serão apresentados mais adiante neste texto. O segundo aspecto refere-se ao circuito neural relacionado à análise auditiva do ambiente. Pinker compara a audição à visão, dizendo que assim como recebemos uma série de estímulos luminosos que precisam ser diferenciados e separados (uma pessoa de um fundo de árvores, por exemplo), precisamos distinguir os diversos estímulos sonoros que nos são apresentados, por exemplo, separar um solista de uma orquestra, uma voz em um ambiente cheio de ruídos, uma vocalização animal em meio a uma floresta cheia de ruídos. O autor defende que nosso ouvido detecta cada freqüência e envia cada uma delas ao sistema nervoso, que as associa, percebendo-as como um tom complexo. “Presumivelmente o cérebro as associa para construir nossa percepção da realidade do som” – pág. 535. Isto é, a interpretação em tons complexos provavelmente se dá pelo fato de que sons naturais não ocorrem em freqüências puras, mas como tons complexos; logo, o sistema nervoso associa novamente as diferentes freqüências que constituem um som oriundo de um mesmo ponto no espaço e ao mesmo tempo porque são, em verdade, uma mesma fonte sonora. Nesse sentido, “melodias são agradáveis ao ouvido pela mesma razão que linhas simétricas, regulares, paralelas ou repetitivas são agradáveis aos olhos”. O sistema nervoso, então, se utiliza desse circuito neural para fazer a interpretação das melodias e harmonias presentes na música. O terceiro aspecto defendido por Pinker é a emoção trazida pela música. Baseando-se na sugestão de Darwin de que a música surgiu no homem devido às chamadas de acasalamento de nossos ancestrais, o autor defende que uma série de “chamadas emocionais” (como murmurar, chorar, rir, resmungar, gritar) tem um apelo acústico próprio; “é provável que melodias evoquem fortes emoções porque sua estrutura assemelha-se a chamadas emocionais de nossa espécie”. A música, então, traria diversos sentimentos à tona semelhantemente a essas expressões emocionais. É interessante notar que, segundo tal proposta de Darwin, a música poderia ser até anterior à fala. Outro aspecto apontado por Pinker é a seleção de habitat. Fazendo mais uma comparação entre o campo visual e auditivo, o autor ressalta que prestamos atenção a uma
- 200. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 190 Julho/2010 série de características visuais que sinalizam segurança, insegurança ou mudança de habitat, como vistas distantes, paisagens verdejantes, nuvens (que trazem chuva) ou pôr- do-sol. Ele então escreve: “Talvez nós também prestemos atenção a características do mundo auditivo que sinalizem segurança, insegurança ou mudança de habitat. Trovões, ventos, água correndo, pássaros cantando, rosnados, passos, corações e galhos batendo, todos têm efeitos emocionais, presumivelmente porque eles revelam eventos dignos de atenção no mundo” - pág. 537. A música também interferiria com tais circuitos neurais, de tal forma que ela altera nossas emoções e nossa noção de segurança ou insegurança. O quinto aspecto ressaltado por Pinker é o controle motor. O ritmo é um componente universal da música e até mesmo único em algumas culturas. Tal ritmicidade que nos faz dançar, bater palmas, balançar, e acompanhar a música, certamente estimula nosso sistema motor. O último aspecto defendido pelo autor é um “algo a mais” sem explicação conhecida e que ele coloca como sendo, possivelmente, desde um acidente do funcionamento conjunto de diversos circuitos neurais até uma ressonância entre disparos neuronais e ondas sonoras. As sobreposições entre música e linguagem vão muito além do relatado por Pinker (1998) em seu livro. Patel (2003a) faz uma revisão da sobreposição existente no processamento da sintaxe. Música também possui sintaxe e circuitos neurais que fazem o processamento dessa característica musical parecem ser os mesmos utilizados para a fala. A evidência vem de ambos os processos gerarem um potencial evocado P600, significativamente indistinto em amplitude e distribuição no escalpo, após a apresentação de sentenças verbais ou seqüências de acordes musicais com incongruências de sintaxe (baseadas em regras de estrutura verbal para os estímulos verbais e regras harmônicas para os estímulos sonoros). O processamento sintático ocorre em regiões do lobo frontal anterior. Koelsch e col. (2004) testaram a capacidade da música para representar significados. Eles apresentaram palavras aleatórias a voluntários após eles terem ouvido ou uma frase ou um trecho musical (apenas instrumental). Um eletroencefalograma com registro de potenciais evocados mostrou a expressão de um componente N400 para a apresentação de palavras não relacionadas ao estímulo inicial, independente deste ser uma frase ou um trecho musical, o qual não variou em latência, distribuição no escalpo, fontes neurais e amplitude. O componente N400 já havia sido descrito em experimentos de semântica, aparecendo após a apresentação de palavras não relacionadas com o contexto
- 201. Neurociências Julho/2010 Pág. 191 prévio.Diante dos resultados, os autores concluíram que “a música pode não apenas influenciar o processamento de palavras, mas ela pode também pré-ativar representações de conceitos, sejam eles abstratos ou concretos, independente do conteúdo emocional desses conceitos”; em outras palavras, assim como a linguagem, a música pode facilitar a compreensão de significados (em palavras e, provavelmente, também contextos). Há ainda mais: paralelos entre a rítmica da linguagem e a da música (Patel, 2003b). A análise do ritmo da linguagem e da música em subcomponentes e a comparação entre os domínios revelam que o agrupamento rítmico é semelhante na linguagem e na música, mas não sua estrutura periódica (que é mais organizada na música). Novas evidências ainda sugerem que a rítmica de linguagem de uma cultura deixa impressões na sua rítmica musical. Isto é, diferenças na rítmica da linguagem refletem-se na rítmica musical nas diferentes culturas. Esses achados reforçam a noção de que a música possui tanto sintaxe quanto semântica e seja, possivelmente, como a linguagem, relativamente inerente ao homem e não um simples produto da cultura. Novos estudos transculturais permitirão afirmar se essas evidências se confirmam. Fica claro, portanto, que a música tem estreitas e importantes relações com o funcionamento de diversos circuitos neurais. Estes não foram selecionados por vantagens adaptativas trazidas pela música, mas permitem, em última instância, sua criação e percepção. A própria capacidade de discriminação de timbres seguramente não é produto da necessidade de reconhecimento de diferentes instrumentos musicais. O reconhecimento de sons complexos com freqüência fundamental definida é importante também para diferenciar diferentes vocalizações de animais na natureza, além da própria comunicação entre indivíduos; eles seriam uma boa indicação para distinguir as vocalizações de ruídos de fundo (Zatorre, 2005). As tonalidades e o timbre certamente serviriam também à identificação de vozes (lembrem-se dos bebês reconhecendo a voz da mãe). A percepção de sons complexos evoluiu ao ponto de tornar a percepção de dois sons muito consonantes como iguais, não só em humanos (Wright e col., 2000). Essa percepção, provavelmente deu vantagem adaptativa aos seus possuidores. Qual ou quais vantagens é algo ainda incerto. (Pinker, 1998). Origens da musicalidade Se de fato a música tem envolvimento com tantos circuitos neurais, essa propriedade não pode ser uma exclusividade apenas da espécie humana, mas deve estar presente no cérebro de outros animais também. A capacidade para interpretar música, de uma forma diferente de outros sons quaisquer (também chamados sons não musicais) ou, até mesmo, produzi-la, deve estar presente pelo menos em outras espécies de mamíferos. O primeiro grupo lembrado quando se fala de música em animais, no entanto, são
- 202. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 192 Julho/2010 os pássaros. Desde o século retrasado (Clark, 1879) tal grupo é investigado. As razões são óbvias, percebidas por qualquer pessoa que já tenha entrado em contato com a natureza (e escutado o som dos pássaros). Estudos recentes sobre o assunto (Baptista e keister, 2000) apontam semelhanças entre a melodia do canto dos pássaros e as melodias produzidas pelo homem. Segundo os autores, os pássaros “frequentemente usam as mesmas variações rítmicas, relações tonais, permutações e combinações de notas que os compositores humanos”. Detalhes presentes nas músicas produzidas pelo homem são também notadas nas melodias usadas pelos pássaros, como inversões de intervalo, relações harmônicas simples e retenção de uma determinada melodia com a troca de registro (tonalidade) usado. O caso mais atípico e impressionante, talvez, seja da espécie Probosciger aterrimus, a Cacatua-Negra, uma espécie de papagaio do extremo norte da Austrália e Nova Guiné, que molda gravetos para que se assemelhem a baquetas (de bateria) e batucam em diversos troncos até que achem um com ressonância agradável e, então, o utilizam para produzir sons como parte de seu ritual de acasalamento. Mas voltando aos mamíferos, Wright e col. (2000), trabalhando com macacos- rhesus, mostraram que os mesmos são capazes de reconhecer como semelhantes melodias idênticas tocadas em oitavas diferentes, mas não em tons diferentes. Ainda, tal reconhecimento positivo aconteceu para melodias tonais, mas não para melodias atonais. Estes resultados são consistentes com o achado de Bendor e Wang (2005), já descrito. O experimento de Wright e colegas, porém, pode ter sido afetado pela exposição prévia dos animais a música. Freqüentemente tais animais ficam em ambientes com televisões ligadas para os mesmos (Hauser e McDermott, 2003), portanto, expostos a música e melodias diversas. É provável que o caso mais conhecido e consistente de musicalidade nos mamíferos esteja nas baleias-jubarte (Megaptera novaeangliae). Há décadas que se conhece o “canto” dessas baleias e estudos recentes (Payne, 2000) também apontam para semelhanças estreitas com as regras de construção musical utilizadas pelo homem. A despeito de poderem produzir sons sem ritmicidade ou tonalidade, as baleias optam por produzir sons rítmicos, de forma semelhante a composições humanas e com tonalidade definida. Mais do que isso: - O canto produzido por elas é composto de fraseados de tamanho semelhante às frases na música composta por homens e, assim como nós, elas exploram diversos fraseados dentro de um mesmo tema antes de partir para um tema diferente. Da mesma forma, são freqüentes composições que exploram um tema, partem para uma seção mais elaborada e, depois, retornam ao tema inicial (semelhante ao nosso formato de composição: estrofe – refrão – estrofe); - O tamanho total de um canto (uma música?) assemelha-se ao tamanho médio
- 203. Neurociências Julho/2010 Pág. 193 demúsicas produzidas pelo homem, possivelmente pelo fato de que o tamanho de seu córtex permite uma capacidade atencional semelhante à nossa; - Ainda que elas tenham uma extensão tonal que alcança sete oitavas musicais, as baleias preferem compor músicas com intervalo entre notas também semelhantes às nossas composições (que raramente explora toda essa extensão em uma única composição); - Elementos percussivos são incorporados à música e intercalados com tons puros numa taxa semelhante àquela encontrada em composições humanas; - Algumas repetições encontradas são semelhantes a rimas, indicando que as baleias possam usar desse artefato tanto quanto os humanos usam: um recurso mnemônico para lembrar-se de composições complexas. Tantos elementos comuns entre os sons musicais produzidos por essas diferentes espécies apontam para o fato de que a música não possa ser apenas um produto cultural humano. Nas palavras de Gray e col., 2001: “O fato de que a música das baleias e dos homens tem tanto em comum, mesmo com nossos caminhos evolucionários não tendo se cruzado em 60 milhões de anos, sugere que a música deve ‘predar’ os humanos, ao invés de sermos os inventores dela. Nós somos adeptos tardios do ambiente musical.” – pág. 53 Tais indícios de produção musical em outras espécies animais reforçam a idéia de que as raízes da musicalidade devem residir em outros fatores que não a cultura humana. Talvez uma conseqüência natural da interação entre as freqüências sonoras, que causa sons mais ou menos desagradáveis ao encéfalo dependendo das freqüências envolvidas. De fato, as notas utilizadas no sistema de afinação da música ocidental, e em grande parte do mundo, são derivadas da Série Harmônica (ver http://www.phy.mtu.edu/~suits/overtone.html para maiores detalhes), com as escalas musicais sendo construídas com base nas interações entre notas de maior consonância. Sons musicais chamados de dissonantes causam um fenômeno chamado batimento, relatado como desagradável pela grande maioria das pessoas e que são freqüentemente utilizados na música para gerar sensações de suspense e tensão. Ainda, sons dissonantes apresentados a bebês de apenas quatro meses causam afastamento da fonte sonora, expressões faciais fechadas e até choro, enquanto que sons consonantes os fazem virar-se para a fonte sonora e freqüentemente sorrirem (Trainor e Heinmiller, 1998). Dado que recém-nascidos não tem conhecimento algum de escalas musicais, é improvável que tais respostas emocionais à música acontecem nestes da mesma forma que elas acontecem nos adultos. É então plausível que a própria física da interação de freqüências induza a percepção daquilo que é agradável ou desagradável e permita a produção ou
- 204. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 194 Julho/2010 reconhecimento de sons musicais mesmo em espécies que não o homem. Apesar de tantas evidências, a falta de consenso entre pesquisadores sobre a musicalidade em outras espécies animais permanece. As críticas são freqüentemente embasadas no fato dos cantos serem essencialmente produzidos por machos, como parte do ritual de acasalamento. Ainda assim, tal uso não invalida que elas sejam capazes de produzir sons musicais e que a estrutura das “músicas” produzidas seja semelhante à humana. Muito pelo contrário, a organização musical semelhante entre diferentes espécies nos mostra que ela não é um acidente, mas uma propriedade específica do sistema nervoso central, que caminha em estreitas relações com a comunicação intra-específica e a seleção sexual. É possível que a origem da musicalidade de humanos resida nestes mesmos mecanismos (de seleção sexual), como apontado por Darwin. Mais provável ainda que sua existência se apóie em diversos fatores e não apenas em um deles, uma propriedade emergente da interação de diversos sistemas, como apontado por Pinker (1998). Independente dos motivos pelos quais a música se originou no homem, seguramente os motivos pelos quais ela permanece são outros (a não ser que ela já tenha se originado por esses outros motivos, claro – improvável quando se compara com outros grupos). Na espécie humana, a música adquire outros significados muito mais fortes como promover a coesão de grupo e a interação social (podendo até possuir a mesma capacidade de abstração e atribuição de significados que a linguagem, como apontado por Koelsch e col., 2004). Se há algo de exclusivo entre homem e música, isso parece ser a produção e a apreciação da mesma por puro prazer. Bibliografia Arendt, D., Wittbrodt, J. (2001). Reconstructing the eyes of Urbilateria. Phil.Trans. Roy. Soc. Lond. B 356: 1545-1563. Arendt. D. (2003) Evolution of eyes and photoreceptor cell types Int. J. Dev. Biol. 47: 563-571 Autuori, M. (1940) Algumas observações sobre formigas cultivadoras de fungo (Hym. Formicidae). Revista de Entomologia, v.11. Autuori, M. (1941) Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp.). I. Evolução do sauveiro (Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908). Arquivos do Instituto Biológico São Paulo, v.12, p.197- 228. Autuori, M. (1942) Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp.-Hymenoptera-Formicidae). III. Escavação de um sauveiro (Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908). Arquivos do Instituto Biológico São Paulo, v.13, p.137-148. Baddeley AD, Hitch G. 1974. Working memory. In The Psychology of Learning and Motivation, vol. 8, ed. Bower GA. New York: Academic Press, pp.47-89.
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- 212. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 202 Julho/2010
- 213. Unidade 4 Metabolismo Aline Dal’OlioGomes Lab. de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos eniladal@gmail.com Entendemos como Metabolismo um conjunto de reações químicas que mantém um organismo vivo. Os processos metabólicos variam ajustando as respostas dos animais tanto às suas necessidades endógenas quanto às mudanças ambientais. Sendo assim, este módulo irá abordar as variações do metabolismo animal decorrentes de diferentes fatores bióticos e abióticos com especial ênfase em metabolismo energético e temperatura: 1) abordagem geral das definições que envolvem o metabolismo energético, seguida da apresentação de como os fatores abióticos influenciam o metabolismo usando como exemplo a temperatura; 2) técnicas de medida do metabolismo energético em diferentes condições fisiológicas, com especial atenção à técnica de respirometria; 3) a influência do metabolismo nos fenômenos comportamentais de vertebrados ectotérmicos frente às alterações da temperatura ambiental; 4) regulação da temperatura e metabolismo dos animais endotérmicos e ajustes da febre e queda regulada da temperatura corpórea relacionada a depressão metabólica em vertebrados; 5) os fenômenos de depressão metabólica e dormência sazonal apresentados por animais de diferentes grupos como adaptação comportamental, fisiológica e bioquímica; 6) interação entre metabolismo energético e reprodução, importância dos lipídios nesse processo e como esses compostos podem variar em relação a dieta dos pais e às condições do ambiente; 7) finalizamos o módulo procurando entender o efeito ecofisiológico da temperatura no metabolismo e como este pode ajudar a estabelecer os limites ambientais em vários processos fisiológicos dos indivíduos e, conseqüentemente, a viabilidade das populações, comunidades e ecossistemas, podendo atuar de um modo ativo na conservação ambiental.
- 214. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 204 Julho/2010 Capítulo 19 Metabolismo e Temperatura: Conceitos e Implicações pág. 205 Carlos Eduardo Tolussi Revisado pela Dra. Renata Guimarães Moreira Capítulo 20 Medindo a chama da vida pág. 217 Tatiana Hideko Kawamoto Revisado pela Dra. Silvia C. Ribeiro de Souza Capítulo 21 Ectotermia: um acesso de baixo custo à vida pág. 235 Jessyca Michele Citadini Revisado pela Dr. Carlos Arturo Navas Capítulo 22 Termorregulação em endotérmicos: febre e anapirexia. “Ana” o quê? pág. 247 Carolina da Silveira Scarpellini Revisado pela Dra. Kênia Bícego Capítulo 23 Metabolismo energético em câmera lenta: mecanismos de depressão metabólica sazonal pág. 257 Lilian Cristina da Silveira Revisado pela Dra. Silvia C. Ribeiro de Souza Capítulo 24 Custos e benefícios da reprodução: papel dos lipídios pág. 269 Aline Dal’ Olio Gomes Revisado pela Dra. Renata Guimarães Moreira Capítulo 25 A ecofisiologia no cenário das mudanças climáticas globais pág. 279 Lye Otani Revisado pela Dr. Carlos Arturo Navas Bibliografia pág. 286
- 215. Metablismo Julho/2010 Pág. 205 Metabolismoe Temperatura: Conceitos e Implicações Carlos Eduardo Tolussi Laboratório de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos ctolussi@gmail.com Metabolismo: conceitos e considerações gerais O metabolismo é definido como o conjunto de transformações das moléculas orgânicas catalisadas por enzimas nas células vivas; a soma do anabolismo e catabolismo. As milhares de reações químicas catalisadas por enzimas nas células são organizadas funcionalmente em muitas sequências de reações, na qual o produto da primeira reação se torna o reagente da próxima (Nelson e Cox, 2005). Dentre essas reações, algumas degradam nutrientes orgânicos em produtos finais simples, extraindo energia química e a convertendo em uma forma útil para a célula; juntas essas reações degradativas, produtoras de energia livre, são designadas como catabolismo (Fig. 1). Outras vias começam com moléculas precursoras pequenas e são convertidas em moléculas mais complexas e maiores, incluindo as proteínas e os ácidos nucléicos. Tais vias biossintetizadoras, que invariavelmente requerem a adição de energia, são coletivamente designadas de anabolismo (Fig. 1) (Nelson e Cox, 2005). Na ausência de trabalho externo ou de armazenagem de energia química, toda energia liberada durante os processos metabólicos é transformada em calor. Este fato simples torna possível usar a produção de calor como índice de metabolismo energético (taxa metabólica), desde que o organismo esteja em um estado térmico estável com o ambiente (Randall e col., 2000). Segundo Schmidt-Nielsen (2002), a taxa metabólica refere-se ao metabolismo de energia por unidade de tempo, e pode ser medida em princípio por três métodos distintos. 1) Cálculo dos valores energéticos ingeridos e o valor de todos os excrementos (principalmente fezes e urina). Esse método supõe que não haja alteração na composição do organismo, portanto, ele não pode ser usado para os organismos em crescimento ou aqueles que têm alguma alteração na quantidade de gordura ou de outro material; 2) Cálculo através da produção de calor do organismo. Esse método fornece informações sobre todo o combustível utilizado e, em princípio, é o método mais preciso; 3) Cálculo da quantidade de oxigênio utilizada nos processos de oxidação, desde que haja informações sobre as substâncias oxidadas (não havendo metabolismo anaeróbio).
- 216. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 206 Julho/2010 Figura 1– Esquema dos processos metabólicos, Anabolismo e Catabolismo (Modificado de Nelson e Cox, 2005). A taxa metabólica varia com o tipo e a intensidade dos processos que estão ocorrendo. Esses processos incluem o crescimento e o preparo de tecidos; o trabalho interno químico, osmótico, elétrico e mecânico; e o trabalho externo para a locomoção e comunicação. Desta forma, a energia ingerida pode seguir diferentes caminhos, sendo que uma parte desta será utilizada para realização de diferentes trabalhos como os descritos acima e também liberada na forma de calor (Fig. 2) (Randall e col., 2000). Para conhecer a taxa metabólica de um organismo, é necessário analisar primeiramente a taxa metabólica basal ou padrão (TMB), que consiste na menor taxa metabólica ou no mínimo de energia que o organismo necessita para viver (Hochachka e Somero, 2002). Com a TMB é possível calcular o quanto da taxa metabólica deste organismo foi alterada para realizar algum trabalho.
- 217. Metablismo Julho/2010 Pág. 207 Figura2– Caminho que a energia química dos alimentos segue nos animais (Modificado de Randall e col., 2000). Em mamíferos, para que a TMB seja validada deve ser levado em consideração as seguintes condições: a análise deve ser no estágio de desenvolvimento adulto; o organismo não deve ingerir alimentos (geralmente sendo utilizada uma noite em jejum para humanos); as condições de temperatura devem ser “normais” para aquela espécie; não deve haver condições estressantes; o animal deve estar em repouso. A TMB deve ser medida diretamente através da produção de calor, ou indiretamente pela medição do consumo de oxigênio (VO2 - volume de oxigênio por Kg por minuto). É possível também calcular a taxa metabólica de repouso (TMR), que é similar a TMB, mas neste caso o organismo não precisa estar em jejum (Hochachka e Somero, 2002). As técnicas para medidas do metabolismo energético serão abordados mais detalhadamente no próximo capítulo. É importante mencionar que a TMB é tecido especifico (Rolfe e Brown, 1997). Em humanos, por exemplo, o relativo tamanho do fígado, trato gastrointestinal, rim, pulmão, sistema nervoso, coração e músculos são 2; 2; 0,5; 0,9; 2; 0,4; e 42%, respectivamente, e a
- 218. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 208 Julho/2010 soma de todos estes tecidos representa 50% da massa total do organismo. Entretanto, a contribuição de cada tecido na TMB é de 17; 10; 6; 4; 20; 11 e 25% respectivamente, representando 90% da TMB em humanos (Hochachka e Somero, 2002). Como foi dito acima, a TMB pode variar devido a diferentes fatores, entre eles a temperatura. Por isso, é necessário medir o equivalente da taxa metabólica basal, na qual o animal não está gastando energia metabólica adicional para se aquecer ou resfriar. Por essa razão, a taxa metabólica padrão (TMP), é definida como o metabolismo do animal em repouso em jejum em certa temperatura corporal. Para alguns ectotérmicos, a TMP depende do histórico de sua temperatura prévia, em virtude da compensação metabólica ou da aclimatação térmica (Randall e col., 2000). Energia, Temperatura e Calor: conceitos e sua importância nos organismos Conceitos Serão apresentados abaixo os conceitos de energia e temperatura necessários para o entendimento dos tópicos abordados neste capítulo: a energia está relacionada à realização de trabalho, como a energia associada ao movimento (energia cinética). Existem outras formas de energia como a química provinda, por exemplo, através do ATP (Ferrano e Soares, 1998); Para a compreensão de como a temperatura pode interferir nos processos metabólicos é necessário compreender que, quando há um aumento da energia em uma molécula, a movimentação dos seus átomos é elevada, fazendo com que as mesmas se choquem com maior intensidade umas com as outras, tal processo é chamando de energia cinética molecular (Ferrano e Soares, 1998). temperatura é a grandeza que mede a intensidade da agitação térmica (Ferrano e Soares, 1998); calor é a energia em trânsito determinada pela diferença de temperatura entre os sistemas envolvidos (Ferrano e Soares, 1998). Endotermia e Ectotermia A velocidade das reações químicas aumenta com a temperatura, devido a isso, a atividade metabólica de um animal está relacionada diretamente com a sua temperatura corporal: animais com temperaturas corporais baixas apresentam taxas metabólicas reduzidas. Sendo assim, é possível utilizar a temperatura corporal, mais especificamente sua estabilidade, nos organismos para classificar os processos termorregulatórios corporais (Randall e col., 2000).
- 219. Metablismo Julho/2010 Pág. 209 Animaisexpostos a variações de temperatura em laboratório, seja no ar ou na água, que mantêm sua temperatura corporal acima da ambiental, regulando-a dentro de seus limites fisiológicos através do controle da produção e da perda de calor, são denominados homeotérmicos. Na maioria dos mamíferos, a faixa de temperatura corpórea central normal é de 37°C e 38°C e para as aves esta temperatura é próxima de 40°C. Alguns outros vertebrados conseguem controlar sua temperatura corporal desta maneira, embora tal controle seja limitado a períodos de atividade ou crescimento rápido desses organismos. Ao contrário disso, os pecilotérmicos são os animais nos quais a temperatura corporal tende a flutuar mais ou menos com a temperatura do ambiente, quando expostos a temperaturas do ar ou da água variadas experimentalmente (Randall e col., 2000). Previamente os peixes, anfíbios, répteis e invertebrados foram considerados pecilotérmicos e, aves e mamíferos homeotérmicos. Porém, com a progressão dos estudos de campo observou-se que esta classificação não era apropriada, já que, dependendo do ambiente em que o animal vive ou do seu comportamento a sua temperatura pode variar (Randall e col., 2000). Peixes que vivem em águas profundas, na qual as oscilações térmicas são dificilmente mensuráveis, apresentam uma temperatura corporal constante e, portanto, deveriam ser denominados homeotérmicos. Há também mamíferos que podem oscilar sua temperatura em vários graus, podendo chegar até a 0°C em períodos como a hibernação (Schmidt- Nielsen 2002). Devido a estas inconsistências em relação a classificação descrita acima, foi necessário a formação de uma outra nomenclatura baseada na “fonte corpórea” de calor, sendo separados em: os que geram calor metabólico, endotérmicos; e os que não geram calor, ectotérmicos (Randall e col., 2000). Endotérmicos são os animais que geram seu próprio calor corporal. A sua produção se dá pelo subproduto do metabolismo, elevando suas temperaturas corporais consideravelmente acima das temperaturas do ambiente. Os maiores exemplos são as aves e os mamíferos. Ectotérmicos são os animais que produzem calor metabólico em taxas comparativamente menores, normalmente muita baixas para permitir a endotermia. Frequentemente, os ectotérmicos têm baixas taxas de produção de calor metabólico e altas condutâncias térmicas, fazendo com que sejam pobremente isolados (Randall e col., 2000). O mecanismo fisiológico e comportamental adotado pelos diferentes vertebrados, ectotérmicos e endotérmicos, para o ajuste da temperatura corpórea será apresentado nos próximos capítulos. Um outro conceito a ser mencionado é o de heterotermia, que consiste na produção de vários graus de calor endotérmico pelos animais. Contudo, eles geralmente não regulam a temperatura corporal dentro de uma faixa estreita. Estes animais podem ser divididos em dois grupos, os heterotérmicos regionais e os heterotérmicos temporais. Os
- 220. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 210 Julho/2010 heterotérmicos regionais são geralmente ectotérmicos que podem alcançar temperaturas centrais elevadas, por meio da atividade muscular, enquanto seus tecidos periféricos se aproximam da temperatura ambiente, como alguns tubarões, salmão e muitos insetos voadores. Os heterotérmicos temporais constituem em uma grande categoria de animais cujas temperaturas variam muito com o tempo. Os monotremados, como os équidnas, assim como outros mamíferos e aves em torpor ou em hibernação são exemplos deste conceito (Randall e col., 2000). Metabolismo e Temperatura Tecido adiposo marrom, UCPs e avUCP Uma das formas utilizadas pelos mamíferos para produção de calor é através do uso do tecido adiposo marrom (TAP). Este tecido é estritamente de mamíferos, tentativas de encontrar órgãos que possuem uma grande geração de calor como o TAP em aves ou outros animais não mamíferos não foram bem sucedidas. Entretanto, aspectos fundamentais bioquímicos parecidos com o TAP foram encontrados difundidos nos eucariotos, que certamente perderam um órgão de geração de calor especializado como o TAP, mas eles são capazes de explorar alguns dos mecanismos bioquímicos usados pelo TAP para a produção de calor (Hochachka e Somero, 2002). O TAP é caracterizado pela alta densidade de triglicerídeos e uma grande concentração de mitocôndrias, sendo esta última característica a que a diferencia do tecido adiposo branco, que apresenta uma baixa quantidade dessa organela. Fisiológica e bioquimicamente, o TAP é caracterizado por uma série de circuitos de regulação genética, hormonal e neural que estão envolvidos na termorregulação dos mamíferos. Além disso, existe uma inserção de proteínas desacopladoras (UCPs) na membrana interna da mitocôndria, que media o influxo de prótons que não são ligados para a geração de ATP (Hochachka e Somero, 2002). A família das proteínas UCPs (principalmente a UCP1) está envolvida em uma parcial dissipação do gradiente eletroquímico de prótons da mitocôndria, que desacoplaria a fosforilação oxidativa, fazendo com que haja a produção de calor (Collin e col., 2005). Como mencionado anteriormente, não foi observado um TAP ou um tecido termogênico em outros animais (Toyomizu e col., 2002). Contudo, em pinguins foi encontrado desacopladores em células musculares quando os animais eram expostos ao frio (Skulache e Maslov, 1960; Skulache, 1963), sendo mediado pelos ácidos graxos (Levechev, e col., 1965). Além disso, foi descoberto outra proteína, denominada avUCP, que apresenta 70% dos aminoácidos idênticos as UCP2 e UCP3 de mamíferos. Demonstrou-se
- 221. Metablismo Julho/2010 Pág. 211 quea expressão da avUCP foi aumentada quando os animais foram aclimatados ao frio (Raimanbalt e col., 2001). Tais resultados experimentais para aves e os já conhecidos estudos prévios para mamíferos demonstram que a avUCP e a UCP1, respectivamente, são um dos responsáveis pela regulação térmica desses grupos que os permitem serem classificados como endototérmicos. Efeitos da temperatura nas proteínas Como já foi dito anteriormente, dentre um determinado limite, a temperatura causa efeitos em vários processos fisiológicos, como no metabolismo, mais precisamente na ação e no funcionamento das enzimas. A principal habilidade das enzimas é a diminuir a energia de ativação, que é o mínimo de energia requerida para uma reação ocorrer (Hochachka e Somero, 2002). A aplicação deste conceito será abordada com mais detalhes posteriormente. Os efeitos da temperatura sobre as taxas de atividade biológicas são quantificadas pelo cálculo do coeficiente de temperatura ou Q10. Este cálculo mede o efeito que a alteração de 10°C tem sobre uma determinada taxa de atividade biológica através da equação (Hochachka e Somero, 2002): Q10 = (k1/k2)10/(t1-t2) Na qual, k1 e k2 são a taxa constante determinada pelo aumento e diminuição da temperatura, t1 e t2 , respectivamente. Como pode ser observado abaixo (Fig. 3), com um Q10 de 2 e em uma temperatura inicial de 0°C, a taxa de consumo de oxigênio dobraria com um aumento de 10°C, quadruplicaria em 20°C, aumentando constantemente e de forma regular com a elevação da temperatura. Se o Q10 for de 3 o aumento seria 3, 9, 27 e assim por diante (Schmidt-Nielsen, 2002).
- 222. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 212 Julho/2010 Figura 3 – Relação da temperatura e o consumo de oxigênio (Modificado de Schmidt-Nielsen, 2002). Para muitos processos, como as taxas de respiração e metabólica, os valores de Q10 são próximos a 2, quando realizados testes em animais com uma taxa de temperatura corpórea “normal”. Para temperaturas que apresentam efeitos letais, o Q10 apresenta valores menores que 1, assim como para queda de temperatura o valor será menor que 2 também (Hochachka e Somero, 2002). A interferência da temperatura para que uma reação química ocorra, origina-se pelo fato de que a reatividade das moléculas é tipicamente dependente da sua energia cinética. Porém, isso é uma explicação parcial e qualitativa para os valores de Q10 observados nos cálculos biológicos. Uma alteração da temperatura em 10°C acarreta em uma menor mudança relativa na energia cinética das moléculas que integram o sistema, por exemplo, para 25°C uma mudança de 10°C representa apenas uma alteração entorno de 3% da média do nível de energia cinética (Hochachka e Somero, 2002). Isto é explicado pelo fato de que a energia cinética das populações de moléculas segue uma função Maxwell- Boltzmann. Essa função aborda que as partículas possuem um intervalo de diferentes velocidades, e a velocidade de uma determinada partícula varia constantemente devido a colisões com outras partículas (Fig. 4). No entanto, a fração de um número grande de partículas, dentro de um determinado intervalo de velocidade é quase constante. Com isso, é importante considerar não apenas a frequência do nível de energia que ocorre dentro da
- 223. Metablismo Julho/2010 Pág. 213 população,mas também, que a energia daquele sistema é maior que a média de energia para que ocorra a reação, com isso podemos explicar porque os valores de Q10 ficam em torno de 2 mesmo com a elevação de 10° da temperatura (Hochachka e Somero, 2002). Figura 4–Relação da energia de uma molécula e a energia de ativação (Modificado de Hochachka e Somero, 2002). Dito isto, é importante mencionar a interferência da temperatura nos eventos catalíticos das enzimas e para entendermos como se dá esta interferência é preciso responder duas questões: Porque as enzimas são capazes de direcionar as transformações químicas de maneira tão rápida em temperaturas biológicas adequadas? Porque que a temperatura é tão importante na atividade enzimática? Estas duas questões estão ligadas diretamente com as mudanças da estrutura tridimensional (conformação) da enzima (Hochachka e Somero, 2002). A questão da velocidade da atividade catalítica das enzimas foi respondida graças aos métodos que possibilitaram a caracterização da sua estrutura tridimensional. Isso permitiu desvendar as mudanças conformacionais no ciclo de catálise, abrangendo a ligação do substrato na enzima e o fim com a liberação do produto. Esses métodos mostraram a existência de eventos complexos ocorrendo durante o processo catalítico e que são inadequadamente representados pela descrição convencional das reações enzimáticas (Hochachka e Somero, 2002): 1) Enzima + substrato enzima – substrato 2) Complexo complexo ativado 3) enzima – produto complexo 4) enzima + produto
- 224. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 214 Julho/2010 Apesar do esquema de catálise enzimática estar de forma geral correto, há falhas na sugestão do processo da estrutura da enzima durante o ciclo da catálise (Hochachka e Somero, 2002). Os quatro degraus existentes de ativação com a notável capacidade da enzima de alterar altas taxas das ligações covalentes no esquema acima demonstram que após o substrato se ligar a enzima (degrau 1) há a formação e ativação de um complexo (degrau 2). Os recentes estudos sobre o funcionamento das enzimas concluíram que o principal evento que governa o ciclo da catálise não é a alteração nas ligações covalentes dos reagentes (transformação do substrato em produto), mas sim as mudanças conformacionais durante a ligação e liberação do substrato que alteram a barreira da energia de ativação para formar ou quebrar as ligações covalentes dos substratos (Hochachka e Somero, 2002) (Fig. 5). Figura 5 - Ilustração do funcionamento das enzimas e transformação dos substratos em produtos (Modificado de Hochachka e Somero, 2002).
- 225. Metablismo Julho/2010 Pág. 215 Épossível integrar os conceitos de energia mudando a conformação da molécula em temperaturas biológicas normais, e é por isso que as enzimas podem reduzir a energia de ativação. Desta forma, a alteração da temperatura pode alterar a conformação da enzima e isto acarretaria na alteração do vácuo catalítico (local onde há a transformação de substrato em produto), que gera uma alteração na formação ou na quebra das ligações covalentes alterando a energia de ativação que pode resultar na diminuição da velocidade da reação (Hochachka e Somero, 2002). Os fatores mencionados acima ilustram a relação da temperatura com os processos biológicos, principalmente o metabolismo, demonstrando a importância desse fator abiótico nos organismos endotérmicos e mais fortemente nos ectotérrmicos, já que esses não possuem mecanismos fisiológicos como as UCPs para controlar a sua temperatura corporal. Com base nisso, nos capítulos posteriores serão apresentadas algumas técnicas utilizadas para medir o metabolismo animal e os diferentes mecanismos utilizados por animais ectotérmicos e endotérmicos no ajuste dos processos metabólicos frente as alterações ambientais.
- 226. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 216 Julho/2010
- 227. Metablismo Julho/2010 Pág. 217 Medindoa chama da vida Tatiana Hideko Kawamoto Laboratório de Ecofisiologia e Fisiologia Evolutiva th.kawamoto@gmail.com Este capítulo foi baseado no livro Measuring Metabolic Rates de John R.B. Lighton (2008). Neste capítulo será apresentado um contexto histórico do desenvolvimento de técnicas para medidas do metabolismo, mostrando os principais estudos de metabolismo e temperatura que serviram de base para o que conhecemos hoje. Contudo, veremos que a ciência não segue uma seqüência de eventos ordenada nem linear, e nem caminha progressivamente da completa ignorância para o conhecimento completo da realidade. Longe disso, as descobertas científicas e paradigmas geralmente percorrem um grande e tortuoso percurso histórico. Para o desenvolvimento do conceito de metabolismo, apresentado no capítulo anterior, não foi diferente do que o que ocorre na ciência em geral. Entremeada com os trabalhos dos primeiros alquimistas, as primeiras medidas de metabolismo demoraram cerca de 100 anos para serem feitas desde o surgimento das primeiras idéias de metabolismo energético. O problema não era, a princípio, a medida de metabolismo energético em si, mas a necessidade de desvendar o que era o fogo, o ar e a vida. A seqüência de eventos históricos, simplificada para fins didáticos, apresenta três relações chave entre: ar e vida, fogo e ar, e fogo e vida. A conexão mais intuitiva é a relação entre ar e vida. Desde os primórdios da humanidade sabemos que a vida é depende do ar. Leonardo da Vinci (1452–1519), em seu Codex Atlanticus produzido entre os anos de 1478 a 1519, declarou sem maiores explicações que “onde uma chama não pode arder, nenhum animal que respira pode viver” (tradução livre). O grande desafio para desenvolvimento do conhecimento sobre a relação entre ar e vida, no entanto, não era exatamente saber que a vida estava ligada à presença de ar, mas sim, entender o que é o ar e como ele suporta a vida. A composição do ar foi desvendada juntamente com a compreensão de alguns aspectos sobre o fogo e o processo de combustão. Boa parte do conhecimento que temos hoje sobre a matéria foi moldado pelas experimentações alquimistas, pré-método científico. Em algumas das muitas tentativas de transformar outros metais em ouro, ou de encontrar o elixir da longevidade, os alquimistas perceberam que, ao término da chama, a queima do carvão deixava pouco ou nenhum resíduo. A partir daí, deduziram a existência de uma substância vital presente no material a ser queimado que sustentava e era a própria chama. Eis que entre 1703 e 1731 o protoquímico e médico alemão Georg Ernst Stahl (1660–1734) propuseram o nome de flogisto para a tal substância. Segundo a teoria do
- 228. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 218 Julho/2010 flogisto, a combustão cessava quando o ar ficava saturado dessa substância, ou o material esgotava a sua quantidade de flogisto. Este era o caso da queima de metais, cuja calcinação deixava para trás como resíduo o calx, o metal supostamente “deflogisticado”. O calx quando combinado com carvão, teoricamente repleto de flogisto, voltava à sua forma metálica anterior a calcinação, reforçando a teoria do flogisto. Um pouco antes da ampla aceitação da teoria do flogisto, Robert Boyle realiza experimentos mostrando que quando a pressão do ar ao redor de velas, pássaros e camundongos diminui até certo nível, eles morrem, demonstrando que algo no ar mantinha tanto a chama da vela quanto a vida dos animais testados. Neste contexto, o ar não podia estar saturado de flogisto, já que o que se estava fazendo era liberar mais espaço para o flogisto e, no caso dos animais, não havia chama para saturar o ar de flogisto. Boyle também mostra que o metal calcinado não perde peso, contrário do que seria esperado pela teoria, mas sim ganha peso, reforçando ainda mais as idéias contra o flogisto. Mas é John Mayow (1643–1679) quem faz a pergunta chave: será que a combustão e a vida são mantidas pela mesma substância? Ao colocar um camundongo em uma jarra com a abertura voltada para uma vasilha com água (Fig. 1) ele observou o nível da água subir até o momento que o animal morria. O nível da água sempre subia mais ou menos até o mesmo nível. O camundongo estava claramente consumindo algo do ar. O mesmo acontecia com a vela. Mayow havia inventado o primeiro respirômetro semi-quantitativo. Ele ainda colocou a vela e o camundongo juntos, na mesma jarra, e observou que quando a vela apagava, instantes depois o camundongo morria, sugerindo que ambos eram sustentados pela mesma substância presente no ar, a qual chamou de “nitro-aereus”. Incrivelmente, a partir dessas primeiras descobertas ele propôs que o nitro-aereus passava pelos pulmões, depois para o sangue onde combinava com o combustível aí presente aquecendo o animal. Propôs ainda que o mesmo acontecia na atividade muscular e no coração. Essa substância era o que conhecemos hoje como oxigênio. Pouco tempo depois de ganhar alguma notoriedade com essas descobertas e de se tornar membro da Royal Society, John Mayow morre, encerrando abruptamente uma carreira científica que prometia inúmeras descobertas mais. O próximo pesquisador que coleciona descobertas que serviram de base para o entendimento do metabolismo energético foi Joseph Priestley (1733–1804). Ele vivia ao lado de uma cervejaria e, primeiro, descobriu que o gás resultante da fermentação da cevada Figura 1 - Ilustração mostrando o equipamento usado por John Mayow em seus experimentos de combustão e respiração. Consiste em uma jarra de vidro virada com a abertura em um recipiente repleto de água (Modificado de http://en.wikipedia.org/wiki/File:Mayow).
- 229. Metablismo Julho/2010 Pág. 219 extingueo fogo. Percebeu, ainda, que o gás que não sustenta mais a chama, em parte dissolve em água e é semelhante ao gás da fermentação da cevada. Além disso, ele descobriu que ao jogar óleo de vitriol sobre giz ele conseguia produzir este mesmo gás que ele chamou de “fixed-air”. Havia, uma terceira fração desse ar que sobrava após a chama se apagar que não sustentava mais a chama e nem dissolvia em água. Prietley pensou ter descoberto o flogisto. Hoje conhecemos essa substância como nitrogênio. Ele percebeu ainda que parte do ar que sobrava na jarra após o camundongo morrer também era “fixed air”. Propôs ainda que o “fixed air” seria retirado do ar pelas plantas permitindo que o ar sustentasse a vida e a combustão novamente. O “fixed air” nada mais é que o nosso gás carbônico. Priestley produziu, ainda, um outro gás ao aquecer óxido de mercúrio. Incrivelmente, este gás sustentava a chama de velas de forma mais intensa e por mais tempo do que o próprio ar. Neste momento ficamos tentados a antever o próximo passo e dizer que Priestley descobre o oxigênio e derruba a teoria do flogisto. Entretanto, como dito no início deste texto, a ciência percorre caminhos tortuosos e, por mais contraditório que pareça, Priestley foi um dos mais ardorosos defensores do flogisto e interpretou todos os seus incríveis resultados segundo este paradigma. De fato foi a partir desta perspectiva que ele descreveu o experimento em que o óxido de mercúrio é aquecido, atribuindo erroneamente o efeito ao processo de deflogisticamento do ar. A teoria do flogisto só é derrubada após um acúmulo massivo de experimentos e evidências produzidos por Antoine Lavoisier (1743–1794) e os anti-flogistianos que estabeleceram que era mais parcimonioso assumir que o flogisto era um gás o qual Lavoisier chamou de oxigênio. Apesar da controvérsia entre flogistianos e anti-flogistianos, ambos aceitavam as similaridades entre o processo de combustão e a manutenção da vida na presença de ar. Com os estudos de nutrição e taxa metabólica, Lavoisier juntou todos os elementos necessários para solidificar o conceito de metabolismo energético como uma combustão lenta dos alimentos realizada pelos organismos e tecidos vivos. O desenvolvimento dos paradigmas, a partir de então, acompanharam o desenvolvimento tecnológico dos equipamentos de medida. Deste modo, a seguir farei uma rápida descrição das principais técnicas respirométricas: calorímetro de gelo, manômetros e respirometria fechada, a coulorimetria e a respirometria aberta. Calorímetro de gelo e primeiros conceitos Antoine Lavoisier, Marie-Anne Paulze e Pierre-Simon Laplace realizam experimentos que serão o estopim dos estudos de metabolismo e temperatura como conhecemos hoje. Ao colocar uma cobaia dentro de uma gaiola de metal envolta por gelo (Fig. 2), medem, indiretamente, o metabolismo através da transferência de energia (calor) da cobaia para o
- 230. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 220 Julho/2010 gelo. Usando o conceito de calor latente1 proposto por Joseph Black e sabendo que o calor latente de derretimento do gelo é 0.334kJ/g, calcularam pela primeira vez, através da quantidade de água produzida por esse derretimento, a energia perdida por um animal ajustando o metabolismo para 0ºC. Chegaram ao valor de 270kJ/h ou 75W de energia, aproximadamente o mesmo que uma vela queimando. Daí advém o nome de calorimetria à técnica e de caloria à unidade de medida que adotamos nos estudos de metabolismo energético. Dentre as muitas descobertas científicas que o casal é responsável, somente na área de metabolismo energético eles realizaram uma série de medidas que estabeleceram conceitos básicos que ainda estão sendo desvendados nos dias de hoje. Medindo humanos e animais estabeleceram que o consumo de oxigênio aumenta com o tamanho dos animais e com o exercício, descobriram a termogênese induzida por dieta, inventaram o método de calorimetria indireta que mede a taxa metabólica através do consumo de oxigênio e a calorimetria direta (calorímetro de gelo). Contudo, o trabalho intelectual do casal Antoine Lavoisier e Marie-Anne Paulze é bruscamente interrompido com o advento da Revolução Francesa, momento em que ambos são decapitados. Somente um século após a morte do casal avanços em instrumentos manométricos proporcionam novidades técnicas no campo das medidas metabólicas. 1 Energia absorvida por uma substância enquanto muda de estado, sem mudança de temperatura. Os mais comuns são o calor latente de fusão (estado sólido para líquido) e de ebulição (líquido para gasoso). Figura 2 - Ilustração do primeiro calorímetro de gelo usado em 1782 e 1783 por Antoine Lavoisier, Marie-Anne Paulze e Pierre- Simon Laplace para medir o calor envolvido em diversos tipos de reações químicas, baseados no conceito de calor latente de Joseph Black. Além de inaugurar os estudos da termoquímica, realizam a primeira medida de metabolismo energético ao medir um porquinho-da-índia no calorímetro de gelo (Modificado de http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ice- calorimeter.jpg.)
- 231. Metablismo Julho/2010 Pág. 221 Manômetrose a respirometria fechada A respirometria fechada baseia-se em medidas indiretas para quantificar o consumo de oxigênio através de mudanças de pressão e volume de ar presente dentro de um recipiente hermeticamente fechado. A maneira mais simples de medir a pressão de gases é usando manometria. As técnicas necessárias para realizar as primeiras medidas manométricas já existiam na época de Lavoisier. Seu predecessor, Robert Boyle, já havia estabelecido as bases do método científico aplicado à química tornando-se um marco divisor de águas que separava o amadorismo e experimentalismo puro dos alquimistas do que conhecemos hoje como química moderna ao publicar seu livro de 1661, The Skeptical Chymist. Mais especificamente, Boyle havia descrito o comportamento dos gases em relação à pressão e a temperatura, estabelecendo o que conhecemos até hoje como Lei de Boyle. Em 1643, cerca de 20 anos antes, Evangelista Torricelli inventa o primeiro manômetro usado para medir pressão atmosférica (Fig. 3). Em 1661, Christian Huygens inventa o manômetro em tubo-U, permitindo uma nova série de medidas comparativas, já que no tubo em U (Fig. 4), a diferença na altura da coluna de líquido é diretamente proporcional à diferença de pressão em cada uma das aberturas do tubo, conforme a fórmula: Pa – Po = H.g.ρ onde H é a diferença na altura do menisco do líquido, Pa é a pressão medida, Po é a pressão de referência, g é a gravidade e ρ é a densidade do líquido usado. Assim, foram lançadas as bases para o desenvolvimento de instrumentos que hoje em dia apresentam uma variedade enorme, cada qual com as suas vantagens e suas desvantagens: amplitude de pressão medida, sensibilidade, dinâmica da resposta às mudanças de pressão e custo que mudam muito de um instrumento para outro criando uma variedade enorme de possibilidades de montagem de equipamentos. Figura 3 - Esquema mostrando o primeiro manômetro inventado por Evangelista Torricelli em 1643.
- 232. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 222 Julho/2010 Apesar da tecnologia e o conhecimento sobre as propriedades físico-químicas dos gases terem sido estabelecidas no século XVII, é somente no início do século XX que esse tipo de equipamento se populariza e passa a ser amplamente usado em laboratórios de pesquisa. Um esquema simplificado de um sistema respirométrico fechado (Fig. 5) consiste em uma câmara hermeticamente fechada, com um absorvedor de gás carbônico colocado, de preferência, no fundo deste recipiente separado do animal com uma tela de metal, já que o absorvedor geralmente é composto por uma substância química corrosiva (Ascarite II ou KOH). A câmara ainda é ligada a um manômetro líquido que indica a queda de pressão do ar que preenche a câmara conforme o organismo consome o oxigênio, e uma seringa de ar que ao injetar ar na câmara procura manter o menisco do manômetro no mesmo nível, mantendo, assim, o mesmo volume de ar durante todo o experimento. Ao final do experimento, medimos o consumo do animal através da diminuição total do volume de ar causada pelo consumo de oxigênio do animal. O que veremos a seguir são as principais variações deste padrão básico de respirometria fechada. Figura 5 - Esquema de um sistema simples de respirometria fechada. O sistema geralmente é mantido em temperatura constante durante todo o experimento. O absorvedor pode ser Ascarite II (Thomas Co.) ou KOH. O manômetro indica a mudança de pressão do ar que preenche a câmara respirométrica, e a seringa permite que se injete ar para que o menisco volte para o nível inicial. Figura 4- Esquema mostrando o funcionamento de um manômetro em tubo-U. Seu funcionamento permite a comparação entre pressões de dois sistemas. Pressão atmosférica versus recipiente respirométrico, por exemplo.
- 233. Metablismo Julho/2010 Pág. 223 Respirômetrode Volume Constante de Warburg O Respirômetro de Volume Constante de Warburg foi amplamente usado por Otto Warburg e colaboradores de Berlim e foi o primeiro descrito por Joseph Barcroft e John Haldane em 1902. A câmara respirométrica é acoplada a um manômetro líquido em U e a um braço lateral repleto de absorvedor de gás carbônico (Fig. 6). O manômetro em U aqui possui como pressão de referência a própria pressão atmosférica, diferente do respirômetro de Gilson, descrito mais adiante. É comum o uso do fluido de Brodie como o líquido do manômetro (23g de cloreto de sódio, 5g de tauroglicocolato de sódio, 500mL de água). Neste sistema o volume do recipiente onde fica o animal e a temperatura exata do momento que foi determinado o volume precisam ser conhecidos para realizar os cálculos: O2=h [( Vf [ 273.15 / T ] + Vq x b ) / P ] (consumo em µL O2) onde h é a altura do menisco no manômetro, Vf é o volume de gás livre (mL) da câmara somado ao volume de ar dentro do manômetro até a altura do menisco descontado o valor do volume do animal medido, T é a temperatura em graus Celsius, Vq é o volume em mL de todos os líquidos na câmara, b é a solubilidade do gás medido no líquido da câmara, e P é a pressão atmosférica por mililitro do fluido manométrico (geralmente fluido de Brodie). Este sistema respirométrico é extremamente difícil de ser usado e é muito instável. O manômetro usa como a pressão de referência a pressão atmosférica que pode mudar com a altitude ou com a condição climática (p.e. chuva), podendo incutir erro na medição. Outro fator de instabilidade é a diluição dos gases do ar interno na câmara na solução aquosa de KOH, o que pode alterar a medição também. Parte desses problemas foram solucionados pelo sistema respirométrico de Gilson que veremos a seguir.
- 234. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 224 Julho/2010 Figura 6 - Esquema simplificado de um respirômetro de Warburg. Note que a pressão de referência do manômetro em U é a própria pressão atmosférica. Respirômetro de Pressão Constante de Gilson O respirômetro de Pressão Constante de Gilson (Gilson, 1963) é um sistema de respirometria fechada semelhante ao Warburg, porém resolve o problema de alterações na pressão atmosférica ao ligar uma das pontas do manômetro líquido em U a um termobarômetro, que nada mais é do que outro frasco hermeticamente fechado com volume e pressão de gás constantes. Para manter constantes a pressão e o volume do ar o sistema todo é mantido em um banho térmico que mantém a temperatura. (Fig. 7). O volume é mantido constante pela manutenção do menisco do manômetro sempre na mesma altura através da injeção do mesmo volume de ar que já foi consumido pelo animal. A vantagem do respirômetro de Gilson é que se trata de uma medida física direta, onde não precisamos conhecer o volume da câmara onde está o organismo, diferente do sistema de Warburg em que era necessário saber o volume de ar exato da situação inicial do sistema. Os passos a serem seguidos são: 1. Coloque o animal na câmara; 2. Absorva qualquer CO2 produzido pelo animal; 3. Meça a mudança de pressão causada pelo consumo de O2; 4. Ajuste periodicamente o volume de ar para que a pressão se mantenha constante.
- 235. Metablismo Julho/2010 Pág. 225 Cálculos: O2=(µL x PB x 273.15 ) / ( 101.325 x T ) (consumo em µLO2) onde µL é o volume de ar que diminuiu no sistema, PB é a pressão barométrica em kilopascals e T é temperatura em Kelvin. Figura 7 - Esquema simplificado de um respirômetro de Gilson. Note que o termobarômetro é um frasco que contém um volume constante de ar. Transformações para CPTP (Condições Padrão de Temperatura e Pressão): microlitros/hora para microgramas/hora=>multiplique por 1.43; microlitros/hora para micromoles/hora=>multiplique por 0.04464. A aparente simplicidade deste sistema respirométrico à primeira vista, esconde uma série de detalhes técnicos e de procedimento em que o experimentador precisa estar bem treinado para conseguir um bom funcionamento do sistema. Por exemplo, o líquido que mantém a pressão pode vazar sobre o organismo durante a montagem do sistema, o animal pode entrar em contato com o absorvedor e sofrer injúria durante o registro do consumo de oxigênio, além das limitações próprias da respirometria fechada listadas no final deste item. Cálculo de Quociente Respiratório (QR) Como já visto no Capítulo 19, a razão entre o que é produzido como CO2 e o que é consumido de O2 pode ser usado para estabelecermos o substrato energético (carboidrato, proteína ou lipídio) que está sendo usado pelo animal no momento da medida para obter energia. Em uma condição em que o animal tem um QR de 1, ou seja, usa carboidratos como substrato e o sistema respirométrico não possui absorvedor de CO2, o sistema não
- 236. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 226 Julho/2010 apresenta mudança de volume inicial versus final. Parece que o animal não respira porque o consumo de oxigênio compensa a produção de gás carbônico. Podemos usar esta característica para obter o QR usando a fórmula: QR = (MR-MRap)/MR onde QR é o quociente respiratório, MR é o metabolismo medido com o absorvedor, MRap é o metabolismo medido sem o absorvedor. Os valores de QR variam com o substrato energético que está sendo queimado e pode ser uma medida interessante a ser realizada, de acordo com a pergunta sobre metabolismo energético que se quer responder. Limitações da respirometria fechada A respirometria fechada foi muito importante no início do século XX e ainda hoje é usada em condições específicas de medições de ensaios enzimáticos e de cultura de tecidos. Contudo, a técnica está limitada a medições e condições físico-químicas muito específicas para que as alterações no ar de dentro da câmara respirométrica sejam passível de ser acompanhada. Essa limitação torna a técnica inapropriada para medir metabolismo de organismos íntegros onde a medida não é estável. Isto acontece com animais que funcionam como conformadores metabólicos (mudam o metabolismo conforme a concentração de oxigênio), alterando o metabolismo de forma consistente. Este é o caso de animais que produzem calor, por exemplo abelhas e insetos voadores em geral, que alteram seus níveis de atividade ao longo do experimento, ou que respiram de forma intermitente, como os artrópodes traqueados. A respirometria fechada não permite, também, medições muito longas, que se estendam por dias, por exemplo. O aumento de gás carbônico, perda de água, alimentação, produção de excretas e diminuição de oxigênio produzem alterações metabólicas inconvenientes e impeditivas às medidas. Dentre as alterações listadas anteriormente, as que causam efeitos metabólicos mais importantes são a diminuição (hipóxia) e esgotamento do oxigênio (anóxia), e o progressivo aumento de gás carbônico (hipercapnia). Outra limitação quanto ao seu uso, é a impossibilidade de acompanhar a atividade do animal, o que incute imprecisão na medida de metabolismo energético. Para pequenos artrópodes o efeito é pior porque estes tendem a aumentar a atividade como resposta ao confinamento em recipientes pequenos. Ambas as técnicas a seguir aparecem como soluções a alguns dos problemas da respirometria fechada que acabaram de ser listados.
- 237. Metablismo Julho/2010 Pág. 227 RespirometriaCoulométrica A respirometria coulorimétrica foi descrita pela primeira vez por N. T. Werthessen em 1937. Ela baseia-se, como na respirometria fechada, no princípio de constância de volume e pressão do gás encerrado em um recipiente respirométrico, associado à produção eletrolítica de oxigênio. Esse sistema de grande precisão resolve o problema de alterações nas condições do ar interno á câmara respirométrica, porém é pouco utilizada. O funcionamento é simples: oar de uma câmara respirométrica fica ligado a um recipiente que contém solução saturada de sulfato cúprico. Como na respirometria fechada, o gás carbônico produzido pelo organismo medido é absorvido do ar por ascarite ou solução de KOH. Conforme o volume de ar da câmara diminui, a solução de sulfato cúprico sobe e encosta no anodo, fechando o circuito. Assim que a eletrólise vai liberando oxigênio, restabelece a concentrações de oxigênio, o volume de ar da câmara aumenta e empurra a solução de sulfato cúprico para baixo, desligando o circuito novamente (Fig. 8). Usando o montante de eletricidade liberada ou consumida, medido em coulombs, desta reação de eletrólise obtemos a produção de oxigênio em quantidades muito precisas. Através da fórmula: nLO2 = Q[Vm/(4F)] onde Q é a carga de eletricidade, em coulombs, descarregada na solução saturada; Vm é o volume molar de oxigênio em CPTP; e F é a constante de Faraday (96.485 coulombs /mol). Figura 8 – Esquema simplificado de um sistema coulorimétrico. Todo o sistema é normalmente mantido em temperatura constante. Conforme o organismo consome oxigênio, libera gás carbônico que é retirado do ar pelo ascarite, diminuindo o volume de ar da câmara respirométrica. Isto permite que o nível de solução de sulfato cúprico suba pelo tubo e atinja o anodo, iniciando a eletrólise. Com o avançar da reação eletrolítica, o oxigênio produzido preenche a câmara respirométrica novamente fazendo o nível de solução de sulfato cúprico baixar e desligar o sistema eletrolítico.
- 238. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 228 Julho/2010 Respirometria de fluxo O próximo avanço nas técnicas respirométricas não vem no sentido de facilitar as medidas, muito pelo contrário, a grande desvantagem das técnicas de respirometria de fluxo é a complexidade do equipamento. Enquanto a respirometria fechada é até certo ponto intuitiva e passível de ser feita de modo artesanal, como descrito acima, a respirometria de fluxo passa a se valer de equipamentos mais sofisticados e que exigem um conhecimento técnico mais apurado para que sejam devidamente manejados e as medidas válidas sejam obtidas. A seu favor, a respirometria de fluxo traz uma significativa expansão das fronteiras do que é possível de ser medido e do que se pode conhecer do metabolismo dos organismos, limites estes os quais ainda estamos explorando. Com o equipamento adequado, montado de maneira eficiente, já podemos obter medidas de consumo de oxigênio de uma única drosófila em tempo real (Lighton e Schilman, 2007). Esta respirometria usa um sistema de fluxo criado por bombas de ar à vácuo associado a analisadores de gases compostos de sensores de oxigênio e gás carbônico. Enquanto a respirometria fechada baseia-se na medida de consumo de oxigênio, a respirometria de fluxo permite o registro tanto do consumo de oxigênio quanto do gás carbônico produzido, isoladamente ou associados no mesmo sistema respirométrico. Ela tem expandido as possibilidades de medição de fenômenos fisiológicos mais dinâmicos e ligados a ajustes dos organismos a diferentes contextos biológicos. Uma característica marcante é a possibilidade de medidas dos animais executando atividades diferentes, com grande precisão no registro de gasto energético. A respirometria de fluxo teve um impacto direto na maneira como lidamos com a fisiologia. Seu uso na medicina, na melhoria do desempenho de atletas, ou na veterinária, no desempenho de animais de corrida, já nos é cotidiano. Toda a fisiologia do esporte, dos ajustes rápidos realizados pelo corpo durante os diferentes tipos de práticas esportivas só puderam ser investigadas diante destes avanços nas técnicas de respirometria, que permitiram obter medidas de gasto energético em tempo real. Se em um extremo temos a possibilidade de medir fenômenos fisiológicos mais dinâmicos e de ajustes rápidos, no outro extremo temos a possibilidade de acompanhar ajustes de animais diminutos e de baixo metabolismo. Papel de destaque no desenvolvimento de novos equipamentos e técnicas encontra-se na figura de John R. B. Lighton (Sable Systems International). O enorme panorama de desenhos experimentais, de montagem dos equipamentos (exemplo, Fig. 9) e mesmo de empresas que oferecem soluções para as diferentes necessidades de pesquisadores e outros profissionais que usam respirometria, tornam o assunto inesgotável e difícil de sintetizar de maneira satisfatória em um texto introdutório. Sendo assim, o que irei explorar a seguir são algumas características necessárias para
- 239. Metablismo Julho/2010 Pág. 229 guiara escolha do tipo de medida mais adequado à pergunta que se deseja responder, assim como as vantagens e desvantagens de cada tipo de medida. Para mais detalhes técnicos, dicas de equipamentos e soluções para possíveis problemas, recomendo o livro Measuring Metabolic Rates de John R. B. Lighton de 2008. Figura 9 – Esquema de uma das maneiras de montar um sistema respirométrico de fluxo com equipamento da Sable Systems International. 1. bomba de ar; 2. câmara para manter estabilidade de pressão do ar; 3. fluxímetro; 4.controlador de umidade relativa do ar (UR%); 5. controlador de abertura e fechamento das câmaras respirométricas; câmara respirométrica com animal; 7. absorvedor de umidade do ar e gás carbônico; analisador de oxigênio; 9. programa que registra os dados do analisador. Linha de base: a linha de base é o patamar de referência sobre o qual o consumo de oxigênio ou a produção de gás carbônico são comparados para se obter a medição. São as quantidades iniciais dos gases presentes no ar, antes do animal alterar as proporções dos gases no fluxo. Como a linha de base é o valor de referência a partir do qual se obtém a medida, esta precisa estar bem estável e estabelecida antes do início do registro de uma respirometria de fluxo. Analisador de oxigênio: a quantidade de oxigênio no ar (cerca de 20,95%) faz com que a medida possa ter uma grande amplitude e flutuabilidade de resposta. Uma boa medida de consumo de oxigênio demanda um bom sensor de oxigênio, uma boa calibração e ajuste dos sensores, uma boa estabilidade da composição do ar que entra no sistema e a manutenção do equipamento em um lugar protegido, detalhes que fazem a refletem na obtenção de uma medida válida ou não. Conhecer o equipamento também é importante já
- 240. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 230 Julho/2010 que cada sensor responde de uma maneira às perturbações que ocorrem ao redor do equipamento. Para alguns aparelhos que são sensíveis à vibração, por exemplo, colocar uma bomba de ar vibrando na mesma mesa pode ser um desastre. Além disso, medir o consumo de oxigênio demanda tempo e paciência, já que a instabilidade do sistema é uma grande desvantagem a ser considerada, efeito especialmente sentido na medida de animais muito pequenos e/ou de metabolismo baixo. A vantagem da medida de consumo de oxigênio é a sua correspondência direta com o metabolismo energético do organismo (ver Analisador de CO2). Analisador de gás carbônico: a quantidade de gás carbônico no ar é muito menor do que a de oxigênio e este pode ser retirado do ar com o uso de absorvedores, antes de entrar no sistema. Isto nos permite criar uma linha de base de valores muito pequenos ou até mesmo de zero CO2, a partir da qual qualquer quantidade de CO2 registrada terá vindo do animal medido. Por ser uma medida mais estável, é a mais recomendada para a medição de pequenos artrópodes. A desvantagem em se medir somente gás carbônico é a necessidade em saber o QR do animal nas diferentes situações em que este está sendo medido, já que o metabolismo obtido a partir do CO2 depende do QR para ser convertido em unidades de energia, diferente do que ocorre com o O2. Outro possível problema é a possibilidade da não correspondência direta com o metabolismo devido a efeitos de liberação massiva de CO2 por mudanças de pH no sangue. Fluxo de ar: a escolha do fluxo de ar a ser usado depende do fenômeno a ser medido. Animais com metabolismo alto pedem fluxos de ar alto, tanto para evitar hipóxia e hipercapnia, em um sistema de lavagem de câmaras, ou mesmo em um sistema de máscara, em que não há perigo de hipóxia e hipercapnia, para que a dinâmica do consumo registrado acompanhe as mudanças metabólicas na mesma velocidade em que elas acontecem. Se a captação da amostra de ar pela máscara acontece em uma velocidade menor do que as mudanças que se deseja acompanhar do organismo, a lentidão do registro passa a não captar o fenômeno. Por outro lado, animais que apresentam baixo metabolismo e/ou pequeno tamanho corpóreo, imprimem baixas trocas gasosas, alterando pouco a composição do ar que passa pelo sistema. Nestes casos, diminuir o fluxo permite que haja alteração na composição do ar suficiente para que esta alteração seja sentida pelo sensor presente no analisador. Porém, fluxos muito baixos causam uma defasagem entre a atividade observada no animal e o registro do analisador, aspecto que precisa ser considerado na hora de decidir o fluxo de ar usado. Lavagem das câmaras respirométricas: o formato da câmara respirométrica tem
- 241. Metablismo Julho/2010 Pág. 231 influênciadireta neste tipo de medida devido ao fato do gás carbônico ser mais pesado que os demais gases presentes no ar e tender a se depositar na parte inferior da câmara. Isto cria, no melhor dos casos, defasagens de medidas e, no pior dos casos, alterações na dinâmicas imprevisíveis na lavagem da câmara. Esta alteração na dinâmica de lavagem pode criar registros no sensor que não tem relação direta com as trocas de gases realizadas pelo animal medido, mas sim, com lavagens ineficientes, incompletas e irregulares das câmaras respirométricas. Os melhores desenhos de câmaras respirométricas são câmaras sem cantos e irregularidades onde o gás carbônico não tenha a possibilidade de ficar retido, e de tamanho próximo ao tamanho do animal. Por outro lado, o formato e tamanho da câmara tem impacto direto no comportamento do animal que está sendo confinado e características do comportamento deste precisam ser considerados para que se evite fatores de estresse quando não se quer medi-los. Por exemplo, de maneira geral, recintos sem cantos ou sem irregularidades (exemplo extremo são recintos perfeitamente esféricos) são altamente perturbadores e podem ser um fator de estresse para o animal, apesar de ser o melhor formato de câmara sob o aspecto de lavagem. Absorvedores de água: a presença de vapor de água no ar que passa pelos sensores dos analisadores de gases altera a medida diminuindo o sinal, ou seja, o valor registrado é menor do que o registrado por um fluxo de ar seco passando pelo sensor. Em animais que realizam grandes volumes de trocas de gases, como mamíferos e aves, esse efeito é menor não afetando de modo impeditivo o registro. Entretanto, quando lidamos com animais de metabolismo mais baixo, como anfíbios, répteis e artrópodes, o vapor de água causa efeitos significativos nas medidas. Para lidar com o vapor de água presente no fluxo de ar normalmente usamos uma sustância que retira essa água do ar (p.e. sílica-gel, drierita ou perclorato de magnésio). Absorvedores de gás carbônico: o ponto no sistema onde o gás carbônico será retirado da corrente de ar muda conforme a montagem do equipamento, como visto acima. Ele pode ser usado para filtrar o ar inicial que entra no sistema. Se o analisador de oxigênio for o equipamento escolhido para a medida, o ar precisa passar por um absorvedor de gás carbônico antes de entrar no aparelho. As substâncias mais usadas em equipamentos respirométricos são o Ascarite II, o KOH e cal sodada. Manutenção de temperatura durante a medida: a manutenção de temperatura constante durante as medidas hoje em dia é feito por câmaras climáticas que vão desde geladeiras modificadas de modo a manter uma ou duas temperatura programadas, até salas modificadas para esse mesmo fim. Estas câmaras climáticas permitem boa variedade de
- 242. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 232 Julho/2010 combinações de fatores abióticos que, em conjunto com a respirometria de fluxo, permite a realização das medidas. Respirometria de fluxo em medidas de respirometria fechada: ainda é bastante usada para a medição de animais com baixo metabolismo e/ou muito pequenos. A estratégia usada aqui é manter a câmara fechada por tempo suficiente para que a quantidade de oxigênio caia e/ou a produção de gás carbonico seja alta o suficiente para ser detectado pelo sensor do analisador. Após este período, o fluxo passa novamente pela câmara respirométrica, renovando o ar dentro desta, permitindo que uma nova medida inicie na sequência. O ar que sai da câmara é direcionado para os analisadores, podendo ou não passar por um absorvedor de água e CO2 antes de entrar no analisador (para detalhes técnicos consultar Lighton, 2008). O tipo de registro que esse procedimento gera está esquematizado na Fig. 10. Figura 10 - Ilustração de uma medida de consumo de oxigênio de respirometria fechada feita em um sistema de fluxo de ar, mostrando a linha de base (pontilhado azul claro), a curva de lavagem da câmara (linha contínua branca) e a área correspondente ao consumo de oxigênio do animal (vermelho). Respirometria de fluxo em medidas de respirometria aberta: é a medida ideal para estudos de comportamentos e gasto energético em contextos biológicos com mudanças de estado mais dinâmicas, como pode ser visto na Fig. 11. Sua utilização só não é mais ampla devido a dificuldades em controlar possíveis problemas de lavagem de câmaras e interferências na sensibilidade dos equipamentos, e seu uso ainda é limitado para animais muito pequenos (p.e. pequenos artrópodes) e/ou de metabolismo muito baixo (p.e. anfíbios). Nestes organismos a respirometria aberta usada mais apropriada é a de produção de CO2. Apesar de já existir equipamentos capazes de realizar respirometria aberta até mesmo de uma Drosophila sp. seu uso é restrito devido ao preço dos equipamentos capazes de realizar estas medidas de forma válida.
- 243. Metablismo Julho/2010 Pág. 233 Figura11- Exemplo de registro de respirometria aberta de uma formiga forrageando. Produção de CO2 da formiga antes de beber uma solução aquosa de açúcar 30% (flecha da esquerda), enquanto estava bebendo (registro entre as flechas) e depois de beber (registro após flecha da direita) (Modificado de Schilman e Roces, 2006). Considerações finais Muitas vezes pensamos que a fronteira do conhecimento científico está delimitada pelo o que podemos realizar tecnologicamente em determinado momento histórico. Contudo, a história da ciência e dos cientistas mostra que o mundo científico é feito também de muita criatividade e ousadia em questionar velhos modelos. Neste contexto, é emblemático o exemplo do embate de Priestley (representando os flogistianos) e o casal Lavoisier (representando os anti-flogistianos). É inegável a qualidade de Priestley como cientista e investigador de propriedades da matéria, porém, sua visão de mundo molda a interpretação de seus resultados, e mesmo possuindo evidências suficientes para superar o velho modelo flogistiano, molda a interpretação de seus resultados conforme o paradigma vigente. Coube a Lavoisier mudar a forma de pensar sobre o ar, a vida e a combustão, imprimindo uma longeva mudança de perspectiva ao mundo. Todo este histórico permitiu o desenvolvimento das novas técnicas e dos novos materiais disponíveis apresentados, como as câmaras respirométricas transparentes e detectores de movimento, que possibilitaram a medição da determinação das relações energéticas envolvidas em fenômenos fisiológicos e comportamentais mais dinâmicos. Estas medidas têm sido carro-chefe de novidades recentes na fisiologia como a endotermia de insetos, medidas precisas de gasto energético de organismos em estado reprodutivo, auxiliando também na melhoria de técnicas de criação, medidas de desempenho animal com implicações em interpretações evolutivas e ecológicas, entre outros. Alguns destes processos fisiológicos e comportamentais que envolvem alterações no metabolismo energético de animais ectotérmicos e endotérmicos são apresentados nos cap. seguintes.
- 244. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 234 Julho/2010
- 245. Metablismo Julho/2010 Pág. 235 Ectotermia:um acesso de baixo custo à vida Jessyca Michele Citadini Laboratório de Ecofisiologia e Fisiologia Evolutiva jessyca.citadini@gmail.com A temperatura ambiental é um dos fatores físicos mais importantes para sobrevivência dos animais. Como discutido em capítulos anteriores, os animais ectotérmicos possuem a temperatura do corpo variável de acordo com a temperatura do ambiente. Contudo, em muitos desses organismos, a manutenção de uma temperatura corpórea relativamente alta e estável eventualmente mais apropriada para as atividades metabólicas, envolve de forma complexa, sinérgica e equilibrada, a fisiologia e o comportamento (Bogert, 1949; 1959). Transferência de energia Para que um corpo ou animal mantenha uma temperatura constante, a perda de energia deve ser igual ao ganho. Uma compreensão dos mecanismos fisiológicos envolvidos nas trocas de energia que afetam a temperatura dos animais requer o conhecimento de alguns princípios físicos. Como já mencionado na presente unidade, o calor, por exemplo, é a transferência de energia entre corpos que diferem em temperatura, e tal transferência acontece via quatro diferentes formas que são: condução, convecção, irradiação e evaporação (Schmidt-Nielsen e Duke,1996). Condução A condução ocorre entre corpos físicos que estão em contato entre si, sejam sólidos, líquidos ou gases. Convecção A transferência de energia que ocorre em fluidos em geral e ocorre devido às diferenças de densidade das partes envolvidas. Radiação A transferência de energia que ocorre na ausência de um contato direto com um objeto - é dessa forma que todos os dias o Sol aquece a Terra. Evaporação Energia perdida através da água e o resultado é o resfriamento da superfície corporal. Os animais ectotérmicos, utilizam esses mecanismos na regulação da temperatura, por exemplo: condução (seleção do substrato), a convecção (posições em relação ao sol), a radiação (comportamento e pigmentação da pele) e a evaporação através do ofego (Fig.1).
- 246. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 236 Julho/2010 Figura 1 - Representação da troca de energia por condução, convecção, radiação e evaporação para um réptil em um ambiente terrestre (De Heatwole e Taylor, 1987, Modificado de Withers, 1992). Ectotérmicos Vamos primeiramente examinar as relações termais de animais ectotérmicos aquáticos. Os animais de hábitos noturnos geralmente não apresentam uma significativa troca de energia com o meio, portanto, são termoconformadores, já os de hábitos diurnos fazem a termorregulação por migrações verticais e horizontais. Em seguida, vamos examinar os animais ectotérmicos terrestres, os de hábitos noturnos podem evitar temperaturas extremas, são, portanto termoconformadores, já os diurnos termorregulam por heliotermia e seleção de substrato (Withers, 1992). No final será abordada a influência da temperatura sobre a locomoção de vertebrados terrestres e a influência da mesma nas respostas comportamentais defensivas. Ectotérmicos Aquáticos A água tem uma condutividade relativamente baixa de energia e um calor específico alto, e, por conseguinte leva um longo tempo, tanto para aquecer como para esfriar. Por causa disto, rápidas flutuações de temperatura do ar fora da água se transformam em pequenas e lentas mudanças dentro dela. O ar é rapidamente aquecido ou resfriado e conseqüentemente foram entre os animais terrestres que se desenvolveram as maiores adaptações a temperaturas extremas (Withers, 1992). A dissipação de energia através das brânquias é tão eficaz para a maioria dos animais aquáticos que a produção metabólica de energia não tem nenhum significado térmico e a temperatura do corpo é semelhante à temperatura da água. Muitos animais ectotérmicos aquáticos são capazes de termorregulação precisamente a uma temperatura de preferência (Tpref). Esta regulação da temperatura de preferência é realizada através do comportamento por uma água de temperatura adequada, ao invés da termorregulação por meio fisiológico (Withers, 1992).
- 247. Metablismo Julho/2010 Pág. 237 Osanfíbios são um grupo particularmente interessante de animais ectotérmicos, pois muitas espécies são de transição entre ambientes aquáticos e terrestres. Eles podem apresentar uma temperatura corpórea (Tc) entre 0°C (por exemplo, uma salamandra caminhando sobre um campo de neve) até mais de 40°C (um sapo se aquecendo). Como seria de esperar, os anfíbios aquáticos tem uma Tc similar a temperatura do ar (Ta), mas muitos podem selecionar uma temperatura de preferência, se existe um gradiente térmico adequado na Ta. Por exemplo, muitos girinos selecionam a água mais quente ao redor das bordas de um tanque e evitam o frio em água mais profunda (Brattström, 1970). Os girinos de Hyla regilla expõem a superfície dorsal para que seja exposta à radiação solar. Agrupamentos de girinos podem absorver radiação solar suficiente para aumentar a temperatura da água local (Brattström, 1962). Anfíbios terrestres possuem um potencial para aumentar a temperatura corpórea escolhendo microclimas ou aquecendo através do sol, mas sua alta perda de água por evaporação cutânea tende a diminuir a eficiência do aquecimento ao sol, no entanto, quando hidratados são excelentes evitando o sobreaquecimento (Withers, 1992). Ectotérmicos terrestres Muitos ectotérmicos terrestres apresentam uma considerável capacidade para a termorregulação comportamental e fisiológica. O ar tem baixa condutância e uma menor capacidade de energia do que a água, desta forma é mais fácil para um ectotérmico terrestre manter o gradiente termal entre Tc e Ta. A taxa de aquecimento ou resfriamento de um objeto ou animal, em ambientes frios ou quentes é determinada pela temperatura diferencial, pela propriedade da superfície e pela propriedade termal do meio (condutividade e calor específico) (Withers, 1992). Muitas variáveis afetam a condutância dos animais. A mais importante é o tamanho corpóreo, presença de isolamento e a natureza do meio (ar ou água). A massa corporal é de suma importância uma vez que a relação área de superfície/massa corpórea do animal determina inércia termal, ou seja, a tendência a mudar a temperatura do corpo em decorrência das mudanças na temperatura ambiente. Animais grandes têm uma menor área superfície/massa que os pequenos animais, e desta forma resfriam ou aquecem mais vagarosamente (Withers, 1992). A inversa relação entre condutância termal e massa do corpo tem profundo significado ecológico. Animais pequenos possuem considerável dificuldade para a manutenção da temperatura, por exemplo, uma abelha que tem 20 gramas de massa irá perder temperatura em um ambiente frio em poucos minutos. O isolamento térmico também pode afetar a condutância, por exemplo, as abelhas que possui os pelos do corpo removido têm uma maior condutividade que as abelhas que possuem os pêlos (May, 1976). Em
- 248. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 238 Julho/2010 animais geralmente o ganho é mais rápido do que a perda de energia, isto é particularmente evidente em lagartos e crocodilianos. Existem também mudanças no batimento cardíaco (mais rápido durante o aquecimento), desta forma os ajustes cardiovasculares e metabólicos provavelmente facilitam o aquecimento e retardam o resfriamento (Fig.2) (Withers, 1992). Figura 2- As iguanas marinhas de Galápagos aquecem e resfriam em velocidades diferentes. (A) No ambiente terrestre a iguana ao tomar sol absorve energia dos raios de sol, ocorrendo a vasodilatação dos vasos sanguíneos cutâneos e o batimento cardíaco torna-se mais rápido (conforme registrado pelo Eletroencéfalograma – ECG), o que asseguram o aquecimento do sangue e circulação eficiente. (B) A perda de energia sobre a água é retardada pela lentidão dos batimentos cardíacos e pela vasoconstricção dos vasos sanguíneos cutâneos, que miniminizam o fluxo sanguíneo para a pele (Modificado de Eckert, 1997). Aquecimento nos insetos A postura do corpo e a orientação das asas podem afetar significantemente a temperatura do corpo de um inseto se aquecendo (Fig.3). As libélulas se aquecem em temperaturas baixas do ar e regulam seu ganho através da radiação solar e dos ajustes posturais. Diversas espécies se aquecem com as asas posicionadas para frente e para a trás para reduzir a perda de energia. Muitas borboletas podem elevar a temperatura torácica 150 C acima da temperatura do ar por ajustes posturais, embora algumas espécies usem vias metabólicas para elevar a temperatura torácica (Withers, 1992).
- 249. Metablismo Julho/2010 Pág. 239 Figura3- Adaptações posturais da libélula para maximizar o ganho de energia (i) por heliotermia ou (ii) para minimizar o ganho de energia (May,1976 – Modificado de Withers, 1992). Coloração A coloração tem importante efeito na termorregulação, pois 50% da energia radiante vêm do sol e é no espectro visível. Conseqüentemente a refletância visual (cor) influencia no ganho de energia. As superfícies pretas refletem menos energia radiante que as superfícies brancas. Por exemplo, nos animais que apresentam coloração preta é esperado que absorvam mais radiação e assim apresentem uma temperatura corpórea maior que os animais de coloração branca (Fig.4) (Withers, 1992). Figura 4- Temperatura no tórax (símbolos sólidos) e abdômen (símbolos abertos) de besouros do deserto da Namíbia – Onymacris rugatipennis (élitra preta) e O. brincki ( élitra branca) em ambiente de luz solar natural (De Henwood, 1975, modificado de Withers, 1992). Aquecimento em répteis e anfíbios A temperatura corpórea dos repteis é bastante variável, variando de poucos graus até acima de 400 C. Lagartos noturnos e algumas espécies de diurnos são termoconformadores, com a temperatura corpórea similar a temperatura do ambiente.
- 250. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 240 Julho/2010 Lagartos noturnos não possuem nenhuma fonte de radiação solar (embora alguns aqueçam durante o dia enquanto estão inativos), muitos lagartos que habitam as florestas não podem se aquecer porque eles habitam ambientes sombreados. O lagarto tropical Anolis cristatellus é um oportunista termal; ele é termoconformador em áreas sombreadas, mas é termorregulador em áreas abertas. Alguns lagartos absorvem energia através do contato do ventre com uma superfície ou substrato de energia, por exemplo, em rochas aquecidas. Esses lagartos são chamados de tigmotermos porque seu maior ganho de energia é através da condução em vez da radiação (Withers, 1992). A maioria dos lagartos diurnos se aquece em luz solar e são chamados de termorreguladores com temperatura de preferência do corpo de aproximadamente 35 a 40°C. Esses lagartos heliotérmicos manipulam a troca de energia através de vias comportamentais e fisiológicas. Assim, o controle comportamental inclui: mudança na orientação do corpo em relação ao sol, alterações do contorno do corpo, mudança na coloração (componente fisiológico) e também o controle fisiológico através das alterações na circulação periférica. Lagartos heliotérmicos têm uma estreita faixa de temperatura de preferência, a faixa de tolerância termal é o intervalo de temperatura com o qual o animal pode sobreviver sem comprometer o sistema fisiológico. A faixa de sobrevivência termal é definida como a temperatura crítica mínima e a temperatura crítica máxima. A temperatura “ótima” é um intervalo que seria o ideal para muitas funções bioquímicas e fisiológicas, com um aumento chegando a um platô e depois decaindo em altas temperaturas, isso ocorre por causa da instabilidade termal das estruturas e funções das proteínas, como já discutido em capítulos anteriores (Withers, 1992). Na caatinga brasileira os sapos Pleurodema diplolistris passam os 10 ou 11 meses anuais de seca enterrados na areia sem água e sem alimento, quando a chuva chega, os machos emergem cantando em uníssono e logo saltam para a lagoa mais próxima. Atraídas pela cantoria, as fêmeas escolhem seus pares e liberam dezenas de óvulos. Em um ou no máximo dois meses, quando as chuvas cessam e os rios desaparecem os sapos recém- nascidos precisam estar completamente formados e prontos para se enterrarem na areia (Carvalho e col., 2010). Adaptações ao Frio Muitos ectotérmicos estão bioquímica e fisiologicamente adaptados para sobreviver e até mesmo funcionar normalmente em baixas temperaturas ambientais. Entretanto, temperaturas que são frias o suficiente para congelar os tecidos do animal são potencialmente letais e devem ser evitadas ou requerer adaptações específicas para a sobrevivência. Muitos ectotérmicos simplesmente evitam condições congelantes por migrações ou buscando por microclimas mais quentes, mas alguns ocasionalmente têm
- 251. Metablismo Julho/2010 Pág. 241 contatocom temperaturas congelantes. Ectotérmicos aquáticos podem experimentar apenas condições brandas de congelamento, desde que a água doce ou água do mar congele entre 00 C a -20 C. Ectotérmicos terrestres, ao contrário, são particularmente mais susceptíveis ao congelamento porque a temperatura do ar pode cair abaixo de zero (-20 a -500 C). Existe uma variedade de estratégias que permitem aos animais ectotérmicos sobreviverem em condições congelantes (Withers, 1992). Estratégias anti-congelamento Vários ectotérmicos, tais como os artrópodes polares e o peixe icefish, evitam se congelar diminuindo o ponto de congelamento dos fluidos do seu corpo abaixo da temperatura média do ambiente, ou permitindo que os fluidos super-resfriem abaixo do ponto de congelamento normal (Withers, 1992). Depressão osmótica do ponto de congelamento A água doce congela a 00 C. As soluções apresentam uma depressão do ponto de congelamento, isso ocorre pela presença de moléculas de soluto. Os ectotérmicos podem potencializar o congelamento pelo aumento da concentração osmótica de seus fluidos corpóreos, desta forma o ponto de congelamento fica abaixo da temperatura ambiente. A normal concentração dos fluidos corpóreos confere uma proteção muito limitada contra o congelamento em água doce, pois o ponto de congelamento dos tecidos é geralmente entre -0,60 C a -0,7 0 C. Os animais marinhos são mais propensos ao congelamento, pois seus tecidos são geralmente não hiper-osmótico e, portanto, eles podem congelar a mesma ou a temperatura maior que a água do mar, que seria de aproximadamente -1,86°C. Alguns ectotérmicos acumulam altas concentrações de solutos específicos para diminuir o ponto de congelamento entre 1 a 10°C. Esses solutos são açucares ou alcoóis de açúcar. Estes compostos podem também apresentar um efeito crioprotetor – eles protegem a membrana e as enzimas contra a desnaturação pelo frio e o ferimento provocado pelo gelo (Withers, 1992). Super-resfriamento Um animal pode ficar exposto a uma temperatura consideravelmente abaixo do ponto no qual seus líquidos corpóreos possivelmente congelariam, todavia, permanecem super- resfriados, a menos que a formação de gelo se inicie por meio da nucleação. Por exemplo, se um pedaço de água congelada a −1,9° C for colocada próxima ao peixe, o estado de super-resfriamento é destruído, e o peixe congela e morre. Desta forma, o super- resfriamento será uma boa estratégia apenas quando o risco de entrar em contato com
- 252. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 242 Julho/2010 agentes nucleadores for muito baixo. Tal super-resfriamento é de fato de grande importância para a sobrevivência de muitos animais. Durante uma noite ocasionalmente fria, por exemplo, o super-resfriamento pode ser essencial para os animais intolerantes ao congelamento que não conseguem buscar um refúgio mais quente. Répteis e anfíbios, cujos fluidos corpóreos, se nucleados, começariam a congelar a -0,6°C foram super-resfriados até -8°C, sem que congelassem (Lowe e col., 1971). Isso pode significar a diferença entre a vida e a morte para um animal que fica inesperadamente exposto a uma noite muito fria, antes de encontrar um esconderijo para proteção contra os rigores do inverno. (Schmidt-Nielsen e Duke, 1996). Um componente particularmente efetivo na redução do ponto de congelamento e também do de super-resfriamento é o glicerol. O glicerol freqüentemente ocorre em alta concentração em insetos hibernantes e é muito eficaz no aumento da tolerância ao frio (Schmidt-Nielsen e Duke, 1996). Proteínas anti-congelamento A substância responsável pela redução no ponto de congelamento tornou-se conhecida como uma substancia "anticongelativa". Ela foi originariamente identificada e sua composição elucidada no sangue de um peixe antártico, Trematomus (DeVries, 1970). É uma glicoproteína que atua impedindo a adição de moléculas de água à matriz de cristais de gelo e, portanto, o seu desenvolvimento. O anticongelativo impede a adição de moléculas de água ao cristal, pois se liga a superfície do mesmo e assim bloqueia o seu subseqüente crescimento (DeVries, 1982). Tolerância ao congelamento Embora uma tolerância natural ao congelamento e a formação de gelo sejam fundamentais para a sobrevivência de muitos insetos no inverno, somente alguns vertebrados suportam a formação pronunciada de gelo. Os peixes parecem incapazes de suportá-la e a maior parte dos vertebrados superiores não tolera o congelamento sob condições naturais (Schmidt-Nielsen e Duke, 1996). Exceções são encontradas entre alguns anfíbios que enfrentam o inverno no solo. A rã, Hyla versicolor, apresenta um congelamento parcial e controlado, além disso, há toda uma preparação para o inverno. Nesta estação esses animais apresentam 3% de glicerol em seus fluidos corpóreos - possivelmente se o animal estivesse no verão ele seria muito menos tolerante ao congelamento; mas, por outro lado, em rãs que não toleram o congelamento, tais como a rã leopardo comum, Rana pipiens, o glicerol encontra-se ausente. Essa rã suporta o inverno em um habitat aquático, ao passo que a rã no solo tem contato com temperaturas que rapidamente declinam abaixo de zero. Outras rãs tolerantes
- 253. Metablismo Julho/2010 Pág. 243 aocongelamento, como a rã madeira, Rana sylvatica, rapidamente elevam seus níveis glicêmicos como resposta ao início da formação de gelo, e isso parece aumentar a tolerância das mesmas ao congelamento (Storey e Storey, 1985). Adaptações a ambientes quentes Ectotérmicos expostos a temperaturas elevadas podem tentar regular a sua temperatura corpórea abaixo da temperatura do ar, ou podem usar de adaptações bioquímicas de tolerância para altas temperaturas corpóreas. A primeira estratégia da termorregulação só pode ser conseguida através de resfriamento evaporativo, por conseguinte, não está disponível para os animais aquáticos. A segunda estratégia é o aumento da temperatura crítica máxima (TCM) (Withers, 1992). Temperatura Crítica Máxima O limite máximo térmico para as células vivas é o ponto de ebulição da água (100°C à pressão atmosférica normal). Nenhum dos animais ou plantas é capaz de sobreviver a temperaturas próximas do ponto de ebulição, mas algumas bactérias termofílicas podem se desenvolver a temperaturas acima de 100°C (Brock, 1985) Ao se discutir tolerância a temperaturas extremas, deve distinguir entre as quais um organismo pode sobreviver e aquelas nas quais pode completar todo o seu ciclo de vida. A temperatura letal, na qual ocorrem 50% de mortalidade, não pode ser determinada com exatidão, pois o tempo de exposição é de grande importância. A maioria dos invertebrados e vertebrados possui TCM acima de 30°C e alguns superam os 40°C, isto é geralmente consistente com o grupo taxonômico, mas pode haver considerável variabilidade de acordo com os habitats e com o ambiente termal (Schmidt-Nielsen e Duke, 1996). Alguns fatores que contribuem para a morte por excesso de temperatura são os seguintes (Schmidt-Nielsen e Duke, 1996): - Desnaturação das proteínas, coagulação térmica; - Inativação térmica das enzimas a um ritmo que supera o da formação; - Suprimento inadequado de oxigênio; -Efeitos de temperaturas diferentes (Q10) em reações metabólicas interdependentes; - Efeitos da temperatura nas estruturas das membranas. Resfriamento por evaporação A evaporação dissipa a energia da água. Por conseguinte, a perda de água por evaporação pode dissipar uma quantidade considerável de energia e baixar a temperatura
- 254. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 244 Julho/2010 corpórea. O grau de resfriamento evaporativo depende da umidade relativa do ambiente e da temperatura (Withers, 1992). Alguns animais ectotérmicos possuem mecanismos para manter sua pele úmida durante a evaporação. Por exemplo, alguns anfíbios espalham com as patas substâncias lipídicas de glândulas dérmicas para prevenir a desidratação da pele, e um alto fluxo sanguíneo cutâneo mantém o nível de hidratação da pele. Ectotérmicos terrestres tendem a reduzir a evaporação cutânea para evitar a desidratação rápida. Por exemplo, alguns animais terrestres relativamente impermeáveis são capazes de melhorar o resfriamento evaporativo regulando a temperatura corpórea a altas temperaturas do ar para aumentar significativamente sua perda de água cutânea ou respiratória (Withers, 1992). O lagarto Dipsosaurus dissipa totalmente sua produção metabólica de energia pela respiração ofegante a uma temperatura do ar (Ta) maior que 40ºC, embora não seja capaz de reduzir significativamente a temperatura corpórea abaixo da Ta. O lagarto Sauromalus pode reduzir a temperatura corpórea em aproximadamente 0,9ºC abaixo da temperatura do ar e a temperatura do cérebro em cerca de 2,7ºC, através do ofego. As rãs Chiromantis e Phyllomedusa têm significativamente menor perda de água por evaporação do que outros sapos, conseqüentemente, a sua temperatura corpórea é semelhante à temperatura do ar. Ambas Chiromantis e Phyllomedusa podem aumentar drasticamente a perda de água, quando submetidas a altas temperaturas e precisamente regulam a temperatura corpórea abaixo da temperatura do ar. A Chiromantis apresenta glândulas cutâneas mucosas para elevar a perda de água da evaporação, enquanto a Phyllomedusa impermeabiliza a epiderme com uma camada de cera (Withers, 1992). Correlações ecológicas em ser ectotérmico (1) São capazes de habitar áreas de grande estresse ambiental; (2) Possuem tamanho corpóreo pequeno, o que faz com que tenham menor necessidade energética; (3) O corpo possui um formato (alongado, achatado dorso-ventralmente ou achatado lateralmente) que aumenta a relação superfície/massa; (4) A eficiência da conversão de energia assimilada em biomassa costuma ser mais eficiente em ectotérmicos do que em endotérmicos; (5) Permitem aos ectotérmicos acesso a nichos ecológicos não disponíveis aos endotérmicos. A influência da temperatura nos sistema locomotor dos vertebrados ectotérmicos
- 255. Metablismo Julho/2010 Pág. 245 Odesempenho locomotor tem sido considerado um bom indicador quantitativo de adequação biológica (fitness) em estudos sobre influência da temperatura no desempenho comportamental de lagartos (Bennett 1980; Hertz e col., 1983; Huey e col., 1984) e serpentes (Herckrotte,1967; Oliveira e Martins, 2002). Além dos efeitos sobre a locomoção de vertebrados ectotérmicos, a temperatura pode influenciar na magnitude e tipo das respostas comportamentais apresentadas. Mudanças no comportamento defensivo, induzidas pela temperatura, têm sido reportadas em vertebrados ectotérmicos tão diversos como lagartos (Rand, 1964; Hertz e col., 1982; Crowley e Pietruszka, 1983), anfíbios anuros (Gomes e col., 2002), salamandras (Brodie Jr. e col., 1991) e serpentes (Herckrotte, 1967; Arnold e Bennett, 1984; Schieffelin e Queiroz, 1991; Keogh e DeSerto, 1994; Mori e Burghardt, 2001). Outros estudos com lagartos mostraram que algumas espécies mudam seus displays defensivos com a temperatura ambiental (Hertz e col., 1982; Crowley e Pietruszka, 1983), ou tornam-se mais agressivos e menos propensos á fuga quando a temperatura corpórea é baixa (Hertz e col., 1982). Estudos com serpentes sugerem que também neste grupo há modulação do comportamento defensivo induzido pela temperatura corpórea. Nos estudos feitos por Arnold e Bennett (1984) foi observado que serpentes se tornam mais agressivas, com maior exposição da cabeça e com maiores tentativas de bote, quando apresentam baixas temperaturas corpóreas. Considerações finais Desta forma podemos observar que nos animais ectotérmicos, a maioria das atividades fisiológicas são depende da temperatura do corpo, sendo que a mesma está diretamente relacionada com a temperatura do ambiente. Muitos processos bioquímicos e fisiológicos são a base do padrão comportamental e são dependentes da temperatura (Bartholomew, 1982). Sabemos que vários fatores (abióticos e bióticos) podem influenciar nos padrões de comportamentos nos animais. Entre os fatores abióticos, a temperatura pode influenciar diretamente o seu metabolismo e conseqüentemente na sua atividade (Lillywhite 1987). De acordo com Shine e col. (2000), a temperatura do corpo pode ser uma das mais importantes influências no comportamento anti-predador em vertebrados ectotérmicos, pois a temperatura irá determinar a habilidade do animal para detectar, repelir ou escapar do predador.
- 256. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 246 Julho/2010
- 257. Metablismo Julho/2010 Pág. 247 Termorregulaçãoem endotérmicos: febre e anapirexia. “Ana” o quê? Carolina da Silveira Scarpellini Lab. de Fisiologia, Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal UNESP/Jaboticabal carolinascarpellini@gmail.com Conforme visto no capítulo anterior, geralmente a Tc de ectotérmicos (peixes, anfíbios, répteis e alguns invertebrados) varia conforme a temperatura ambiente. Entretanto, a maioria das espécies endotérmicas – aves e mamíferos – praticamente não tem sua Tc alterada diante de uma ampla faixa de flutuação da Ta (Bícego e col., 2007). Os endotérmicos regulam a Tc por meio de mecanismos termorreguladores autonômicos além daqueles comportamentais já apresentados também pelos ectotérmicos. Os mecanismos autonômicos podem ser divididos em duas grandes categorias: os de ganho e os de perda de energia térmica (Branco e col., 2005). Os mecanismos de ganho, por sua vez, podem ser subdividos em: conservação e produção de energia térmica. A conservação de energia térmica nos mamíferos ocorre principalmente por vasoconstrição periférica e piloereção, enquanto que os mecanismos de produção de energia térmica incluem aqueles resultantes do metabolismo basal, os dependentes e os independentes de tremor da musculatura esquelética (Bícego e col., 2007). A produção de energia térmica resultante do metabolismo basal constitui a conhecida “termogênese obrigatória”, uma vez que todos os processos metabólicos de um organismo resultam na liberação de energia sob a forma de calor. O tremor consiste em movimentos involuntários da musculatura esquelética sem que haja alteração na posição do corpo. Assim, como não há trabalho mecânico, praticamente toda a energia é liberada na forma de calor (Branco e col., 2005). A produção de energia térmica independente de tremor pode ser originada no músculo esquelético de aves (Bicudo e col., 2002) e no tecido adiposo marrom de mamíferos placentários (humanos, ratos, morcegos,...). Este último, localizado próximo às escápulas e aos rins, é de especial importância para os animais de pequeno tamanho, recém-nascidos e aclimatados ao frio (Mackowiak, 1998; Branco e col., 2005). Como já mencionado no capítulo 1, o tecido adiposo marrom é bastante vascularizado e apresenta alta densidade de mitocôndrias. Neste tecido os ácidos graxos, derivados da degradação dos triglicerídeos dos adipócitos, servem como substrato para oxidação na mitocôndria. Nas mitocôndrias das células em geral, a oxidação dos substratos resulta em um gradiente de prótons entre o espaço intermembrana e a matriz mitocondrial. Os prótons retornam para a matriz mitocondrial através da enzima ATP sintase, resultando na formação de ATP. Como já discutido anteriormente, a UCP1, também chamada
- 258. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 248 Julho/2010 Termogenina, é encontrada na membrana interna das mitocôndrias e providencia uma via alternativa para o fluxo de prótons independente da ATP sintase, logo grande parte da energia da oxidação dos ácidos graxos é dissipada como energia térmica, contribuindo para o aquecimento dos animais (Fig. 1). Por fim, os mecanismos de perda de energia térmica são basicamente: vasodilatação periférica, sudorese (único meio de perder energia quando a Ta é maior que a Tc e é extremamente importante para humanos, equinos e bovinos) e ofegação (importante para cães, gatos, ovelhas e aves). A ofegação se dá pela inspiração do ar atmosférico através das vias aéreas e a expiração através da abertura oral. A exposição da língua ao ar favorece a evaporação da água da saliva e contrui para a dissipação da energia térmica corpórea (Randall, 1997). Os mecanismos comportamentais estão relacionados ao contato com superfícies mais quentes ou mais frias ou à adoção de posturas corporais que facilitem ou evitem a troca de energia térmica entre o animal e o ambiente, como visto também para ectotérmicos. Um comportamento muito comum em ratos é espalhar saliva sobre os pêlos quando expostos a um ambiente quente, o que promove uma perda evaporativa de energia térmica nesses animais (Bícego e col., 2007). No sistema nervoso central (SNC) de vertebrados há uma região chave no controle dos mecanismos termorreguladores, principalmente autonômicos, denominada área pré- Figura 1- Representação do fluxo de prótons entre o espaço intermembrana e a matriz em uma mitocôndria. A seta tracejada representa a via pela qual os íons atravessam a membrana interna durante a síntese de ATP. A seta contínua que atravessa a proteína desacopladora (termogenina) indica o caminho dos prótons durante a dissipação de energia térmica na termôgenese sem tremor (Modificado de Nelson e col., 2004).
- 259. Metablismo Julho/2010 Pág. 249 ópticado hipotálamo anterior (APO). A APO situa-se na transição entre o diencéfalo e o telencéfalo (Fig. 2) e é considerada termossensível (pois detecta as alterações térmicas locais), além de termointegradora, já que recebe informações térmicas de várias regiões do organismo por meio dos termorreceptores cutâneos e/ou espinais. Ainda, a APO contém neurônios sensíveis ao aumento de temperatura que, segundo o modelo proposto por Hammel (1965) e modificado posteriormente por Boulant (2006), quando ativados pelos termorreceptores cutâneos e espinais ou pela alteração local da temperatura, estimulam a perda e inibem a produção de energia térmica levando à manutenção da Tc. Por outro lado, quando esses neurônios são inibidos pela queda nas temperaturas ambiente e/ou local, ocorre uma redução na perda e um aumento na produção de energia térmica com consequente manutenção da Tc (Matsuda e col., 1992; Boulant, 1998; Bícego e col., 2007). Estados térmicos Os endotérmicos podem apresentar cinco estados térmicos: eutermia, hipertermia, hipotermia, febre e anapirexia (Gordon, 2001). Quando o animal apresenta uma Tc considerada típica para sua espécie, diz-se que ele está em eutermia. Para a manutenção da eutermia, o animal pode ou não empregar energia além daquela já consumida pelo metabolismo basal. Quando a eutermia é mantida apenas por meio do metabolismo basal, isto é, quando nem os mecanismos de produção nem os de perda de energia térmica são Figura 2- Esquema de um corte sagital do encéfalo humano mostrando a localização da APO. (http://healthysleep.med.harvard.edu/_i/198.jpg).
- 260. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 250 Julho/2010 · · ativados, diz-se que o animal está dentro da zona termoneutra (ZTN) ou zona de conforto térmico da sua espécie. Dessa forma, ZTN é a faixa de Ta na qual não há gasto extra de energia para que a eutermia seja mantida. Por exemplo, a Tc em eutermia para humanos é aproximadamente 37ºC (lembrando que esse valor muda ao longo de 24 horas) e, geralmente, a ZTN para humanos adultos nus, encontra-se entre 28 e 30ºC (Blatteis, 1998). Assim, quando a Ta ultrapassa pouco o limite crítico inferior ou superior da ZTN, a energia extra é empregada para manter a eutermia. Entretando, se a Ta aumenta ou reduz extremamente, nem mesmo a ativação dos mecanismos de perda ou de produção de energia térmica é suficiente para a manutenção da eutermia e a Tc acaba acompanhando tais alterações, resultando nos estados de hiper ou hipotermia, respectivamente, que são consequências de falhas do sistema termorregulador em manter a eutermia (Fig. 3). Figura 3- Esquema de três estados térmicos: eutermia, hipotermia e hipertermia. A linha tracejada representa as variações de VO2 em relação à Ta. A linha contínua representa as variações da Tc em relação à Ta. VO2, consumo de O2; TCI, temperatura crítica inferior; TCS, temperatura crítica superior; Tc: temperatura corporal. Na hipertermia moderada, a vasodilatação não compromete a oferta de sangue para outros tecidos porque há uma redistribuição do débito cardíaco. Essa redistribuição se dá pela redução da perfusão para os tecidos não vitais ou para aqueles que recebem mais sangue que o necessário considerando o metabolismo local. Porém, na hipertermia severa, a vasodilatação pode ser tão intensa que conflita com os mecanismos de regulação da pressão arterial causando o chamado heat stroke, ou choque térmico. A hipertermia severa resulta em edema nos membros inferiores, tontura, exaustão, dor de cabeça, vômito e diarréia (Branco e col., 2005). Já a hipotermia severa pode causar redução na velocidade de
- 261. Metablismo Julho/2010 Pág. 251 conduçãodos impulsos nervosos culminando em comprometimento da coordenação motora, amnésia, alucinação, decréscimo da frequência respiratória, dentre outros, podendo levar o indivíduo ao coma. Os outros estados térmicos (febre e anapirexia) referem-se a alterações reguladas da Tc. Na febre, mecanismos de ganho de energia térmica são ativados induzindo o aumento da Tc (Kluger, 1991) e, durante a anapirexia, mecanismos de perda de energia térmica são ativados reduzindo a Tc (Gordon, 2001; Steiner e Branco, 2002). Note que os mecanismos ativados durante a febre são opostos àqueles ativados durante a hipertermia. O mesmo vale para os mecanismos ativados durante a anapirexia e a hipotermia. Nesse contexto, há situações em que é mais vantajoso para o organismo um aumento ou uma queda regulada da Tc do que a manutenção da eutermia. Veremos a seguir quais são essas situações e porque, nestes casos, a febre ou a anapirexia são mais benéficas ao organismo que a eutermia. Febre A febre, como mencionado anteriormente, é um aumento regulado da Tc, pois é controlada por sinais encefálicos que ativam os mecanismos de ganho de energia térmica, diferentemente do que ocorre na hipertermia que também é um aumento da Tc, porém devido a falhas no sistema termorregulador. Para o desenvolvimento da febre em um ambiente com Ta baixa, é necessária intensa produção de energia térmica além de redução na sua perda, enquanto em um ambiente com Ta alta, apenas uma diminuição da perda de energia térmica pode ser suficiente para elevar a Tc aos níveis febris. A hipertermia, por outro lado, é mais dependente da Ta: em uma Ta baixa a hipertermia dificilmente ocorrerá. Deve ser lembrado que valores de Tc muito altos e por muito tempo não são benéficos, pois podem causar desidratação, delírio, lesões no encéfalo, convulsões, dentre outros prejuízos. O aumento na produção de energia térmica, em decorrência do desenvolvimento da febre, implica no aumento da taxa metabólica e isso pode representar um perigo extra para indivíduos com substratos metabólicos limitados como recém- nascidos, idosos e subnutridos. O limiar da Tc a partir do qual a febre é considerada perigosa para a sobrevivência do indivíduo ainda é algo muito discutível entre os pesquisadores: alguns consideram 39ºC, enquanto outros afirmam que febres de até 41ºC não são perigosas para humanos (Branco e col., 2005). A resposta febril é uma reação complexa, geralmente resultante do contato com agentes inflamatórios ou infecciosos, chamados de pirogênios exógenos e tem sido descrita em todos os grupos de vertebrados: mamíferos (Kluger, 1991), aves (D'Alecy e Kluger,1975; Macari e col., 1993; Maloney e Gray, 1998), répteis (Hallman e col., 1990; Don e col., 1994), anfíbios (Kluger, 1977; Bicego-Nahas e col., 2000) e peixes (Reynolds e col., 1976), além de
- 262. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 252 Julho/2010 alguns invertebrados (Kluger, 1991). Como em ectotérmicos a Tc é muito semelhante à Ta e a termorregulação se dá essencialmente por mecanismos comportamentais, como já abordado, uma forma de inferir a Tc dos animais é mensurar a Ta selecionada pelos animais. Dessa forma, quando os ectotérmicos infectados são colocados em um gradiente térmico que possibilite a “escolha” da Ta mais confortável, eles direcionam-se e permanecem no lado mais quente do gradiente, desenvolvendo assim a chamada febre comportamental (Fig. 4). A ampla ocorrência da febre sugere que ela surgiu há muito tempo na escala filogenética e, que por ser conservada ao longo de tantos anos, deve conferir benefícios aos organismos (Kluger, 1991; Kluger e col., 1998). De fato, muitos estudos apontam o aumento da atividade do sistema imune (Fig. 5) e a queda na sobrevida dos agentes patogênicos como alguns dos benefícios do aumento regulado da Tc (Kluger, 1991; Marnila e col., 1995; Kluger e col., 1998). Figura 4- Esquema de um gradiente térmico. O animal é colocado no centro do aparato e pode direcionar-se para o local com temperatura mais confortável. No caso da febre, o animal desloca-se para o lado com Ta mais alta.
- 263. Metablismo Julho/2010 Pág. 253 Apóso contato do organismo com os pirogênios exógenos (geralmente microorganismos invasores), estes são fagocitados por células do sistema imune. Os fagócitos produzem citocinas (IL-1ß, IL-6, TNF-α, IFN-α) que atuam como pirogênios endógenos e induzem a síntese e a liberação de prostaglandina (PG), principalmente a PGE2 que atua na APO ativando os mecanismos de ganho e inibindo os de perda de energia térmica (Kluger, 1991; Matsuda e col., 1992; Blatteis e Sehic, 1997a,b). Em contrapartida, estudos demonstraram que em ratos há alguns pirogênios endógenos (MIP-1, IL-6 e endotelina-1) que desencadeiam febre independente da liberação de PGE2 (Zampronio e col., 1994; Fabricio e col., 1998). Acredita-se que a febre seja gerada por um balanço entre a ação dos pirogênios e dos antipiréticos. Os antipiréticos são definidos como aqueles agentes que reduzem a resposta febril, mas não alteram a Tc no estado de eutermia (Branco e col., 2005). Por fim, os benefícios conferidos pela febre podem ser evidenciados (1) pelo aumento da sobrevida de animais infectados e febris (mamíferos - inclusive humanos -, lagartos, peixes e grilos) em comparação àqueles infectados não febris e (2) pelo aumento da mortalidade de animais (lagartos e coelhos) infectados quando tratados com fármacos antipiréticos (Branco e col., 2005). Anapirexia Anapirexia, segundo o “Glossário de termos para Fisiologia Térmica”, é uma condição patológica na qual há um decréscimo regulado da Tc devido à ativação de mecanismos de perda de energia térmica, diferentemente da hipotermia que ativa mecanismos de ganho de energia. Essa nomenclatura (anapirexia), apesar de bem definida, Figura 5- Efeito da Tc sobre a fagocitose (Modificado de Wenisch e col., 1996).
- 264. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 254 Julho/2010 ainda gera alguns conflitos quanto ao seu uso (Romanovsky 2004), mas particularmente neste capítulo estas divergências não serão levadas em conta. O oxigênio (O2) é crucial para o metabolismo oxidativo e, consequentemente, para a produção de energia na forma de ATP. Sendo assim, é evidente que um aporte adequado de O2 é essencial para a sobrevivência dos animais e que um déficit de O2, mesmo que localizado e passageiro, pode causar prejuízos irreversíveis (López-Barneo e col., 2001). No entanto, alguns animais enfrentam condições de hipóxia (baixa pressão parcial de O2) ao longo da vida, seja por exposição ambiental (tocas, altas atitudes, etc) ou por insuficiências cardíacas, respiratórias e/ou metabólicas, traumatismos cranianos, acidentes vasculares encefálicos, dentre outros (Bao e col., 1997; Reissmann e col., 2000; Gordon, 2001). Então, como os animais sobrevivem a tais situações? Uma das respostas adaptativas mais conhecidas parece ser a queda regulada da Tc, ou anapirexia, que é observada ao longo de toda a escala filogenética dos vertebrados e em organismos unicelulares, como é o caso do Paramecium caudatum (Steiner e Branco, 2002). Durante a anapirexia, ocorre atenuação da hiperventilação e do débito cardíaco causados pela hipóxia e inibição da termogênese, além de aumento na afinidade da hemoglobina pelo O2, o que facilita a captação desse gás na superfície respiratória (Mortola e Gautier, 1995; Wood, 1995; Gautier, 1996; Barros e col., 2001; Steiner e Branco, 2002). Todas essas respostas associadas à anapirexia conferem benefícios ao animal hipóxico, pois diminuem respostas altamente custosas, contribuindo para uma depressão no metabolismo e facilitando a captação de O2 nos pulmões. Dessa forma, um aumento na sobrevida de ratos, camundongos, lagartos e até mesmo no Paramecium é observado quando tais organismos são expostos à hipóxia e têm suas Tcs reduzidas (Artru e Michenfelder, 1981; Hicks e Wood, 1985; Malvin e Wood, 1992; Wood, 1995; Wood e Stabenau, 1998). De modo semelhante ao que ocorre na febre comportamental, a queda da Tc pode ser evidenciada quando ectotérmicos hipóxicos são colocados em um gradiente de temperatura e selecionam regiões mais frias do que selecionariam em situações de normóxia (Hicks e Wood, 1985; Gordon e Fogelson, 1991; Malvin e Wood, 1992). Com todos esses benefícios associados à queda da Tc, seria de se esperar que reduzir a Tc de um paciente em situações nas quais o O2 constitui um fator limitante, como em casos de hemorragia, anemia, isquemia, envenenamento, cirurgias cardíacas e traumas cranianos, contribuiria para minimizar os efeitos da hipóxia, facilitando assim a recuperação do indivíduo. De fato, isso vem sendo aplicado na clínica (Schwab e col., 1997; Holzer e col., 1997, Gordon, 2001; Kline e col., 2004), entretanto, a forma usada para diminuir a Tc do paciente é a hipotermia forçada que também proporciona benefícios, mas apresenta uma desvantagem em relação à anapireixa, que é o aumento da resposta metabólica do paciente
- 265. Metablismo Julho/2010 Pág. 255 pormeio da ativação dos mecanismos de ganho de energia térmica, os quais são altamente custosos e que não é desejável numa situação hipóxica (Gordon, 2001). Apesar da vasta observação da anapirexia hipóxica nos vertebrados e no Paramecium caudatum e da sua importância clínica, os mecanismos envolvidos nesta resposta ainda são pouco conhecidos e apenas nas últimas décadas alguns de seus mediadores/modularores foram descritos. Dentre estes estão a dopamina, a serotonina, o óxido nítrico e os receptores opióides kappa atuando especificamente na APO induzindo a queda da Tc (Steiner e col., 2002a; Gargaglioni e col., 2005; Scarpellini e col., 2009). Por outro lado, os receptores mi e delta, também na APO, estão envolvidos no retorno da Tc ao estado eutérmico após o término da hipóxia (Scarpellini e col., 2009). Ainda, a adenosina e o monóxido de carbono (Barros e Branco, 2000; Paro e col., 2001) parecem atuar em alguma outra região no SNC para induzir e inibir, respectivamente, a anapirexia. Como pode ser notado, a anapirexia parece ser resultado de um balanço entre agentes indutores e inibidores da queda da Tc, assim como acontece na febre. Steiner e col. (2002a) propuseram um modelo para a indução da anapirexia dependente dos sistemas intracelulares de segundos mensageiros, GMP cíclico (GMPc) e AMP cíclico (AMPc). O modelo sugere que os agentes indutores da anapirexia (óxido nítrico, serotonina, dopamina e talvez os agonistas endógenos dos receptores opióides kappa) atuem nos neurônios sensíveis ao aumento de temperatura da APO, aumentando os níveis intracelulares de GMPc e AMPc, induzindo uma menor produção de energia térmica e uma maior perda desta, levando à queda da Tc. É interessante ressaltar que a redução dos níveis de GMPc e AMPc, na APO, ou seja, o efeito contrário ao que acontece na indução da anapirexia, ocorre no desenvolvimento da febre (Steiner e col., 2002b). A hipóxia é o estímulo anapirético mais estudado, mas uma queda regulada da temperatura corporal também é observada em animais que apresentam o fenômeno de depressão metabólica durante a dormência sazonal. Entretanto, nestes animais a queda da Tc não é induzida por uma diminuição da disponibilidade de oxigênio ambiental, mas parece ocorrer como parte de uma inibição coordenada de todas as variáveis fisiológicas contribuindo assim, para a economia energética e para o aumento da sobrevivência dos animais frente a condições ambientais desfavoráveis (Carey e col., 2003). Em suma, é importante ressaltar que os animais podem apresentar Tcs diferentes (febre e anapirexia) do estado de eutermia sem que isso represente um descontrole ou uma falha nos sistemas controladores. E, geralmente tais alterações na Tc conferem benefícios aos animais, contribuindo para um aumento da sua sobrevivência durante determinadas situações, tais como infecção e hipóxia. Deve ser lembrado, evidentemente, que essas alterações, para serem benéficas, devem ocorrer dentro de limites em que o animal não sofra com extremos das duas condições.
- 266. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 256 Julho/2010
- 267. Metablismo Julho/2010 Pág. 257 Metabolismoenergético em câmera lenta: mecanismos de depressão metabólica sazonal Lilian Cristina da Silveira Laboratório de Metabolismo e Energética lilian.fisioib@usp.br Diversos animais desenvolveram a habilidade de ‘prever’ uma fase em que as condições ambientais tornam-se desfavoráveis, ou ótimas, para determinadas funções, por meio de um sistema temporizador interno e da percepção de sinais ambientais cíclicos, tais como fotoperíodo, temperatura e umidade. Animais que apresentam dormência sazonal exibem uma série de ajustes comportamentais e metabólicos meses antes da fase desfavorável, que possibilitam, dentre outros eventos, o armazenamento de substratos energéticos que serão utilizados para a produção de energia durante os meses de dormência, como mencionado acima. A dormência sazonal é caracterizada pela presença de dois componentes principais: o jejum e a depressão metabólica. A habilidade de deprimir a taxa metabólica de repouso é de ampla ocorrência nos animais e pode estar associada à dormência sazonal, como nos casos de estivação e hibernação, ou dissociada da dormência sazonal, como no torpor diário, sono e anidrobiose. A depressão metabólica é, portanto, de ampla ocorrência nos animais e considerada um dos exemplos de flexibilidade fenotípica mais fascinantes. A estivação possibilita que muitos animais, incluindo anuros, peixes e caramujos, sobrevivam à escassez de água. Já a hibernação geralmente está associada aos efeitos combinados de temperaturas reduzidas e escassez de alimento. Beija-flores e alguns pequenos mamíferos apresentam torpor diário, um estado de hipometabolismo semelhante à hibernação, mas com apenas algumas horas de duração, que está associado à fase do dia na qual a disponibilidade de alimento é reduzida. Tartarugas sobrevivem longos períodos em anóxia, sem acesso ao ar atmosférico, embaixo da camada de gelo que se forma nos lagos durante o inverno. Seja em condições anóxicas ou na presença de oxigênio, a depressão metabólica estende o tempo de sobrevivência dos organismos por reduzir a demanda de energia e a velocidade de utilização das reservas de substratos. Na maioria dos casos, a taxa metabólica é reduzida para 5–40% da taxa metabólica de repouso, mas alguns organismos como esporos e cistos sofrem depressão metabólica ainda maior e, em muitos casos, a taxa metabólica simplesmente não pode ser detectada, uma condição denominada criptobiose (Storey e Storey, 2004; Carey e col., 2003). Ciclo Anual
- 268. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 258 Julho/2010 Antecipação Um dos aspectos mais característicos da dormência sazonal é a antecipação do fenômeno. Meses antes do estresse ambiental, os animais iniciam uma série de ajustes comportamentais e fisiológicos que possibilitam, dentre outras respostas, o armazenamento de substratos, seja na forma de alimento em suas tocas ou tornando-se obesos, ou ambos. Quando a oferta de O2 no ambiente não é limitante, como na maioria dos casos de hibernação e estivação, a energia é estocada principalmente na forma de lipídios, uma forma de estocagem vantajosa do ponto de vista energético uma vez que a oxidação de ácidos graxos fornece mais energia por grama de substrato que carboidratos. Esquilos, por exemplo, dobram sua massa corpórea e triplicam a massa adiposa durante a fase de preparação para a dormência (Dark, 2005). Os eventos de deposição/mobilização de lipídios, que resultam em aumento/diminuição da massa adiposa, da taxa metabólica basal e da ingestão de alimentos estão ligeiramente dessincronizados. A diminuição da ingestão alimentar ocorre bem antes que a massa corpórea atinja seu máximo. E uma diminuição da TMB já no meio do verão, antes que a ingestão de alimentos diminua, possibilita um aumento da massa corpórea dado pelo acúmulo de gordura. A massa corpórea máxima é atingida no final do verão ou início do outono, quando a secreção de insulina (hormônio lipogênico) também é máxima e os níveis de absorção de glicose são mínimos, indicando uma possível insensibilidade à insulina nos adipócitos (Dark, 2005). Tais fenômenos são bem caracterizados em mamíferos, mas ciclos semelhantes de deposição/mobilização de lipídios ocorrem em ectotérmicos (Souza e col., 2004). As alterações da adiposidade em animais hibernantes não são simplesmente resultado de aumento da ingestão alimentar e/ou diminuição da taxa metabólica, mas principalmente de uma mudança programada do nível ideal de adiposidade (Dark, 2005). Lesões cerebrais que produzem obesidade em ratos de laboratório também aumentam a massa corpórea em hibernantes, mas o ciclo anual de deposição de gordura persiste (Barnes e Mrosovsky, 1974), fornecendo um indício da robustez desta resposta sazonal. Desta maneira, estes ciclos parecem ser rigidamente controlados, provavelmente por um mecanismo central, que deve utilizar-se de um sinal proveniente do tecido adiposo branco (TAB) que informa a quantidade total de reservas e, desta forma, possibilita o ajuste da adiposidade do animal ao momento de seu ciclo anual de atividades. Tem sido proposto que este sinal é dado principalmente pela leptina, um hormônio peptídico amplamente conhecido por sua atuação no controle da adiposidade em mamíferos não hibernantes (Ahima e Flier, 2000; Dark, 2005). A leptina é produzida principalmente pelo TAB e sua concentração plasmática é normalmente correlacionada ao nível de
- 269. Metablismo Julho/2010 Pág. 259 adiposidadedo animal. Este peptídeo de 16kDa age no hipotálamo diminuindo a ingestão alimentar e aumentando a lipólise (Ahima e Flier, 2000). Entretanto, os poucos estudos que investigam a ação da leptina em hibernantes tem sido contraditórios e sugerem a existência de diferentes padrões de secreção ao longo do ciclo sazonal. No morcego Myotis lucifugus, durante a pré-hibernação, a relação usual entre o nível de adiposidade e a secreção de leptina não é observada. Os níveis plasmáticos de leptina elevam-se antes do aumento da massa adiposa e diminuem à medida que a massa adiposa alcança seu máximo. Neste animal, a secreção de leptina, notoriamente um hormônio cujo efeito inclui aumento do gasto energético, parece estar dissociada da adiposidade durante a hibernação, permitindo a diminuição da taxa metabólica durante a fase de armazenamento e dormência (Kronfeld-schor e col., 2000). Já em marmotas Marmota flaviventris, as concentrações plasmáticas de leptina são positivamente relacionadas com o aumento da massa adiposa e tamanho do adipócito. Neste caso, a fim de se esquivarem do efeito anorexigênico da leptina e alcançarem a adiposidade necessária para sustentar a demanda de energia na dormência, estes animais parecem ter desenvolvido um estado de resistência à leptina (Florant e col., 2004). Recentemente, os efeitos e a estrutura da leptina, antes estudados somente em mamíferos, têm sido investigados em outros grupos. Vários trabalhos fornecem evidências da existência de um peptídeo com função e estrutura semelhantes às da leptina em ectotérmicos (Johnson e col., 2000; Niewiarowski e col., 2000; Paolucci e col., 2001; Spanovich e col., 2006). A administração diária de leptina durante 15 dias no lagarto Sceloporus undulatus resulta em efeitos similares aos observados em ratos, ou seja, elevação da temperatura corpórea e diminuição da ingestão de alimentos, embora a massa corpórea não tenha sofrido alterações significativas quando comparados ao grupo controle (Niewiarowski e col., 2000). Neste mesmo animal, que apresenta dormência sazonal, os níveis circulantes de leptina são menores no outono, quando a quantidade de reservas lipídicas é máxima (Spanovich e col., 2006), assim como foi observado no morcego Myotis lucifugus (Kronfeld-schor e col., 2000). Dormência Quando o nível de adiposidade adequado é atingido e o animal está pronto para iniciar a fase de hibernação ele progressivamente diminui a atividade e procura seu abrigo onde permanecerá até a primavera. A entrada em hibernação é caracterizada por uma rápida e acentuada diminuição da taxa metabólica, das frequências cardíaca e respiratória, acompanhadas por uma diminuição da temperatura corpórea. Em endotérmicos, a temperatura corpórea cai a valores tão baixos quanto 0ºC e os animais ingressam em um estado de hipotermia voluntária, enquanto que não hibernantes expostos a temperaturas
- 270. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 260 Julho/2010 entre 10 e 25°C tipicamente sofrem falência cardíaca (Driedzic e Gesser, 1994; Ruf e Arnold, 200). O efeito letal da hipotermia nas células de mamíferos não hibernantes deve-se, em grande parte, ao efeito assimétrico da temperatura nas taxas das reações, que resulta em um desacoplamento entre a produção e o consumo de energia. Dado que a manutenção do gradiente de íons através das membranas é um processo dependente de energia, que supre a atividade de enzimas como a Na+ ,K+ -ATPase, um maior consumo em relação à produção de ATP resulta em despolarização de membranas e em uma cascata de eventos que culminam na morte celular. Curiosamente, hibernantes durante a fase ativa são tão suscetíveis a estes efeitos quanto não hibernantes, o que sugere que os mecanismos celulares de resposta ao estresse são semelhantes em hibernantes e não hibernantes e, portanto, reforça a importância dos ajustes que ocorrem antes da fase de hibernação (Storey, 2004). Esta semelhança, somada à constatação de que a habilidade de hibernar é amplamente observada nos mamíferos e pode ser considerada uma característica ancestral e uma propriedade básica da sua fisiologia, sugerem que o fenótipo hibernante não seria resultado da expressão de genes exclusivos de hibernantes, mas sim da expressão diferenciada de genes comuns a todos os mamíferos (Heldmaier e col., 2004; Storey, 2004). Com base neste pressuposto, bastaria encontrar um mecanismo para a ativação da expressão deste conjunto de genes para que a indução do hipometabolismo em não hibernantes se tornasse possível (Quadro 1). Durante a depressão metabólica, alguns processos fisiológicos diminuem, enquanto outros são totalmente interrompidos. Durante toda fase de dormência o coração deve continuar a bombear sangue, embora, muitas vezes, a uma temperatura corpórea muito menor e contra uma resistência periférica maior do que durante a fase ativa do animal (Fahlman e col., 2000). Pequenos mamíferos em torpor reduzem a freqüência cardíaca de 200-300 para 3-5 batimentos por minuto. Diferentemente da função cardíaca, o fluxo sanguíneo renal, a taxa de filtração glomerular e a formação de urina são muito reduzidos ou cessam completamente durante o hipometabolismo. Nos mamíferos, estes processos são retomados durante os despertares periódicos, de maneira que poucas alterações são observadas na osmolaridade e na concentração de eletrólitos no plasma (Carey e col., 2003). Outros animais encontraram soluções diferentes para lidar com resíduos: formação de produtos finais voláteis, estocagem de lactato nas carapaças de tartarugas e acúmulo da uréia resultante do catabolismo de proteínas a fim de aumentar a resistência à dissecação durante a estivação (Storey e Storey, 2007).
- 271. Metablismo Julho/2010 Pág. 261 Dadoo elevado custo dos processos de digestão, absorção e assimilação de alimentos (ação dinâmica específica), a interrupção da alimentação também contribui de maneira significativa para a economia energética do animal. O trato gastrointestinal apresenta um intenso metabolismo, atingindo cerca de 20-30% do metabolismo basal em mamíferos (Tracy e Diamond, 2005) e o jejum prolongado envolve alterações na estrutura e função deste órgão. Na depressão metabólica sazonal, observa-se uma pronunciada atrofia do intestino, embora a capacidade funcional do órgão seja preservada, garantindo que o animal esteja apto a digerir e absorver nutrientes após o despertar (Carey e col., 2003). Na dormência sazonal de lagartos teiú jovens, a depressão metabólica é acompanhada por uma redução de 37% da massa do intestino médio, seguida por um aumento de três vezes da massa total do órgão após o despertar e a retomada da alimentação (Nascimento e col., 2007). Em hibernantes clássicos como os esquilos, a depressão metabólica é alcançada através do efeito termodinâmico das baixas temperaturas no inverno combinado à inibição ativa do metabolismo através de diversos mecanismos de regulação (Carey e col., 2003). Por outro lado, alguns endotérmicos e ectotérmicos, apresentam depressão metabólica em temperaturas relativamente altas (Fig. 1). Lêmures de Madagascar podem hibernar a temperaturas corpóreas acima de 20ºC e o lagarto teiú hiberna a uma temperatura corpórea A indução de um estado hipometabólico em humanos já foi considerada em diversas obras de ficção científica e, de fato, parece que a ciência está cada vez mais próxima de tornar esta idéia real, o que traria imensos benefícios para a medicina em uma variedade de condições. Os mecanismos moleculares que preservam a viabilidade dos órgãos em hibernantes a temperaturas próximas a 0º e em condições de restrição energética, são de grande interesse para pesquisadores que buscam melhorar e estender o tempo de preservação de órgãos destinados a transplantes. Esta idéia ganhou novo fôlego em 2005, quando o pesquisador Mark Roth divulgou que camundongos expostos a gás sulfídrico (H2S), um inibidor específico e reversível da enzima mitocondrial citocromo c oxidase (CCO), tiveram seu consumo de oxigênio diminuído em 90% seguido por uma queda da temperatura corpórea para 2 ºC acima da temperatura ambiente (~15 ºC). Após 6 h de exposição ao H2S, estes animais retomaram sua taxa metabólica e temperatura normais quando colocados novamente em contato com o ambiente (Blackstone e col., 2005). Provavelmente, ajustes paralelos nos processos consumidores de energia, assim como ocorre nas células dos hibernantes, acompanharam a inibição do metabolismo mitocondrial nestes camundongos, preservando a viabilidade celular. Quadro 1: Da ficção científica para a clínica médica: indução de depressão metabólica Mark B. Roth Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle
- 272. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 262 Julho/2010 de cerca de 17ºC, apresentando uma redução de cerca de 80% do metabolismo. Nestes casos, há uma maior contribuição de mecanismos intrínsecos de inibição metabólica e um efeito menos significativo da temperatura (Heldmaier e col., 2004; Souza e col., 2004). Figura 1- a) Lagarto teiú Tupinambis merianae; b) Primata lêmure Microcebus murinus. Hibernação interrompida por episódios de despertar e hibernação contínua Em pequenos mamíferos, a hibernação consiste de fases de torpor que duram de uma a três semanas, interrompidas por despertares periódicos que, geralmente, duram menos de 24 horas, nos quais os animais acordam, elevam a temperatura corpórea para aproximadamente 37ºC e restabelecem todas as funções fisiológicas (Fig. 2). Este padrão de hibernação interrompida por episódios de despertar consome substancialmente mais energia quando comparado à hibernação contínua, apresentada por outros animais, por exemplo, alguns anfíbios e répteis. Na marmota, 72% da energia consumida durante a hibernação é gasta nos despertares (17%) e durante os períodos de eutermia (57%) (Heldmaier e col., 2004). A importância biológica dos episódios de despertar ainda não é conhecida, mas tem sido sugerido que sejam importantes no reconhecimento de patógenos e iniciação de resposta imune além de reposição de RNAm e proteínas degradados durante o hipometabolismo (Prendergast e col., 2002; Knight e col., 2000). a b
- 273. Metablismo Julho/2010 Pág. 263 Figura2– Registro contínuo da taxa metabólica (TM) e da temperatura corpórea (Tc) na marmota (Marmota marmota), evidenciando o hipometabolismo e hipotermia durante a entrada em hibernação (1), a manutenção do hipometabolismo durante a hibernação (2), o rápido reaquecimento durante o despertar (3), e a eutermia (4). A ventilação é reduzida em uníssono com a queda da taxa metabólica e assume um padrão episódico, com ventilações seguidas por períodos de apnéia que podem durar de alguns minutos a uma hora ou mais (à direita). Ta representa temperatura ambiente. (Modificado de Heldmaier e col., 2004). Despertar O armazenamento de lipídios é crítico não somente para a sobrevivência do animal durante a fase de dormência, mas também para que o despertar seja bem sucedido. Na primavera, quando os animais despertam da fase de dormência, a taxa metabólica eleva-se antes que a ingestão de alimentos seja restabelecida e ocorre uma diminuição da massa corpórea mesmo após o início da alimentação (Dark, 2005). Em alguns mamíferos hibernantes, a elevação da temperatura corpórea envolve o aumento da produção de calor no tecido adiposo marrom através da oxidação de ácidos graxos e ciclagem fútil de elétrons através de proteínas desacopladoras (UCPs) da membrana mitocondrial interna, como visto em capítulos anteriores. Neste momento, as reservas remanescentes de carboidratos são utilizadas e algum grau de oxidação de proteínas faz-se necessário, provendo aminoácidos para a síntese de glicose, essencial ao aumento de atividade metabólica dos tecidos dependentes de glicose (Carey e col., 2003; Souza e col., 2004). Mecanismos de depressão metabólica: inibição dos processos que produzem e consomem energia nas células Fosforilação reversível Os mecanismos moleculares de depressão metabólica devem ser reversíveis, possibilitando o rápido restabelecimento das funções metabólicas no despertar. Um mecanismo bastante conservado filogeneticamente e que parece ser responsável por grande parte dos ajustes na depressão metabólica é a fosforilação reversível, que consiste na ligação de grupos fosfato a resíduos de aminoácidos específicos de uma proteína, catalisada por proteínas quinases, e na remoção desses grupos, catalisada por proteínas fosfatases. Quando o aminoácido modificado está localizado em uma região da proteína que é crítica para a sua estrutura tridimensional, ocorrem efeitos marcantes que modificam algumas de suas propriedades ou a sua interação com outras proteínas ou estruturas sub- celulares. Em diversas condições fisiológicas, várias enzimas glicolíticas, receptores e transportadores de membrana, proteínas responsáveis pela transcrição gênica, síntese e
- 274. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 264 Julho/2010 degradação de proteínas e regulação do ciclo celular são reguladas por fosforilação reversível (Storey, 2004). O primeiro relato do papel da fosforilação reversível nos ajustes ao hipometabolismo veio de estudos com moluscos marinhos, nos quais a fosforilação da piruvato quinase causou diminuição da atividade desta enzima e do fluxo pela via glicolítica (Storey e Storey, 1990). Na depressão metabólica há uma inibição coordenada de processos que produzem e consomem energia nas células, além de ajustes específicos, como mudanças no tipo de substrato energético preferencial e de catabólitos acumulados. Em condições anóxicas, carboidratos são o principal substrato para a produção de ATP, já quando a oferta de O2 no ambiente não é limitante, como na maioria dos casos de hibernação e estivação, há uma tendência geral à inibição do catabolismo de carboidratos e maior contribuição dos ácidos graxos como combustível energético (Carey e col., 2003). Tais ajustes nas vias catabólicas são alcançados, principalmente, pela regulação de enzimas reguladoras de taxa de reação. De uma maneira geral, o catabolismo de carboidratos é regulado no nível das enzimas glicogênio fosforilase, hexoquinase, fosfofrutoquinase-I e II e piruvato quinase, por regulação alostérica e/ou fosforilação reversível. Observa-se, entretanto, que a regulação destas enzimas durante o hipometabolismo ocorre de maneira mais sistemática durante a depressão metabólica anaeróbia. Nos casos de depressão metabólica aeróbia, tem sido demonstrado que o ponto de regulação mais importante é a piruvato-desidrogenase (PDH), que exibe uma forte inibição em vários órgãos de todos os hibernantes já estudados. Este complexo enzimático, que atua convertendo o piruvato proveniente da glicólise a acetil-CoA e regula desta forma a entrada dos carboidratos na via de fosforilação oxidativa, é convertido em uma forma menos ativa quando sofre uma fosforilação catalisada pela enzima piruvato desidrogenase quinase (PDK) (Storey, 2004). Expressão Gênica A mudança do tipo de substrato preferencial é regulada, em parte, no nível da expressão gênica. Para ilustrar como esta regulação acontece, vejamos o que acontece no coração de esquilos terrícolas durante a hibernação (Fig.3). Durante a fase de dormência, há um aumento da expressão e síntese da isoforma 4 da PDK (PDK4), o que resulta em uma diminuição da porcentagem ativa da PDH e, consequentemente, da formação de acetil- CoA a partir de piruvato. Estes ajustes favorecem: a diminuição do uso de carboidratos, preservados para utilização pelo cérebro, um tecido dependente de glicose; uma ênfase na utilização de ácidos graxos e a diminuição da taxa metabólica do animal. Curiosamente, ratos submetidos a jejum apresentam maior expressão da PDK4 em diversos tecidos, sugerindo que a resposta observada em animais hibernantes pode ser padrão em mamíferos, levando à supressão da oxidação de carboidratos em uma condição onde a
- 275. Metablismo Julho/2010 Pág. 265 oxidaçãode lipídios deve ser priorizada (Wu e col., 2000). Confirmando esta idéia, alterações na expressão de enzimas envolvidas na oxidação e síntese de ácidos graxos também foram observadas durante o hipometabolismo. A diminuição da expressão da enzima acetil-CoA carboxilase, que catalisa a formação de malonil-CoA a partir de acetil-CoA, primeiro passo da síntese de ácidos graxos, inibe a síntese e favorece a oxidação de ácidos graxos ao diminuir a formação de malonil-CoA, um inibidor da enzima responsável pelo transporte de ácidos graxos para dentro da mitocôndria (carnitina palmitoil transferase – CPT). Paralelamente, há um aumento da expressão da lipase pancreática, uma enzima envolvida na hidrólise de triglicerídeos e geralmente expressa no pâncreas, no coração do hibernante. A quantidade de lipase pancreática, assim como da lípase hormônio sensível, também se encontra aumentada no tecido adiposo branco dos esquilos durante a hibernação o que favorece uma maior liberação de ácidos graxos no plasma (Van Breukelen e Martin, 2002). A regulação da atividade de enzimas mitocondriais também desempenha importante papel na depressão das taxas do metabolismo oxidativo (Storey e Storey, 2004). Assumindo que o equilíbrio redox e o balanço entre as concentrações de adenilatos (carga energética) não se alteram durante a transição do estado ativo para o estado dormente, a inibição do fluxo de substratos através do Ciclo de Krebs seria dada por regulação da concentração de enzimas mitocondriais, como a citrato sintase, e /ou pela regulação de enzimas que suprem a via com os intermediários que constituem substratos em diferentes etapas de reação (Storey, 2004). Figura 3 – Modelo de regulação proposto para a mudança do tipo de substrato preferencial, de
- 276. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 266 Julho/2010 carboidratos para ácidos graxos, durante a hibernação em mamíferos. Foram indicados os efeitos da concentração plasmática de insulina e ácidos graxos (AG) na expressão gênica da isoforma 4 da enzima piruvato quinase desidrogenase (PDK4) e na oxidação de carboidratos e ácidos graxos no coração dos animais durante a atividade de outono e dormência de inverno. As linhas com cabeça de seta indicam ativação e as linhas terminadas em elipse indicam inibição; linhas sólidas indicam a regulação predominante e as linhas pontilhadas indicam vias menos atuantes. As setas em vermelho indicam aumento ou diminuição na concentração ou atividade e o ajuste correspondente nas taxas de oxidação de AG e de carboidratos. PPARα é um receptor nuclear, ativado por ácidos graxos, que funciona como fator de transcrição de genes envolvidos no metabolismo de lipídios. TG, triglicerídeos; HSL, lípase hormônio sensível (Modificado de Carey e col., 2003). Síntese e degradação de proteínas Outro processo que envolve alto custo energético e que constitui um alvo na depressão metabólica é a síntese protéica. As atividades de síntese protéica e transcrição gênica utilizam 25%-30% e 1%-10% do ATP produzido nos tecidos de mamíferos no estado basal (Rolfe e Brown, 1997). A síntese protéica pode ser inibida como uma conseqüência da inibição da transcrição gênica através de uma diminuição dos níveis de RNAm ou diretamente através da fosforilação reversível de proteínas ribossomais e consequente inibição da maquinaria de tradução. Em alguns moluscos e mamíferos hibernantes, a quantidade de RNAm sofre pouca alteração nas células em depressão metabólica e esta aparente extensão da meia-vida do RNAm levou os autores a proporem o termo “RNAm latente”. Portanto, a inibição da síntese protéica parece acontecer principalmente através da fosforilação reversível de proteínas da maquinaria de tradução e de alterações no estado de agregação dos polissomos. Paralelamente, dada a inibição da síntese de proteínas, a degradação também parece ser inibida durante o hipometabolismo, aumentando a meia vida destas moléculas, o que além de contribuir para a economia energética, diminui a formação de produtos nitrogenados e os custos de seu processamento, estocagem e excreção (Storey e Storey, 2004). Composição lipídica das membranas Estudos envolvendo comparações intra-específicas da composição lipídica de membrana sugerem que seria um importante alvo de regulação em estados de depressão metabólica, embora ainda sejam poucos os trabalhos que confirmam esta hipótese que é baseada em uma teoria intensamente debatida na literatura por Hulbert e col. (2000) na última década. Uma vez que a fração substancial do metabolismo está relacionada com a função de enzimas associadas às membranas de suas células, os autores propuseram que a composição lipídica das membranas desempenha papel determinante na intensidade metabólica de uma espécie através de sua influência sobre a atividade destas enzimas. De
- 277. Metablismo Julho/2010 Pág. 267 maneirageral, animais menores possuem membranas mais insaturadas e, consequentemente, taxa metabólica massa específica maior que animais maiores (Hulbert e Else, 2000; Hulbert, 2007). Adicionalmente, as adaptações à temperatura em peixes e outros ectotérmicos que vivem em ambientes frios, próximos à região polar, aparentemente envolvem um aumento do conteúdo de ácidos graxos polinsaturados (PUFAs) que mantém a fluidez das membranas e preserva a função de proteínas de membrana em órgãos vitais (Gibbs, 1998). Em um caramujo terrestre estivante, alterações na composição da membrana mitocondrial interna do hepatopâncreas, dissociadas de efeitos da temperatura, foram sugeridas com base na redução de cerca de 80% do conteúdo de cardiolipina durante o estado hipometabólico e tais alterações estariam relacionadas à redução de proporções similares da atividade da CCO (Stuart e col., 1998). Esquilos em torpor apresentam uma diminuição da porcentagem de ácidos graxos saturados (SFAs) e aumento de PUFAs nas membranas dos cardiomiócitos, provavelmente em resposta à queda da temperatura corpórea, embora a atividade da Na+ ,K+ -ATPase ainda esteja diminuída em comparação com as taxas em animais ativos (Charnock e col., 1980). Na marmota, um hibernante herbívoro, alterações sutis em ácidos graxos específicos dos fosfolipídeos parecem desempenhar um papel importante na regulação metabólica durante a dormência sazonal, observando-se um aumento da razão entre os PUFAs n6 e n3 nos cardiomiócitos (Ruf e Arnold, 2008). Tais alterações estariam relacionadas ao controle dos níveis de Ca++ e à ausência de arritmia cardíaca durante a queda da temperatura corpórea e o torpor, ao contrário dos severos efeitos da hipotermia sobre a função cardíaca em mamíferos não hibernantes. Curiosamente, evidências sugerem que o ajuste não ocorre no ventrículo cardíaco de lagartos teiú, provavelmente em virtude da dormência nestes animais ocorrer em temperaturas relativamente elevadas e à ausência de despertares periódicos durante o estado hipometabólico, além de outras diferenças na morfologia e função do órgão desses animais (Silveira, dados não publicados). Face à redução das taxas de produção de energia, a inibição de processos celulares que a consomem é crucial para que um novo estado de equilíbrio seja alcançado. A manutenção de gradientes iônicos adequados através das membranas é critica para a viabilidade celular e, durante a depressão metabólica, há uma diminuição do movimento dos íons em ambas as direções, tanto passivo através de canais iônicos, quanto pelo transporte ativo, o que possibilita grande economia energética (Hochachka e Guppy, 1987). A atividade da Na+ ,K+ -ATPase, utiliza 19%-28% do ATP produzido nos tecidos de mamíferos no estado basal (Rolfe e Brown, 1997) e a inibição deste processo contribui, de forma significativa, para a depressão metabólica e sobrevivência dos animais durante a dormência (Carey e col., 2003). A fosforilação reversível e as alterações da composição lipídica das membranas têm sido sugeridas como os principais mecanismos que afetam a
- 278. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 268 Julho/2010 atividade desta proteína. Considerações Finais A depressão metabólica não se manifesta com a mesma magnitude em todos os mecanismos e processos no interior das células ou em todos os órgãos e tecidos do animal. Acredita-se que exista uma ‘hierarquia’ entre os processos consumidores de energia nas células de mamíferos, com a síntese de proteínas e RNA sendo mais sensíveis a variações no suprimento de energia do que no bombeamento de íons, o que evidencia a importância da manutenção do gradiente iônico através das membranas (Buttgereit e Brand, 1995). Adicionalmente, o grau de inibição em diferentes órgãos e tecidos parece ser variável. Por exemplo, a atividade da Na+ ,K+ -ATPase no tecido cardíaco de esquilos mantém-se inalterada durante a hibernação, embora esteja significativamente reduzida no músculo esquelético, rins e fígado (Balaban e Bader, 1984; MacDonald e Storey, 1999). No conjunto, a inibição destes vários processos, cuja atividade é mais intensamente deprimida no estado dormente, resulta na diminuição do gasto energético e da velocidade de utilização das reservas de substratos endógenos, possibilitando a sobrevivência dos animais durante a fase de dormência.
- 279. Metablismo Julho/2010 Pág. 269 Custose benefícios da reprodução: papel dos lipídios Aline Dal’Olio Gomes Laboratório de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos eniladal@gmail.com Introdução Além dos processos fisiológicos e comportamentais apresentados até aqui (termorregulação, febre, anapirexia, hibernação e dormência), o processo reprodutivo também ocasiona alterações no metabolismo energético dos animais. Como já discutido, as células requerem um contínuo fornecimento de energia para biossíntese e metabolismo, mas a disponibilidade de alimento e a demanda energética flutuam na maioria dos habitats, e grande parte dos organismos cessa a alimentação quando iniciam os comportamentos que perpetuam a espécie. Neste período em que o trato digestório está vazio, o organismo depende das fontes internas (tecido adiposo) e externas (estoques de alimentos) de nutrientes. Durante a evolução dos animais, a habilidade de armazenar quantidades significativas de energia no organismo e mecanismos que inibem o comportamento de ingestão devem ter permitido aos animais a realização de outras atividades que garantissem o sucesso reprodutivo (Scheneider, 2004). Essa habilidade para controlar a disponibilidade de energia interna e externa parece ser central para a ligação entre a reprodução e o balanço energético, e permite que os animais priorizem suas opções comportamentais de acordo com as flutuações nas condições energéticas e reprodutivas (Scheneider, 2004). Sendo assim, quando o alimento é abundante e o requerimento energético é baixo, a energia é disponível para todos os processos necessários para sobrevivência do indivíduo e da população, incluindo crescimento, manutenção, termorregulação e reprodução (Fig. 1a). Desta forma, os comportamentos relacionados à defesa territorial, corte, cópula e cuidado parental recebem uma alta prioridade, e a energia excedente é armazenada (Scheneider, 2004). Por outro lado, quando a energia é escassa, os mecanismos fisiológicos tendem a favorecer aqueles processos que garantem apenas a sobrevivência do indivíduo. Assim, os processos fisiológicos que promovem os comportamentos de forrageamento, armazenamento e ingestão recebem prioridade (Fig.1b), pois a reprodução é muito custosa energeticamente e pode ser retardada quando a sobrevivência do indivíduo está em risco (Scheneider, 2004). Deste modo, os mecanismos que controlam o balanço energético são integrados com aqueles que controlam a reprodução, sendo importante entender a ligação entre a fisiologia do balanço energético e o sucesso reprodutivo.
- 280. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 270 Julho/2010 Figura 1: Relação entre o balanço energético e a reprodução. Custos da reprodução Os processos envolvidos na reprodução que contribuem para o aumento da demanda energética incluem: esteroidogênese; desenvolvimento gonadal (vitelogênese e espermatogênese/espermiogênese); comportamentos reprodutivos (defesa de território, corte, acasalamento, migração) e cuidado parental. Deste modo, para que haja um sucesso reprodutivo, os animais precisam estar preparados fisiologicamente, e para isso é necessário que acumulem grande quantidade de reservas energéticas. Em geral, a reprodução é energeticamente custosa para ambos os sexos, mas a magnitude do gasto e sua relação com o sucesso reprodutivo diferem entre machos e fêmeas. Os machos alocam relativamente pouca energia para a produção de gametas e, então podem se reproduzir com sucesso com um investimento de energia menor, que é direcionado para corte e cópula. Em contraste, as fêmeas de muitas espécies apresentam altos custos na atividade reprodutiva independente da fecundidade (como migração, cuidado parental), e necessitam de uma reserva energética substancial antes de iniciar a atividade reprodutiva (Aubret e col., 2002). Diferentes padrões da relação entre a captação de reservas energéticas e a reprodução podem ser observados entre os vertebrados. Os peixes, principalmente migratórios como o salmão, não se alimentam durante a migração reprodutiva, assim toda a energia necessária para o desenvolvimento gonadal e para atividade de natação são provenientes das reservas energéticas obtidas anteriormente ao período reprodutivo (Lucas e Baras, 2001). +Alimento abundante Baixa demanda energética ↑Energia= Crescimentoo Manutenção Reprodução +Alimento escasso Alta demanda energética = ↓Energia Crescimento Manutenção A B
- 281. Metablismo Julho/2010 Pág. 271 Emespécies de anfíbios de zona temperada, que apresentam reprodução explosiva durante o verão, os animais devem acumular energia suficiente para sobreviver durante a dormência no inverno e ainda suportar as atividades reprodutivas ao despertar, como vocalização, defesa de território, corte e cópula (Wells, 2007). Os machos de Rana temporaria e Bufo bufo, geralmente não se alimentam ao longo de todo esse período reprodutivo (Jorgensen, 1992). Contudo, em espécies com períodos reprodutivos prolongados e relativamente baixa taxa de vocalização, pode ocorrer apenas uma diminuição da ingestão de alimentos, sendo o gasto energético suplementado através da alimentação (Wells, 2007). Adicionalmente, machos de Scinax mantêm a alimentação durante toda a estação reprodutiva, sugerindo o aumento do suporte energético para a vocalização (Carvalho e col., 2008). Algumas espécies aumentam a ingestão de alimentos durante o período de intenso cuidado parental, considerando que outras aumentam tanto a captação quanto o armazenamento em antecipação ao nascimento da prole (Wade e Schneider, 1992). Em muitas espécies de aves, a necessidade energética da nova prole requer aumento do forrageamento e da alimentação por ambos os pais em ordem deles produzirem um fornecimento suficiente do leite do papo (Schneider, 2004). Em mamíferos, a lactação e o comportamento termorregulatório do cuidado parental são energeticamente custosos às fêmeas. Assim, anteriormente ao nascimento da prole, as fêmeas de alguns mamíferos se alimentam muito e armazenam o excesso de nutrientes, que são posteriormente direcionados a alta demanda energética da lactação. Contrariamente a isso, algumas espécies apresentam uma pequena ingestão de alimentos ao longo da gravidez, enquanto os estoques de alimentos aumentam durante esta fase, para serem consumidos durante a lactação (Bronson, 1989). Há ainda espécies nas quais a ingestão de alimento e o armazenamento precedem a estação reprodutiva: elefantes marinhos e pinguins imperador apresentam um período de massiva alimentação que ocorre 3 meses antes do período de jejum, competição pela corte e reprodução (Anderson e Fedak, 1987; Groscolas, 1990). Papel dos lipídios e ácidos graxos na reprodução Durante o processo de vitelogênese, o fígado é estimulado pelo hormônio estradiol a sintetizar a vitelogenina, uma fosfoglicolipoproteína, que dentre seus diferentes componentes é formada por ácidos graxos que são mobilizados das reservas de lipídios (tecido adiposo, músculo e/ou fígado) e incorporporados nos oócitos por pinocitose (Fig. 2). Desta forma, a qualidade e a quantidade dos lipídios e também de ácidos graxos podem variar com o status reprodutivo.
- 282. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 272 Julho/2010 Figura 2: Vitelogênese nos vertebrados. Lipídios como fonte energética De modo geral, para os vertebrados, os lipídios são a principal fonte de reserva energética, sendo geralmente armazenados no fígado, tecido adiposo e/ou músculos. O fígado, juntamente com o tecido adiposo, são órgãos de armazenamento que apresentam importante papel na reprodução (Sheridan, 1994). Além disso, o tecido adiposo serve como reserva energética durante a hibernação e estivação; e está também envolvido na vitelogênese de espécies ovíparas que produzem muitos ovos, e no desenvolvimento intra- uterino de embriões (Jared e col., 1999). Deste modo, o acúmulo de lipídios nos diferentes tecidos é altamente dependente da qualidade nutricional, bem como da estação do ano e do status de desenvolvimento e reprodução (Sheridan, 1994), motivo pelo qual a concentração de lipídios armazenados se altera significativamente ao longo do tempo entre os indivíduos e populações, em resposta às necessidades energéticas (Meffe e Snelson, 1993; Moreira e col., 2002). Love (1980) discutiu o processo de mobilização lipídica durante o ciclo reprodutivo entre espécies de peixes estudadas até aquele momento. Em algumas, como por exemplo, Gadus morhua, ocorreu um aumento de lipídio hepático nas fases iniciais da vitelogênese seguido de uma redução nestes teores na fase que antecede a desova. Em outras, como Coreogonus clupeanorfis, conforme avança o período reprodutivo, declinam os teores de lipídio hepático e muscular. Trabalhos mais recentes mostraram que, em fêmeas, com a chegada da fase vitelogênica ocorreu a mobilização de lipídios hepático e muscular para as gônadas (Oreochromis niloticus, El-Sayed e col., 1984; Trisopterus lucus, Merayo, 1996). Ao contrário disso, em machos e fêmeas de Diplodus sargus ocorreu um aumento de lipídios Proteína Lipídios Tec. adiposo Músculo Estradiol Vitelogenina Fígado Ovário
- 283. Metablismo Julho/2010 Pág. 273 emtodos os órgãos de reserva analisados (fígado, músculo e gônadas) durante a fase reprodutiva (Pérez e col., 2007). Para os anfíbios, os corpos gordurosos parecem ter um papel muito importante na reprodução, variando com as alterações sazonais e os ciclos reprodutivos. No anuro Bufo arenarum, este tecido está relacionado ao aumento de massa ovariana (Penhos, 1953). O mesmo é observado para Rana sculenta, em que a variação do peso e a composição química dos corpos gordurosos estão relacionados com a atividade sexual (Roca e col., 1970), e para Rana cyanophlyctis, na qual foi encontrado uma diminuição do peso dos corpos gordurosos com o aumento dos ovários (Pancharatna e Saidapur, 1985). Nas fêmeas de uma espécie de cecília vivípara, Typhlonectes compressicauda, foi observado um aumento em todos os órgãos de reserva (tecido adiposo e fígado) no início da estação chuvosa, que parece estar relacionado com a vitelogênese e o preparo para a gravidez (Exbrayat, 1988). Contudo, os machos de Anuros e Gymnophiona mostram que os órgãos podem ser considerados como reserva polivalente, podendo ser utilizado em muitas circunstâncias (Exbrayat e Hraoui-Bloquet, 2006). Para os répteis, os corpos gordurosos também representam o principal estoque de lipídios (Scott e col., 1995, Sheridan, 1994), contudo, os lipídios do fígado contribuem para o crescimento folicular (Bonnet e col., 1994) e os lipídios do músculo podem ser usados quando as fontes energéticas do tecido adiposo são limitadas (Derickson, 1976). As fêmeas reprodutivas de serpentes viperinas Natrix maura, têm mais lipídios no fígado do que as fêmeas pós-reprodutvas (Fig. 3), suportando a importância deste órgão na produção de vitelogenina. Além disso, comparações feitas entre as cobras pré e pós-reprodutivas nessa mesma espécie, indicaram que os corpos gordurosos foram a principal fonte de lipídios para a reprodução em machos e fêmeas (Fig. 3). O padrão de variação de lipídios nos machos foi similar à disponibilidade de alimento, indicando que as serpentes aumentaram a atividade de forrageamento e as reservas lipídicas de acordo com a maior disponibilidade de presas. Contudo, de maio a junho, as reservas de lipídios diminuíram mesmo com o aumento de presas, o que sugere que durante este período a taxa de investimento energético foi alta devido à atividade reprodutiva (espermatogênese). Em contraste, os lipídios nas fêmeas não foram correlacionados com a disponibilidade alimentar, pois durante a vitelogênese as reservas de lipídios diminuíram mesmo com um aumento na disponibilidade de alimento. Durante este período, as fêmeas mobilizaram tanto os lipídios armazenados quanto os lipídios obtidos diretamente da dieta para a síntese de vitelogenina (Santos e Llorente, 2004).
- 284. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 274 Julho/2010 Figura 3: Alocação de lipídios dos órgãos de reserva em machos e fêmeas pré e pós-reprodutivos (NRM e NRF, respectivamente) e machos e fêmeas reprodutivos (RM e RF, respectivamente) de serpentes viperinas Natriz maura (Modificadode Santos e Llorente, 2004). Muitas medidas do metabolismo lipídico variam significativamente com a estação reprodutiva ativa dos lagartos tree (Urosaurus ornatus), especificamente a massa dos corpos gordurosos, o conteúdo de lipídios totais hepáticos, a atividade da enzima diacilglicerol aciltransferase (enzima responsável por ligar uma molécula de acetil-Coenzima A no diacilglicerol formando um triacilglicerol) no fígado e corpos gordurosos, e a concentração de ácidos graxos livres circulantes (Lacy e col., 2002). Estes resultados são consistentes com muitos dados existentes em que machos e fêmeas exibem ciclos de armazenamento e depleção de lipídios coincidente com os eventos reprodutivos, como a vitelogênese, gravidez, defesa territorial e corte (Castilla e col., 1992; Derickson, 1976). Como podemos observar o local e a forma de armazenamento, variam conforme a espécie estudada. Em geral, os lipídios são armazenados nos tecidos de reserva na forma de triacilgliceróis e as diferenças encontradas no local de armazenamento podem refletir a história de vida dos animais (Sheridan, 1988). Ácidos graxos Os lipídios, em sua maioria, são compostos por ácidos graxos (AG), que são ácidos carboxílicos com cadeias hidrocarbonadas de 4 a 36 átomos de carbono. Em alguns, esta cadeia é totalmente saturada e em outros contém uma insaturação (monoinsaturado; MUFA) ou mais insaturações (polinsaturado; PUFA) (Nelson e Cox, 2005). De modo geral, os lipídios podem ser classificados em neutros (triacilgliceróis - TG) e polares (fosfolipídios - FL). Sabe-se que 90% da composição dos triacilgliceróis, principal substrato energético, C. gordurosos Fígado Músculo Músculo % de lipídios no tecido seco
- 285. Metablismo Julho/2010 Pág. 275 correspondeaos ácidos graxos, compostos principalmente por saturados e monoinsaturados. Nos fosfolipídios, 70 a 80% da sua composição é de ácidos graxos e na sua maioria polinsaturados, formando a bicamada lipídica que é responsável pelo controle da fluidez das membranas biológicas (Bell e col., 1986). Os ácidos graxos polinsaturados participam de importantes funções biológicas, como crescimento, regulação da resposta imune e ainda as alterações fisiológicas dos animais frente a um estresse ambiental (Bell e cols., 1995). Adicionalmente, os PUFAs participam também dos processos reprodutivos dos vertebrados, influenciando na concentração de hormônios esteróides gonadais, vitelogênese, na manutenção da estrutura de membrana dos espermatozóides, na qualidade dos ovos, desova e sobrevivência larval (Izquierdo e col., 2001; Wathes e col. 2007). Contudo, a composição desses ácidos graxos pode variar muito em relação à dieta dos pais e às condições do ambiente. Desta forma, quando as dietas maternas são deficientes, a transferência de ácidos graxos para as gônadas se torna insuficiente para um desenvolvimento oocitário adequado, reduzindo a qualidade dos gametas e da progênie (Adams, 1999). Ovíparos x Vivíparos Os lipídios que compõem o vitelo são compostos principalmente por fosfolipídios e triacilgliceróis, e a sua proporção pode variar entre as espécies. Fêmeas de lagartos ovíparos possuem de 26 a 34% de lipídios no vitelo (Speake e Thompson, 2000). Proporções similares de lipídios (20%) são encontradas na composição da vitelogenina de peixes (Yaron e Sivan, 2006). Contudo, o vitelo de aves é composto por 40 a 65% de lipídios (Jones e col., 1998). A maioria dos fosfolipídios presentes no vitelo são ricos em PUFAs e suportam o crescimento tecidual dos embriões, enquanto os triacilgliceróis são utilizados como reserva energética para o desenvolvimento embrionário (Yaron e Sivan, 2006). O perfil de PUFAs do vitelo pode ser afetado pela composição da dieta materna, e também é dependente de fatores metabólicos, os quais diferem entre as espécies (Speake e Thompson, 2000). Os ovos colocados pelas espécies ovíparas devem conter todos os nutrientes requeridos para sustentar o desenvolvimento completo do embrião até a eclosão. Contudo, a evolução da viviparidade, apresentou a oportunidade para as mães reduzirem o investimento no ovo, como um abastecimento compensatório de nutrientes ao embrião via placenta durante a gestação. Sendo assim, os ovos de espécies ovíparas de aves, tartarugas e jacarés possuem altas proporções de triacilglicerol (80-86%) e apenas 9-12% de fosfolipídios. Contrariamente a isso, os ovos de espécies vivíparas possuem uma proporção de TG de 65- 70%, considerando que a proporção de fosfolipídos é de 18-23% (Speake e Thompson, 2000).
- 286. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 276 Julho/2010 Há uma clara distinção no perfil das classes de lipídios do vitelo entre espécies ovíparas e vivíparas. Esta reorganização do perfil de lipídios do vitelo contribui para uma redução no investimento materno de energia durante a maturação oocitária (Speake e Thompson, 2000). Espécies vivíparas possuem menos triacilgliceróis no vitelo que espécies ovíparas, pois a energia, presumivelmente na forma de ácidos graxos livres, pode ser provida para o embrião através da placenta durante o desenvolvimento, uma vez que todo o requerimento lipídico para espécies ovíparas deve estar contido no vitelo do ovo no tempo da ovulação (Thompson e Speake, 2006). Fecundidade A composição de ácidos graxos dos ovários é altamente afetada pelo conteúdo de ácidos graxos da dieta, o qual influencia significativamente a qualidade dos ovos. A porcentagem de PUFAs aumenta com o aumento desses AGs na dieta dos reprodutores (Izquierdo e col., 2001). Estudos realizados com uma espécie de peixe, Siganus guttatus, mostraram que a elevação do conteúdo lipídico na dieta dos reprodutores resultou em um aumento na fecundidade e eclosão das larvas (Duray e col., 1994). Altas porcentagens importantes de PUFAs (como ácido eicosapentanóico, EPA-C20:5n3 e ácido araquidônico, AA-C20:4n6) são encontradas também nos ovos de anuros e lagartos insetívoros, refletindo a importância da dieta dos reprodutores (Huang e col., 2003). Fertilização Dietas contendo concentrações de EPA e DHA (C22:6n3, ácido docosahexanóico) mostram uma correlação com a reprodução de algumas espécie de peixes (Fernández- Palacios e col., 1997). A composição de ácidos graxos dos espermatozóides depende do conteúdo de AGs essenciais na dieta dos reprodutores de espécies de truta arco-íris (Watanabe e col., 1984) e seabass (Asturiano, 2001). É possível que a motilidade dos espermatozóides durante a fertilização seja afetada. Particularmente em salmonídeos, em que a criopreservação dos espermatozóides é utilizada, a composição de ácidos graxos nos espermatozóides pode ser um fator que determina a integridade da membrana após o descongelamento (Izquierdo e col., 2001). A alta porcentagem de DHA encontrada nos testículos de peixes é similar aos espermatozóides de humanos e, assim como nos mamíferos, a concentração de DHA em peixes pode ser positivamente correlacionada com a densidade, número de espermatozóides móveis e a motilidade (Jeong e col., 2002). O comportamento de membrana pode ser importante no controle da fusão dos espermatozóides com o óvulo (Bell e col., 1999).
- 287. Metablismo Julho/2010 Pág. 277 Contudo,há grande diferença entre aves e mamíferos com respeito à composição de AGs dos fosfolipídios dos espermatozóides. Os espermatozóides de mamíferos, como em peixes, são caracterizados por altas proporções de PUFAs da série n3, principalmente DHA, em aves, ao contrário, predomina os PUFAs da série n6. Essa diferença no perfil de AG parece representar uma adaptação à temperatura, já que as aves apresentam uma temperatura corpórea maior do que a de mamíferos (41°C/37°C). Além disso, os testículos dos mamíferos estão mantidos a uma temperatura mais baixa do que o resto do corpo, devido a externalização da cavidade testicular. Desta forma, os espermatozóides das aves devem se desenvolver e funcionar em um ambiente consideravelmente mais quente que o experimentado por mamíferos. O principal PUFA dos espermatozóides das aves, o C22:4n6, possui o mesmo comprimento de cadeia do DHA (C22:6n3), o principal PUFA dos espermatozóides de peixes e mamíferos, mas com 2 insaturações a menos. Essa diferença no grau de insaturação pode representar a manutenção de propriedades biofísicas das membranas dos espermatozóides nas diferentes temperaturas (Kelso e col., 1997). Esteroidogênese Os PUFAs são importantes também na síntese de eicosanóides (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), podendo interferir na esteroidogênese gonadal em peixes (Izquierdo e col., 2001) e mamíferos (Wathes e col., 2007). O EPA é conhecido por ser o precursor das prostaglandinas (PG) da série III, considerando que o AA é o precursor das prostaglandinas da série II. In vitro, o AA estimula a produção de testosterona no testículo de goldfish através da conversão a PGE2. Ao contrário, o EPA e DHA bloqueiam a ação esteroidogênica do AA e PGE2 (Wade e col., 1994). Assim, o tempo de espermiação pode ser retardado e subsequentemente a taxa de fertilização reduzida pela depressão da esteroidogênese causada pela deficiência de AG. Adicionalmente, o AA pode regular a transcrição do gene que expressa a proteína Star, responsável pelo transporte do colesterol da membrana externa da mitocôndria para a interna, onde se localizam a maioria das enzimas envolvidas na esteroidogênese (Wang e col., 2000). Além disso, algumas PGs produzidas por fêmeas de golfish parecem estimular o comportamento sexual dos machos e sincronizar machos e fêmeas para a desova (Sorensen e col., 1988). Desenvolvimento embrionário e larval A comparação entreos ovos de animais marinhos e de água doce mostrou que o AA e a razão DHA/EPA nos fosfolipídios dos ovos são positivamente correlacionados com a simetria e a viabilidade dos ovos. Como já mencionado, estes ácidos graxos participam de
- 288. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 278 Julho/2010 um papel estrutural importante como componentes dos fosfolipídios das biomembranas e estão associados aos processos de fluidez. O tecido neural, especialmente dos olhos, pode formar relativamente grande proporção da massa corporal total de embriões e larvas, assim o requerimento de DHA nos estágios embrionários e larval pode ser crítico para a função do sistema neural e visual (Furuita e col., 2000). Estudos com mamíferos indicam que uma deficiência na dieta em DHA traz prejuízos para a visão. O ácido araquidônico (C20:4n6) é também um importante constituinte dos fosfolipídios de tecidos embrionários, principalmente cérebro, coração e fígado, devido a síntese de eicosanóides (Speake e Thompson, 2000). A necessidade do desenvolvimento dos tecidos para AA e DHA pode ser cumprida diretamente pela transferência destes ácidos graxos do vitelo, ou alternativamente, por sua síntese feita pelos embriões a partir de seus precursores (Speake e Thompson, 2000). Assim, os AGs podem ser oxidados para a produção de energia, mas o requerimento para síntese de fosfolipídios em tecidos em desenvolvimento são mais seletivos. Conclusão Como visto até agora, a estreita relação entre o balanço energético dos animais e os processos fisiológicos, nesse caso a reprodução, garante a sobrevivência dos indivíduos e a perpetuação da espécie. Contudo, alterações do habitat podem resultar em diminuição ou eliminação de muitos recursos alimentares para os animais, alterando assim, toda a composição de lipídios, e ácidos graxos, o que pode resultar em uma redução na qualidade dos gametas dos pais e da sua prole. Dentro do cenário global das mudanças ambientais ocasionadas por ações antrópicas, é fundamental que estudos de conservação sejam feitos, envolvendo a influência do balanço energético nos processos fisiológicos, principalmente no funcionamento do sistema reprodutivo, para garantir a sobrevivência das espécies.
- 289. Metablismo Julho/2010 Pág. 279 Aecofisiologia no cenário das mudanças climáticas globais Lye Otani Laboratório de Ecofisiologia e Fisiologia Evolutiva lye@usp.br Relações energéticas no contexto ecológico O orçamento energético dos animais e suas diversas relações com o ambiente são muito utilizados como base de teorias ecológicas que visam explicar a diversidade da história evolutiva observada nos vertebrados (McNab, 1992). O orçamento energético de um animal é constituído basicamente dos processos e mecanismos de obtenção e dispêndio, os quais são influenciados e regulados por diversos fatores. A obtenção de energia nos animais ocorre através da ingestão, digestão, assimilação e metabolização do alimento (Nagy e Negus, 1993; Robbins, 1993; Speakman, 2000). Apesar do processo ser aparentemente simples, a obtenção de energia para manutenção do equilíbrio energético é limitado por fatores intrínsecos e extrínsecos ao animal (Fig. 1). No ambiente natural, os animais devem lidar primeiramente com a sazonalidade e disponibilidade do alimento, além disso, sua qualidade também influenciará na quantidade de energia disponível para ser assimilada. Essa assimilação de energia, por sua vez, é controlada por uma série de limites intrínsecos do animal (Castle e Wunder, 1995; Toloza e col., 1991; Speakman, 2000; Bacigalupe e Bozinovic, 2002; Karasov e col., 2004). A cada passo dentro do processo de alimentação, desde a manipulação do alimento até o processo de excreção existem uma série de gargalos onde ocorre uma perda de energia (Speakman, 2000; Bacigalupe e Bozinovic, 2002; Speakman e Król, 2005). Esses gargalos são importantes uma vez que estão diretamente ligados à ecologia animal, influenciando na taxa alimentar, no tempo de forrageamento e nas diversas Figura 1. Ilustração da aquisição e gasto de energia. O modelo mostra alguns gargalos que limitam a assimilação de energia e alguns processos que demandam um maior gasto energético (Modificado de Weiner, 1992).
- 290. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 280 Julho/2010 atividades envolvidas com o dispêndio de energia, que são importantes para estabelecer o papel do animal no ecossistema (Karasov, 1990). Os processos e mecanismos relacionados ao despêndio de energia são importantes na determinação da sobrevivência e sucesso reprodutivo dos animais dentro do seu contexto ecológico. Como visto nos capítulos anteriores, as diversas atividades que contribuem para o gasto energético (e.g. reprodução, termorregulação, forrageamento, locomoção, estresse, produção de tecidos, entre outros) estão extremamente ligados aos diversos fatores ambientais, tanto bióticos como abióticos que compõe o ecossistema ao qual o animal está inserido (Weiner, 1992, McNab, 1992). Toda essa cadeia de relações envolvidas no orçamento energético animal determina o potencial dos diferentes grupos sistemáticos para produzir ajustes comportamentais, morfológicos e/ou fisiológicos para a manutenção do seu equilíbrio energético, ao longo de gradientes ecológicos espaciais e temporais. Assim, a diversidade e os padrões de distribuição dos diversos táxons de animais estão relacionados com esse potencial de ajuste, no entanto, qualquer alteração dentro dessa grande cadeia pode mudar drasticamente esse cenário (Bennett, 1987; Feder, 1987; Spicer e Gaston, 1999). De fato, constantes mudanças ambientais, sejam naturais ou causadas pelo homem, afetam as relações energéticas do ecossistema, possibilitando a evolução e extinção das espécies. Extinções e perda da biodiversidade no mundo atual O ambiente está em constante alteração desde o surgimento do planeta. Essas alterações, como visto anteriormente, afetam o balanço energético dos seres vivos levando a uma série de processos evolutivos que moldam a distribuição e os padrões das inúmeras espécies (Hughes e col., 1997; Crowley e col., 1988; Myers e Knoll, 2001). Juntamente com esses ciclos evolutivos são observados processos naturais de extinção, tais processos foram registrados em diversas épocas ao longo da história do planeta (Fig. 2). No entanto, com o surgimento do ser humano há 100 mil anos, e principalmente com a Revolução Industrial, o consumo e o desperdício dos recursos naturais tem levado espécies e comunidades inteiras ao ponto de extinção (Williams e Fraústo da Silva, 2005). Assim, além das variações ambientais naturais, os seres vivos agora têm que lidar com as alterações ambientais causadas pelas atividades humanas (Carey, 2005). Uma das alterações mais antiga e mundialmente problemática causada pelo homem é a perda e a subseqüente fragmentação de hábitats (Miller e Cale, 2000; Primack e Rodriques, 2001). Como resultado do desmatamento, a diminuição do tamanho do hábitat e o aumento do isolamento dos organismos acarretam em alterações nas comunidades biológicas de maneira complexa, englobando diversos fatores concomitantemente (Fahring
- 291. Metablismo Julho/2010 Pág. 281 eMerriam, 1994; Zuidema e col., 1996, Drinnan, 2005). A principal consequência da fragmentação ambiental é a redução da dispersão das populações, o que as tornam mais susceptíveis à depressão endogâmica, redução da diversidade genética, e a outros problemas associados com o isolamento e o tamanho populacional (Fahring e Merriam, 1994; Zuidema e col., 1996). A habilidade de se deslocar e os seus padrões de deslocamento, juntamente com a ecologia, o uso do hábitat e a habilidade de interagir com as mudanças em seu ambiente, são exemplos de fatores nos possibilitam entender como os efeitos da fragmentação atuam sobre essas populações (Pearman, 1997). Além da redução populacional, a fragmentação modifica as condições de luz, temperatura, umidade e vento, influenciando diretamente os microhábitats, evidenciadas pelo efeito de borda (Kapos, 1989; Bierregaard e col., 1992; Rodrigues, 1998; Galindo-Leal e Câmara, 2005). Desse modo, as espécies que conseguem se estabelecer nesse novo ambiente devem ser capazes de responder rapidamente a essas alterações de hábitats, incluindo as matrizes devastadas entre eles (Laurance e Yensen 1991, Tocher e col., 1997, Gascon e col., 1999). Essa capacidade de tolerância se deve a fisiologia e a capacidade para manter o balanço energético e o equilíbrio interno (homeostase) face às novas condições (Calow, 1991; Zachariassen e col., 1991; Carey, 2005). Sob a óptica da fisiologia comparada e abordando as relações energéticas, as diferenças fisiológicas e sua plasticidade observada entre as espécies animais nos possibilita entender e prever quais serão os organismo mais afetados e quais serão os beneficiados com esse novo ambiente. A dispersão e a invasão de diversas espécies exóticas de animais e plantas em todo o planeta, além do surgimento e dispersão de novas patologias estão intimamente relacionadas com os limites fisiológicos dessas novas espécies em adaptar-se às condições ambientais criadas pelo ser humano. Como conseqüência da instalação dessas espécies invasoras no novo ecossistema, podemos observar um desequilíbrio nas relações ecológicas através das alterações no hábitat e o surgimento de novas interações ecológicas que antes não eram observadas, por exemplo: competição, predação, parasitismo (Dukes e Mooney, 1999; Vitousek e col., 1996; Kolar e Lodge, 2001). A proliferação de patologias e/ou surgimento de novas doenças é uma das principais conseqüências das ações conjuntas das diversas alterações ambientais, uma vez que há a instalação de espécies invasoras e as comunidades nativas estão mais vulneráveis (Daszak e col., 2000; Daszak e col., 2001; Primack e Rodrigues, 2001; Navas e Otani, 2007).
- 292. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 282 Julho/2010 Figura 2 - Panorama geral das extinções em massa ao longo da história geológica de nosso planeta (Modificado de Otani e Patrício, 2010). A vulnerabilidade das comunidades e o crescente surgimento de novas patologias evidenciam o desequilíbrio energético do ecossistema. Essa vulnerabilidade dos ecossistemas, por sua vez, também pode ser potencializada pela introdução de poluentes resultantes das diversas atividades antrópicas. Esses poluentes podem contaminar a água o solo e o ar, sendo prejudicial a saúde pública e ambiental. A poluição da água, por exemplo, é resultante da liberação de produtos químicos tóxicos e esgotos urbanos. Tais poluentes comprometem fontes de alimento e água potável, essenciais para qualquer organismo vivo, além de desencadear um desequilíbrio neste ecossistema. Alguns desses compostos propiciam a proliferação de determinadas espécies, as quais modificam outras características da água, como por exemplo, a incidência de luz e a concentração de gases (Primack e Rodrigues, 2001). No ar, os poluentes podem promover a formação de ácidos,
- 293. Metablismo Julho/2010 Pág. 283 quepor sua vez, alteram o pH do solo e de corpos d’água, reduzindo e até dizimando populações de animais (Beebee e col., 1990; Blaustein e Wake, 1995; France e Collins, 1993) e plantas (Hinrichsen, 1987; Mackenzie e El-Ashry, 1988). No Brasil, a produção de lixo por ano chega a cerca de 90 milhões de toneladas (IBGE, 2009), e a principal fonte de CO2 é proveniente das mudanças no uso do solo e da terra e, também, das queimadas (Sampaio e col., 2008). Entre os anos de 1970 a 2004 houve um aumento na emissão anual de CO2 de aproximadamente 80%, atingindo 38 gigatoneladas em 2004 (IPCC, 2007 – AR4). Como conseqüências dessas ações, observamos a elevação de 0,75% da temperatura média no Brasil (Marengo, 2007; Sampaio e col., 2008). Além de alterações na temperatura, podemos observar um aumento da precipitação nas regiões sudeste e centro-oeste do Brasil e o aumento do nível relativo do mar, da ordem de 4 mm nos últimos 50 anos (Marengo, 2007; Sampaio e col., 2008). As respostas climáticas frente à degradação ambiental podem acarretar em alterações e redistribuição dos grandes biomas brasileiros (Sampaio e col., 2008). Essa reestruturação radical dos biomas terá conseqüências dramáticas nas comunidades biológicas, favorecendo, mais uma vez, aquelas espécies capazes de se adaptar às novas condições (Bazzaz e Fajer, 1992; Buckeridge, 2008). É provável que as espécies de distribuição mais restrita e de pouca habilidade de dispersão sejam mais afetadas por essas mudanças, podendo ser extintas. É valido ressaltar que essas alterações não afetarão apenas os organismos terrestres, comunidades marinhas são afetadas pela alteração da temperatura e da elevação do nível do mar. Tais conseqüências já podem ser observadas em algumas espécies de corais que necessitam de uma determinada luminosidade, temperatura e correntes de água (Carey, 2005). Diante desse cenário, fica evidente que a fisiologia comparada tem um papel fundamental dentro da Biologia da Conservação, ao estabelecer os limites ambientais que garantem o equilíbrio energético dos indivíduos. Tal equilíbrio é, por conseguinte, indispensável para a eficiência reprodutiva das espécies, bem como a viabilidade das populações em um determinado ambiente. A análise integrada da variação fisiológica, em diferentes níveis de abordagem, e de suas relações com as pressões de seleção torna-se essencial para se compreender os padrões atuais de distribuição da diversidade animal (Pough, 1989; Mangum e Hochachka, 1998, Wells, 2001; Angilletta e col., 2002). Fisiologia comparada e a conservação biológica Entender as relações biológicas com o ambiente, através do conhecimento sobre a história natural das espécies, é a melhor maneira de proteger e manejar as comunidades biológicas (Gilpin e Soulé, 1986). De natureza multidisciplinar, a biologia da conservação propõe complementar as diversas disciplinas aplicadas e entender os efeitos da atividade
- 294. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 284 Julho/2010 humana nas espécies, comunidades e ecossistemas, além de desenvolver abordagens práticas para prevenir a extinção de espécies e, se possível, reintegrar as espécies ameaçadas ao seu ecossistema funcional (Primack e Rodrigues, 2001). Dentro desta perspectiva, os princípios, conceitos e métodos utilizados na área da fisiologia são de extrema importância para o entendimento dos declínios populacionais e para a conservação ambiental (Koeman, 19991; Zachariassen e col., 19991; Carey, 2005; Wikelski e Cooke, 2006; Navas e Otani, 2007). A aptidão de sobrevivência e reprodução dos diversos organismos vivos estão relacionados à variação ambiental, e os mecanismos por traz desses padrões podem ser entendidos através de estudos da fisiologia comparativa (Carey, 2005; Wikelski e Cooke, 2006). O estudo do balanço energético provido pela fisiologia comparativa nos possibilita estabelecer relações de causa-e-efeito entre os agentes estressores e as respostas obtidas nos diversos níveis de organização biológica (Clements, 2000; Carlisle, 2000). Os padrões e processos do ecossistema podem ser influenciados, mesmo que indiretamente, pelas ligações energéticas entre o individuo e o ecossistema (Parmelee, 1995; DeAngelis, 1995). Diversas técnicas para avaliar o equilíbrio energético dos animais podem ser utilizadas em laboratório e em campo, como por exemplo: a biotelemetria, detectando alterações comportamentais e fisiológicas (freqüência cardíaca, temperatura corpórea, taxa opercular, batimento caudal, da asa ou de outros apêndices) em tempo real, a quantificação de produção de CO2 através de isótopos (Speakman, 1997; Nagy e col., 1999; Costa e Gales, 2003), além das técnicas de respirometria já abordadas no capítulo 2 desta unidade. Os índices de condição corpórea também podem fornecer importantes informações sobre o estado nutricional e o equilíbrio energético das mais diversas espécies de animais e são facilmente obtidos a partir de vários métodos, inclusive métodos não-invasivos (Stevenson e Woods, 2006). Através desses métodos apresentados pela fisiologia comparativa, somos capazes de entender como as modificações do ambiente relatadas anteriormente podem afetar os diversos aspectos da fisiologia metabólica dos animais (Calow, 1991; Zachariassen e col., 1991; Hopkins e col., 1998; Beyers e col., 1999; Barbieri e col., 2002; Carey, 2005). A fisiologia da conservação tem sido amplamente explorada dentro do cenário da ecotoxicologia, assunto que será abordado mais especificamente em capítulos posteriores. Diante da introdução dos poluentes, a fisiologia comparada nos possibilita detectar o nível de estresse enfrentado pelos organismos e diagnosticar o nível de alteração ambiental, além de servirem como base de planos de manejo e acompanhamento dos resultados provenientes desses procedimentos (Wikelski e Cooke, 2006). A grande maioria dos trabalhos nesta área é realizada com organismos aquáticos e será discutida com mais profundidade na Unidade de Ecotoxicologia. Em peixes foi observado que pesticidas podem
- 295. Metablismo Julho/2010 Pág. 285 afetara homeostase dos animais levando a alterações de comportamento alimentar, taxa de crescimento, capacidade natatória, metabolismo de repouso e regeneração de tecidos (Beyers e col., 1999; Barbieri e col., 2002). Poluentes também têm sido relacionados a mudanças na demanda energética e associados ao declínio das populações de anfíbios (Carey e Bryant, 1995; Calow, 1991; Rowe e col., 1998; Rowe e col., 2001). Apesar da grande importância do equilíbrio energético para a conservação, a maioria dos trabalhos ligando a fisiologia da conservação com a energética estão relacionados aos efeitos dos pesticidas (Calow, 1991; Rowe e col., 1998). Porém, é valido ressaltar que os poluentes não são os únicos fatores que afetam o equilíbrio energético dos animais. O aumento de extinções localizadas ligados a diminuição do tamanho do hábitat e o aumento do isolamento dos organismos também podem estar relacionados com as relações energéticas dos animais (Fahring e Merriam, 1994; Zuidema e col., 1996; Drinnan, 2005; Neckel-Oliveira e Gascon, 2006). Dentro do panorama da diminuição da fragmentação e redução do hábitat, por exemplo, a fisiologia comparativa nos propicia entender como o desempenho locomotor pode estar relacionado com a capacidade de dispersão (Navas e Otani, 2007) ou até entender como alterações hormonais causadas por essas mudanças podem prejudicar o ciclo reprodutivo (Suorsa e col., 2003; 2004). Tais características fisiológicas podem atuar na seleção natural dentro do contexto da fragmentação ambiental, determinando a estrutura das comunidades presentes em cada fragmento (Navas e Otani, 2007). Em suma, podemos concluir que os estudos provenientes da fisiologia da conservação nos possibilitam entender o modo como as alterações ambientais causadas pelo homem podem afetar as diferentes espécies. Uma vez que há uma alteração nessa equação de obtenção e consumo de energia, esses mecanismos podem acarretar em conseqüências graves para a aptidão dos indivíduos e também na viabilidade das populações (Navas e Otani, 2007). Através desses dados, podemos detectar quais os principais organismos mais vulneráveis para cada fator estressor (Mangum e Hochachka, 1998; Somero, 2000; Costa e Sinervo, 2004), possibilitando o desenvolvimento de planos de manejos apropriados para cada táxon e, mais a longo prazo, de planos para monitoramento dos ambientes alterados (Carey, 2005; Wikelski e Cooke, 2006). Além disso, os dados da fisiologia comparada também são muito importantes para a construção de modelos que propõem prever futuras distribuições geográficas das espécies juntamente com simulações de mudanças climáticas e ambientais.
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- 309. Unidade 5 Neuroendocrinologia comparada Renato MassaakiHonji Lab. de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos honjijp@usp.br O que é neurociência ou neurobiologia? E endocrinologia? E neuroendocrinologia? Como visto na Unidade 3, a neurociência ou neurobiologia refere-se a todos os estudos ligados ao sistema nervoso. Neste capítulo, uma breve descrição sobre o conceito de endocrinologia será abordada, apresentando principalmente a endocrinologia comparada em vertebrados, visto que, em invertebrados (Unidade 7), vários organismos apresentam substâncias secretadas por células, que causam efeitos direta ou indiretamente em células alvos, distantes do seu centro de origem. Em relação à neuroendocrinologia, ciência que pode ser caracterizada pela interseção entre a neurobiologia e a endocrinologia, será intensamente discutida neste capítulo. Os sistemas biológicos: nervoso, endócrino e imune, estão, fisiológica e anatomicamente interligados, interagindo multidirecionalmente para garantir a homeostase do organismo. Neste contexto, vários eixos biológicos são identificados e pesquisados na área de neuroendocrinologia, como por exemplo: o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (H-H-G), o hipotálamo-hipófise-adrenal (H-H-A) e o eixo imune-pineal. Desta forma, veremos, ao longo deste capítulo, a importância dos estudos em fisiologia comparada, em especial a neuroendocrinologia, destacando-se as principais vias de comunicação entre os diferentes eixos biológicos e entre os diferentes grupos de vertebrados. Adicionalmente, os sistemas nervosos e endócrinos, agem em conjunto para integrar as informações ambientais com a fisiologia e ecologia (endocrinologia ambiental), focando não apenas nos fatores ambientais naturais, mas também nos efeitos dos compostos orgânicos de origem antrópica (disruptores endócrinos). Esses compostos químicos (poluentes) que podem interagir com o sistema endócrino serão discutidos na Unidade 6.
- 310. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 300 Julho/2010 Lista de abreviações pág. 301 Capítulo 26 Neuroendocrinologia comparada: análise comparativa entre o encéfalo e a hipófise de peixes e mamíferos pág. 305 Renato Massaaki Honji Revisado pela Dra Renata Guimarães Moreira Capítulo 27 Neuroendocrinologia comparada: o encéfalo e a hipófise de anfíbios, répteis e aves pág. 323 Amanda de Moraes Narcizo Revisado pelar Dra. Renata Guimarães Moreira Capítulo 28 Sistema neuroimunoendócrino pág. 337 Marina Marçola Revisado por Dr. Eduardo Koji Tamura e Sanseray Cruz-Machado Bibliografia pág. 348
- 311. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.301 Lista de abreviações AA-NAT – enzima aril-alquilamina-N-acetiltransferase Ach – acetilcolina ACTH – hormônio adrenocorticotrópico ADH – hormônio antidiurético AH – adeno-hipófise Ala – alanina ARC – núcleo arqueado Arg – arginina Asn – asparagina Asp – ácido aspártico AVT – arginina vasotocina cfGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de catfish cGnRH-II – hormônio liberador de gonadotropinas de chicken-II CRH – hormônio liberador de corticotropina CRH-like – similar ao hormônio liberador de corticotropina Cys – cisteína DA – dopamina DIT – 3,5 diiodotirosina FSH – hormônio folículo estimulante GABA – ácido gama-aminobutílico GH – hormônio de crescimento ou hormônio somatotrópico GHRH – hormônio liberador de hormônio de crescimento Gln – glutamina Glu – ácido glutâmico Gly – glisina GnIH – hormônio inibidor de gonadotropinas GnRH – hormônio liberador de gonadotropinas gpGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de guinea pig Gpr54 – receptor acoplado à proteína G (54) GtHs – gonadotropinas H-H – hipotálamo-hipófise H-H-A – hipotálamo-hipófise-adrenal H-H-G – hipotálamo-hipófise-gônadas H-H-T – hipotálamo-hipófise-tireóide HIOMT – enzima hidroxiindol-O-metiltransferase
- 312. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 302 Julho/2010 His – histidina IGF – fator de crescimento insulínico IL– interleucina Ile – isoleucina IST – isotocina kiss1/GPR54 – kisspeptina/receptor acoplado à proteína G (54) Leu – leucina LH – hormônio luteinizante LPH – lipotropinas LPS – lipopolissacarideos Lys – lisina MCH – hormônio concentrador de melanina ME – eminência média Met – metionina mGHRH – hormônio liberador de hormônio de crescimento de mamíferos mGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de mamíferos MIS – hormônio indutor da maturação final e ovulação MSH – hormônio melanotrópico MST – mesotocina NH – neuro-hipófise NO – óxido nítrico NSQ – núcleo supraquiasmático OC – quiasma óptico PD – pars distalis Phe – fenilalanina PI – pars intermedia PIF – fator inibidor da prolactina pjGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de peixe rei PN – pars nervosa POA – area pré-óptica POMC – proopiomelanocortina PPD – proximal pars distalis PRF – fator liberador de prolactina PRL – prolactina Pro – prolina PT – pars tuberalis PVN – núcleo paraventricular
- 313. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.303 RHs – hormônios liberadores RIHs – hormônios inibidores RPD – rostral pars distalis sbGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de seabream Ser – serina sGnRH – hormônio liberador de gonadotropinas de salmão SHAM – animais falso-operados SL – somatolactina SNC – sistema nervoso central SON – núcleo supra-óptico SS – somatostatina T3 – triiodotironina T4 – tiroxina Tgb – tiroglobulina Thr – treonina TNF – fator de necrose tumoral TPO – tiróide peroxidase TRH – hormônio liberador de tireotropina Trp – triptofano TSH – hormônio estimulador da tireóide Tyr – tirosina Val – valina VGX – vagotomia bilateral cervical α7nAchR – receptor nicotínico de acetilcolina α7
- 314. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 304 Julho/2010
- 315. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.305 Neuroendocrinologia comparada: análise comparativa entre o encéfalo e a hipófise de peixes e mamíferos Renato Massaaki Honji Laboratório de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos honjijp@usp.br A endocrinologia é uma área específica de uma das disciplinas mais amplas da biologia, conhecida como fisiologia. Considerando que a fisiologia é o estudo dos processos biológicos que permitem a vida existir e funcionar, a fisiologia animal comparada tem um foco nas comparações e contrastes dos mecanismos, processos ou respostas fisiológicas de diferentes animais (escala evolutiva) ou de uma simples espécie, que estão submetidas a diferentes condições, sejam elas: naturais ou artificiais (Withers, 1992; Norris, 2007). Já a neuroendocrinologia, pode ser caracterizada pela interseção entre a neurobiologia e a endocrinologia, ou seja, é o estudo da modulação exercida pelo cérebro sobre o sistema endócrino e vice-versa, o estudo dos efeitos exercido pelo sistema endócrino sobre o cérebro (Zohar e col., 2010). Um dos principais objetivos deste capítulo é ilustrar a diversidade de processos neuroendócrinos empregados por diferentes grupos de animais (principalmente em relação às diferenças observadas nos sistemas fisiológicos entre os mamíferos e os peixes). Adicionalmente, o entendimento do sistema endócrino, é um dos caminhos essenciais para que se possa entender como os mecanismos bioreguladores e sistemas evoluíram nos animais e como eles operam para manter a vasta gama de espécies viventes. Endocrinologia e neuroendocrinologia: um pouco de história As glândulas endócrinas, ou glândulas de “secreção interna”, secretam os produtos sintetizados em seu interior na corrente sanguínea e essas moléculas funcionam como sinais químicos nos organismos. Esses produtos de secreção, também denominados de hormônios, assim como os estudos das glândulas endócrinas começaram a ser pesquisados a cerca de 100 anos atrás (Norris, 2007). O estudo da neuroendocrinologia em mamíferos, especialmente em relação ao conceito de que o encéfalo controla as funções hipofisárias está bem estabelecido na literatura (Guyton e Hall, 2006). Segundo Zohar e colaboradores (2010), este conceito foi estabelecido depois da segunda Guerra Mundial, com os estudos propondo que fatores liberados pelo encéfalo eram transportados pela corrente sanguínea até a glândula hipofisária (conhecida também como pituitária) e estimularia a liberação de substâncias por esta glândula (Donovan e Harris, 1954). Inicialmente, as substâncias sintetizadas pelo sistema nervoso eram denominadas de fatores, até que, sua estrutura
- 316. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 306 Julho/2010 química específica seja conhecida e passaram a ser denominadas de hormônios (Guyton e Hall, 2006; Norris, 2007). Já em peixes, neuroendocrinologia é um assunto mais recente, e as primeiras informações sobre a relação do hipotálamo e hipófise neste grupo de animais eram realizadas experimentos, olhando apenas a atividade das células hipofisárias isoladamente, ou seja, analisando essas atividades celulares da glândula hipofisária, desconectadas do encéfalo (Olivereau e Ball, 1966). Outros estudos posteriores a esta época, apresentaram pela primeira vez, em peixes, que extratos encefálicos, estimulavam as células hipofisárias em carpas (Cyprinius carpio) (Breton e Weil, 1973). Estes estudos foram considerados os pioneiros em neuroendocrinologia da reprodução em peixes, sendo que, passados aproximadamente 35 anos, apesar de grandes progressos na área de neuroendocrinologia em peixes, vários tópicos ainda permanece incertos. Neuroendocrinologia em mamíferos O conceito de que o encéfalo coordena às funções hipofisárias em mamíferos está bem descrito na literatura especializada (Revisões: Withers, 1992; Guyton e Hall, 2006; Berne e Levy, 1998; Norris, 2007). Neste sentido, forneceremos uma visão geral sobre as principais características do eixo hipotálamo-hipófise (H-H) em mamíferos, pois, este eixo pode ser considerado o componente mais complexo e, em alguns casos, o mais dominante de todo o sistema neuroendócrino. De uma forma geral, as relações anatômicas e fisiológicas deste eixo são elaboradas e sutis. Anatomicamente, o encéfalo de mamíferos compreende às seguintes regiões: cérebro, que pode ser subdividido em: telencéfalo e diencéfalo; cerebelo; e tronco encefálico, que também pode ser subdividido em: bulbo (localizado mais caudalmente), mesencéfalo (localizado mais cranialmente) e ponte (localizado entre ambos, bulbo e mesencáfalo) (Hansen e Koeppen, 2002). Fisiologicamente, um dos principais núcleos responsável pela coordenação da glândula hipofisária, é o hipotálamo (Withers, 1992; Guyton e Hall, 2006; Norris, 2007). Em relação à hipófise, esta pode ser dividida em: hipófise anterior, ou adeno-hipófise (AH); e hipófise posterior, ou neuro-hipófise (NH). Fisiologicamente, numerosos hormônios são sintetizados, armazenados e liberados pela hipófise (Berne e Levy, 1998; Norris, 2007). Para melhor compreensão do eixo H-H, a seguir cada parte deste eixo é considerada separadamente. Hipotálamo em mamíferos O hipotálamo desempenha um papel fundamental na regulação da hipófise e pode ser considerado como uma estação central de transmissão, atuando na recepção, integração e no redirecionamento de sinais. Nas diferentes regiões (núcleos) hipotalâmicos
- 317. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.307 são identificados conjuntos de hormônios liberadores e inibidores que se dirigem à hipófise, regulando a síntese e a liberação de outros hormônios. Originalmente, os nomes dos peptídeos hipotalâmicos baseiam-se nos hormônios hipofisários, cuja estimulação/secreção, é influenciada por estes peptídeos (Berne e Levy, 1998). A tabela 1 fornece uma lista de hormônios hipotalâmicos atualmente conhecidos. Devido à diversidade de hormônios hipotalâmicos e a complexidade da fisiologia hormonal, abordaremos apenas um exemplo hormonal para ilustrar toda essa diversidade, o mecanismo de ação e apresentar algumas interações fisiológicas. Levando-se em consideração apenas a reprodução, o principal representante do primeiro passo na cascata de hormônio que participa diretamente na coordenação da atividade reprodutiva em animais, é o hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) (Schally e col., 1973). Esta molécula é sintetizada em neurônios específicos do encéfalo e alcança a glândula hipofisária, estimulando as células gonadotrópicas (GtHs) via sistema porta em tetrápodes ou por inervação direta das GtHs em peixes teleósteos (Parhar, 2002; Lethimonier e col., 2004). Adicionalmente, este decapeptídeo foi originalmente caracterizado em tecidos nervosos de mamíferos (Matsuo e col., 1971; Burgus e col., 1972), no entanto, o GnRH é identificado em todos os vertebrados, de lampreias a mamíferos (Guilgur e col., 2006). Acreditava-se que o GnRH de mamíferos era a única forma da molécula, entretanto, alguns anos depois, foram identificadas outras variantes de GnRH em outros vertebrados (Sherwood e col., 1983). Desde então, múltiplas formas de GnRH têm sido identificadas em Tabela 1. Hormônios e fatores hipotalâmicos (modificado de Berne e Levy, 1998).
- 318. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 308 Julho/2010 espécies representativas de todas as classes de vertebrados (Tab. 2) (Weltzien e col., 2004), ou seja, foram identificadas múltiplas variantes de GnRH em agnatas (Sower e col., 1993), em elasmobrânquios (Lovejoy e col., 1991a), em peixes teleósteos (Sherwood e Adams, 2005), em anfíbios (Conlon e col., 1993), em répteis (Lovejoy e col., 1991b), em aves (Miyamoto e col., 1984) e em mamíferos (White e col., 1998). Segundo Sherwood e Adams (2005); Guilgur e colaboradores (2006) e Zhang e colaboradores (2008), são caracterizadas 25 diferentes formas moleculares de GnRH em várias espécies de vertebrados e invertebrados (14 formas em vertebrados e 11 formas em invertebrados), entretanto, todas as formas são decapeptídeos, exceto em Octopus vulgaris (Iwakoshi e col., 2002) e Aplysia californica (Zhang e col., 2008), que possuem doze aminoácidos e, além disso, os aminoácidos número 01, 04, 09 e 10 são perfeitamente conservados ao longo da evolução (Tab. 2). É importante salientar, que as diferentes formas de GnRH são comumente conhecidas pelo nome da espécie em que foi primeiramente isolada (Weltzien e col., 2004; Guilgur e col., 2006; Tsai, 2006). Em geral, duas formas de GnRH têm sido identificadas no sistema nervoso de uma única espécie, o cGnRH-II (chicken-II) localizado em áreas do cérebro médio (midbrain), cuja função ainda é especulativa e uma outra forma, relacionada com a liberação das GtHs pela hipófise (Gorbman e Sower, 2003). Em mamíferos, essa outra forma de GnRH identificada foi o mGnRH (mamíferos) ou gpGnRH (guinea pig) (Dubois e col., 2002; Whitlock, 2005). Essa variedade de formas de GnRH, também sugere-se que existam diferentes formas de receptores para GnRH, mas em geral, as diferentes formas de GnRHs exercem diversas ações intracelulares através de ligações específicas com os receptores acoplados à proteína-G (família Gq/11), como por exemplo, a ativação da fosfolipase C, elevação do segundo mensageiro, ativação da proteína kinase C e mobilização do cálcio (Blomenröhr e col., 2005). Os receptores de mGnRH diferem de outros receptores acoplados a proteína-G, pois, faltam a cauda C-terminal e apresentam mudanças em alguns aminoácidos altamente conservados (Blomenröhr e col., 2002). A modulação (inibição e/ou estimulação) dos neurônios de GnRH está sob a influência de substâncias carreadas pela corrente sanguínea (feedback), uma vez que, a liberação de GnRH, estimula as células gonadotrópicas a produzirem os hormônios gonadotrópicos, que por sua vez, geram alterações nas concentrações dos hormônios das glândulas periféricas, e estes, podem exercer um controle por feedback no hipotálamo (Berne e Levy, 1998).
- 319. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.309 Adicionalmente, outras complexas interações de sinais neuronais, que se convergem para os neurônios hipotalâmicos, estariam atuando nesta modulação do GnRH. Alguns exemplos de interações de sinais neuronais são: alterações das características ambientais, semelhantes, ao fotoperíodo (alternância de claro e escuro), mudanças de temperatura, entre outros, são convertidos em sinais eletroquímicos e são transmitidos via neurônios sensoriais até o hipotálamo, influenciando na síntese e liberação de GnRH (Takei e Loretz, 2006); o ciclo de claro e escuro (dia/noite), que estimula a glândula pineal a sintetizar a melatonina, que por sua vez, pode atuar na modulação do GnRH (Ekströn e Meissl, 1997); a kisspeptina, uma nova proteína descoberta recentemente e o seu receptor Tabela 2. Estrutura das 25 formas de hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) conhecidas. Os aminoácidos grifados em azul são diferentes da forma de GnRH de mamíferos. As formas de GnRH grifadas em cinza, tem sido identificadas em peixes. Adaptado de: Iwakoshi e col., (2002); Sherwood e Adams, (2005); Guilgur e col., (2006).
- 320. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 310 Julho/2010 (GPR54), ambos são regulados pelos esteróides gonadais, e também estão diretamente relacionado com a secreção de GnRH (Colledge, 2008). E ainda no ano 2000, foi identificado um novo dodecapeptídeo hipotalâmico que age diretamente sobre a hipófise, inibindo a liberação de GtHs, denominado de hormônio inibidor de gonadotropinas (GnIH) (Tsutsui e Osugi, 2009). Estes são alguns exemplos de interações fisiológicas observadas nos animais. A proposta desta introdução foi mostrar o histórico dos hormônios hipotalâmicos, i.e. quando foram descobertos, a sua natureza química, as diferentes formas (quando for aplicado), as possíveis células alvos, o mecanismo de ação, o mecanismo de modulação (inibição e/ou estimulação) e suas interações fisiológicas com outros eixos biológicos. Desta forma, foi discutida resumidamente, a complexidade fisiológica observada nos neurônios hipotalâmicos, e agora, veremos como agem estas substâncias quando são liberadas no sistema porta hipofisário (presente em mamíferos e ausente em peixes teleósteos), sistema este, de grande importância para a regulação das funções hipofisárias, pois através deste sistema, os neuro-hormônios sintetizados no hipotálamo podem ser levados diretamente a AH, controlando as funções de suas células. Hipófise em mamíferos Como dito anteriormente, a hipófise pode ser dividida em duas porções distintas, a adeno-hipófise (AH), ou hipófise anterior, a neuro-hipófise (NH), ou hipófise posterior, e entre essas duas partes, há uma zona intermediária, chamado de pars intermedia (Guyton e Hall, 2006; Berne e Levy, 1998). Esta zona intermediária é pouco desenvolvida em mamíferos (humanos), sendo maior e mais funcional em outros vertebrados. Embriologicamente, a NH, se origina do assoalho do diencéfalo e constitui a porção nervosa da hipófise e a AH se origina do ectoderma do teto da cavidade oral primitiva (Junqueira e Carneiro, 2004). Desta forma, dois hormônios são sintetizados por neurônios no hipotálamo, e são armazenados e liberados pela NH, são eles: o hormônio antidiurético (ADH) e a ocitocina. Já na AH, cinco tipos celulares são possíveis de identificar: as células corticotrópicas, que sintetizam a adrenocorticotropina (ACTH) e a β-lipotropina; as células tireotrópicas, que produzem a tireotropina (TSH); as células gonadotrópicas que sintetizam o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo estimulante (FSH); as células somatotrópicas que produzem o hormônio de crescimento (GH) e as células lactotrópicas, que sintetizam a prolactina (PRL) (Guyton e Hall, 2006). A tabela 3 fornece uma lista de hormônios hipofisários atualmente conhecidos. Os hormônios hipofisários em mamíferos, como observado para os hormônios hipotalâmicos, são bem conhecidos na literatura especializada (Revisões: Withers, 1992; Guyton e Hall, 2006; Berne e Levy, 1998; Norris, 2007). Em geral, as funções dos hormônios
- 321. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.311 hipofisários podem ser sintetizadas da seguinte forma: o ADH, também conhecido como arginina-vasopressina, formado primariamente nos núcleos supra-ópticos (são polipeptídeos), tem a função primária de conservar a água corporal e regular a tonicidade de líquidos corporais, ou seja, a ausência de ADH impede a reabsorção significativa de água pelos ductos coletores (excreção diminuída de água pelos rins) e na presença de ADH, a permeabilidade dos ductos à água aumenta muito, conservando assim a água no corpo e produzindo uma urina muito concentrada. Já a ocitocina, é formada primariamente nos núcleos paraventriculares (são polipeptídeos) e o papel principal consiste em ejetar o leite da glândula mamária no processo de lactação, mas também apresenta um papel nas contrações do útero, especialmente ao final da gestação (Guyton e Hall, 2006; Berne e Levy, 1998). Em relação à AH, o hormônio ACTH, produzido pelas células corticotrópicas, é um hormônio, cuja função fisiológica consiste em regular o crescimento e a secreção do córtex supra-renal, ou seja, os hormônios mais importantes de sua glândula alvo são os corticosteróides, relacionados com o metabolismo (controle do metabolismo de proteínas, carboidratos e gorduras) e com o estresse nos animais. O ACTH é estimulado pelo hormônio liberador de corticotropina (CRH), sintetizado pelo hipotálamo. O hormônio TSH, sintetizado pelas células tireotrópicas, é um hormônio glicoprotéico, cuja função consiste em regular o crescimento e o metabolismo da tireóide e a secreção de seus respectivos hormônios (a tiroxina, T4 e a triiodotironina, T3), relacionado também com o metabolismo corporal. O TSH, por sua vez, é estimulado pelo hormônio liberador de tireotropina (TRH). As células gonadotrópicas, que sintetizam o FSH e o LH, que são hormônios glicoprotéicos, estão diretamente relacionadas com a reprodução animal, atuando principalmente nas gônadas, estimulando a síntese dos esteróides gonadais (testosterona, progesterona e estradiol) e como descrito acima (item 2.1.), as GtHs são estimuladas pelo GnRH Tabela 3. Hormônios hipofisários atualmente conhecidos (modificado de Berne e Levy, 1998).
- 322. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 312 Julho/2010 (sintetizado no hipotálamo). O GH e a PRL, são hormônios cuja função fisiológica consiste respectivamente em: estimular o crescimento e o desenvolvimento somático pós-natais e ajuda a manter a massa corporal magra e a massa óssea normais em adultos, além de atuar no metabolismo, incluindo especificamente, o aumento da síntese protéica, mobilização dos ácidos graxos e diminuição da taxa de utilização da glicose; já a PRL, em humanos, participa na estimulação do desenvolvimento das mamas e na produção de leite. O GH é estimulado pelo hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH) e inibido pela somatostatina (SS), ambos sintetizados em núcleos hipotalâmicos. A PRL é estimulada pelo fator liberador de prolactina (PRF) e inibido pelo fator inibidor da prolactina (PIF), mas também sofre influência negativamente pela SS e positivamente pelo TRH. Para maiores informações sobre os hormônios hipofisários em mamíferos, ver as revisões de: Guyton e Hall, (2006) e Berne e Levy, (1998). Adicionalmente, a figura 1 sintetiza os principais pontos abordados no eixo H-H em mamíferos. Neuroendocrinologia em peixes Em geral, a neuroendocrinologia em peixes, é um assunto recente se compararmos este tema com os mamíferos. Neste caso, uma abordagem geral em peixes se faz Figura 1. A combinação das tabelas 1 e 3, sumarizando o eixo hipotálamo-hipófise em mamíferos. Modificado de Berne e Levy, (1998) e Guyton e Hall, (2006).
- 323. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.313 necessária para posteriormente entendermos as diferenças observadas neste diverso grupo de vertebrados e compará-los com o grupo dos mamíferos. Os peixes em geral são os representantes mais numerosos e diversos entre os vertebrados, contando com aproximadamente 50% deste grupo (Nelson, 2006; Moyle e Cech, 2003). São conhecidas cerca de 28000 espécies viventes de peixes que ocupam os mais diversos ambientes aquáticos, ocorrendo desde as altas altitudes até as fossas submarinas dos oceanos. Em relação à sua distribuição, 58% são marinhos, 41% são dulciaqüícolas e 1% vivem entre esses dois ambientes, ou seja, essas espécies realizam migrações entre o ambiente marinho e o ambiente de água doce (Wooton, 1990). Além da importância como fonte alternativa de alimento, os peixes também constituem uma rica fonte de material biológico que podem ser utilizados como modelos para entender os controles dos processos biológicos (Blázquez e col., 1998). Desta maneira, com esse grande número de espécies existentes, a constantes descobertas de novas espécies e a distribuição mundial, esse sucesso do grupo é atribuído a uma série de adaptações fisiológicas, anatômicas, morfológicas, comportamentais entre outras características relacionadas aos processos de respiração, nutrição, osmorregulação, flutuação, percepção sensorial e reprodução (Hoar, 1969; Wooton, 1990; Moyle e Cech, 2003; Zavala-Camin, 2004). Em relação à reprodução, os peixes são ótimos exemplos da complexidade reprodutiva, com as diferentes formas anatômicas observados nas gônadas entre as espécies; as diferentes formas de liberação dos gametas para a fertilização externa (como por exemplo, a desova total ou a desova parcelada); desenvolvimento de diferentes órgãos especializados para a fertilização interna (gonopódio, por exemplo); as diferentes formas de cuidado com a prole (guardadores e não guardadores de ovos e larvas); além das diferentes formas de construções de ninhos e a migração reprodutiva, seja nas formas de “piracema” ou naquelas longas migrações entre os mares e os rios e vice-versa, que são acompanhadas por grandes alterações osmóticas e metabólicas (Wooton, 1990; Vazzoler, 1996; Lowe-McConnell, 1999; Hochachka e Somero, 2002; Moyle e Cech, 2003; Zavala- Camin, 2004). Todos estes mecanismos apresentados acima sofrem influência direta ou indiretamente do eixo hipotálamo-hipófise e levando-se em consideração o mesmo exemplo apresentado acima para o hipotálamo em mamíferos (item 2.1.), apresentaremos as diferenças observadas no hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) entre peixes e mamíferos. Hipotálamo em peixes O conceito de que o hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH) é um neuropeptídeo hipotalâmico essencial na cascata de hormônios que coordena a fisiologia
- 324. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 314 Julho/2010 reprodutiva, ou seja, o GnRH é um link essencial na integração dos estímulos externos e internos que controlam a reprodução em todos os animais, também é aplicado aos peixes teleósteos (Weltzien e col., 2004; Guilgur e col., 2006; Zohar e col., 2010). O GnRH é sintetizado em áreas específicas do encéfalo de peixes e estimula a produção de GtHs na AH, que em teleósteo, ao contrário dos mamíferos, ocorre via inervação direta das células gonadotrópicas (Lethimonier e col., 2004; Guilgur e col., 2006). Neste contexto, em várias espécies foram descritas múltiplas formas de GnRH, sendo que, para a maioria das espécies de peixes foram encontradas três formas, sendo: cGnRH-II (chicken II), sGnRH (salmon) e uma terceira forma que pode ser considerada específica (Weltzien e col., 2004; Guilgur e col., 2006; Zohar e col., 2010). Em geral para Characiformes (Characidae) a terceira forma de GnRH encontrada foi o sbGnRH (seabream) (Powell e col., 1997), para Cyprinidontiformes (Atherinopsidae) o pjGnRH (peixe rei) (Somoza e col., 2002), para Perciformes (Cichlidae) o sbGnRH (Pandolfi e col., 2005), entre outras formas (Lethimonier e col., 2004; Guilgur e col., 2006). Entretanto, em algumas espécies de teleósteos, apenas 2 formas de GnRH foram identificadas, como por exemplo, em Siluriformes, no qual, foram identificado apenas o cfGnRH (catfish) e o cGnRH-II (chicken II) (Bogerd e col., 1994; Zandbergen e col., 1995; Dubois e col., 2002). A presença destas diferentes formas de GnRH identificadas em várias espécies de teleósteos levanta a questão sobre a precisa função das múltiplas formas de GnRH e o controle da reprodução e de outros processos fisiológicos, como por exemplo, o comportamento reprodutivo. Ainda em relação a diferentes formas de GnRH, em peixes teleósteos, os neurônios sintetizadores de GnRH apresentam distribuição neuro-anatômica diferenciada, como por exemplo, o sGnRH é expresso por neurônios do gânglio nervoso terminal, o cGnRH-II pelos neurônios localizados no tegumento do mesencéfalo (anterior, o “midbrain”) e na região posterior do diencéfalo (o sinencéfalo) e a terceira forma é expressa principalmente pelos neurônios pré-ópticos (telencéfalo ventral), hipotálamo basal e glândula hipofisária (ver revisões de: Gorbman e Sower, 2003; Guilgur e col., 2006; Zohar e col., 2010). Com isto, as diferentes formas de GnRH são identificadas em diferentes regiões do encéfalo e adicionalmente, tem sido observado diferentes origens embriológicas destes neurônios que sintetizam e secretam este hormônio (Dubois e col., 2002; González-Martínez e col., 2004; Pandolfi e col., 2005). As diferentes funções destas diversas formas de GnRHs encontradas em peixes, ainda são discutidas na literatura especializada. Sugere-se que o cGnRH-II atue como um neuromodulador e/ou possui um papel fundamental no comportamento reprodutivo. Já a segunda ou terceira forma, está relacionada especificamente com a reprodução, ou seja, sugere-se que esteja relacionada com a liberação das GtHs na adeno- hipófise dependendo da espécie a ser considerada (Dubois e col., 2002; Sherwood e Adams, 2005; Pandolfi e col., 2005).
- 325. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.315 Em peixes teleósteos não é observado um sistema porta hipotálamo-hipofisário (como em mamíferos) e com isso, as fibras nervosas de GnRH terminam próximas as células gonadotrópicas da AH e como consequência, os GnRHs estão presentes nos extratos de encéfalo e de hipófise. Entretanto, em vários teleósteos, pelo menos uma das formas de GnRH encontrada no encéfalo não foi detectável na hipófise, levantando-se outra questão a respeito de qual (ou quais) formas estão presentes na hipófise e qual (is) estimula (m) a produção de GtHs na AH (Powell e col., 1994; Somoza e col., 1994; Goos e col., 1997). Neste sentido, alguns estudos apontam que, apenas o cGnRH-II foi identificado no encéfalo e não foi observado na hipófise (é importante salientar que o cGnRH-II é identificado em todas as espécies de teleósteos) e com isso, a distribuição diferencial das diferentes formas de GnRHs sugerem diferentes funções para estes diferentes peptídeos (Goos e col., 1997). Neste contexto, a identificação exata das formas de GnRH e a distribuição é de suma importância para entender os primeiros passos no controle da reprodução de peixes teleósteos. As espécies da Ordem Siluriformes são bons modelos biológicos por apresentarem diferenças dentro deste grupo de peixes teleósteos em relação aos demais grupos, como por exemplo, no catfish africano, apenas duas formas de GnRH foram identificadas, como mencionado anteriormente (cGnRH-II e cfGnRH), entretanto, não necessariamente as duas formas de GnRH são liberadas na hipófise e controlam a síntese e liberação de gonadotropinas, pois, peixes teleósteos não apresentam sistema porta hipotálamo-hipófise e a morfologia da NH e AH é exclusiva em teleósteos (Zandbergen e col., 1995; Dubois e col., 2001). Adicionalmente, neste grupo, por exemplo, em extratos de hipófise (Schulz e col., 1993) e de encéfalo (Bogerd e col., 1992) de catfish africano, foram identificadas estas duas formas de GnRH, e em alguns estudos indicam a presença de apenas uma gonadotropina (Schulz e col., 1995; Agulleiro e col., 2006). Portanto, sugere-se que as duas formas de GnRH observadas em catfish africano estejam relacionadas com a liberação de apenas uma gonadotropina. A identificação da presença de uma ou duas gonadotropinas em Siluriformes, ainda não é bem compreendida. Desta forma, uma análise descritiva na hipófise de peixes teleósteos se faz necessária, o que veremos a seguir. Hipófise em peixes A hipófise em peixes, assim como em mamíferos, é dividida em duas regiões distintas: a adeno-hipófise (tecido glandular endócrino) e a neuro-hipófise (origem nervosa), identificadas de acordo com os diferentes tipos celulares, e provavelmente, possuem a mesma origem embriológica que os mamíferos (Junqueira e Carneiro, 2004; Weltzien e col., 2004). Em relação aos hormônios hipofisários, na região da NH, são encontradas as terminações axonais dos neurônios hipotalâmicos, sendo que, em geral, nos teleósteos
- 326. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 316 Julho/2010 nessa região são liberadas os neuro-hormônios, como por exemplo, a arginina – vasotocina (AVT), a isotocina (IST) e o hormônio concentrador de melanina (MCH), entre outros neuropeptídeos (Acher, 1996; Batten e col., 1999; Duarte e col., 2001; Weltzien e col., 2004; Kawauchi, 2006). Apesar de a NH estar diretamente relacionada com a reprodução, os estudos sobre o controle neuroendócrino das funções hipofisárias em teleósteos requerem o conhecimento da morfologia da hipófise, inervação dessa hipófise e a identificação e localização dos diferentes tipos celulares encontradas na região da AH (Weltzien e col., 2004). Em geral, a AH em peixes é subdividida em três regiões distintas, no que diz respeito ao arranjo e localização topográfica das células, características tintoriais dessas células e distribuição dos ramos da NH (Laiz-Carrión e col., 2003; Cala e col., 2003; Weltzien e col., 2004; Kawauchi e Sower, 2006; Cinquetti e Dramis, 2006). Essas regiões são denominadas de: “pars intermedia” (PI), “rostral pars distalis” (RPD) e “proximal pars distalis” (PPD). Na PI encontram-se as células produtoras de melanotropina (MSH) e as células produtoras de somatolactina (SL); na PPD localizam-se as células produtoras de gonadotropinas (GtHs), comumente chamadas de FSH (hormônio folículo estimulante) e de LH (folículo luteinizante). As células produtoras de tireotropina (TSH) e as células produtoras de hormônio de crescimento (GH), conhecidas como células somatotrópicas, também são identificadas na região PPD. Já a RPD contém as células produtoras de prolactina (PRL) e as células produtoras de hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Adicionalmente, segundo Kawauchi e Sower (2006), os hormônios adeno-hipofisários podem ser agrupados conforme sua similaridade estrutural e funcional em 3 famílias: a família derivada de proopiomelanocortina, que abrange a adrenocorticotropina (ACTH) e a melanotropina (MSH); a família prolactina/somatotropina, que inclui prolactina (PRL), hormônio de crescimento (GH) e somatolactina (SL); e a família dos hormônios glicoprotéicos, que contém gonadotropinas (GtH) e tireotropina (TSH) (Agulleiro e col., 2006; Takei e Loretz, 2006; Kawauchi e Sower, 2006). É importante salientar, que todos esses hormônios, exceto a somatolactina, estão presentes nos outros vertebrados (Ono e col., 1990; Kaneko, 1996). Neste caso, as funções fisiológicas dos hormônios hipofisários são semelhantes ao apresentado para mamíferos e, portanto, serão discutidas apenas as diferenças observadas entre estes dois grupos de vertebrados. Proopiomelanocortina (POMC) é um precursor protéico de vários hormônios, como por exemplo, a adrenocoticotropina (ACTH), melanotropina (MSH) e β-endorfina (Kawauchi e Sower, 2006). O papel fisiológico de ACTH é estimular a síntese e liberação de cortisol no tecido inter-renal de teleósteos (Segura-Noguera e col., 2000), sendo que, em teleósteos, o principal hormônio desta glândula é o cortisol, e em peixes, este hormônio atua em vários processos fisiológicos, como por exemplo, no metabolismo, nos aspecto
- 327. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.317 relacionados ao estresse e na osmorregulação (Segura-Noguera e col., 2000; Kawauchi e Sower, 2006). Em relação ao MSH, o papel fisiológico desse hormônio em teleósteos é estimular a dispersão dos grânulos de pigmentos nos melanócitos, produzindo assim uma rápida mudança de coloração no peixe (Cala e col., 2003; Kawauchi e Sower, 2006). Sabe-se ainda, que o papel fisiológico da PRL em teleósteos, está relacionado principalmente com a osmorregulação (Segura-Noguera e col., 2000; Forsyth e Wallis, 2002; Cala e col., 2003; Kawauchi e Sower, 2006; Mancera e Fuentes, 2006). Adicionalmente, alguns estudos indicam que a PRL esteja envolvida também na reprodução e nos aspectos relacionados ao estresse (Cala e col., 2003). O hormônio GH tem um papel fundamental na regulação do crescimento e desenvolvimento em teleósteos, além de estar envolvido em outros processos fisiológicos, como por exemplo, osmorregulação, reprodução e metabolismo (Segura-Noguera e col., 2000; Forsyth e Wallis, 2002; Cala e col., 2003; Kawauchi e Sower, 2006; Agulleiro e col., 2006). As células produtoras de somatolactina (SL), também conhecidas como PIPAS- cells, foram primeiramente descritas por Ono e colaboradores (1990); Rand-Weaver e colaboradores (1991); e até o momento este hormônio só foi encontrado em peixes (Kaneko, 1996; Kawauchi e Sower, 2006). Apesar de ser um hormônio descoberto a mais ou menos 20 anos atrás, o verdadeiro papel fisiológico da SL em peixes, ainda continua desconhecido. Algumas evidências indicam que a SL esteja envolvida em vários processos fisiológicos, como por exemplo: no metabolismo, na regulação ácido-básica e na osmorregulação (Kakizawa e col., 1993; Kakizawa e col., 1995; Kaneko, 1996), no desenvolvimento embriológico (Laiz-Carrión e col., 2003), nos aspectos relacionados ao estresse (Rand-Weaver e col., 1993; Kaneko, 1996), na reprodução (Olivereau e Rand- Weaver, 1994; Kaneko, 1996; Vissio e col., 1997; Johnson e col., 1997; Mousa e Mousa, 2000) e na produção de esteróides sexuais (Planas e col., 1992; Mayer e col., 1998). Em relação ao TSH, as possíveis funções fisiológicas deste hormônio seriam: pode estar envolvido na metamorfose em Pleuronectiformes (Schreiber e Specker, 1999), no desenvolvimento ontogenético (larval) (Laiz-Carrión e col., 2003) e indiretamente na reprodução, pois, foi observado que o hormônio tireoidiano (T3) intensifica o efeito estimulatório do GnRH em Salmo trutta (Mylonas e col., 1994) e em outros trabalhos sugerem que os hormônios tireoidianos agem sinergisticamente com as gonadrotopinas (Sullivan e col., 1989 apud Mylonas e col., 1994). Finalmente, os últimos hormônios hipofisários a serem discutidos neste capítulo, são as GtHs, ou seja, o FSH e o LH. Estes hormônios exercem um papel fisiológico muito importante na reprodução de peixes, desta forma, abordaremos especificamente o eixo H-H- G em peixes e as possíveis relações com o ambiente externo, tanto em relação ao estímulo para a reprodução como no bloqueio do mesmo.
- 328. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 318 Julho/2010 Eixo hipotálamo-hipófise-gônadas em peixes e sua relação com o ambiente externo A reprodução em peixes, apesar de ser modulada por fatores ambientais (temperatura, fotoperíodo, pluviosidade entre outros), é controlada endogenamente por um sistema endócrino, principalmente pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, que sintetiza e libera gonadotropinas, esteróides gonadais e hormônios moduladores do processo reprodutivo entre outras substâncias (Takei e Loretz, 2006; Zohar e col., 2010; Levavi-Sivan e col., 2010). Esse processo ocorre naturalmente com o desenvolvimento das gônadas, maturação, liberação e fertilização dos gametas, sendo que em geral, em peixes, a desova e a fertilização ocorrem no ambiente externo (Rocha e Rocha, 2006). Os ovos fertilizados originam embriões e posteriormente larvas, que crescem e se tornam adultos, reiniciando o ciclo. Em geral, a fisiologia da reprodução em peixes pode ser sintetizada da seguinte forma (Fig. 2) (Blázquez e col., 1998; Weltzien e col., 2004; Zohar e col., 2010; Levavi-Sivan e col., 2010): a partir do momento em que a idade e o peso mínimo são atingidos para o início da reprodução, alterações ambientais como o fotoperíodo, a temperatura e, possivelmente as chuvas, são captadas através dos olhos, pineal, narinas e receptores cutâneos, que as convertem em sinais eletroquímicos e são transmitidos via neurônios sensoriais até o hipotálamo. O papel do fotoperíodo na influência sazonal do ciclo reprodutivo em peixes teleósteos é bem estabelecido na literatura, entretanto, os mecanismos fisiológicos envolvidos nesta modulação ainda não são bem compreendidos. Em várias espécies de teleósteos, foram registrados, efeitos positivos, negativos ou nenhum efeito da melatonina sobre a maturação gonadal. Por outro lado, sabe-se também, que a secreção da melatonina é realizada durante a fase escura e acredita-se que este hormônio seja um dos principais responsáveis pelos efeitos do fotoperíodo sobre o sistema endócrino (Kah e col., 1999; Falcón e col., 2010). Adicionalmente, este preciso link entre as mensagens do fotoperíodo e os efeitos sobre o sistema neuroendócrino em peixes, precisam ser investigados mais profundamente.
- 329. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.319 Figura 2. Representação esquemática dos principais fatores relacionados com o controle neuroendócrino da reprodução em peixes teleósteos (explicações no decorrer do texto). Imagens: Renato Massaaki Honji, Rafael Henrique Nóbrega e Leonardo Gastón Guilgur.
- 330. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 320 Julho/2010 Os fatores ambientais citados estimulam o hipotálamo a sintetizar e liberar o hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH), que estimula as células gonadotrópicas na hipófise a sintetizar e liberar o hormônio folículo estimulante (FSH), que via corrente sanguínea chega às camadas foliculares dos oócitos em desenvolvimento e na camada teca, converte o colesterol em testosterona. Esta é transportada à camada granulosa, na qual é aromatizada a 17-estradiol pela enzima aromatase, também sob influência do FSH. O 17-estradiol age no fígado (via corrente sanguínea), estimulando a síntese da glicolipofosfoproteína (vitelogenina) que, também via corrente sanguínea, é “sequestrada” pelo oócito por micropinocitose (processo dependente de FSH), promovendo o crescimento do oócito e incorporação de vitelo. A detecção da vitelogenina, como precursora do vitelo tem sido intensamente pesquisada nas últimas décadas, desde a síntese do 17-estradiol como produto de ação no fígado até estudos com enfoques ambientais, como por exemplo, os disruptores endócrinos que são fatores externos que podem afetar o sistema endócrino e assim toda a fisiologia reprodutiva (GoksØyr e col., 2003). Os machos de teleósteos também possuem o gene para vitelogenina, entretanto, o mesmo não é expresso devido ao baixo nível de estradiol circulante, podendo ser expresso em situações adversas, como por exemplo, na exposição dos indivíduos aos poluentes com ação estrogênica (Moncaut e col., 2003). Este assunto será descrito intensamente no capítulo de ecotoxicologia, principalmente em relação aos disruptores endócrinos na neuroendocrinologia. Assim, na fase de vitelogênese, que é um processo pelo qual o citoplasma do oócito acumula substâncias de reservas para posterior utilização pela larva, ocorre um aumento nos níveis plasmáticos de 17-estradiol e testosterona e esse aumento inibe a síntese de FSH (feedback negativo) e juntamente com a ação do GnRH estimulam a secreção do hormônio luteinizante (LH) nas fases finais da vitelogênese. O LH estimula a camada teca do folículo a produzir 17-hidroxiprogesterona, que é transportada à camada granulosa e convertida a 17α,20-dihidroxy-4-pregnen-3-one ou 17α,20-21-trihidroxy-4- pregnen-3-one pela enzima 20-hidroxiesteróide-desidrogenase, dependendo da espécie considerada (Peter e Yu, 1997). O hormônio 17-20-dihidroxy-4-pregnen-3-one é conhecido como o hormônio indutor da maturação final e da ovulação (MIS) na maioria dos peixes. Nos machos, o controle da síntese de esteróides é semelhante ao das fêmeas. FSH e LH estimulam a esteroidogênese testicular e a espermatogênese, sendo os andrógenos, testosterona e 11-cetotestosterona produzidos pelas células de Leydig no tecido intersticial dos testículos, sendo, esses hormônios gonadais os mais importantes no desenvolvimento do testículo e das características sexuais secundárias nos machos (Grier, 1993; Cyr e Eales, 1996; Nagahama, 2000; Haider, 2004; Garcia-López e col., 2006).
- 331. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.321 Recentemente, foi descoberto mais um sistema neuroendócrino que possui íntima relação com a regulação da reprodução e da puberdade em vertebrados, o chamado sistema kiss1/GPR54 (Zohar e col., 2010; Taranger e col., 2010). Zohar e colaboradores (2010), que apresentam resultados obtidos em relação ao sistema kiss1/GPR54 em peixes, confirmam a existência deste sistema em vertebrados considerados mais basais durante a evolução deste grupo. Por outro lado, estudos adicionais sobre este novo sistema neuroendócrino em espécies de peixes que apresentam distintas estratégias reprodutivas é necessário (Zohar e col., 2010). Portanto, estas múltiplas e complexas interações hormonais existentes entre os vários sistemas (sensoriais e reprodutivos) durante a reprodução dos peixes é controlada endogenamente pelo sistema neuroendócrino, principalmente pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas como dito anteriormente (Fig. 2). De uma forma em geral, sabe-se que todo esse controle ocorre quando os peixes encontram-se no ambiente natural, mas altera-se de alguma forma, ainda pouco esclarecida, quando espécies migradoras são transferidas para o cativeiro, em operações de cultivo, pois neste ambiente confinado, os peixes não conseguem eliminar os seus gametas. Neste caso, intervenções hormonais exógenas em diferentes níveis do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (Fig. 2) são necessárias para dar continuidade ao processo de maturação gonadal (Zohar e Mylonas, 2001), procedimento necessário para a maioria das espécies ícticas tropicais, por serem reofílicas (peixes de piracema). Adicionalmente, considerando-se que as espécies de peixes de piracema, quando são impedidas de migrar, apresentam um bloqueio na reprodução, fica evidente, que a construção de reservatórios nos rios brasileiros causa grandes impactos no ciclo de vida dos peixes reofílicos, principalmente nos aspectos relacionados à fisiologia reprodutiva. Os estudos sobre a disfunção endócrina de peixes em cativeiro, principalmente em relação ao eixo hipotálamo-hipófise-gônadas são escassos mesmo em espécies de clima temperado, e raros em teleósteos de clima tropical, e o fato de que muitas espécies de peixes encontram-se em vias de extinção, tornam as pesquisas envolvendo o eixo H-H-G de suma importância, pois, estes estudos contribuem para uma ação urgente de conhecimento da fisiologia reprodutiva dessas espécies, para que não ocorra o risco de uma espécie ser extinta sem nem mesmo ter sido estudada a sua fisiologia reprodutiva, premissa básica para um futuro trabalho de repovoamento da espécie. Adicionalmente, veremos no capítulo 32, os efeitos dos poluentes (disruptores endócrinos) na neuroendocrinologia dos animais.
- 332. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 322 Julho/2010
- 333. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.323 Neuroendocrinologia comparada: o encéfalo e a hipófise de anfíbios, répteis e aves Amanda de Moraes Narcizo Lab. de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos amnarcizo@usp.br Considerando-se a evolução do sistema nervoso dos vertebrados pode-se dizer que a tendência mais importante foi o aumento na complexidade, no tamanho, na conformação e na capacidade funcional do encéfalo. Este processo evolutivo, também denominado encefalização, levou a consolidação de diversas capacidades funcionais, incluindo as respostas rápidas às informações do ambiente interno e externo, a alta capacidade de armazenar informações e um aumento na complexidade e flexibilidade do comportamento destes animais. Outra consequência da encefalização foi a capacidade de formar associações entre eventos passados, presentes e, pelo menos em humanos, eventos futuros (Hickman e col., 2004). O evento da encefalização gerou em todos os vertebrados um órgão que é o centro de controle do organismo, sendo este centro o integrador de todas as funções fisiológicas. Os diversos sistemas que formam o organismo não funcionam de modo independente. Ao contrário, estão ao mesmo tempo em funcionamento, respondendo a diferentes estímulos para a realização dos processos vitais, gerando também assim, um ritmo biológico. Desta forma, o sistema nervoso e o sistema endócrino são os maiores responsáveis pela coordenação dos ajustes das atividades de cada sistema fisiológico que compõe um organismo vertebrado, sendo o encéfalo considerado também um importante órgão produtor de hormônios (Schmidt-Nielsen, 2002). Neste contexto, no presente capítulo serão apresentados, de forma comparativa entre os grupos de vertebrados: anfíbios, répteis e aves, alguns aspectos da anatomia e dos efeitos fisiológicos de hormônios produzidos pelo eixo hipotálamo-hipófise e a influência destes em outros sistemas. Breve descrição do desenvolvimento do sistema nervoso em vertebrados O sistema nervoso central dos vertebrados surge, na fase embrionária, de uma faixa dorsal ectodérmica, que é conhecida como placa medular. Esta placa se invagina para formar um tubo oco, chamado tubo neural. A extremidade anterior deste tubo se alarga e cresce muito mais rapidamente do que o restante e dá origem a um encéfalo primitivo, composto por três vesículas primárias. No sentido antero-posterior estas vesículas são denominadas prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo. A parte contínua do tubo neural,
- 334. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 324 Julho/2010 posterior ao rombencéfalo, da origem à medula espinhal e grande parte do restante do sistema nervoso (Orr, 2000; Hickman e col., 2004). Mesmo nos vertebrados mais primitivos como os ciclóstomos (lampreias e peixes- bruxa) a vesícula anterior e a posterior se subdividem em duas partes, formando o total de cinco vesículas encefálicas. Assim, o prosencéfalo divide-se em telencéfalo e diencéfalo, o mesencéfalo não se divide, e o rombencéfalo divide-se em metencéfalo e mielencéfalo (Orr, 2000; Hickman e col., 2004). Em todos os vertebrados, o telencéfalo dá origem aos lobos olfativos e ao cérebro, no entanto a importância destas duas novas estruturas varia marcadamente na escala filogenética. Sobre este mesmo aspecto, uma das grandes e notáveis mudanças associada à importância do desempenho do papel biológico destas duas estruturas, foi como o cérebro de grupos mais primitivos, como o dos peixes e anfíbios, se expandiu para formar uma estrutura profundamente sulcada e enormemente emaranhada na linhagem que leva aos mamíferos (Hickman e col., 2004). Nos peixes o telencéfalo se desenvolve em lobos olfativos grandes, destacando sua principal função sensorial e os hemisférios cerebrais são formados por uma massa ganglionar basal conhecida como corpo estriado e por uma fina camada epitelial dorsal chamada de pálio. Portanto, o pálio é composto por tecido não nervoso e o mesencéfalo é o centro da atividade encefálica neste grupo de animais. Nos anfíbios o centro da atividade encefálica permanece na região dorsal do mesencéfalo, onde as células cinzentas se encontram numa região chamada teto, e pela primeira vez em vertebrados, células nervosas são encontradas invadindo o pálio (região do telencéfalo) resultando em aumento dos hemisférios cerebrais. Na classe dos répteis ocorre um destacado aumento dos hemisférios cerebrais devido à invasão de células cinzentas no pálio, sendo agora esta estrutura denominada de neopálio. Este evento está diretamente relacionado à mudança do centro nervoso do mesencéfalo para o cérebro. Como as aves e os mamíferos têm seu ancestral nesta classe de animais, não surpreende que o pálio, invadido por substância cinzenta, seja o centro da atividade encefálica também nestes outros dois grupos derivados. Assim, nas aves o telencéfalo se desenvolve em pequenos lobos olfativos, sugerindo alguma relação pelo olfato notavelmente pobre neste grupo de animais, e em um cérebro grande que recobre o diencéfalo e os lobos ópticos (Orr, 2000). As diferenciações do diencéfalo serão, neste momento, descritas de forma geral para os vertebrados sendo, posteriormente, abordadas as particularidades dos grupos de interesse de discussão deste capítulo. Assim, das paredes do diencéfalo surgem os pedúnculos ópticos e as camadas sensoriais e pigmentares da retina. No local onde estas duas estruturas se encontram, certas fibras de cada nervo óptico cruzam para o lado oposto formando o quiasma óptico (Orr, 2000). O diencéfalo diferencia-se em três regiões: o epitálamo (dorsal), o tálamo (central), e o hipotálamo (ventral). O epitálamo é derivado do
- 335. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.325 teto do diencéfalo e dá origem ao complexo endócrino epifisário, que inclui a glândula pineal. A maior parte do diencéfalo se torna o tálamo. Este compreende a principal estação de retransmissão de sinais entre a porção superior e inferior do cérebro, atuando como um centro de impulsos olfativos e visuais, além de estar associado a várias estruturas glandulares e sensoriais. O hipotálamo, oriundo do piso do diencéfalo, contém vários núcleos neurossecretores que são fontes de neuro-hormônios envolvidos com a regulação da função hipofisária. É também da região ventral do diencéfalo que se origina o pedúnculo da hipófise ou infundíbulo, e o lobo posterior, conhecido também por pars nervosa ou neurohipófise (Orr, 2000; Norris, 2007). Adicionalmente, o lobo anterior da hipófise (adenohipófise) é derivado, na fase embrionária, da ectoderme dorsal da cavidade oral primitiva de uma região denominada bolsa de Rathke. Assim, a hipófise se origina da fusão do infundíbulo com a bolsa de Rathke durante o desenvolvimento embrionário. E apesar de a adenohipófise não possuir qualquer ligação anatômica com o encéfalo, ela está funcionalmente ligada a ele por um sistema circulatório chamado sistema porta-hipofisário, com exceção dos teleósteos, como visto no capítulo anterior (Orr, 2000; Hickman e col., 2004; Norris, 2007; Guyton e Hall, 2006). O mesencéfalo sofre uma mudança relativamente pequena no grupo dos vertebrados. No entanto, possui maior importância principalmente no grupo dos peixes, mas também no dos anfíbios, atuando como o centro de coordenação nervosa, como comentado anteriormente. Na parte dorsal, o mesencéfalo desenvolve-se em duas proeminências conhecidas como lobos ópticos, que tem função na recepção visual. Nas aves os lobos ópticos são excepcionalmente grandes e esta característica parece ter relação com a visão aguçada que este grupo apresenta (Orr, 2000; Hickman e col., 2004). O metencéfalo, dorsalmente, dá origem ao cerebelo, sendo este um centro de coordenação muscular e equilíbrio. O cerebelo nos anfíbios é muito pequeno e é discutido, na anatomia funcional, que esta característica tenha relação com os movimentos notavelmente vagarosos deste grupo. O cerebelo dos répteis é geralmente maior que dos anfíbios, no entanto não atinge o tamanho do cerebelo de alguns peixes, como os tubarões, nem o tamanho do das aves e dos mamíferos (Orr, 2000; Hickman e col., 2004). O mielencéfalo forma o bulbo do encéfalo, é extremamente importante em todos os vertebrados já que é o centro de muitas atividades vitais como a respiração, o batimento cardíaco e o metabolismo. Em peixes também é o centro de controle da linha lateral e do ouvido interno (Orr, 2000; Hickman e col., 2004). Estes aspectos são importantes do ponto vista evolutivo visto que o desenvolvimento das três vesículas encefálicas apresenta relações funcionais, incluindo as funções de percepção do ambiente externo. Estas relações primitivas do encéfalo, apesar de extremamente fundamentais, foram, em alguns casos, amplificadas e em outros
- 336. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 326 Julho/2010 reduzidas e/ou mantidas ao longo da contínua evolução conforme as prioridades sensitivas eram moldadas pelo habitat do animal e pelo seu modo de vida (Hickman e col., 2004). Considerações anatômicas do eixo hipotálamo-hipófise: anfíbios, répteis e aves Pelo sistema neuroendócrino ter sido mais bem estudado na classe dos mamíferos, a nomenclatura aplicada às estruturas, aos hormônios e funções foi, primeiramente, atribuída a este grupo. Posteriormente estes conhecimentos foram empregados a vertebrados não mamíferos. Por isso para discutir alguns aspectos anatômicos entre anfíbios, répteis e aves, será aqui apresentado um esquema morfológico generalizado do eixo hipotálamo-hipófise de mamíferos, uma vez que o sistema neuroendócrino entre os tetrápodes exibe muitas características encontradas neste grupo de vertebrados (Fig. 1) (Norris, 2007). A adenohipófise é um epitélio de estrutura glandular que pode ser dividida em três regiões anatômicas: pars distalis (PD), pars tuberalis (PT) e pars intermedia (PI). Estas regiões podem ser distinguidas tanto pelos tipos celulares quanto pelas relações anatômicas Figura 1. Eixo hipotálamo-hipófise generalizado de mamíferos. O hipotálamo contém vários centros neurossecretores incluindo a área pré-óptica (POA), núcleo supraquiasmático (NSQ), núcleos arqueados (ARC), núcleos supra-ópticos (SON), e núcleos paraventriculares (PVN). A eminência média (ME) e pars nervosa (PN) são áreas neurohemais separadas. A ME conecta, pelo sistema de vasos sanguíneos passando pela pars tuberalis (PT), o hipotálamo a pars distalis (PD) onde os hormônios hipotalâmicos estimulam ou inibem a liberação dos hormônios trópicos. A pars nervosa armazena os nonapeptídeos produzidos no hipotálamo e é suprida por outro sistema de vasos sanguíneos. (OC) representa o quiasma óptico e (PI) significa pars intermédia (Modificado de Norris, 2007).
- 337. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.327 com a neurohipófise. Já a neurohipófise, como dito anteriormente, é derivada de tecido nervoso e nela podem ser identificadas duas regiões: a eminência média (ME), mais anterior, e a pars nervosa (PN), região posterior. Um sistema vascular denominado sistema porta hipotálamo-hipofisário se desenvolve entre a eminência média da neurohipófise e a pars distalis da adenohipófise. É através deste sistema que, por exemplo, o sangue contendo os hormônios liberadores hipotalâmicos flui para a pars distalis, e então os hormônios trópicos da mesma fluem para o sistema venoso alcançando a circulação geral do organismo. O sistema de vasos da pars nervosa se conecta diretamente com o sistema de drenagem venosa, não tendo associação com o sistema porta hipotálamo-hipofisário. Das subdivisões da adenohipófise pode-se dizer que a pars tuberalis é constituída por uma fina camada celular da adenohipófise e está em contato com a eminência média, e que o sistema porta passa por ela. Estudos recentes têm demonstrado que a PT tem um importante papel de conexão endócrina entre a glândula pineal e a secreção de prolactina (PRL) pelas células da pars distalis (Norris, 2007). Diferentemente do que foi descrito para teleósteos no capítulo anterior, a pars intermedia nestes grupos de vertebrados apresenta um único tipo celular sendo responsável pela produção do hormônio melanotrópico (MSH) e a pars distalis possui cinco tipos celulares sendo responsáveis pela produção de seis hormônios trópicos: hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), hormônio estimulador da tireóide (TSH), hormônio de crescimento (GH), a prolactina (PRL), e duas gonadotropinas (GtHs) produzidas pelo mesmo tipo celular, sendo comumente em células distintas, estas são: o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH). Adicionalmente a adenohipófise libera lipotropinas (LPH) e endorfinas, embora não listados como hormônios trópicos, estes peptídeos podem exercer função endócrina ligando-se a receptores opióides no sistema nervoso (Guyton e Hall, 2006; Norris, 2007). Quanto ao hipotálamo, seus núcleos neurossecretores da área pré-óptica produzem neuro-hormônios que são armazenados na neurohipófise, estes são nos grupos de vertebrados aqui discutidos, a arginina-vasotocina (AVT) e mesotocina (MST). Os axônios destes núcleos atravessam a ME chegando na PN. Núcleos neurossecretores incluindo núcleo supraquiasmático (NSQ), núcleos arqueados (ARC) e núcleos paraventriculares (PVN) controlam o funcionamento da PD. Outros hormônios hipotalâmicos, como: o hormônio liberador de tireotropina (TRH), o hormônio liberador de gonadotropinas (GnRH), o hormônio liberador de corticotropina (CRH), o fator liberador de prolactina (PRF) e a dopamina (DA), percorrem através do sistema porta hipotálamo-hipofisário e se ligam a receptores em diferentes tipos celulares liberando hormônios trópicos na adenohipófise (Norris, 2007).
- 338. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 328 Julho/2010 Em anfíbios, a pars tuberalis aparece pela primeira vez na filogenia dos vertebrados e a pars intermedia, neste grupo, é pouco vascularizada apresentando inervações diretas por neurônios dos núcleos hipotalâmicos. Os répteis ocupam uma posição central na evolução dos tetrápodes, e por isso a hipófise deste grupo de vertebrados apresenta grande diversidade anatômica, podendo ser encontrados animais com características anatômicas similares a anfíbios e também similares a aves e mamíferos. De forma, geral pode-se dizer que não é encontrada inervação direta do hipotálamo na adenohipófise sendo esta característica mantida para os grupos derivados, aves e mamíferos. A pars tuberalis é bem desenvolvida em Rhynchocephalia, Chelonia e Crocodilia, mas é bem reduzida e algumas vezes ausente em lagartos. Em serpentes adultas, a PT é completamente ausente. Ainda não há uma explicação para o desaparecimento da PT nos Squamatas. Ao contrário, enquanto a pars intermedia é bem desenvolvida em quelônios e crocodilos e em algumas cobras, a PI é reduzida ou ausente em lagartos e algumas cobras. Nas aves, diferentemente de todos os tetrápodes, a pars intermedia é ausente em todos os indivíduos adultos de todas as espécies. Em algumas aves, como os pombos e o pardal de coroa branca, a eminência média é separada em anterior e posterior sendo que cada uma destas regiões possui seu próprio sistema porta com a PD. Não se sabe ao certo quão frequente este sistema duplo é encontrado em outras aves, entretanto, é discutido que este sistema de regionalização da ME e PD poderia representar um mecanismo mais eficiente de entrega dos neuro-hormônios hipotalâmicos a específicos tipos celulares na PD (Norris, 2007). Considerações fisiológicas do eixo hipotálamo-hipófise: anfíbios, répteis e aves Como dito anteriormente, o sistema neuroendócrino é constituído pelo eixo hipotálamo-hipófise, e de forma resumida, este sistema funciona da seguinte maneira: o hipotálamo, modulado por variáveis ambientais e pelo sistema nervoso, promove a síntese de hormônios liberadores (RHs - Releasing Hormones) ou hormônios inibidores (RIHs - Release-Inhibiting Hormones) em seus neurônios neurossecretores. Através de seus prolongamentos axônicos, que terminam ou na ME (encontrando com o sistema porta) ou no interior do infundíbulo na PN, os hormônios produzidos no hipotálamo chegam até a hipófise e, atuando em células específicas regulam a secreção dos hormônios trópicos, que por sua vez, regulam outras glândulas endócrinas. Esses hormônios trópicos atingem certas glândulas endócrinas periféricas, como exemplo, a glândula tireóide que em resposta libera seus hormônios na corrente sanguínea e assim, afetam células específicas não endócrinas, além de exercerem um efeito de controle negativo sobre o hipotálamo e a hipófise. A figura 2 apresenta os hormônios produzidos neste eixo, de forma geral, em anfíbios, répteis e aves (Norris, 2007).
- 339. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.329 Existem vários eixos distintos envolvendo o hipotálamo, a hipófise e o alvo endócrino específico. E entre tantos fatores produzidos por este sistema integrativo, os eixos que mais recebem a atenção dos pesquisadores são: o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (H-H-G), discutido no capítulo anterior, o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (H-H-A), que será abordado no capítulo seguinte e o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide (H-H-T), que terá um pouco mais de destaque neste capítulo. Feed back alça curta AVT MST Feed back alça longa Hormônios Somatotrópico (GH) e Prolactina (PRL) Hormônio melanotrópico (MSH) Hormônios Trópicos (TSH, LH, FSH, ACTH, GH) Arginina- vasotocina (AVT) Mesotocina (MST) Fatores ambientais Encéfalo Hipotálamo Eminência média Pars intermedia Pars nervosa Pars distalis Alvos não endócrinos Alvos não endócrinos Alvos endócrinos Tecidos alvos HormôniosEfeitoEfeito Efeito Figura 2. Sistema neuroendócrino dos vertebrados: anfíbios répteis e aves. O hipotálamo secreta RHs e RIHs, estes são armazenados na ME e liberados (sistema porta hipofisário) na PD e PI (PI ausente em aves) onde regulam a liberação dos hormônios trópicos. A atividade do hipotálamo é influenciada por vários fatores ambientais via sistema nervoso central. Os hormônios trópicos afetam alguns alvos não endócrinos, mas principalmente alvos endócrinos que respondem liberando hormônios que tem efeitos em células-alvo específicas. Estes, por sua vez, modulam a liberação dos hormônios hipotalâmicos (RHs/RIHs) e adenohipofisários. O hipotálamo também secreta nonapeptídeos, mesotocina e arginina-vasotocina, que são armazenados na PN até que sejam liberadas no sistema de vasos sanguíneos (Modificado de Norris, 2007).
- 340. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 330 Julho/2010 Hormônios da tireóide Os hormônios da tireóide são derivados de duas moléculas de tirosina iodadas. Primeiramente, a tirosina é incorporada por uma proteína conhecida por tiroglobulina (Tgb) e então iodada pela enzima tireóide peroxidase (TPO). Uma tirosina iodada tem 2 iodetos ligados nas posições 3 e 5 do anel fenólico, respectivamente. Essa molécula é chamada de 3,5 diiodotirosina, ou DIT. Duas DITs são unidas pela TPO removendo o anel fenólico de uma DIT e ligando um grupo hidroxila de um grupo fenólico de outra DIT. O resultado desta estrutura química é uma tironina com 4 iodetos ligados, resultando na molécula chamada de T4. A tiroglobulina acoplada a molécula T4 é hidrolizada na tireóide e o hormônio T4 é liberado na corrente sanguínea. Normalmente, nos vertebrados, o T4 é a tironina mais circulante e é convertida a T3 com a remoção de um iodeto de seu anel externo pela tireóide deiodinase antes de ser liberada da glândula tireóide (Norris, 2007). Os hormônios tireoidianos são hidrofóbicos e, portanto, pouco solúveis em água, e da mesma forma como os esteróides, atravessam facilmente as membranas celulares. No entanto, mesmo com esta natureza existe um mecanismo de transporte específico para melhorar a circulação destes hormônios da tireóide pelas membranas celulares. Na circulação os hormônios da tireóide são transportados ligados a proteínas plasmáticas sendo estas ligações facilmente reversíveis. Assim, que esta ligação é desfeita pela entrada do hormônio na célula, outras moléculas do mesmo hormônio são ligadas nas proteínas plasmáticas. Várias e diferentes proteínas séricas são capazes de se ligar e transportar os hormônios da tireóide, e somente aproximadamente 1% destes hormônios são transportados livremente no plasma podendo entrar no tecido alvo, por difusão ou por transporte mediado por carreador, ser metabolizados no fígado e rins. O mecanismo molecular da ação dos hormônios da tireóide é similar ao mecanismo de ação descrito para estrógenos. Os hormônios da tireóide entram na célula alvo onde migram para o núcleo e se ligam a receptores específicos. O dímero, formado pelo hormônio e o receptor nuclear, promove o início da transcrição gênica resultando na síntese de proteínas (Guyton e Hall, 2006). Receptores nucleares para os hormônios da tireóide têm sido isolados e caracterizados em todos os grupos de vertebrados (Helbing e col.; 2006; Brown e Cai, 2007). Normalmente, os receptores têm maior afinidade para o T3 do que para os T4 (Fig. 3), apoiando a hipótese de que a conversão de T4 para T3 é requisito para a ação do hormônio da tireóide, o T3 é mais ativo, mais relevante na fisiologia dos vertebrados (Gross e Pitt-Rivers, 1952; Kistler e col., 1975; Norris, 2007; Sechman e col., 2009). Adicionalmente, as células-alvo para os hormônios tireoidianos estão equipadas com uma enzima específica, conhecida como deiodinase, que realiza essa conversão (Brown, 2005). Os hormônios da tireóide, triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), têm sua produção estimulada
- 341. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.331 pelo TSH produzido na adenohipófise sob influência do hormônio hipotalâmico TRH (Guyton e Hall, 2006; Norris, 2007). Figura 3. Ação do hormônio da tireóide em células-alvo. Tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) facilmente difundem através da membrana celular. Grande parte da T4 é desiodada para formar T3, que interage com o receptor do hormônio tireoidiano, ligado como um heterodímero com um receptor de retinóide X. Isso faz com que aumente ou diminua a transcrição dos genes que levam a formação de proteínas, sendo esta a resposta da célula-alvo dos hormônios tireoidianos (Modificado de Guyton e Hall, 2006). Alguns estudos têm mostrado que o hormônio CRH também age como o TSH estimulando a produção de tireotropinas em vertebrados não mamíferos (Groef e col., 2006). Em vertebrados, as tireotropinas têm atuação no desenvolvimento embrionário, na formação do sistema nervoso, na regulação do metabolismo (Norris, 2007). Em anfíbios, desempenham função importante na metamorfose, sendo extensivamente estudadas neste contexto biológico, estando envolvidas no aparecimento de membros e desaparecimento da cauda (Nishikawa e Yoshizato, 1986; Yaoita e Nakajima, 1997; Nakajima e Yaoita, 2003; Brown e col., 2005), bem como na reestruturação de órgãos, reorganizando a pele (Yoshizato, 1996), o sistema respiratório, o fígado, o trato digestório, desenvolvendo as criptas viliais, o encéfalo e a medula espinhal, o sistema imune (Rollins-Smith, 1998), o
- 342. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 332 Julho/2010 sistema hematopoiético, entre outros trabalhos. Shi (2000) escreveu um livro dedicado exclusivamente a metamorfose em anfíbios. O primeiro experimento em anfíbios foi realizado por Gross e Pitt-Rivers em 1925 quando a glândula tireóide de um girino foi retirada e a metamorfose foi inibida. Desde então, tem sido identificados cada vez mais mecanismos e relações de influência destes hormônios tireoidianos no desenvolvimento de vertebrados (Brown e Cai, 2007). Nos répteis e aves os hormônios T3 e T4 possuem importante papel na troca de escamas e penas, além da influência no metabolismo. Em frangos, o TRH pode estimular a produção e liberação de TSH bem como de GH, e o efeito do TRH nos dois hormônios trópicos é inibido por outro hormônio hipotalâmico, a somatostatina (SS). A liberação do TSH em anfíbios, répteis e aves é menos específica que o observado para mamíferos, uma vez que sua liberação tem sido estimulada inclusive por hormônios exógenos como mGnRH (hormônio liberador de gonadotropina de mamíferos), mGHRH (hormônio liberador de hormônio de crescimento de mamíferos), e peptídeos como CRH-like (similar ao hormônio liberador de corticotropina), sauvagina e urotensina I (Norris, 2007). Sechman e colaboradores (2009) mostraram em estudos realizados com galinhas que hormônios da tireóide estão envolvidos na regulação do eixo H-H-G nos processos associados com o crescimento e maturação do folículo ovariano. É bem estabelecido que em aves que se reproduzem sazonalmente os hormônios T3 e T4 desempenhem um importante papel na regulação das mudanças gonadais fotoperiódicas (Follet e Nicholls, 1988; Wilson e Reinert, 1999, Sechman e col., 2009). Neste processo vários estudos têm evidenciado o aumento da concentração dos hormônios sexuais no plasma e a diminuição da concentração de T3, sendo estabelecida uma relação negativa entre a concentração plasmática do hormônio tireóideano e a função ovariana durante a maturação sexual (Sechman e col., 2000). Hormônios hipofisários As gonadotropinas (FSH e LH) e tireotropina (TSH) são hormônios glicoprotéicos compostos por duas subunidades a α (alfa) e a β (beta), sendo a subunidade α comum para estes três hormônios e a β específica. O FSH promove a produção do óvulo e a secreção de estrógenos nas fêmeas e nos machos auxilia na produção dos espermatozóides. O LH induz a ovulação, produzindo os esteróides sexuais femininos: a progesterona e o estrogênio. O LH, nos machos, promove a produção dos esteróides sexuais masculinos, primeiramente testosterona. Estes três hormônios são encontrados em anfíbios, répteis, com exceção dos Squamatas que foi encontrado somente o hormônio FSH, e aves. Foi visto que o LH de sapo-boi estimula a tireóide de aves e répteis, destacando a similaridade destas moléculas e suas ações, mantendo também sua influência no eixo gonadal (Norris, 2007).
- 343. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.333 A prolactina (PRL) e o hormônio do crescimento (GH) são hormônios protéicos e pertencem à mesma família de hormônios por apresentarem similaridades estruturais. A prolactina, nos vertebrados apresenta cerca de 300 atuações distintas, além de seu papel mais tradicional, nos processos reprodutivos, como cuidado parental, e em mamíferos com a produção de leite, também controla os equilíbrios hídrico e eletrolítico, o desenvolvimento e crescimento, o metabolismo, o comportamento. Além disso, é um mediador químico do sistema imunológico, sendo importante na formação de novos vasos sanguíneos e, diferentemente dos outros hormônios trópicos a prolactina age diretamente em tecidos alvo e não através do estímulo de outros hormônios. Tem sido mostrado que a PRL desempenha ação de promoção de crescimento em larvas de anfíbios, em alguns anfíbios como os Anuros a PRL tem agido nas larvas como um hormônio anti-metamórfico. Em répteis este hormônio foi pouco estudado, no entanto, em experimentos com Lacerta além de a PRL estimular o crescimento também estimulou o apetite neste grupo de animais. Nas aves a PRL apresenta vários papeis na reprodução, incluindo o desenvolvimento de uma porção ventral depenada e altamente vascularizada durante a incubação dos ovos, realizando assim a transferência de calor. Ainda sobre os aspectos reprodutivos e comportamentais a PRL tem sido associada ao comportamento de cuidado parental em machos. Além disso, estimula a nutrição, tendo importante papel na pré-engorda das aves migratórias, e também é responsável pelo comportamento agitado destas aves no período que antecede a migração. Em pombos, a PRL estimula a produção de um leite que é regurgitado para a alimentação da prole (Norris, 2007). O GH desempenha um papel vital no controle do crescimento do corpo através de seu efeito estimulador na mitose celular, no metabolismo, especialmente nos novos tecidos dos jovens vertebrados, e na síntese do RNA mensageiro e de proteínas. O hormônio do crescimento age diretamente no crescimento e no metabolismo e indiretamente na produção de um hormônio polipeptídico, o fator de crescimento insuliníco (IGF), ou somatomedina produzida pelo fígado. Há uma grande similaridade nas propriedades físicas do GH de anfíbios e mamíferos sugerindo uma considerável conservação deste hormônio na evolução dos tetrápodes. Os mecanismos de ação e função do ACTH entre os tetrápodes são muito similares. A síntese do ACTH é estimulada pelo hormônio hipotalâmico CRH e tem ação nas células corticotrópicas na glândula adrenal, influenciando no metabolismo de proteínas e lipídeos e carboidratos, também pela produção de hormônios corticosteróides. O único hormônio da adenohipófise produzido pela pars intermedia é o hormônio estimulador de melanócitos (MSH). Assim como em peixes, em anfíbios e répteis, este hormônio tem ação direta sobre o tecido epitelial promovendo a dispersão do pigmento melanina no interior dos melanócitos, causando o escurecimento da pele. O MSH é
- 344. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 334 Julho/2010 produzido nas células da pars distalis das aves já que o lobo intermediário é ausente, mas sua função fisiológica neste grupo ainda é incerta. A coloração nesta classe de vertebrados parece estar sob a influência e/ou controle de fatores vindos do eixo reprodutivo (GtHs e esteróides gonadais), e da tireóide. O MSH e o ACTH são derivados de uma molécula precursora que é transcrita e traduzida a partir de um único gene, a proopiomelanocortina (POMC) (Norris, 2007). Os dois hormônios sintetizados na pars nervosa são a mesotocina e a arginina- vasotocina, são muito semelhantes quimicamente, pois sendo compostos por nove aminoácidos diferenciam-se por apenas dois. Estes hormônios são, respectivamente, homólogos à ocitocina e a arginina-vasopressina encontrados em mamíferos. Estes hormônios estão entre os de ação mais rápida, pois são capazes de produzir uma resposta, segundos após a sua liberação (Licht e col., 1984; Choy e Watkins, 1986; Nojiri e col., 1987; Acher e col., 1995; Acher, 1996). Entre estes dois os hormônios da PN, a arginina-vasotocina tem a distribuição filogenética mais ampla, acreditando-se ser ele o hormônio original a partir do qual os demais nonapeptídeos evoluíram (Tab. 1). Tabela 1- Hormônios animais nonapeptídeos (Modificado de Norris, 2007). Peptídeos similares a vasopressina Name Sequência de aminoácidos Grupos de animais Arginine vasopressin C-Y-F-Q-N-C-P-R-G-NH2 Mamíferos Lysine vasopressin C-Y-F-Q-N-C-P-K-G-NH2 Suiformes Phenypressin C-F-F-R-N-C-P-K-G-NH2 Marsupiais Arginine vasotocin C-Y- I-R- N-C-P-R-G-NH2 Não mamíferos Lysine conopressin C-F- I-R- N-C-P-K-G-NH2 Moluscos gastrópodes, sanguessugas Insect diuretic hormone C-L- I-T- N-C-P-K-G-NH2 Gafanhotos Peptídeos similares a Ocitocina Name Sequência de aminoácidos Grupos de animais Oxytocin C-Y-I-Q-N-C-P-L G-NH2 Mamíferos Mesotocin C-Y-I-Q-N-C-P-I-G-NH2 Peixes pulmonados, anfíbios, répteis, aves, alguns marsupiais Isotocin C-Y-I- S-N-C-P-LG-NH2 Peixes ósseos Aspargtocin C-Y-I-N-N-C-P-L G-NH2 Eslamobrânquios Asvatocin C-Y-I-N-N-C-P-VG-NH2 Eslamobrânquios Glumitocin C-Y-I-S-N-C-P-L G-NH2 Eslamobrânquios Phasvatocin C-Y-F-N-N-C-P-VG-NH2 Eslamobrânquios Valitocin C-Y-I-Q-N-C-P-VG-NH2 Eslamobrânquios Annectocin C-F-V-Q-N-C-P-TG-NH2 Annelida – minhoca Cephalotocin C-Y-F-Q-N-C-P-I-G-NH2 Octopoda A arginina-vasotocina é um hormônio de controle hídrico, especialmente nos anfíbios Anuros, nos quais age para a conservação da água promovendo o aumento da
- 345. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.335 permeabilidade da superfície epitelial (a fim de promover a absorção a partir do meio), estimulando a reabsorção da água na urina, na bexiga urinária e diminuindo o fluxo urinário. A ação da arginina-vasotocina é mais claramente compreendida nos anfíbios, e parece desempenhar um certo papel na conservação da água também nas aves e répteis. Para estas três classes de vertebrados tem sido descrita a influência da arginina-vasotocina e da mesotocina no comportamento sexual reprodutivo, pouco se sabe a respeito das funções endócrinas da mesotocina nos vertebrados (Hollis e col., 2005, Norris, 2007). Conclusão O que foi exposto evidencia que a complexidade do sistema neuroendócrino nos vertebrados e a diversidade de respostas fisiológicas e seus efeitos em um organismo é reflexo da integração de todos os sistemas fisiológicos, tendo o hipotálamo e a hipófise como mediadores fundamentais. Além disso, mais estudos a respeito dos efeitos destes hormônios hipotalâmicos e hipofisários nestes grupos de vertebrados são necessários para que as modulações de respostas fisiológicas sejam mais bem elucidadas também do ponto de vista evolutivo.
- 346. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 336 Julho/2010
- 347. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.337 Sistema neuroimunoendócrino Marina Marçola Laboratório de Cronofarmacologia marina.mpf@usp.br No decorrer da evolução dos organismos, percebe-se que a organização celular tende a atingir um grau de especificidade permitindo o agrupamento de células capazes de desempenhar funções específicas e assim, formar os órgãos. Estes por sua vez, apesar de manterem suas especificidades, se organizam de forma a permitir a integridade e funcionalidade do sistema do qual fazem parte. Essa forma organizacional nos permite uma visualização e compreensão anatômica e fisiológica desses sistemas. De maneira geral, o sistema nervoso é responsável pelo controle das demais funções do organismo. Cabe a ele receber inúmeras informações das diferentes partes do corpo e integrá-las para determinar a melhor resposta a ser dada para o estímulo recebido. Para que isso ocorra, existe uma maquinaria de alta complexidade que garante a transmissão, o processamento e a armazenagem da informação. No Unidade 3 (Neurociências), você teve mais informações sobre a anatomia e funcionamento do sistema nervoso. Juntamente com o sistema nervoso, o sistema endócrino também é responsável pelo controle de várias funções do organismo, sobretudo as funções metabólicas, tais como, velocidade de reações celulares e transporte de substâncias para o interior das células. Está também associado ao controle da reprodução, crescimento corpóreo, ritmos biológicos entre outros. Já o sistema imune desempenha o papel de defesa do organismo. Sua função é a de reconhecer agentes estranhos e montar a resposta apropriada para combatê-los, garantindo a homeostase do organismo (Guyton e Hall, 2006). A Ciência até hoje conseguiu desvendar e descrever os sistemas no decorrer da evolução dos organismos. Evidentemente que há muito que se descobrir da particularidade de cada um deles, porém, atualmente tem-se direcionado a compreender a interligação entre eles, garantindo que não só operem na sua particularidade, mas também interagem e modulem entre si. Nesse sentido, enquadram-se os novos estudos direcionados à compreensão do chamado Sistema Neuroimunoendócrino. Os primeiros passos Os antigos anciões gregos acreditavam na influência do cérebro sob a integridade do organismo, dizendo que o estado da mente interferia no decurso da doença. Essa crença perdurou por séculos até a descoberta dos antibióticos, quando se dizia que o tratamento da doença se resumia na eliminação do ‘corpo estranho’ causador da infecção ou inflamação.
- 348. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 338 Julho/2010 Porém, ultimamente tem-se retornado aos princípios antigos, e novas descobertas abrem precedentes que comprovam a integração do sistema nervoso e endócrino com a efetivação e eficiência da resposta imune (Sternberg e Gold, 1997). Já na década de 1970, Besedovsky e Sorkin, (1977) mostram que durante a montagem de uma resposta imune são observadas mudanças no decurso temporal de secreção de alguns hormônios (Fig. 1A) e na atividade elétrica de neurônios da porção ventromedial do hipotálamo de ratos (Fig. 1B), sugerindo uma comunicação entre esses sistemas. Figura 1. (A) A injeção de 4x109 células vermelhas de ovelhas em ratos aumentou a secreção de corticosterona a partir do quinto dia após o tratamento. Animais controles, injetados com glóbulos vermelhos de ratos, não apresentaram mudanças significativas na secreção de corticosterona (barras brancas). (B) A injeção de 5x109 células vermelhas de ovelha aumentou os disparos de neurônios do hipotálamo no quinto dia após o tratamento com o antígeno. Animais tratados com salina (barras brancas) não sofreram alterações (Modificado de Besedovsky e Sorkin, 1977). Hoje, já se sabe que os sistemas nervoso, endócrino e imune estão fisiológica e anatomicamente interligados. As células desses sistemas estão equipadas com uma maquinaria capaz de reconhecer sinais mútuos permitindo que essa comunicação multidirecional ocorra. Células imunes produzem citocinas que são reconhecidas pelo sistema nervoso o qual é capaz de regular imediatamente essa resposta. Essa comunicação ocorre por sinalização nervosa ou por vias humorais (Sternberg e Gold, 1997; Chesnokova e Melmed, 2002). Comunicação bidirecional: resposta imune e sistema nervoso central Durante uma resposta inflamatória, células do sistema imune são capazes de produzir e liberar citocinas que sinalizam não apenas células do sistema imune, mas
- 349. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.339 também células de outros tecidos e sistemas. Por ser um sistema difuso, células e mediadores do sistema imune são capazes de sinalizar para diversas regiões do organismo, seja via sanguínea ou linfática. Até recentemente acreditava-se que o sistema nervoso central (SNC) era provido de um privilégio que não permitia o recebimento e reconhecimento de sinalizações imunológicas. De fato, a barreira hematoencefálica, além de outros mecanismos, garante um grau de privilégio ao SNC, no entanto esse privilégio não acontece de maneira absoluta (Galea e col., 2006). Fisiologicamente, essa barreira impede a passagem de certas substâncias da corrente sanguínea para estruturas do SNC, porém, durante um processo inflamatório ela se torna mais acessível, permitindo uma maior comunicação entre elementos da periferia com elementos centrais. Assim, citocinas produzidas pelo sistema imune são capazes de sinalizar diretamente células do SNC (Sternberg e Gold, 1997; Chesnokova e Melmed, 2002; Galea e col., 2006). Além desse contato direto, essas citocinas são capazes de estimular outras células que estejam fora do SNC e próximas à barreira, como as células endoteliais, que revestem o vaso sanguíneo, a produzirem mediadores que atingem facilmente o SNC, tais como prostanglandinas e óxido nítrico (NO) (Fig. 2). Figura 2. Frente a uma resposta inflamatória, a barreira hematoencefálica sofre uma alteração que permite a passagem de certas citocinas que sinalizam diretamente células do SNC. Além disso, tais citocinas estimulam células próximas à barreira, tais como as células endoteliais, a produzirem mediadores secundários, como NO e prostaglandina, os quais agem sobre as células no SNC (modificado de Sternberg e Gold, 1997).
- 350. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 340 Julho/2010 As citocinas são capazes de estimular diretamente nervos periféricos, como o nervo vago, levando o sinal rapidamente (na ordem de milissegundos) para o SNC (Sternberg e Gold, 1997). Fibras do nervo vago possuem receptores para interleucina-1 (IL-1), mediador inflamatório produzido por células imunes, cujo reconhecimento traduz uma sinalização imediata para o SNC (Thayer e Sternberg, 2009). Outras evidências sugerem que algumas regiões neurais expressam citocinas e seus respectivos receptores (Chesnokova e Melmed, 2002) e células progenitoras neurais possuem receptores de reconhecimento de padrões moleculares que desencadeiam uma resposta imunológica (Rolls e col., 2007). Os dados acima descritos corroboram com a idéia de que o SNC está equipado a receber as sinalizações provindas de uma resposta imune e que isso pode ser feito de forma rápida e eficaz. Por outro lado, o SNC não apenas recebe, como também é capaz de responder prontamente a tais estímulos. Borovikova e colaboradores (2000) demonstraram que a acetilcolina in vitro, principal neurotransmissor do nervo vago, e o estímulo elétrico in vivo deste nervo são capazes de diminuir a liberação de citocinas que favorecem a resposta imune, as chamadas pró-inflamatórias, como por exemplo, o fator de necrose tumoral (TNF; Fig. 3, Borovikova e col., 2000). Recentemente, essa via de resposta é conhecida como via colinérgica anti-inflamatória (Rosas-Ballina e Tracey, 2009). Assim sendo, percebe-se a existência de um reflexo nervoso que modula a resposta imune. Resumidamente, existe um arco aferente estimulado por citocinas que leva o sinal inflamatório para o SNC. A fim de prevenir danos teciduais durante a resposta inflamatória, mediadores anti-inflamatórios são importantes para impedir uma resposta exacerbada. A resposta enviada pelo SNC através de um arco eferente é um exemplo de inibição da produção de mediadores pró-inflamatórios (Fig. 4, Rosas-Ballina e Tracey, 2009).
- 351. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.341 Comunicação multidirecional: sistema imune e sistema neuroendócrino Enquanto que a regulação nervosa da resposta imune ocorre de forma local e regional, visto que a liberação de acetilcolina é feita nas terminações nervosas que inervam órgãos e células imunes (Thayer e Sternberg, 2009), os hormônios se encarregam de fazer essa comunicação de forma sistêmica, uma vez que caem na corrente sanguínea. Eixo hipotálamo–hipófise–adrenal (H-H-A): o estresse e a resposta imune O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (H-H-A) é o mais conhecido comunicador entre sistema neuroendócrino e sistema imune. Sucintamente, o hipotálamo e outras regiões produzem o hormônio liberador de corticotropina (CRH), o qual estimula a liberação do hormônio adrenocorticotropina (ACTH) pela glândula hipofisária. Este estimula a glândula adrenal a liberar corticosterona em ratos, e cortisol em humanos, conhecida pela sua atuação nos mecanismos de estresse. Como feedback negativo, a corticosterona inibe a produção de CRH (Fig. 5, Sternberg e Gold, 1997). Figura 3. A produção de mediadores pró-inflamatórios por macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS, 100ng/ml) foi inibida pela incubação com acetilcolina nas concentrações indicadas acima (A-C). A estimulação do nervo vago reduziu a concentração de fator de necrose tumoral (TNF) no soro e fígado e o desenvolvimento de choque endotóxico, induzido por LPS (15mg/kg). SHAM: animais falso-operados, VGX: animais submetidos a vagotomia bilateral cervical (D-F; modificado de Borovikova e col., 2000).
- 352. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 342 Julho/2010 A corticosterona tem propriedades anti-inflamatórias e age diretamente em diversos alvos imunes. Classicamente, a corticosterona é conhecida pelos seus efeitos anti- inflamatórios. Este hormônio é capaz de inibir a proliferação de linfócitos, estimular a apoptose de neutrófilos e eosinófilos, inibir ou reduzir a expressão de inúmeras citocinas pró-inflamatórias assim como de seus respectivos receptores (Sorrells e Sapolsky, 2007). Durante uma situação de estresse, espera-se que a resposta imune seja amenizada devido aos efeitos anti-inflamatórios da corticosterona. Porém, estudos recentes têm demonstrado que em certas situações de estresse a resposta inflamatória é favorecida. Isso acontece quando um estímulo estressor ocorre logo antes do desafio inflamatório, caso contrário, quando o estresse é crônico, tem-se um efeito de impedir a exacerbação da resposta imune. Esse efeito pró-inflamatório gerado em casos de estresse agudo pode ser decorrente da atuação de catecolaminas, porém a corticosterona também pode mediar alguns desses efeitos, provavelmente via ativação de receptor (Sorrells e Sapolsky, 2007). Figura 4. Frente a um estímulo inflamatório, células imunes produzem citocinas que agem na tentativa de solucionar o problema. Essas citocinas estimulam neurônios aferentes do nervo vago que sinalizam o SNC. Este, por meio de um reflexo eferente modula a função imune, impedindo uma exacerbação da resposta e conseqüente dano tecidual. Tal comunicação é denominada via colinérgica anti-inflamatória (A; modificado de Rosas-Ballina e Tracey, 2009). As células imunes são reguladas a partir do reconhecimento de acetilcolina (Ach) pelos receptores (α7nAchR). Essa sinalização leva a inibição de fatores de transcrição responsáveis pela síntese de citocinas pró-inflamatórias (B; modificado de: Pavlov e Tracey, 2006).
- 353. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.343 A produção de citocinas está também relacionada ao desenvolvimento e amadurecimento do sistema endócrino, uma vez que a exposição à citocinas durante o desenvolvimento intrauterino ou neonatal altera a funcionalidade de eixos endócrinos, sobretudo o H-H-A. Além disso, a superestimulação do eixo H-H-A leva a uma imunossupressão, aumentando a suscetibilidade à infecção (Chesnokova e Melmed, 2002). Eixo imune-pineal: efeitos da melatonina no sistema imune Outro modulador neuroendócrino e inflamatório é a melatonina. A melatonina é uma indolamina sintetizada a partir da serotonina, através de uma acetilação catalizada pela enzima aril-alquilamina-N-acetiltransferase (AA-NAT) e pela metilação da N-acetilserotonina pela enzima hidroxiindol-O-metiltransferase (HIOMT) (Simmoneaux e Ribelayga, 2003). É um hormônio produzido de forma rítmica pela glândula pineal. De maneira geral, o pico de produção dessa indolamina ocorre durante a fase escura. O núcleo supraquiasmático (NSQ) Figura 5. O eixo H-H-A está associado aos processos de estresse, mas também é um dos principais comunicadores entre o sistema neuroendócrino e o sistema imune. O hipotálamo quando estimulado, libera CRH que estimula a produção de ACTH pela glândula pituitária. Este age sobre a glândula adrenal a qual produz coricosterona (cortisol). Como uma resposta de feedback negativo, a corticosterona inibe a produção de CRH pelo hipotálamo. Além de principal mediador do estresse, classicamente, a corticosterona age sobre a resposta imune como um mediador anti-inflamatório (modificado de Sternberg e Gold, 1997).
- 354. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 344 Julho/2010 recebe a informação fótica provinda da retina e funciona como um relógio central. A partir dele, projeções são lançadas para outros osciladores periféricos, tais como a glândula pineal. Dentre suas propriedades cronobiológicas, a melatonina é sinalizadora da intensidade e duração do escuro, sendo responsável, portanto pela sinalização de ritmos sazonais e circadianos (Simmoneaux e Ribelayga, 2003). Existe também a produção extra-pineal de melatonina. Essa produção ocorre de forma não rítmica ao longo do dia em medula óssea (Tan e col., 1999), trato gastrintestinal de ratos (Bubenik e col., 1992), fígado, rim e baço de roedores e primatas (Menendez- Pelaez e col., 1993), placenta humana (Lanoix e col., 2008) e células imunocompetentes, como macrófagos da cavidade peritoneal (Martins e col., 2004), linfócitos humanos (Carrilo- Vicco e col., 2004) e células do colostro humano (Pontes e col., 2006, 2007). O ritmo diário de melatonina no sangue, onde é observado um aumento de cerca de 100 vezes durante a noite, ocorre exclusivamente devido ao ritmo de produção da glândula pineal (Markus e col., 2007). As demais fontes de produção estão envolvidas em ações locais e sua produção tônica pode elevar de forma indiscriminada os níveis plasmáticos tanto de dia quanto de noite. Estudos recentes demonstram que a melatonina é capaz de agir sobre alguns aspectos imunológicos, sobretudo na camada endotelial, em concentrações compatíveis com sua produção noturna: reduz a adesão de neutrófilos e o aumento de permeabilidade vascular induzido por leucotrieno B4 (Lotufo e col., 2006), o rolamento e adesão de neutrófilos à camada endotelial (Lotufo e col., 2001) e a atividade da sintase de óxido nítrico constitutiva (Silva e col., 2007). Fisiologicamente, leucócitos circulantes estão equipados para agir caso necessário. Porém a integridade vascular, sobretudo da camada endotelial, é mantida por diversos mediadores que impedem a transmigração desnecessária desses leucócitos para o tecido. A melatonina noturna e a corticosterona podem estar agindo nesse conjunto de mediadores. Levando em consideração a produção rítmica desses hormônios, é importante que o organismo tenha um mecanismo de resposta imune que não dependa das variações rítmicas. Assim, durante a fase inicial da montagem de uma resposta inflamatória, o organismo deve responder prontamente independente da hora do dia. Considerando o paradigma acima, Markus e colaboradores, (2007) descreveram o chamado eixo imune-pineal, que consiste na ação endócrina e parácrina da melatonina sobre a resposta inflamatória. Durante a montagem da resposta inflamatória, a produção de melatonina pela glândula pineal é inibida por mediadores pró-inflamatórios, tais como TNF, permitindo a montagem de uma resposta rápida e eficiente (Markus e col., 2007). Hoje já se sabe que a glândula pineal está equipada para o reconhecimento desta citocina (Cruz- Machado e col., no prelo). No entanto, como dito anteriormente, a resposta inflamatória deve
- 355. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.345 ser controlada para que não haja danos teciduais. Em um segundo momento, células imunocompetentes localizadas próximo ao local da injúria são capazes de produzir melatonina em altas concentrações agindo de forma parácrina nas células das proximidades e colaborando com uma montagem anti-inflamatória da resposta (Fig. 6; Markus e col., 2007). Estudos in vitro, demonstraram que a produção extra-pineal de melatonina desempenha um papel protetor contra danos teciduais, visto que é capaz de reduzir a síntese de NO (Tamura e col., 2009). Além do mais, existe uma alça que interliga as glândulas adrenal e pineal. A corticosterona é capaz de aumentar a síntese de melatonina, visando uma resposta mais apropriada frente a uma injúria (Fernandes e col., 2009). Figura 6. O Eixo Imune-Pineal descreve a relação da resposta imune com as propriedades da melatonina. Fisiologicamente, a melatonina noturna age sobre o endotélio inibindo a transmigração de células imunes para o tecido. No entanto, o organismo precisa responder prontamente ao estímulo inflamatório independente da hora do dia. Na primeira fase da resposta inflamatória, citocinas pró- inflamatórias (TNF) agem sobre a glândula pineal inibindo a síntese de melatonina. Em um segundo momento, células imunocompetentes presentes no local da injúria produzem melatonina que age localmente na tentativa de solucionar o problema (modificado de Markus e col., 2007).
- 356. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 346 Julho/2010 Outra relação da melatonina está relacionada à manutenção funcional de certos órgãos imunes. A remoção cirúrgica ou a perda da funcionalidade da pineal acomete a manutenção de diversos órgãos imunes, tais como baço e timo. O tamanho desses órgãos é reduzido nesses dois casos, e, portanto, seu papel funcional é comprometido. Em casos de reposição da melatonina, essas situações são revertidas, visto que a capacidade proliferativa de diversas células imunes é recuperada (Carrillo-Vicco e col., 2005). 3.3 – Eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (H-H-G): Os hormônios reprodutivos e o sistema imune Para garantir a perpetuação da espécie, dois aspectos de relevância devem ser tomados em conta. O primeiro é a capacidade do indivíduo de deixar descendentes que carreguem seu código genético, e isso é garantido pelo sistema reprodutor, regulado por diversos órgãos e mediadores endócrinos (ver capítulos acima). Já o segundo é a capacidade de garantir sua própria sobrevivência frente a um processo que o ameaça, como uma doença. Cabe ao sistema imune garantir esse aspecto. Dessa forma, considerando a integridade dos organismos, existe uma correlação entre a incapacidade reprodutiva durante um processo infeccioso (Morale e col., 2001; Tomaszewska-Zaremba e Herman, 2009). A regulação endócrina do eixo reprodutivo é feita por hormônios produzidos pelo hipotálamo, hipófise e gônadas, caracterizada como eixo hipotálamo-hipófise-gônadas (H-H- G). Resumidamente, o hipotálamo produz o hormônio liberador de gonadodropina (GnRH) que age sobre a porção anterior da hipófise, a qual produz e libera o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo-estimulante (FSH), estes são responsáveis pela produção de hormônios nas gônadas sexuais, tais como testosterona ou progesterona, os quais completam a alça de feedback negativo inibindo a produção dos hormônios hipotalâmicos e hipofisários (Guyton e Hall, 2006). Como visto anteriormente, durante uma resposta inflamatória ocorre a ativação do eixo H-H-A aumentando a liberação de corticosterona, por outro lado as atividades reprodutivas são inibidas. Existem poucos estudos que interligam os hormônios sexuais com a resposta imune. De maneira geral, a inibição nos níveis de GnRH e LH durante uma resposta inflamatória pode estar associada ao aumento no nível de corticosterona, à liberação de prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias como IL-1β. O efeito de TNF e IL- 6, assim como opióides, catecolaminas, neurotransmissores, óxido nítrico e prostaglandinas na inibição desses hormônios ainda é contraditório (Fig. 7; Tomaszewska-Zaremba e Herman, 2009). Outro aspecto importante na intermodulação entre o eixo reprodutivo e o sistema imune é a manutenção do período gestacional. Durante a gravidez é necessário uma associação íntima entre estes aspectos. Para manter a gestação até o final do seu período
- 357. Neuroendocrinologia Comparada Julho/2010 Pág.347 correto é necessário que haja uma supressão do sistema imune para que o feto não seja rejeitado antes do tempo, caso isso não ocorra, a probabilidade de um aborto é aumentada. Estudos têm relacionado a participação da progesterona na regulação da resposta imune durante a gestação (Morale e col., 2001). Concluindo Vimos que para a manutenção da integridade do organismo é necessário que os sistemas estejam interligados entre si garantindo uma regulação recíproca que visa a continuidade do equilíbrio homeostático. Quando essa harmonia é rompida é importante que todo o organismo esteja apto a reconhecer os sinais e respondê-los de maneira organizada e eficiente. Neste contexto vimos que os sistemas Nervoso, Endócrino e Imune se organizam e comunicam mutuamente para garantir o perfeito funcionamento do organismo. Figura 7. Durante uma resposta inflamatória as atividade reprodutivas são inibidas devido a diminuição nos níveis de GnRH e LH. Ainda não está muito esclarecido com é feito essa inibição. Estudos indicam que o reconhecimento de citocinas como IL-1β por estruturas do SNC é o responsável. Por outro lado, a ação de opióides, catecolamindas, GABA, óxido nítrico (NO) e prostaglandinas, assim como o reconhecimento do estímulo inflamatório (LPS) diretamente pelo SNC podem estar associados à modulação dos hormônios sexuais, porém ainda não estão muito bem descritos (modificado de Tomaszewska-Zaremba e Herman, 2009).
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- 368. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 358 Julho/2010
- 369. Unidade 6 Ecotoxicologia Aquática TiagoGabriel Correia Lab. de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos tigabriel@usp.br Em sua definição clássica, a ecotoxicologia é a “Ciência que estuda os efeitos das substâncias naturais ou sintéticas sobre os organismos vivos, populações e comunidades, que constituem a biosfera, incluindo assim a interação das substâncias com o meio nos quais os organismos vivem num contexto integrado”. Neste módulo serão abordadas as consequências fisiológicas tanto para invertebrados como para vertebrados, resultantes da exposição a alguns metais, tais como Al, Mn, Zn, Cu e Cd. Entre os principais efeitos apresentados, destacam-se o transporte de Cd e Cu nas brânquias de crustáceos e a interface com os ecossistemas marinho e estuarino, a interferência do Al e Mn como possíveis agentes causadores de desequilíbrio metabólico e as implicações para a sobrevivência e reprodução, além de disfunções sobre o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas de teleósteos nas vias de síntese hormonal sistêmica e neural.
- 370. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 360 Julho/2010 Capítulo 29 Metal não essencial: o cádmio e seus efeitos pág. 361 Priscila Ortega Revisado pela Dra Flavia Pinheiro Zanotto Capítulo 30 Transporte de Metais Essenciais em Organismos Aquáticos: o cobre e o zinco pág. 371 Marina Granado Revisado pela Dra Flavia Pinheiro Zanotto Capítulo 31 Efeitos da toxicidade de metais no metabolismo de organismos aquáticos pág. 381 Vanessa Ap.Rocha Oliveira Vieira Revisado pela Dra Renata Guimarães Moreira Capítulo 32 Alterações neuroendócrinas resultantes da exposição a metais pág. 395 Tiago Gabriel Correia Revisado pela Dra Flavia Pinheiro Zanotto Bibliografia pág. 407
- 371. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.361 Metal não essencial: o cádmio e seus efeitos Priscila Ortega Laboratório de Fisiologia Comparada priortega218@gmail.com O cádmio Os metais, de maneira geral, são distinguidos entre essenciais e não essenciais. Metais essenciais, como o cobre e zinco, estão associados com mecanismos bioquímicos, que, dentro de limites, tendem a assegurar uma concentração fixa do metal dentro de um tecido particular. Os metais não essenciais, como o cádmio e o mercúrio, por sua vez, não são regulados, então, a concentração interna varia de tecido para tecido de acordo com a exposição (Turoczy e col., 2001). O cádmio é um poluente ambiental que aumentou sua importância nos últimos anos devido a industrialização, ao fumo e à falta efetiva de terapias para a contaminação por cádmio. Em geral, a população é contaminada por este metal através da exposição a águas e alimentos contaminados (Jeong e col., 2000). Ele é um dos metais que frequentemente ocorre combinado com o zinco em uma taxa de zinco/cádmio de 1 para 100, sendo um raro elemento que pode ser encontrado acumulado no corpo, principalmente no fígado e rins, onde apresentam entre 50-75% do total de acúmulo do metal, devido aos seus processos de detoxificação (Fasset, 1975). Por isso, animais terrestres, marinhos e animais de água doce apresentam a maioria do cádmio acumulado em fígado, rim e glândulas digestivas. Suas características típicas são uma coloração branco ou acinzentado, dúctil à temperatura ambiente. É um bom condutor de calor e eletricidade, não reagindo com o oxigênio do ar e, geralmente, está associado ao zinco. Sua massa atômica é de 112,40 gramas e número atômico 48, possuindo distribuição eletrônica terminada em 5s2 4d10 . Dessa forma, o cádmio é considerado um metal de transição devido à sua distribuição eletrônica, apesar de muitos autores descrevê-lo como um metal pesado, levando em consideração sua massa atômica e todos os seus efeitos nocivos nas células e tecidos em que pode se acumular (http://www.tabela.oxigenio.com, acessado em 02/05/2010). Este metal é tóxico, sendo encontrado em pilhas e baterias, além de dejetos industriais descartados no meio ambiente, não possuindo uma função fisiológica conhecida. Ele pode atingir cursos de água e até mesmo manguezais, onde o descarte de lixo vem crescendo a cada ano.
- 372. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 362 Julho/2010 Figura 1: Localização do elemento químico cádmio na Tabela Periódica (www.mundofisico.joinville.udesc.br/PreVestibu..., acessado em 02/05/2010). Ele pertence ao grupo II B da Tabela Periódica, com valência +2, tendo aproximadamente o mesmo raio iônico (0,92 Å) do íon cálcio. Assim, o cádmio poderia competir com o íon pelos canais de cálcio para entrar nas células. Além disso, o cádmio pode substituir o zinco e cobre (por possuírem a mesma valência) como co-fatores ou em funções enzimáticas. Ele ainda induz a produção de metalotioneínas, proteínas sequestradoras de metais. Os crustáceos Os crustáceos pertencem a um grupo diversificado de organismo, estando presentes em diversos hábitats: estuarino, marinho, dulcícola e terrestre. Ao longo da evolução destes organismos, surgiram adaptações especializadas das células epiteliais encontradas nas brânquias, tegumento, hepatopâncreas e glândula antenal (análogo ao rim), para a regulação e passagem de moléculas e íons entre o meio externo e a hemolinfa (Ahearn e col., 1999; Monteilh-Zoller e col., 1999). Isso faz com que esse grupo apresente sucesso adaptativo em ambientes tão diversos, mesmo em ambientes com contaminação por metais pesados. Assim, os crustáceos possuem uma variedade de formas de detoxificação celular que reduzem a concentração de metais potencialmente tóxicos encontrados no ambiente. Essas formas incluem: (1) mecanismos fisiológicos regulatórios que equilibram taxas de excreção e ingestão de metais do ambiente (Ahearn e col., 1999); (2) mecanismos de sequestro intracelular de metais que envolvem locais de união de alta afinidade com proteínas de baixo peso molecular conhecidas como metalotioneínas, seguida por sua eliminação pela
- 373. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.363 membrana lisossomal (Ahearn e col., 1999); e (3) processos de sequestros intracelulares de metais envolvendo vacúolos específicos contendo grânulos metálicos fosfóricos ou sulfurosos que subsequentemente são eliminados por exocitose (Ahearn e col., 2004). Contudo, metais não essenciais, como o cádmio, podem ser capturados e acumulados em invertebrados marinhos através da água ou dieta contaminada (Nuñez-Nogueira e Rainbow, 2005). Por isso, a concentração do metal depende de fatores como a espécie de crustáceo estudada, a localização, a dieta, o tamanho, o sexo do animal e o tipo de tecido. Quando animais de espécies diferentes são comparados, nota-se uma diferença significativa na concentração de metal detectada. Em espécies particulares, o tamanho dos animais e o tipo de tecido são fatores significantes para o acúmulo de metal, mas aparentemente o sexo dos animais não parece ter importância (Turoczy e col., 2001). Acumulação de cádmio em tecidos de crustáceos O cádmio, por não apresentar qualquer função fisiológica conhecida, pode acumular em tecidos de acordo com a concentração externa do metal, não sendo evidenciada qualquer regulação interna em animais, causando toxicidade inclusive em baixas concentrações (Playle e col.., 1993). Efeitos tóxicos podem ser encontrados com a acumulação do excesso do metal, tornando-se metabolicamente disponível e agindo na destruição de processos celulares (Harris e Santos, 2000). O acúmulo de mercúrio e zinco em alguns tecidos aumenta com o tamanho do caranguejo, sendo encontradas altas concentrações destes metais principalmente na carapaça. Altas concentrações de cobre, mercúrio e zinco são encontrados no tecido muscular, enquanto que altas concentrações de cádmio são encontradas no hepatopâncreas, indicando que o acúmulo do metal depende do tipo de dieta do animal (Turoczy e col., 2001). O que se sabe, atualmente, é sobre acúmulo do metal no hepatopâncreas de crustáceos. Este acúmulo se dá em maior quantidade quando comparado com as brânquias. Outros aspectos importantes devem ser citados, como é o caso de alterações na resposta imune de mexilhões resultante da exposição ao cádmio. Por ser moluscos bivalves, os mexilhões são organismos indicadores de poluição do ambiente, pois são filtradores, possuindo sistema circulatório aberto exposto às flutuações do ambiente e a fatores contaminantes. Seu sistema imune pode representar o estado de sua saúde, refletindo o grau de poluição a que está submetido. As células imunes, principalmente hemócitos, desempenham um papel principal na defesa do organismo. Os antígenos estimulam a migração de hemócitos, seguido pela fagocitose e degradação intracelular do patógeno por enzimas líticas ou pela produção de metabólitos reagentes ao oxigênio (Coles e col., 1995).
- 374. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 364 Julho/2010 Assim, com a exposição ao cádmio, o número de hemócitos circulantes aumenta. Isto leva a um aumento na produção de radicais superóxidos pelos hemócitos, que desempenha um importante papel na morte intra e extracelular de patógenos invasivos na célula. Este excesso de radicais superóxidos acarreta na intoxicação da própria célula (Coles e col ., 1995). Exceto o cádmio, com a permanência dos animais em ambientes poluídos, seus processos regulatórios são ajustados para conter os efeitos do metal e para manter a homeostase. Assim, alguns sistemas fisiológicos desenvolvem uma “resistência” à presença de metais tóxicos (Harris e Santos, 2000). Desse modo, peixes expostos a metais pesados podem apresentar suas brânquias danificadas e afetar as suas funções respiratórias e regulação iônica. Já em Oncorhynchus mykiss, longas aclimatações em ambientes com exposição ao cobre podem resultar na restauração da atividade da Na/K ATPase (Harris e Santos, 2000). A tabela a seguir retrata os tecidos que sofrem acumulação por metais e a ordem de crescimento deste acúmulo em diferentes caranguejos estudados previamente. Transporte de cádmio Poucos estudos foram realizados com as células do hepatopâncreas de crustáceos, por isso, assim como em células de brânquias, a interação do cádmio com as células ainda é pouco conhecida. Acredita-se que o contato com o metal se dá através da alimentação e da entrada de água. Vários estudos mostram que altas concentrações de cádmio podem ser letais para vários animais, principalmente crustáceos, possibilitando a ocorrência de efeitos fisiológicos adversos, especialmente na respiração e osmoregulação. Assim, as brânquias, como órgão responsável pela respiração, regulação ácido-base, regulação osmótica e iônica, ao entrar em contato com altas concentrações do metal, podem sofrer danos morfológicos resultando em deficiência respiratória e osmoregulatória. Estudos focam na retirada de cádmio do meio aquático e sua acumulação, mas pouco se sabe sobre seu transporte celular. As respostas tóxicas dos metais geralmente envolvem aspectos geoquímicos, pois a competição e a complexação desses metais pode interferir com a quantidade de metal livre disponível na água, afetando a biodisponibilidade para os animais expostos (Matsuo, e col., 2005).
- 375. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.365 Tabela 1: Resumo dos estudos realizados com diferentes concentrações de metais acumulados nos tecidos em caranguejos (modificado de Turoczy e col., 2001). Em crustáceos, a aparente retirada de metal ocorre através das brânquias. Silvestre e colaboradores (2004) estudaram no caranguejo Eriocheir sinensis o influxo de cádmio em brânquias perfundidas. Além disso, observa-se que o cálcio compete com o cádmio e o influxo deste último aumenta com a retirada de cálcio do meio externo, aumentando a toxicidade do cádmio. A retirada de sódio do meio parece inibir a entrada de cádmio em brânquias perfundidas de caranguejos (Silvestre e col.., 2004). Em anfípodas, o cádmio diminui o influxo de sódio. Isso sugere que o cádmio pode entrar nas células epiteliais por trocadores de cálcio, como o Na/Ca. Outro aspecto importante é que o cádmio poderia passar pelo epitélio através das difusões paracelulares, junções ou entradas transcelulares. Já no caranguejo Carcinus maenas em pós-muda, observou-se que o cádmio é retirado do meio via canais de cálcio localizados na membrana apical das brânquias (Bondgaard e Bjerregaard, 2005). Em peixes, cátions metálicos se acoplam às brânquias e determinam a toxicidade do metal (Matsuo, e col.., 2005). O cádmio causa alterações na homeostase do cálcio, envolvendo competições entre os dois íons pelo canal de entrada do cálcio, provavelmente contido nas células de cloreto das brânquias dos peixes (Matsuo, e col., 2005), além de
- 376. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 366 Julho/2010 interromper a homeostase de cálcio através da inibição de canais Ca-ATPase basolaterais nestas mesmas células (Matsuo, e col., 2005). Figura 2: Possível transporte de cádmio em células estriadas de crustáceos eurialinos. Em resumo, o cádmio parece entrar em células de crustáceos e peixes via canais para cálcio, trocadores Na/Ca e via Ca-ATPase, embora não haja estudos em nível celular para o transporte de cádmio utilizando-se de inibidores específicos para cada tipo de transportador. Interação do cádmio com a salinidade Vários estudos realizados com peixes e invertebrados marinhos demonstram um alto grau de variabilidade na entrada e acumulação de metais. Em crustáceos, as respostas metabólicas e fisiológicas à exposição de cádmio são altamente afetadas pelas condições dos animais experimentais e pelo estágio do ciclo da muda. No entanto, a acumulação e efeitos tóxicos do cádmio parecem aumentar em ambientes com baixas salinidades ou baixos níveis de cálcio. Isso se dá devido à competição entre o cádmio e cálcio por sítios de ligação, além das taxas de entrada e retorno de íons que aumenta em caranguejos expostos em meios diluídos (Zanders e Rojas, 1996). Acredita-se que o influxo de Cd é dependente da salinidade, porém há resultados contraditórios. Por exemplo, enquanto a acumulação de cádmio em tecidos e no exoesqueleto em Carcinus maenas se mostra inversamente relacionado com a salinidade
- 377. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.367 externa ou concentrações de cálcio, encontram-se caranguejos em localidades marinhas que apresentam alta acumulação de taxas do metal na hemolinfa em relação a aqueles situados em estuários (Zanders e Rojas, 1996). No entanto, muitos estudos mostraram que a acumulação e os efeitos tóxicos do cádmio aumentam em ambientes com baixas salinidades ou baixos níveis de cálcio (Zanders e Rojas, 1996). Quando há diminuição de salinidade, a quantidade de Cd livre no meio aumenta, tornando-o mais tóxico por não se complexar com íons de cloreto que ficam indisponíveis em baixa salinidade. Como o cádmio compete com o cálcio por sítios de associação, em baixas concentrações de cálcio há a maior entrada de cádmio, principalmente em animais que estão em meios diluídos. Estes metais, em geral, são fortes inibidores da anidrase carbônica, enzima responsável pelas trocas gasosas. A anidrase carbônica é uma enzima central nos processos integrativos de transporte iônico e osmorregulação em crustáceos eurialinos, e a inibição dessa enzima poderia potencialmente afetar a regulação de múltiplos íons de maneira indireta. A tabela abaixo demonstra concentrações de cádmio encontradas em diferentes salinidades, resultando no acúmulo do metal em órgãos em salinidades menores, comprovando a competição entre os íons cádmio, cálcio e sódio. Tabela 2: Concentração de cádmio em vários tecidos de caranguejos aclimatados em diferentes salinidades (125 ou 25) e expostos a diversas concentrações de cádmio (modificado de Zanders e Rojas, 1996).
- 378. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 368 Julho/2010 Interação do cádmio com órgãos de mamíferos Atualmente tem-se considerado o cádmio como um contaminante ambiental. O reconhecimento de propriedades metalúrgicas disponíveis para o Cd, como a resistência à corrosão, conduziram ao aumento da produção do metal após 1910 (Fasset, 1975). Exposição de trabalhadores à fumaça de óxidos foi reconhecida por ser a causa de agudas e, às vezes, fatais edemas pulmonares. A atenção foi voltada para doenças renais e enfisemas em trabalhadores expostos ao pó de óxido de cádmio por longos períodos em fábricas de baterias. Assim, físicos japoneses estudaram uma única doença que afetava mulheres idosas. A doença era caracterizada por osteomalacia, proteinúria e glicosúria em mulheres que viveram muito tempo em lugares contaminados. Concluiu-se que a doença teria sido causada por um grande aumento na exposição ao cádmio e possíveis outros metais contaminando a água e arroz, associados a baixas ingestões de cálcio, vitamina D, estresse da gravidez e lactação (Fasset, 1975). A doença foi denominada de Itai-Itai devido à severas dores nos ossos. Nesta época, estudos bioquímicos e toxicológicos mostraram que pequenas quantidades de cádmio absorvidas normalmente tendem a ser retidas por longos períodos, particularmente no rim. A descoberta de ligantes protéicos específicos no fígado e rim, e várias interações entre cádmio, zinco e cobre conduziram a um aumento no interesse da toxicologia do cádmio e de como este poderia desempenhar um papel importante na hipertensão (Fasset, 1975). Assim, muitas pesquisas envolvendo formações de complexos e ligantes foram desenvolvidas para se tentar entender a dinâmica do metal. Atualmente, os principais estudos envolvendo mamíferos foram feitos com ratos e camundongos. Seus efeitos foram encontrados nos rins, fígado e testículos. Em testículos, o cádmio pode ser transportado de forma oportunista para o interior de suas células endoteliais vasculares, resultando em um aumento da acumulação celular e toxicidade, e formação de células cancerosas (Dalton e col.., 2005). É conhecido que a necrose testicular induzida por cádmio é comum em várias espécies de animais como roedores, sapos, peixes, entre outros. Os eventos celulares que precedem a toxicidade testicular induzida por cádmio indicam que células endoteliais vasculares são danificadas primeiramente, causando, talvez, os eventos. Dados sugerem que o gene Cdm produz o ZIP8 responsável pelo transporte de íons como manganês e, talvez o zinco. Desse modo, o cádmio seria transportado de forma oportunista para o interior de células endoteliais vasculares do testículo resultando no aumento da acumulação e toxicidade do íon nas células (Dalton e col.., 2005). Nos rins, o cádmio pode ter uma possível relação com a hipertensão. Estudos feitos a partir de autopsias mostram uma grande taxa de acúmulo de cádmio, ou do complexo zinco/cádmio em pessoas com hipertensão (Fasset, 1975). Ratos e coelhos que foram tratados com cádmio também desenvolveram um quadro de hipertensão. Porém, esses
- 379. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.369 resultados não foram confirmados já que outras pesquisas evidenciaram que o cádmio poderia não participar da hipertensão, pois isto poderia estar relacionado com o fumo, a idade, o sexo e patologias renais (Fasset, 1975). Outro aspecto relacionado com a patologia renal é a proteinúria. Ela é considerada por ser o primeiro sinal de disfunção nos túbulos renais, quando níveis de cádmio acumulado no córtex renal alcançam taxas de 200 ppm (Fasset, 1975). Atualmente, o principais danos nos rins se dão nos túbulos renais associados com numerosos tumores em animais de laboratórios e humanos (Jeong, e col.., 2000). O fígado é um dos principais órgãos alvos da toxicidade do cádmio. Os danos causados no fígado através da exposição aguda ao cádmio são caracterizados por apoptose e necrose. Os danos morfológicos refletem nos altos níveis de enzimas serosas do fígado como: alanina aminotransferase (ALT) aspartato aminotransferase (AST) e sorbitol dehidrogenase (SDH). Já os efeitos crônicos da toxicidade por cádmio manifestam primeiramente como inflamações granulomatoses, proliferação celular, hiperplasia nodular e apoptose (Jeong, e col.., 2000). No fígado, assim, o cádmio pode induzir uma disfunção na homeostase tecidual, ou seja, uma modificação na proliferação e morte celular. Isso indica que as junções gap são alteradas ou inibidas pelo acúmulo de cádmio. As junções gap são comunicações intercelulares que regulam a homeostase celular através da passagem de moléculas solúveis em água de baixo peso molecular. Elas consistem na reunião de proteínas conhecidas como conexinas, sendo importantes na regulação da proliferação celular, diferenciação e morte, desenvolvimento embriônico e carcinogênese (Jeong, e col.., 2000). Assim, o cádmio induz a morte celular (apoptose e necrose) e a proliferação celular (regeneração celular) através da exposição aguda. A exposição crônica de cádmio também induz a morte celular (apoptose) e a proliferação celular (regeneração celular e hiperplasia nodular). O rompimento da homeostase do tecido pelo cádmio sugere que as junções gap são alteradas pelo cádmio (Jeong e col.., 2000). Essa alteração ou até mesmo inibição das junções gap pode acarretar o desenvolvimento de tumores. Além disso, o cádmio pode causar o rompimento da actina do citoesqueleto, que forma a rede de microfilamentos das células e são altamente associadas com as junções gap. Isto resulta na mudança estrutural das junções intercelulares, destruição das junções ou até mesmo na sua internalização (Jeong e col., 2000).
- 380. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 370 Julho/2010
- 381. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.371 Transporte de Metais Essenciais em Organismos Aquáticos: o cobre e o zinco Marina Granado Laboratório de Fisiologia Comparada de Crustáceos marinagranado@usp.br Introdução Durante a evolução, organismos aquáticos e terrestres desenvolveram diversas estratégias para manutenção do equilíbrio das relações de íons de metais presentes e viáveis no meio ambiente. As células selecionam íons necessários para o desenvolvimento e excluem aqueles que não o são e posteriormente mantém a concentração interna dos íons em situação ótima (Perales-Vela e col., 2006). Metais são tomados e acumulados por organismos aquáticos, tanto através do meio em que vivem, quanto através da dieta. Muitos metais traço atuam como metais essenciais no metabolismo, mas todos eles possuem potencial para causar efeitos ecotoxicológicos (Rainbow, 2000). Foi concluído que metais traço dissolvidos podem também ser tomados de acordo com o habitat e por último, depende do grau de adaptação de animais aquáticos à água salgada, salobra ou doce (Rainbow, 2000). Metais traço acumulados requerem detoxificação fisiológica, tipicamente pela ligação com grânulos inorgânicos de alta afinidade, frequentemente com base fosfato, ou por ligação com uma proteína detoxificadora, como metalotioneína ou ferritina (Rainbow, 2000). Nas águas não poluidas, os animais obtêm muito do cobre necessário pela absorção através da alimentação e consequentemente a tomada de cobre pelas brânquias é a de menor contribuição para o total de cobre presente no organismo como um todo (Campbell e col., 1999). No entanto, a situação é muito diferente em águas poluídas com cobre, onde as brânquias de truta arco íris podem apresentar aumento de 10% no acúmulo de cobre em intervalo de poucas horas de exposição e simultaneamente há registro de aumento da concentração de cobre no sangue destes animais (Campbell e col., 1999). Metais traço, incluindo os definidos como metais pesados, oriundos da atividade industrial e mineira são descartados nas águas costeiras e estuarinas em diversos locais. Os derivados descartados antropogenicamente podem acumular em sedimentos locais (até 5 vezes mais do que na água) e os invertebrados que habitam tais sedimentos estão potencialmente expostos às altas concentrações de metais (Harris e Santos, 2000). Metais de transição (Cu, Zn, Fe, Co, Se, Mn) são essenciais para a saúde da maioria dos organismos, formando componentes integrantes de proteínas envolvidas em todos os aspectos das funções biológicas. Sua ubiqüidade é “governada” por suas habilidades de formar uma gama grande de coordenadas geométricas e estados de redox, que permitem a
- 382. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 372 Julho/2010 esses elementos a interação com muitas entidades celulares, atuando ambiguamente na respiração celular, transporte de oxigênio, estabilidade protéica, “limpeza” de radicais livres, e ação de diversas enzimas celulares, bem como transcrição de DNA (Bury e col., 2003). A superfície dos crustáceos é coberta por uma cutícula secretada pelas células do epitélio exterior. Pequenos crustáceos são tipicamente permeáveis como um todo, enquanto que grandes malacostracas podem restringir a permeabilidade para regiões selecionadas, como as brânquias. A cutícula impermeável atua como um local para absorção passiva de metais pesados para o corpo do crustáceo e não serão considerados neste texto (Rainbow, 2000). Abaixo da cutícula, a membrana celular do epitélio consiste numa barreira para entrada de metais, como funciona para entrada de químicos para qualquer célula, protegendo os caminhos bioquímicos do organismo dos químicos provenientes do ambiente (Rainbow, 2000). Hepatopâncreas O hepatopâncreas está envolvido numa variedade de processos fisiológicos que incluem secreção de suco digestivo, absorção e estoque de alimento como tambem detoxificação e estoque de metais pesados. Possui ainda a capacidade de concentrar metais oriundos da hemolinfa e do trato digestório e estocá-los em vacúolos intracelulares das células F e R e este é o maior órgão de detoxificação ao lado da glândula antenal, que é análoga aos rins (Alcorlo e col., 2006). Figura 1 - Vista ventral de um crustáceo, onde é visualizado estômago, hepatopâncreas, músculo e intestino. http://resweb.llu.edu/sdunbar/students/epidermis_removed.jpg (04/05/2010). Brânquias
- 383. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.373 As brânquias representam um órgão vital para organismos aquáticos com função indispensável no transporte iônico. Os prejuízos estruturais ocorridos devido à presença de cobre inclui a “demolição” das estruturas celulares e anormalidades das barreiras de absorção e transporte. Dessa maneira, essas alterações afetam a fisiologia do animal, como as trocas de oxigênio e íons nas brânquias. O epitélio branquial é basicamente uma camada única de células e a habilidade adaptativa para se “recuperar” dos danos causados pelos metais pesados é restrita (Yang e col., 2007). Para muitos animais aquáticos, as brânquias são um órgão muito importante para a manutenção da vida. Em animais marinhos, as brânquias são cruciais para respiração, excreção, balanço acido-base e regulação iônica e osmótica (Wu e Chen, 2004). Sendo a primeira proteção nos animais aquáticos, as brânquias são imediatamente expostas ao ambiente externo e consiste no primeiro órgão exposto aos poluentes quando a água está contaminada (Wu e Chen,2004). Figura 1: Brânquias de um peixe retiradas por completo. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bc/Tuna_Gills_cut_out.jpg/250px- Tuna_Gills_cut_out.jpg (04/05/2010). Membrana celular A membrana celular é uma bicamada de lipídeos, com grupos hidrofóbicos direcionados para o lado interno e grupo hidrofílico para o lado externo da camada. A membrana celular também contem diversas proteínas e estas são essenciais para passagem através da membrana de moléculas hidrofóbicas e íons, incluindo metais traço (Rainbow, 2000).
- 384. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 374 Julho/2010 Figura 2: Desenho esquemático de um filamento branquial de crustáceo. Modificado de: Freire e col., 2008. Várias possibilidades de rotas têm sido propostas para o transporte de metais traço através da membrana citoplasmática. São 4 rotas principais: (a) transporte mediado por carreadores onde o metal se liga à membrana que possui uma proteína e é transportado através da membrana. Já no citosol, o metal se liga a uma proteína e é carreado cineticamente; (b) transporte através de canais de proteínas onde os íons de metal são transportados por gradientes hidrofílicos; (c) difusão passiva do metal lipossolúvel (não polar) através da bicamada lipídica; (d) endocitose, onde há o engolfamento de partículas e sua transferência para vesículas intracelulares. Essas duas últimas rotas são provavelmente de menor importância para a tomada típica de metais pesados da solução (Rainbow, 2000). Fora da membrana apical, o ion metal precisa ser apropriado quimicamente para entrar pelo canal da membrana ou ligado em proteínas da membrana. Geralmente são considerados biodisponíveis quando estão na forma livre e na forma hidratada. Não entendi bem aqui! Diversos estudos com tecido epitelial indicaram que a membrana plasmática, mitocondrial e lisossomal possuem proteínas que atuam no transporte de cálcio e de metais pesados como zinco, cádmio e cobre, tanto quanto atuam no transporte de cálcio. Desse modo existem mecanismos regulatórios da atividade intracelular que pode ser interrompida ou até mesmo abolida na presença de concentração significativa de metais pesados (Mandal e col., 2005).
- 385. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.375 Figura 4: Esquema da membrana celular, demonstrando o glicocálice, proteínas transmembranas, lados hidrofílico e hidrofóbico. (http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/La_celula/imagenes/membrana_pl asmatica_bort.gif) (04/05/10) Cobre A natureza redox do cobre é utilizada em um grande número de processos enzimáticos, incluindo a catalização pelo citocromo c mitocondrial, o qual faz do cobre um elemento essencial para as células aeróbicas dos organismos. No entanto, as propriedades redox do cobre podem causar rapidamente a geração de oxigênio reativo quando os níveis celulares de cobre são elevados (Grosell e Wood,2002). O cobre é um dos nutrientes essenciais necessários para a síntese de hemocianina nos crustáceos. O cobre é requerido para funções biológicas normais de diversas proteínas, incluindo muitas das enzimas necessárias para o crescimento e desenvolvimento. No entanto, o excesso de cobre é toxico e causa efeitos biológicos adversos em níveis molecular, celular e tecidual (Yang e col., 2007). A tomada de cobre pelas brânquias envolve diversas etapas: (a) ligação inicial do cobre com a superfície branquial; (b) movimento do cobre através da membrana apical e entrada nas células branquiais; (c) “trafego” intracelular de cobre para a membrana basolateral; (d) movimentação do cobre vindo das células para o sangue (Campbell e col., 1999). Em sistemas de mamíferos o cobre é transportado por subfamílias P-ATPases e a Cu- ATPase tem uma sequência de ligantes de metal que é análoga entre bactérias e seres humanos, implicando desse modo que seja a mesma sequência conservada para os peixes
- 386. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 376 Julho/2010 (Campbell e col., 1999). A completa inibição da tomada de cobre pela aplicação de 50umol/L de vanadato sugere que P-ATPase, localizada basolateralmente é a principal responsável pela tomada de cobre da água (Campbell e col., 1999). Enquanto que o requerimento de cobre em peixes é claramente obtido pela dieta através da ingestão, a homeostase de cobre nas brânquias tem sido observado até recentemente. No entanto, estudos toxicológicos mostram que elevadas concentrações de cobre na água pode levar ao aumento de cobre, particularmente nas brânquias e no fígado, sugerindo que as brânquias possam servir como rota de tomada de cobre (Grosell e Wood,2002). Kamunde (2001 e 2002) demonstrou duas rotas diferentes para tomada de cobre pelas brânquias: (a) na base da competição da tomada de cobre pela baixa concentração de sódio no ambiente e a sensibilidade da proporção da tomada de cobre por bafilomicina A1, um dos caminhos de tomada, aparenta ser através de canal apical de sódio, sendo sensível ao sódio; (b) segunda pela tomada continua de cobre , uma vez que na presença de altas concentrações de sódio no ambiente (1-20mmol/L), sendo insensível ao sódio (Grosell e Wood,2002). Dependendo da concentração de sódio no ambiente, a tomada de cobre através da rota sensível ao sódio é de 2 a 5 vezes maior que através da rota insensível ao sódio. Isso sugere que a rota sensível ao sódio pode ser modulada pelo status interno de sódio, em adição aos níveis aquáticos de sódio (Grosell e Wood,2002). O sódio claramente inibe a tomada de cobre e o inverso também é verdadeiro e uma resposta similar foi descrita para o zinco (Grosell e Wood,2002). Mudanças na salinidade não só causam alterações físico-químicas no meio como também pode haver efeito na fisiologia do crustáceo (Rainbow, 2000). No caso do crustáceo estuarino ser exposto à baixa salinidade, os fluidos corpóreos são hiperosmóticos em relação ao meio, então a água entra osmoticamente (Rainbow, 2000). O crustáceo responde tipicamente ao aumento da entrada osmótica de água pelo aumento da produção urinária e a urina é isotônica em relação à hemolinfa, e desse modo, o aumento da excreção de água é associado com a concomitante perda de íons como sódio e cloreto na urina (Rainbow, 2000). Desse modo, uma redução na salinidade poderá causar aumento da tomada de cálcio, posteriormente potencializando a entrada de metais, como cobre e zinco via rotas de tomada de cálcio. Esse tipo de tomada esta potencialmente sob controle fisiológico (Rainbow, 2000). Alguns crustáceos podem ainda alterar a permeabilidade em resposta à baixa salinidade, e talvez assim fazer mudanças nas proporções da tomada de metais (Rainbow, 2000).
- 387. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.377 Essa regulação da tomada de cobre é aparentemente mediada por um ou mais carreadores de cobre específicos, em contraste à tomada que ocorre pelo canal apical de sódio primariamente envolvido na manutenção da homeostase de sódio (Grosell e Wood,2002). Um mecanismo similar do transporte de cobre através da membrana basolateral pode estar envolvida na regulação da tomada de cobre (vanadato Cu-ATPase) (Grosell e Wood,2002). Geralmente, a concentração de metalotioneína em organismos aquáticos é baixa. No entanto, a síntese pode ser aumentada quando animais estão expostos à altas concentrações de metais. Então, as metalotioneínas atuam na detoxificação de metal, seqüestro e regulação (Yang e col., 2007). É conhecido que a exposição de crustáceos às águas poluídas resulta em prejuizos branquiais que pode resultar em danos para a função respiratória. Como as brânquias de crustáceos também estão envolvidas na osmorregulação e ionorregulação, é possível que os danos branquiais resultem em prejuízos para a osmorregulação (Spicer e col., 1998). Zinco O zinco é homeostaticamente regulado, talvez em um nível mais preciso do que o cobre. Os mecanismos de regulação do zinco são aparentemente diferentes, como acúmulo interno negligenciável, o que reflete a redução da tomada branquial de zinco identificado como parte importante do mecanismo de aclimatação (McGerr e col., 2000). Por ser um micronutriente importante para os organismos aquáticos incluindo os peixes, mas pode ser tóxico por interferir na tomada de cálcio e no seu metabolismo quando o zinco estiver em concentrações que excedam o normal (Rodriguez e col., 2007). O transporte de zinco e cálcio através das brânquias ocorre através de uma competição simples e há correlação evidente de que as células cloreto participam da tomada de zinco. Ainda é desconhecido onde esta competição ocorre: nos canais apicais, ATPase basolateral ou em ambos (Wood,1992). De todas as concentrações testadas de metais essenciais, cobre e zinco produzem hipercalcemia. De acordo com o tempo de exposição, em todos os casos, a glicemia atingiu pico após 3 horas do inicio da exposição, retornando ao normal após 8 horas na maioria dos casos (Rodriguez e col., 2007). Em peixes, o zinco pode ser assimilado através da fase aquosa ou da dieta. Para a fase aquosa do zinco, as brânquias e o intestino são os melhores “pontos” de absorção (Zhang e Wang,2005). Estudos anteriores mostram que a tomada de zinco através da dieta é a rota predominante de acúmulo do metal oriundo do ambiente em peixes marinhos (Zhang e Wang,2005). Em ambientes poluídos, os peixes são continuadamente expostos ao ambiente rico em zinco, tanto pela água quanto pela dieta. Diversos estudos recentes em truta cor de arco íris
- 388. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 378 Julho/2010 tem indicado que as mudanças nas tomadas de metal e nos processos fisiológicos ocorrem após exposição ao zinco (Zhang e Wang,2005). O metabolismo de zinco nas lagostas e no siri azul são similares e aparentam ser regulados, mas se as lagostas forem alimentadas com altas concentrações de zinco através das ostras, poderão acumular quantidades significativas de zinco e este será retido com o passar do tempo. O zinco também é abundante nos sedimentos, onde as lagostas utilizam como habitat (Engel e col., 2001). Embora em algumas espécies possam ocorrer altas concentrações de metal e ainda manter continuo e funcional o processo fisiológico pode ocorrer uma alteração nos processos de excreção e formas de detoxificação (Harris e Santos, 2000). A Na/K-ATPase branquial demonstra a redução sugerida da exposição aguda ao cobre em Carcinus maenas e esta redução é acompanhada por uma severa depleção do sódio na hemolinfa (Harris e Santos, 2000). A água contaminada com cobre e zinco também interfere na função respiratória das brânquias dos crustáceos, resultando na redução da transferência de gases e na sua eficiência, e assim na diminuição da performance respiratória. Foi observado também a redução do consumo de oxigênio e performance cardíaca. É nítido que animais que habitam áreas cronicamente poluídas fazem ajustes em seus processos regulatórios para contra-atacar esses efeitos dos metais e assim manter a homeostase (Harris e Santos, 2000). Existe um custo fisiológico para reestabelecer as condições normais, incluindo reparação dos danos celulares, aumento da quantidade de células para repor células efetoras e para que haja processo de detoxificação. Tudo isso gera custo substancial e essencial para a sobrevivência do animal. Já a longo prazo, mudanças compensatórias, incluindo controle do fluxo metabólico, indução da supressão de enzimas e seleção natural das enzimas variantes, consistem num processo de competição entre as espécies para que haja continuidade na reprodução e desenvolvimento no ambiente contaminado (Harris e Santos, 2000). A alta disponibilidade de comida proveniente de esgoto pode ser uma razão para a presença de espécies bênticas (tais como moluscos e lagostas) e presença de peixes nos sedimentos. Estes organismos podem “captar” metais do sedimento onde habitam e da dieta que consomem (Perales-Vela e col., 2006). A lagosta, por exemplo, é uma espécie que apresenta diversos caminhos/rotas para bioacumulação de metais e outros poluentes, absorvendo pela superfície branquial, ingestão de água e sedimentos e o consumo de organismos já com acúmulo de metais (Morales- Hernandéz e col., 2004).
- 389. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.379 Alsop e Wood (1999) demonstraram que o cálcio presente na água reduz a tomada de zinco (em 3 horas) e isso também foi demonstrado por Barrom e Albeke (2000) em trutas (Niyogi e Wood, 2006). É razoável assumir que o aumento do influxo de zinco branquial ocorra devido ao aumento do influxo do cálcio, desde que utilizem a mesma via de tomada (Niyogi e Wood, 2006). Na membrana basolateral, o zinco não aparenta ser transportados pela Ca-ATPase porque a inibição é tanto competitiva quanto não competitiva e o zinco também não é transportado por mecanismos dependentes de sódio (Marshall, 2002). Além disso, é comum encontrar altos níveis de metais no exoesqueleto, mas tem sido postulado que este fato é principalmente relacionado mais com adsorção do que bioacúmulo (Alcorlo e col., 2006). A tomada em nível da membrana celular é governada por um transportador específico, transporte por canais de proteínas, difusão passiva de metais lipossolúveis e endocitose (Alcorlo e col., 2006). Cálcio em interação com os metais cobre e zinco Há evidências de que a concentração de cálcio afeta a tomada de cobre e zinco no caranguejo Carcinus maenas, independentemente do efeito da salinidade e a tomada de cobre e zinco pelo anfípoda Gammarus pulex é ao menos parcialmente explicado pela tomada do metal via rota de cálcio. Mas por outro lado, a tomada de zinco pelo decápoda Palaemon elegans não aparenta ser seguido por nenhuma rota de outros íons, respondendo a mudanças na osmolalidade do meio (Rainbow, 2000). Elevações do nível de cálcio na água geralmente protegem contra metais, gerando inibição ou redução da entrada de metais como cobre e zinco nos peixes (Wood,1992).Há ainda uma resposta fisiológica adicional nos crustáceos que podem afetar a tomada de metais traço, a permeabilidade intertegumental que diminui conforme o gradiente de salinidade vai do ambiente marinho para o estuarino e para água doce e a tomada do metal acompanha este “decaimento” (Rainbow, 2000). Em organismos expostos a metais pesados, a metalotioneína, uma proteína de ligação rica em cisteina que tem além de tudo propriedade detoxificante e pode ser sintetizada quando se torna necessário, ou seja, quando os níveis de metal estão muito altos. A metalotioneína tem como proposta ser usada como biomarcador para o estudo da evolução da poluição por metais pesados (Yang e col., 2007). Resultados indicam que a exposição ao ambiente aquático rico em cobre leva à mudanças nas microestruturas das brânquias e do hepatopâncreas de Eriocheir sinensis em termos de dose resposta (Yang e col., 2007).
- 390. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 380 Julho/2010
- 391. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.381 Efeitos da toxicidade de metais no metabolismo de organismos aquáticos Vanessa Ap.Rocha Oliveira Vieira Lab. de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos vroliveira@usp.br A fisiologia comparativa está intimamente relacionada à biologia da conservação, sendo assim, a fisiologia da conservação é definida como o estudo de respostas fisiológicas de organismos, frente a alterações antrópicas no meio ambiente, que possam causar ou contribuir para um declínio populacional. Neste estudo está incluído o organismo e suas interações com o meio ambiente tais como: metabolismo, relações térmicas, nutrição, respostas endócrinas às mudanças ambientais e alterações em padrões imunes, sendo que, estes parâmetros podem ser utilizados como biomarcadores, indicando que muitas substâncias tóxicas podem interagir com o organismo como um todo (Wikelski e Cooke, 2006). A influência humana nos sistemas naturais tem aumentado continuamente, justificando a importância de investigar os aspectos antrópicos que causam estresse em animais em seus sistemas naturais. No ambiente aquático, as ações antrópicas são muito evidentes, levando os organismos muitas vezes a ficarem expostos a efeitos subletais que provocam consequências imprevisíveis como alterações nas funções celulares, metabólicas e/ou bioquímicas (Araújo, 1998). As águas continentais encontram-se contaminadas por uma grande variedade de poluentes cujas fontes principais são os efluentes líquidos de origem doméstica e industrial. A diversidade e complexidade destes poluentes resultam em diversos efeitos biológicos e estes efeitos estão relacionados com a composição química de cada poluente despejado no ambiente aquático, dentre estes estão os poluentes das classes dos metais e considerando que há mais de um contaminante presente nas águas pode haver interação entre eles com possíveis efeitos sinergéticos, antagônicos, de potenciação ou adição (Zagatto e Bertoletti, 2006; Mozeto e Zagatto, 2006). O monitoramento e a avaliação do risco dos ambientes impactados não podem ser baseados exclusivamente em análises químicas de amostras ambientais, pois dados como estes não refletem os efeitos reais causados a biota (Barsiene e col. 2006,), sendo assim para avaliar os impactos dos poluentes na qualidade ambiental é fundamental que se avalie os efeitos que estas substâncias causam nos organismos vivos destes ecossistemas (Wells e col. 2001). Os estudos em ecotoxicologia vêm se baseando nas avaliações de riscos ambientais ou ERA (Ecological or environmental risk assessment) causados por poluentes a fim de definir os efeitos adversos sobre os ecossistemas utilizando metodologias científicas
- 392. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 382 Julho/2010 (Depledge e Fossi, 1994), porém os efeitos deletérios sobre as populações, muitas vezes, são difíceis de detectar dado que muitos desses efeitos tendem a se manifestar apenas após longos períodos de tempo e quando finalmente tornar-se claro, o efeito pode ter ido além do ponto onde possa ser revertido através de ações de correção ou redução dos riscos (Oost e col., 2003). Neste capítulo veremos alguns dos metais que se tornam tóxicos quando em excesso e os efeitos dessa toxicidade observados em alguns grupos de animais aquáticos. Metais Os metais, normalmente, estão presentes em baixa concentrações nos ambientes aquáticos (Ash e Stone, 2003), no litoral e rios próximos a centros urbanos, os metais podem ser encontrados em concentrações muito mais elevadas, provavelmente devido à entrada de sistemas fluviais (Morillo e col., 2004) e à poluição, associada a efluentes líquidos de origem doméstica e industrial que muitas vezes não recebem o tratamento adequado. (Chen e col., 2005; Wannaz e col., 2006). Alguns metais, em baixas concentrações, são importantes no metabolismo, participando de processos fisiológicos, são os chamados metais essenciais, e são frequentemente transportados ativamente através das membranas (Tamás e Wysocki 2001, Van Ho e col., 2002) mas, em elevadas concentrações podem se tornar tóxicos. Nessa classe destacam-se os metais ferro (Fe), zinco (Zn), cobre (Cu) e manganês (Mn), por outro lado, existem metais como chumbo (Pb), cádmio (Cd) e mercúrio (Hg), que não são essenciais aos organismos e podem alterar o estado fisiológico, além disso, muitos fatores afetam os efeitos dos metais pesados, tais como sua forma química, via de entrada no organismo, duração da exposição, idade e espécie do animal (Kostial e col., 1978; Madsen- Moller, 1991) Metais essenciais : sua importância no organismo Cobre O cobre é um metal de transição, considerado micronutriente essencial. Órgãos como fígado, cérebro e coração contêm quantidades consideráveis de cobre (Watanabe e col., 1997), ele é um fator requerido para a função celular (Karan e col., 1998; McGeer e col., 2000) atuando como cofator enzimático em vários processos biológicos, além de estar envolvido no processo de transferência de elétrons na cadeia respiratória (Watanabe e col., 1997, Camakaris e col., 1999; Celik e Oehlenschager, 2004) em reações redox em enzimas tais como citocromo, oxidase e superóxido dismutase (Watanabe e col., 1997, Camakaris e col., 1999). Apesar disso, em altas concentrações pode vir a ser prejudicial ao organismo.
- 393. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.383 Mangânes O manganês, em seu estado divalente, tem papel fundamental em vários processos biológicos como no metabolismo de aminoácidos, lipídios, proteínas e carboidratos, além disso, há muitas enzimas que são manganês-dependente incluindo as oxidoredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Alguns autores citam a participação deste metal na função das metaloenzimas como arginase, glutamina sintetase, fosfoenolpiruvato, descarboxilase e manganês superóxido desmutase. Além desta importante função como co-fator enzimático o manganês também está envolvido na função do sistema imune, regulação de glicose no sangue e energia celular, reprodução, digestão e mecanismos de defesa contra radicais livres (Keen e col.,1999; Freeland-Graves e Llanes,1994). Após ser transportado nas células e oxidado intracelularmente por reação com superóxidos a um estado trivalente, este metal mostra-se altamente tóxico principalmente ao sistema nervoso (Archibald e Tyree, 1987). Zinco O zinco participa do metabolismo de ácidos nucléicos, replicação celular e do reparo e crescimento dos tecidos (Murakami e Hirano, 2008). Em baixas concentrações são importantes no processo de neurotransmissão e ainda participam da estrutura de receptores excitatórios de glutamato, no entanto são tóxicos quando em altas concentrações (Smart, 2004). Ferro O ferro faz parte de muitos processos enzimáticos de óxido-redução, dos citocromos, catalases e peroxidades, age também como transportador de oxigênio na hemoglobina (Maham e Arlin, 1995), no entanto, seu excesso pode ocasionar aumento na produção de radicais livres (Schuartsman, 1985). Metais não essenciais Alumínio O alumínio é um metal não essencial e muito tóxico ao organismo, apesar de ser um dos mais abundantes na crosta terrestre, as concentrações deste metal em águas doces são notavelmente baixas. O alumínio não é muito solúvel em água, mas em associação com outros compostos como, por exemplo, F- , OH- , SO- , PO- , H, Si, O, pode acarretar na sua solubilização e capacidade de se ligar a diversas macromoléculas (Lydersen, 1990; Lydersen, 1990a). Segundo Teien (2006) o pH tem um forte controle na especiação de
- 394. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 384 Julho/2010 metais podendo determinar a hidrólise, agregação, precipitação e competição de prótons por locais de ligação disponível (Smith, 1996). A porta de entrada destes compostos nos peixes é através das brânquias, pois os fosfolipídios e as glicoproteínas conferem à membrana externa das brânquias sítios de carga negativa (Wold e Selset, 1977), e o alumínio na forma de hidróxido, torna-se rico em cargas positivas, penetrando facilmente pela superfície branquial (Shi e Haug, 1980; Wilkinson e Campbell, 1993). Cádmio O cádmio é um metal não essencial e geralmente tóxico para os organismos, este metal afeta a estrutura de ácidos nucléicos e atividade de muitas enzimas e neurotransmissores (Cooper e Manalis, 1984). Chumbo As concentrações de chumbo geralmente são baixas em águas continentais, este metal se acumula nos rins, fígado e cérebro e geralmente seu grau de toxicidade varia com o tempo de exposição a que o organismo é submetido (Bastos e Nefussi, 1986). Mercúrio O mercúrio é um dos metais mais tóxicos aos seres vivos, pode ser encontrado em três formas: elementar, inorgânico e orgânico, cada uma com seu grau de toxicidade (Guzzi e La Porta, 2008). A forma inorgânica é a fonte mais significativa de contaminação aquática e seus efeitos estão diretamente relacionados a respostas adversas do sistema nervoso central (Senger e col., 2006). Mecanismos de toxicidade e avaliação Os produtos químicos hidrofóbicos podem acumular-se nos organismos aquáticos através de diferentes mecanismos: via captação direta da água através da pele ou brânquias, via captação de partículas em suspensão (ingestão) e através do consumo de alimentos contaminados. A Transferência de metais pesados através das membranas tem sido estudada em vários tipos celulares. Apesar de muitas semelhanças, os mecanismos envolvidos freqüentemente apresentam propriedades características de cada célula e devido à sua elevada afinidade por proteínas e muitas outras moléculas biológicas, os metais pesados não existem no sistemas biológicos na forma livre ou desvinculado (Bevan e Foulkes, 1989) A absorção intestinal e pulmonar são as principais rotas de entrada de metal no organismo. No intestino a absorção envolve células apicais e basolaterais das membranas
- 395. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.385 celulares, e o transporte do lúmen se deve a afinidade por proteínas de ligação de metais, as metalotioneínas (Foulkes e McMullen, 1987). Além disso, essa interação é sensível a temperatura devido a fluidez de membrana (Foulkes, 1988). Já no epitélio alveolar o contato com metais é acompanhado por efeitos potencialmente negativos, especialmente porque a absorção do metal através do epitélio alveolar é muito mais eficiente do que através da parede intestinal (Friberg e col., 1985), uma possível explicação é que no epitélio alveolar a dinâmica de movimentação de metais pela membrana é maior nos fluidos intestinais devido às menores concentrações de ligantes metal-obrigatório. Os túbulos renais também podem ser uma porta de entrada para os metais, assim como no intestino, células tanto apical quanto basolateral da membrana participam da absorção. Os metais circulantes no plasma são filtrados e reabsorvidos por metalotioneínas. Alternativamente a este processo, os metais podem se ligar a pequenas moléculas como cisteína, glutationa e bicarbonato (Foulkes, 1978). Blazka and Shaikh (1991) demonstraram que nos hepatócitos os metais entram na célula via canais de cálcio, a interação entre Cádmio e cálcio foi descrita por Souza e col.. (1997) onde descreveram que Cádmio inibe a entrada de Cálcio na célula. A maior parte de chumbo e cádmio circula no sangue carreado por eritrócitos, estas células acumulam eficientemente estes metais. As membranas dos eritrócitos diferem das membranas de outras células por sua permeabilidade a anions, a entrada de vários metais, tais como, Cd, Pb, Zn, e Cu é facilitada por formar complexos aniônicos com carbonato, bicarnonato, grupos hidroxil e íons de cloro (Simons, 1986). Mesmo sem a detecção aguda ou crônica dos efeitos, os testes de ecotoxicidade de acumulação do poluente, devem ser considerados como um critério de risco em si, uma vez que alguns efeitos só podem ser reconhecidos em uma fase mais tardia. Os biomarcadores de exposição irão refletir a distribuição da substância química em todo o organismo e essa distribuição pode ser rastreada através de vários níveis biológicos, desde molecular ao ecossistema como um todo (Who, 1993). Um biomarcador pode ser definido como uma resposta biológica, o que pode estar relacionado com exposição ou efeitos tóxicos de substâncias químicas ambientais e podem ser usados para avaliar os sinais do organismo como um alerta dos riscos ambientais (Peakall e col., 1994).
- 396. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 386 Julho/2010 Principais marcadores biológicos ou Biomarcadores Estresse oxidativo Muitos poluentes exercem toxicidade promovendo o estresse oxidativo, este pode ser definido pela toxicidade gerada pelo oxigênio molecular através das espécies reativas de oxigênio (ROS) referindo-se a produtos intermediários do oxigênio (ROIs) ou ainda radicais livres ou oxiradicais (Di Giulio e col., 1989a). Os produtos da redução do O2 molecular são o radical superóxido (O2 - ), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH- ). São potentes oxidantes capazes de reagir com macromoléculas celulares, possivelmente levando a inativação enzimática, peroxidação lipídica (LPO), danos ao DNA e, finalmente, a morte celular (Winston e Di Giulio, 1991). As atividades das enzimas antioxidantes, que inibem a formação dos oxiradicais como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase glutationa-dependente (GPOX) e glutationa redutase (GRED) defendem os organismos contra ROS e são criticamente importantes na desintoxicação. Numerosos antioxidantes de baixo peso molecular como a glutationa reduzida (GSH), betacaroteno, vitamina B, ácido ascórbico (vitamina C), alfatocopherol (Vitamina E) e ubiquinol10 também tem sido descrito com função de desintoxicação (Stegeman e col., 1992; Lopez-Torres e col., 1993). Em ecossistemas aquáticos o oxigênio dissolvido e a temperatura são variáveis ambientais que influenciam os processos oxidativos (Parihar e col., 1997). Proteínas de estresse e Metalotioneínas As proteínas de estresse (também chamadas de proteínas de choque térmico ou HSP) constituem um conjunto de proteínas abundantes envolvidas na proteção e reparação da célula contra o estresse e condições prejudiciais como baixas e altas temperaturas, luz ultravioleta, condições oxidativas, anóxia, metais e xenobióticos (Sanders, 1993). São compostas por dois grandes grupos: as HSPs e as GRP (proteínas reguladoras de glicose), que são altamente sintetizadas quando o organismo é submetido a estresse físico e químico e na privação de glicose e oxigênio respectivamente (Stegeman e col., 1992). Um grupo especial de proteínas de estresse de baixo peso molecular, rico em cisteína, são as metalotioneínas (MTs), que funcionam na regulação de metais essenciais como Cu e Zn e na desintoxicação destes e outros metais não essenciais como Cd e Hg (Roesijadi e Robinson, 1994). A indução da síntese de MT é dependente da espécie em questão, pode ocorrer por aumento da concentração intracelular de metal (Thiele, 1992), e alguns estudos mostram que glicocorticóides e hormônios peptídicos também promovem sua indução (Gerpe e col., 2000)
- 397. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.387 Peroxidação de lipídios Os fosfolipídios de membrana de organismos aeróbios estão continuamente sujeitos a oxidação por fontes tanto endógenas quanto exógenas, mas a própria célula contém mecanismos antioxidantes para prevenção da peroxidação e uma variedade de mecanismos que mantém a integridade da membrana e a homeostase (Vigo-Pelfrey, 1990; Dix e Aikens,1993). O processo de peroxidação é uma reação em cadeia especialmente para os ácidos graxos polinsaturados que são mais sensíveis a ação de ROS devido à dupla ligação de carbonos. Membranas peroxidadas tornam-se rígidas e perdem a permeabilidade e os produtos resultantes podem provocar mutações no DNA e alterações nos padrões de expressão gênica (Marnett, 1999) e os efeitos acumulativos deste processo podem implicar em numerosas condições patológicas (Steinberg, 1997). O processo é iniciado principalmente por radicais hidroxil, especialmente reações catalisadas por metais de transição. Os metais, como os sais de ferro, na presença de peróxido de hidrogênio pode produzir HO (Schaich, 1992): Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO- + HO . Metais e seus complexos implicam na peroxidação de lipídios e subsequentemente na promoção da carcinogênese. (Sole e col., 1990; Kasprzak, 1995). Outros potenciais marcadores biológicos Parâmetros hematológicos - Alguns parâmetros hematológicos são potenciais biomarcadores. A presença de enzimas específicas, como as transaminases, no sangue pode ser indicativa de ruptura das membranas celulares em certos órgãos (Moss e col., 1986). Apesar de serem menos específica, outros parâmetros hematológicos, como hematócrito, hemoglobina, proteína e glicose, podem ser sensíveis a determinados tipos de poluentes, além disso, os níveis de hormônios esteróides sanguíneos ou proteínas normalmente induzidos por esses poluentes podem ser indicativos para determinados efeitos toxicológicos (Correia e col., 2010). Parâmetros imunológicos - Um grande número de substâncias químicas ambientais tem o potencial de prejudicar os componentes do sistema imunológico. Muitos anticorpos e células mediadoras do sistema imune podem ser deprimido por determinados poluentes, como revisto por Vos e col.. (1989). Embora a maioria das pesquisas sobre o sistema imune foi realizada em espécies de mamíferos, outros organismos também podem ser considerados como promissores neste campo de pesquisa (Wester e col., 1994). Parâmetros reprodutivos e endócrinos- O impacto dos compostos xenobióticos na reprodução e na regulação hormonal tem atraído crescente interesse nos últimos anos pois diante de todos os efeitos causados pela toxicidade de metais, deve-se considerar que a permanência de uma espécie em um ecossistema não está somente relacionada com a sua
- 398. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 388 Julho/2010 capacidade de adaptação e sobrevivência, mas também na capacidade se reproduzir na presença destes poluentes (Kime, 1995), uma vez que uma diminuição na taxa reprodutiva das espécies pode, a longo prazo, ameaçar a sobrevivência de um grande número de espécies alterando todo um ecossistema (Spies e col., 1990). Parâmetros neuromusculares - Estudos recentes demonstram que baixos níveis de contaminantes no meio aquático podem alterar as funções neuromuscular agindo sobre a ação da acetilcolinesterase (AChE) (Payne e col.., 1996). Parâmetros genotóxicos : A exposição dos um organismo a substâncias químicas genotóxicas pode induzir um cascata de eventos como alterações estruturais e/ou dano no DNA e posterior expressão do gene mutante e doenças resultantes de danos genéticos (Shugart e col., 1992). A detecção e quantificação de vários eventos neste sentido podem ser utilizados como biomarcadores de exposição. Parâmetros fisiológicos e morfológicos: As alterações na fisiologia e as consequências desses efeitos também podem ser utilizados como biomarcadores. A determinação dos efeitos adversos causados por um composto pode ser realizado através de análises dos substratos metabólicos ou através de alterações histológicas nos tecidos (Ricard, 1998; Pratap e Wendelaar Bonga, 1990). Mecanismos de defesa a poluentes Os organismos possuem eficientes formas de defesa a um agente externo, a biotransformação ou metabolismo, pode ser caracterizado como uma conversão enzimática de compostos xenobióticos em uma forma mais solúvel em água, que pode ser excretado do organismo mais facilmente (Lech e Vodicnik, 1985). Na Maioria das vezes esses processos envolvem enzimas que possuem um grau relativamente baixo de especificidade de substrato, quando comparada com as enzimas envolvidas no metabolismo de compostos constitutivos (Melancon e col.. 1992; Vermeulen, 1996). Os efeitos tóxicos podem se manifestar quando, o composto ou os seus metabólitos, liga-se a macromoléculas celulares, que conduzem a passagem pela membrana provocando danos celulares e/ou efeitos genotóxicos que posteriormente, pode levar ao desenvolvimento e progressão de doenças. O metabolismo é, portanto, um importante determinante da atividade de um composto, da duração da sua atividade e do tempo que este composto permanecerá no organismo (Timbrell, 1991). O principal local de desintoxicação é o fígado através de um mecanismo enzimático subdividido em fases I, II e III. A Fase I é uma alteração de oxidação, redução ou hidrólise da molécula original. Essas reações são catalisadas por enzimas monooxygenases microssomais, citocromo e NADPH citocromo P450 redutase, localizadas principalmente no retículo endoplasmático, que transformam os compostos em produtos hidrofílicos facilitando
- 399. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.389 a excreção. (Bucheli e Fent, 1995). A fase II envolve a conjugação do xenobiótico a um ligante endógeno, frequentemente um grupo químico polar, um açúcar ou aminoácido. As enzimas desta fase catalisam essas conjugações facilitando a excreção por adição de mais grupos polares como a glutationa e ácido glucorônico (Commandeur e col., 1995; Mulder e col., 1990). As enzimas da fase III, peptidases, hidrolases e â-liases catalisam o catabolismo dos metabólitos conjugados para formar produtos mais facilmente excretáveis, mas este processo ainda não está muito bem definido (Oost e col., 2003) Efeitos dos metais nos organismos aquáticos Fitoplâncton Algas são os organismos aquáticos que acumulam metais mais facilmente, estudos recentes com Ulva laetevirens and Gracilaria verrucosa tem demonstrado uma alta afinidade por bioacumular Cd, Cu e Zn (Roncarati, 2003), além da ocorrência natural e abundante, esses organismos fotossintetizantes estão sendo utilizados para programas de biomonitoramento de xenobióticos (Conti and Cecchetti, 2003; Conti e col., 2007). Macroalgas (Conti and Cecchetti, 2003) e microalgas (Tripathi e col., 2006) são ferramentas importantes para monitorar mudanças fisiológicas na presença de metais pesados, estes, são frequentemente transportados ativamente pelas membranas (Tamás e Wysocki, 2001; Van Ho e col.., 2002) e esses transportadores podem ser portas de entrada para metais tóxicos (Zalups e Ahmad, 2003) . As Microalgas empregam uma variedade de estratégias bioquímicas para reduzir a toxicidade de metais e para manter a homeostase no citoplasma (Perales-Vela e col., 2006), uma destas estratégias é o aminoácido cisteína que contém um grupo sulfidril que se liga ao sítio ativo do metal, esse grupamento contém peptídeos como a glutationa que são responsáveis pelo seqüestro do metal nas células, e outra alternativa são as metalotioneínas (Klaassen e col.., 1999) Diante destas características as algas absorvem os poluentes do ambiente aquático e biotransformam em compostos orgânicos tornando-os menos tóxicos, não permitindo que cheguem a níveis tróficos superiores (Pflugmacher e col., 1999). Adicionalmente a isto, estes organismos tem sido utilizados como biorremediadores no tratamento de metais pesados e poluentes orgânicos (Munoz e col., 2006) e sugere-se a utilização destas algas como bioindicadores de poluição aquática e de respostas fisiológicas a xenobióticos (Witton and Kelly, 1995). Invertebrados
- 400. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 390 Julho/2010 Invertebrados respondem diferentemente a exposição de metais. Em moluscos e crustáceos as glândulas digestivas, hepatopâncreas (Viarengo e col., 1984; Olafson e col., 1979a,b) e brânquias (Mouneyrac e col., 1998) são os tecidos que estão diretamente envolvidos com o contato, estoque e excreção de metais e possuem alta capacidade de síntese de MTs. Em ostras e mexilhões a dinâmica de acúmulo é diferente (Arco-íris, 1992), em um estudo com três espécies de bivalve (M. edulis, M. galloprovincialis, R. decussatus) que foram expostos a uma mesma concentração de Cd por um mesmo período de tempo (Bebianno e Langston, 1991, 1992,; Bebianno e col., 1993), foi observada uma relação linear entre a concentração do metal e a síntese de MT, e observou-se que em ambas as espécies de mexilhões (M. edulis, M. galloprovincialis) a quantidade de MT sintetizada foi mais acentuada que na espécie de ostra (R. decussatus). Peixes Os peixes são amplamente utilizados no biomonitoramento da poluição aquática (Zhou e col., 2008) e a contaminação em peixes por metais tóxicos deve ser considerada muito relevante, pois estes animais estão no topo da cadeia alimentar e servem de alimentos para outros animais. Neste grupo a faringe é o principal sítio pelo qual os poluentes aquáticos entram, e as brânquias são freqüentemente afetadas por estas substâncias devido a grande área da sua superfície e espessura deste tecido (Mallat, 1985). Há numerosos estudos que indicam mudanças estruturais induzidas por toxicantes e outros poluentes presente na água (Ferguson e col., 1992; Partearroyo e col., 1992). Estudos demonstraram que efeitos adversos foram observados em peixes expostos ao cobre, por exemplo, podem-se citar alterações nas funções respiratórias e ionoregulatórias devido aos danos em órgãos alvos como as brânquias, como conseqüência, houve um aumento no metabolismo aeróbico, no consumo de oxigênio que por sua vez, reduziu o desempenho natatório (McGeer e col., 2000; Handy, 2003). Além disso, McGeer e col. (2000) demonstraram que a exposição crônica ao cobre aumentou a atividade da Na+ K+ - ATPase branquial, implicando em um maior custo energético para a osmorregulação. Pelgrom e col. (1995) expuseram exemplares de Oreochromis mossambicus a diferentes concentrações de Cu e observaram um aumento no número de células de cloreto conforme se aumentava a concentração do metal. Neste estudo também foi observado um diâmetro aumentado destas células e um aumento das concentrações de cobre nas brânquias e no plasma. Além disso, altos níveis de cobre diminuem o crescimento e prejudicam a conversão alimentar em peixes (Marr e col., 1996; Schlenk & Benson, 2001). O alumínio, por sua vez, provoca acidose plasmática, hipóxia e hipercapnia, perda de eletrólitos, principalmente Na+ e Cl- (Howells e col., 1990; Rosseland e col., 1990). Vários autores observaram ainda nas brânquias, inflamação (edema e inchaço) e em alguns casos
- 401. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.391 fusão lamelar e excessiva produção de muco (Fischer-Scherl and Hoffmann, 1988; Goossenaerts e col., 1988). O mangânes tem sido associado a citotoxicidade, especialmente para células dopaminérgica (Archibald e Tyree, 1987), além disso, já foram demonstrados os efeitos do manganês nas mitocôndrias, onde este metal parece inibir o complexo I, alterando as fosforilações oxidativas (Chen, e col., 2001; Ali e col., 1995). Outros efeitos causados pela exposição a metais estão a diminuição dos estoques de glicogênio no fígado em truta arco-íris (Ricard, 1998) e tilápia (Pratap e Wendelaar Bonga, 1990) e aumento na atividade de enzimas como a aspartato transaminase (AST) e alanina transaminase (ALT), lactato desidrogenase (LDH) e malato desidrogenase (MDH) em Channa punctatus (Sastry e col., 1997).Várias respostas enzimáticas tem sido observada em animais expostos a contaminantes metálicos em campo e em laboratório, experimentos indicaram um aumento ou uma diminuição na atividade, esta dependente de dose, espécie e via de exposição (Wong and Wong, 2000; Jiraungkoorskul e col., 2003; Sanchez e col., 2005). A exposição dos peixes a metais pode causar aumentos de espécies de oxigênio altamente reativas (ROS), já citadas anteriormente, levando ao estresse oxidativo, disfunções osmorregulatórios associado com a inibição da ATPase e dano tecidual (Radi e Matkovics, 1988; Wong e Wong, 2000; Dautremepuits e col., 2004). Muitas substâncias que poluem os ecossistemas podem de alguma forma alterar o sistema endócrino dos animais, estas substâncias são conhecidas como EDC do inglês Endocrine Disrupting Compouds. Os disruptores endócrinos, mesmo em baixas concentrações, exercem efeitos biológicos neste sistema alterando os processos de síntese e/ou degradação de hormônios, seja bloqueando os receptores hormonais ou interferindo na ação dos próprios hormônios (Mathissen e Johnson, 2007). Um dos eixos afetado por metais é o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, entre estes efeitos podemos destacar a diminuição na síntese dos esteróides gonadais, vitelogenina, gonadotropinas e aumento nos níveis de dopamina (Karels e col.,1998). Em estudos com tilápias foram relatadas elevações nos níveis de cortisol (Foo & Lam, 1993) e redução de progestágenos (Correia, 2010), em Oncorhynchus mykiss houve impedimento e/ou atraso no amadurecimento de espermatogônias em espermatócitos (Karels e col.,1998) além de elevação e/ou diminuição dos níveis de esteróides fora do período reprodutivo e inibição da síntese de gonadotropinas, com simultâneo bloqueio sobre as gônadas de responderem à ação destes hormônios (Cooney, 1995). Em truta arco-íris,o cádmio pode inibir a atividade dos receptores de estrogênio (Le Guevel e col., 2000). Outro eixo afetado por compostos metálicos é o eixo hipotálamo-hipófice-interrenal que controla a produção de cortisol e sua secreção no sangue em resposta ao estresse
- 402. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 392 Julho/2010 (Brodeur e col., 1997 a,b; 1998), os metais podem alterar o mecanismo de sinalização deste sistema e ainda alterar a síntese de esteróides pelas células interrenais (Girard e col., 1998). Em adição, os metais têm demonstrado alterar outros sistemas hormonais tais como os tiroidianos e os hormônios de crescimento (Comeau e col., 2001; Devlin e col., 2001). Trutas arco-íris submetidas a toxicidade por Cádmio durante o desenvolvimento, apresentaram modificações na expressão de mRNA do hormônio de crescimento até os últimos estágios do desenvolvimento larval (Jones e col., 2001). Exposição a vários poluentes metálicos alteraram os níveis de triiodotironina (T3) e tiroxina (T4) no plasma de espécies de peixes em ensaios agudos (Sinha e col., 1991) e crônico (Hontela e col., 1995). Anfíbios Segundo Pough (1976) de 30 a 50% das espécies de salamandras e anuros utilizam lagoas temporárias (que aparecem na primavera e secam no verão) para porem seus ovos e esse processo ocorre em tempo suficiente para ocorrer a metamorfose até a lagoa secar. Um dos grandes problemas enfrentados nestes pequenos ambientes, que são dependentes principalmente de água da chuva, é a acidificação devido ao pequeno volume e como conseqüência a biodisponibilização de alumínio (Freda e col., 1991). Já em pântanos ocorre uma ambiente naturalmente ácido devido a crescimento denso de musgo de sphagnum e altas concentrações de ácidos orgânicos (Gorham e col., 1985), níveis elevados de metais podem estar presentes nestas águas porque ácidos orgânicos têm uma alta afinidade por metais (Reuter & Perdue, 1977). A toxicidade por alumínio é totalmente dependente do pH da água, em muitas espécies este metal só é tóxico em pH abaixo de 5, mas há situações que ele se torna biodisponível em pH alto. O íons de hidrogênio e o alumínio podem inibir a enzima de eclosão presente na membrana vitelínica dos ovos de anfíbios, inibindo a ação desta enzima a membrana se torna resistente para o processo de eclosão e impermeável a água e íons (Yoshizaki, 1978). O alumínio divalente age como o Ca e Mg na célula (Freda & Dunson, 1985a), reduzindo a permeabilidade da membrana podendo bloquear a passagem de Na+ e Cl- (Gordon & Sauerheber, 1982), a perda destes eletrólitos é a causa primária de morte de anfíbios (Freda & Dunson, 1984; Freda & McDonald, 1990). Larvas de Pleurodeles waltl (anfíbio urodela) expostos a cádmio não sofreram modificações nos primeiros passos do desenvolvimento, mas tiveram a metamorfose inibida assim como a diferenciação e desenvolvimento gonadal (Flament e col., 2003). O cádmio induz a síntese de HSP (Ait-Aissa e col.., 2000) e estas proteínas interagem com os receptores estrogênicos ou androgênicos e pode alterar os padrões de ação destes hormônios (Pratt and Toft, 1997).
- 403. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.393 Répteis Há poucos estudos com metais em répteis, há trabalhos com concentração de metal pesado em tecidos de tartaruga (Godley e col., 1998, 1999; Sakai e col., 2000 a,b), mas nenhuma informação em efeitos ou limiar de concentração toxicológicos estão disponíveis. O impacto de metais em tartarugas pode ser medido pelo acúmulo destes nos tecidos e Franzellitti e col. (2004) quantificaram as concentrações de Cd, Cu, Fe, Mn, Ni, e Zn no fígado, pulmão, músculo e tecido adiposo de Caretta caretta, encontradas mortas, da região do noroeste da Itália. A escolha destes metais pesados foi realizada com base em estudos prévios que mostraram níveis particularmente altos de Ni, Cu e Zn em sedimentos, Cd e Ni na água e Mn e Fe em bivalves conhecidos por serem base alimentar de C. caretta (Dinelli e col., 1996; Dinelli e Lucchini, 1999; Tankere e col., 2000; Fagioli e col., 1994) e encontraram concentrações altamente significativas de Ni, Mn, Cd e Cu no pulmão, músculo e tecido adiposo e de Mn e Ni no fígado, valores estes comparados a tartarugas de outras áreas não contaminadas, sugerindo a toxicidade por metais como causa da morte. Xu e col. (2006), encontraram altas concentrações de metais pesados na casca, membrana e no conteúdo de ovos de crocodilo (Alligator sinensis) e comparou com outros estudos (Burger e Gochfeld 1991; Burger 1994) e sugere que as altas concentrações de metais presentes nos ovos é um meio que as fêmeas encontraram para tentar reduzir a carga corporal de substâncias tóxicas através da transferência para os ovos, semelhantemente ao que ocorre com outras espécies de répteis já analisadas, incluindo tartarugas (Caretta caretta, Chelonia mydas e Trachemys scripta (Sakai e col., 1995, 2000; Burger e Gibbons, 1998). E ainda, para completar, estudos com ovos de tartarugas e crocodilos demonstraram que de forma similar que a presença de altos níveis de metais aumentam a mortalidade de embriões (Nagle e col., 2001, Manolis e col., 2002b), Conclusão A presença de substâncias poluentes nos corpos aquáticos quando modificam as características do meio alteram toda a cadeia trófica, a sociedade ainda não percebeu a importância do meio ambiente para sua sobrevivência. As causas das agressões ao meio ambiente são de ordem política, econômica e cultural, não pode haver proteção do ambiente enquanto houver desigualdades sociais. Os países ricos consomem os recursos naturais de forma exagerada e são que mais poluem enquanto que os países pobres também mostram uma parcela de culpa por falta de oportunidades. A ciência busca minimizar esses efeitos adversos a biodiversidade tentando identificar os problemas antes que o compartimento ambiental como um todo seja afetado. Se muitas das alterações forem observadas com uma
- 404. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 394 Julho/2010 certa antecedência, talvez seja possível minimizar os efeitos deletérios causados ao meio ambiente ao se elaborar medidas mitigadoras e de proteção a estes ambientes. A utilização de bioindicadores de poluição ambiental constitui uma ferramenta eficiente para avaliação de risco de impacto ambiental, porém cabe ressaltar que este monitoramento requer conhecimentos profundos da fisiologia dos organismos utilizados.
- 405. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.395 Alterações neuroendócrinas resultantes da exposição a metais Tiago Gabriel Correia Laboratório de Metabolismo e Reprodução de Organismos Aquáticos tigabriel@usp.br Desreguladores endócrinos Grande parte dos ecossistemas aquáticos encontra-se contaminado por inúmeros poluentes, os quais podem causar os mais diversos tipos de impactos. Nesse contexto, pode-se destacar uma classe de poluente capaz de alterar as funções endócrinas, não apenas na fauna aquática, mas também sobre toda a cadeia trófica associada. Essa classe de poluentes tornou-se conhecida por desreguladores endócrinos, ou ainda “disruptores” endócrinos, (do inglês, endocrine disruptor compound, ou EDC). É importante destacar que a palavra disruptor não existe na língua portuguesa, sendo, portanto um neologismo (fenômeno linguístico que consiste na criação de uma palavra ou expressão nova, ou na atribuição de um novo sentido a uma palavra já existente) e é comumente utilizada na literatura, principalmente na ecotoxicologia. Observações dos efeitos da exposição aos desreguladores endócrinos (DE) em peixes e outras espécies aquáticas, como por exemplo, invertebrados e anfíbios, têm contribuído para um esforço global na tentativa de estabelecer métodos para a detecção dos efeitos destes compostos sobre populações e para avaliação dos riscos ecológicos (Owen e col., 2008). Os DE podem ser desde compostos químicos sintéticos tais como pesticidas e fertilizantes a xenoestrógenos, fitoestrógenos e metais. Biologicamente podem ter ação sobre os receptores dos hormônios esteróides (nos tecidos alvo) como agonistas ou antagonistas, resultando em estímulo ou redução/bloqueio, respectivamente, nos processos de síntese hormonal (Matthiessen e Johnson, 2007). Há um consenso de que em sua grande maioria esses compostos antropogênicos interferem sobre a afinidade hormônio-receptor, especialmente os envolvidos na reprodução, pois esses parecem ser mais vulneráveis a pertubarções. Dessa forma, são freqüentes em mamíferos as alterações gonadais, má formação do trato genital, infertilidade e tumores; inibição da reprodução e alterações no comportamento de corte em aves e anormalidades nos órgãos reprodutivos em crocodilianos (Depledge, 1999).
- 406. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 396 Julho/2010 Desafios em endocrinologia e fisiologia comparativa: a perspectiva de Hutchinson e Pickford Sob uma perspectiva ecotoxicológica, uma das principais preocupações globais para a fauna aquática está em torno de quatro tipos de desregulação endócrina, a saber: antiestrógenos e antiandrógenos (inibidores da esteroidogênese), perturbadores da tiróide e os compostos capazes de alterar o sistema endócrino de invertebrados, como por exemplo, o hormônio juvenil e hormônios ecdisteróides; uma vez que mais de 95% das espécies animais são invertebrados e também são potenciais alvos para a desregulação endócrina (Hutchinson e Pickford, 2002). Diante das diferenças filogenéticas e especializações fisiológicas específicas em determinados táxons, torna-se quase impossível extrapolar dados registrados, por exemplo, da exposição a DEs em mamíferos para vertebrados mais simples como, por exemplo, peixes e anfíbios; semelhantemente para invertebrados; sendo, portanto, necessários testes específicos para cada composto em que exista a possibilidade de alterações endócrinas (Kendal e col, 1998). Não obstante, moléculas de determinados hormônios, apesar de apresentarem certo grau de conservação evolutiva, desempenham diferentes funções fisiológicas, por exemplo, enquanto o papel principal de prolactina (PRL) em mamíferos é a estimulação da lactação, em peixes a PRL está envolvida na osmorregulação e em anfíbios desempenha um papel na metamorfose e crescimento (Norris, 1996). Enquanto um mesmo DE pode vir a afetar um mamífero de uma determinada maneira, o mesmo nem sempre poderá ser aplicado a outros vertebrados, ou invertebrados. Atualmente é prioridade para a comunidade científica e reguladora internacional, o estabelecimento de métodos de ensaio de eco-toxicidade, a avaliação de risco ecológico e programas de monitoramento ambiental, e em última instância, avaliar se os dados obtidos em laboratório que são essenciais, não são contraproducentes quando comparados com a realidade observada no meio ambiente, para que dessa forma possam apoiar cientificamente de forma significativa e eticamente justificável orientações para testes de desregulação endócrina (Hutchinson e Pickford, 2002). Alterações Neuroendócrinas em Crustáceos A maioria dos estudos ecotoxicológicos, cujo objetivo é o de avaliar possíveis efeitos de desregulação endócrina, considera apenas dados para animais vertebrados, negligenciando representantes dos filos de invertebrados. Isto é alarmante, levando em conta a importância ecológica dos invertebrados. Eles são componentes essenciais de todos os ecossistemas e, portanto, a ameaça de desregulação endócrina deve ser totalmente avaliada para assegurar a proteção ambiental (Matthiessen e Law, 2002).
- 407. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.397 Alguns estudos realizados em laboratório sob condições controladas demonstram que compostos metálicos (íons ou substâncias contaminantes) podem afetar o controle hormonal da muda, a regeneração de membros, o nível de glicose no sangue e causar alterações na pigmentação e na reprodução de crustáceos (Depledge, 1999). O Cd (cádmio) e o Se (selênio) são um dos metais mais deletérios, chegando a afetar o processo de muda (crustáceos), o desenvolvimento gonadal em mexilhões, a ovogênese de ouriços do mar e a alteração do metabolismo de esteróides na estrela do mar Asterias rubens (neste caso, Cd e Zn) (Depledge, 1999). Apesar do número de trabalhos publicados na literatura sobre desregulação endócrina ter aumentado muito nos últimos anos, para os invertebrados, com exceção de crustáceos e insetos, estes dados são escassos. Tratando-se de ecotoxicologia aquática, o filo dos crustáceos possui espécies que são amplamente utilizadas neste tipo de estudo, pois além do fato de serem extremamente representativos para o ambiente aquático, apresentam características que os designam como potenciais espécies sentinela (Depledge, 1999). Metais, como por exemplo, o Cd, tem efeito direto sobre crustáceos, pois pode ser absorvidos através de canais de Ca, ou ainda através de proteínas de membrana (Norum e col., 2005). Uma vez absorvido, o Cd pode impedir o processo de muda em indivíduos adultos de Chasmagnathus granulatus, possivelmente pela inibição da secreção do hormônio da muda (ecdisona). Entre outros efeitos, Barata e col. (2004), sugerem que “metais pesados”, podem afetar a absorção de alimentos em microcrustáceos, tais como cladóceros e copépodos e dessa forma reduzir a aquisição energética, e/ou aumentar a demanda energética associada com o estresse causado por esses poluentes, afetando a reprodução e o crescimento. Rodríguez e col. (2000) concluíram que o Cd é capaz de inibir o crescimento/desenvolvimento gonadal em fêmeas de Uca pugilator (caranguejo violinista), devido a um aumento na secreção do hormônio GIH ( gonad inhibiting hormone) que regula o crescimento das gônadas. Estudos com o hormônio hiperglicemiante de crustáceos CHH, (crustacean hyperglycaemic hormone) realizados por Lorenzon e col., (2000) demonstram que vários metais pesados, como Hg, Cd e Cu induzem a hiperglicemia. Esses autores perceberam que o camarão Palaemon elegans mostrava uma resposta hiperglicêmica, entretanto os efeitos fisiológicos observados dependiam de alguns outros fatores, tais como: o metal testado, a concentração utilizada e o tempo de exposição. O Cd, possui um efeito semelhante a bisfenóis policlorados e ao naftaleno, no que se refere a capacidade de interferir sobre o controle endócrino da pigmentação, sendo capaz de inibir a dispersão de pigmentos dos cromatóforos da glândula do seio; além deste efeito, pode prejudicar o pigmento da retina distal impedindo-o de migrar em direção à luz em Uca pugilator (Fingerman e col.,1998).
- 408. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 398 Julho/2010 Para o filo dos crustáceos, espécies sentinela precisam ser estabelecidas urgentemente para a elaboração de biomarcadores adequados ao monitoramento ambiental. Algumas características básicas das espécies-sentinela consistem em: ser capturadas em locais poluídos, bem como no local íntegro (controle), a biologia e as mudanças sazonais do ambiente devem ser bem conhecidas e, de preferência, ecologicamente importantes. Além disso, outro requisito para as espécies sentinela a serem utilizadas para avaliar o impacto ecológico está no fato de que elas devem ser facilmente cultivadas em laboratório, de preferência apresentar dimorfismo sexual, ter um ciclo de vida curto e um sistema endócrino relativamente conhecido (Matthiessen e Johnson, 2007). Figura 1- Controle endócrino da reprodução em crustáceos - XO: órgão X, SG: glândula do seio, MO: órgão mandibular, B: cérebro, TG: gânglio torácico, HEP: hepatopâncreas, OV: ovario, T: testiculo, AG: glândula androgênica, A.Gl.: glândula antenal, GIH: hormônio inibidor gonadal, GSH: hormônio estimulador gonadal, MOIH: hormônio inibidor do órgão mandibular, CHH: hormônio hiperglicemiante, MF: methyl farnesoato, OH: hormônio ovariano, AGH: hormônio da glândula androgênica e VITELL: vitelogenina. (Modificado de Rodrigues e col., 2007). A seleção de uma espécie de crustáceo que preencha perfeitamente todos os requisitos acima mencionados não é uma tarefa fácil. Por exemplo, dafnídeos têm tempos de geração curtos e são facilmente cultivados, contudo são muito sensíveis a diversos
- 409. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.399 poluentes e seu sistema endócrino é pouco conhecido, por outro lado, decápodes são relativamente resistentes a muitos poluentes, mas enquanto seu sistema endócrino é o mais extensivamente estudado entre os crustáceos, seu ciclo de vida é relativamente longo e o manejo em laboratório nem sempre é uma tarefa fácil. Portanto, a seleção de crustáceos sentinela que ocorram no mesmo ambiente poderá requerer mais de uma espécie para o monitoramento ambiental (Rodriguéz e col., 2007). Alterações neuroendócrinas em teleósteos Apesar do reconhecimento de que muitos xenobióticos alteram as funções reprodutivas, o entendimento acerca dos mecanismos pelos quais tais alterações ocorrem ainda são incipientes em muitos aspectos (Thibaut e Porte, 2004). Os esteróides sexuais possuem duas funções clássicas em peixes: agem como fatores morfogenéticos durante a diferenciação e maturação sexual. Considerando-se que poluentes (xenobióticos ou metais) podem afetar tanto os receptores para os hormônios esteróides (expressão/ transcrição) e as enzimas envolvidas na síntese dos mesmos, a figura 2 representa a conversão bioquímica entre os principais hormônios da reprodução em teleósteos: 17 α hidroxiprogesterona (17 OHP), 17α, 20 β dihidroxi-4 – prenen – 3 ona, Testosterona (T) 17 β Estradiol (E2) e os possíveis sítios de ação de poluentes A neuromodulação da reprodução em teleósteos ocorre principalmente através de duas moléculas secretadas pela proximal pars distalis da hipófise, chamadas de gonadotropinas, GTH – I e GTH – II, as quais são estruturalmente similares ao FSH (hormônio folículo estimulante) e LH (hormônio luteinizante) de mamíferos, respectivamente.
- 410. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 400 Julho/2010 Outra gonadotropina, o decapeptídeo GnRH (gonadotropin releasing hormone) e a dopamina (DA), são os principais neurohormônios que estimulam e inibem a liberação das gonadotropinas, respectivamente (Blazquez e col., 1998). Da mesma forma que ocorre para os hormônios esteróides, o controle neuroendócrino da reprodução também é passível de sofrer alterações por poluentes, ou seja, todo o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas. Processos neurodegenerativos: Manganês e Alumínio Os metais “pesados” têm um importante papel em muitas doenças neurológicas. A maioria destas doenças é decorrente da exposição excessiva proveniente do ambiente, como por exemplo, envenenamento por chumbo. Um segundo grupo de doenças neurológicas, está associado com deposições anormais de metais sem a exposição ambiental excessiva, tais como a doença de Wilson. Há também um terceiro grupo de transtornos nos quais a patogênese pode ser uma extensão natural da presença dos íons metálicos (Montgomery, 1995). O sistema nervoso é um alvo sensível para uma variedade de metais e a neurotoxicidade induzida por um metal tem sido descrita em seres humanos em conexão com a poluição ambiental (Hg, Pb, Cu, Mn, Fe), uso de medicamentos (Li,
- 411. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.401 cisplatina, Bi, sais de ouro (Au)) e a ingestão acidental de inseticidas e raticidas contendo As ou sais de tálio (Ti) (Manzo, 2007). A exposição crônica a certos metais tem sido relacionada a fisiopatologia de algumas doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, e a esclerose amiotrófica; no entanto, os dados ainda são controversos (Manzo, 2007). Pb, Al e Mn são muitas vezes (mas não sempre) encontrados em excesso na autópsia do sistema nervoso obtidos de vítimas dessas desordens neurológicas; entretanto, doenças do sistema nervoso também podem ser induzidas pela deficiência de metais, logo Zn, Cu e Mn são exemplos de elementos essenciais ao organismo, cuja deficiência pode levar a distúrbios neurológicos. Essa deficiência pode resultar da ingestão inadequada de alimentos, efeitos de drogas e outras situações em que as perdas corpóreas do metal são aumentadas (Manzo, 2007). Tabela 1: Metais e doenças neurogenerativas em humanos Metais neurotóxicos Neurodegeneração associada a metais acumulados no cérebro Neurodegeneração associada a deficiências de metais essenciais Chumbo (Pb) Mercúrio (Hg) Lítio (Li) Manganês (Mn) Tálio (Ti) Arsênio (As) Bismuto (Bi) Sais de ouro (Au) Chumbo (Pb) Mercúrio (Hg) Manganês (Mn) Alumínio (Al) Cobre (Cu) Manganês (Mn) Cobre (Cu) Zinco (Zn) Manganês O manganês é encontrado em todos os tecidos e é fundamental para muitos processos fisiológicos, como por exemplo, na regulação dos processos reprodutivos, no metabolismo de carboidratos, lipídios, proteínas e como co-fator de várias enzimas (Prestifilippo e col., 2007), por exemplo, a SOD manganês (superóxido dismutase), e glutamina sintetase (enzima que sintetiza glutamina do neurotransmissor glutamato). Na verdade, cerca de 80% do manganês no cérebro está contido nesta enzima (Quintanar, 2008); como também para as metaloenzimas (manganoproteínas) envolvidas no metabolismo do oxigênio e do nitrogênio (Morello e col., 2007) e enzimas relacionadas ao DNA e neurotransmissores (Lima e col., 2008).
- 412. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 402 Julho/2010 Em relação à toxicidade do manganês, independente da rota de absorção, quando em altas concentrações torna-se tóxico para o cérebro e pode acarretar em desordens neurológicas caracterizadas inicialmente por sintomas psicóticos semelhantes à doença de Parkinson que resultam em uma síndrome conhecida por manganismo (Morello e col., 2007), cujos sintomas são bradicinésia, rigidez e distonia (Gerber, 2002). O manganismo está associado ao acúmulo de manganês no cérebro, mais especificamente em estruturas do gânglio basal, putamen caudato, globus pallidus, substância negra, hipotálamo e núcleo subtalâmico (Erickson e col., 2004). Algumas células do SNC, particularmente os astrócitos, regulam o metabolismo de neurotransmissores, a concentração de íons e removem toxinas do espaço extracelular, portanto, um estressor, como por exemplo, um íon metálico, pode induzir disfunções sobre estas células e conseqüentemente sobre neurotransmissores, como o gaba, o glutamato e a dopamina, ambos do fluído extracelular (Takeda e col., 2003). Segundo Erickson & Aschner (2003), a chave para as alterações neuroquímicas associadas com a neurotoxicidade do Mn são modificações nos níveis do glutamato extracelular, pois o glutamato é o mais freqüente neurotransmissor excitatório, enquanto que o GABA é o mais abundante neurotransmissor inibitório. Estes mesmos autores ainda apontam que alterações sobre estes neurotransmissores podem contribuir para modificações sobre o metabolismo da dopamina. Alumínio A exposição às altas concentrações de Al, assim como de Mn, resulta em efeitos neurotóxicos sobre o sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. No caso do alumínio, não se conhece um papel fisiológico no organismo (Nayak, 2002), desta forma este metal pode produzir efeitos fisiológicos adversos, entre os quais estão alterações bioquímicas, imunológicas respiratórias cardiovasculares, endócrinas (Campbell & Bondy, 2001), neurológicas, esqueléticas, hematológicas, insuficiência renal avançada (Zatta e col., 2003), entre outras. Aparentemente o efeito mais pronunciado ocorre sobre o SNC, com sintomas similares aos que ocorrem na doença de Alzheimer. Desregulação endócrina causada pela exposição ao Al Distúrbios reprodutivos têm sido propostos como a principal razão para o declínio de populações ícticas (Vuorinen e col., 1991). Em países escandinavos, o alumínio presente na água (rios e lagos) juntamente com os efeitos de acidez, despontam como os principais agentes responsáveis por este quadro (Poléo e col., 1997), que não se limita a estes países, incluindo-se aqui os Estados Unidos e Canadá (Heming & Blumhagen, 1988).
- 413. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.403 O Al presente nestes rios e lagos não têm sua fonte diretamente relacionada a efluentes antrópicos, pois originalmente está presente em constituintes geológicos naturais do solo, sendo mobilizado para a coluna d’água principalmente por intermédio de eventos de precipitação ácida (Bjerknes e col., 2003). Entretanto, este metal, em sua forma sulfatada (alum) é amplamente utilizado em estações de tratamento de água como coagulante de partículas sólidas e o resultante desta combinação é descartado para cursos d’água adjacentes (Hullebusch e col., 2002). O Al não é encontrado em seu estado puro na natureza (Constantino e col., 2002), mas sim sob a forma mineral, sendo o mesmo observado para o Mn (Lima e col., 2008). A solubilidade e a disponibilidade biológica de metais dependem não apenas da concentração, mas também das formas físico-químicas nas quais podem vir a ocorrer (Kalembiekiewics e col., 2008). Este metal não é muito solúvel em água, entretanto a chuva ácida (formando ácidos inorgânicos) pode solubilizar parte deste metal produzindo uma diversidade de complexos e formas físico-químicas, desde simples formas iônicas a polímeros, colóides e partículas. O principal fator abiótico que influencia as diferentes espécies químicas apresentadas por este metal é o pH (Teien, 2007). De maneira geral, pode-se dizer que o pH tem um forte controle na especiação de metais, pois influencia a hidrólise metálica, a polimerização, a agregação, a precipitação e a competição de prótons por locais de ligação disponíveis (Smith, 1996). As condições em que o Al torna-se mais tóxico para os organismos aquáticos e mais facilmente absorvido ocorre em pH ácido; íons de Al e de H+ podem interferir sobre a atividade de hormônios esteróides, desde alterações nos processos de síntese nas gônadas
- 414. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 404 Julho/2010 (Mount e col., 1988; Kime, 1995; Tam e col., 1987; Tam & Zang, 1996), alterações sobre a vitelogênese (Mugyia & Tanahashi, 1998; Hwang e col., 2000, Berg e col., 2004), alterações sobre a síntese e atividade gonadotrópica (Kime, 1995) e alterações na maturação e desova de oócitos (Vuorinen & Vuorinen, 1991; Vuorinen e col., 2003). Atualmente, apenas alguns poucos estudos apontam as conseqüências endócrinas da exposição ao Al em teleósteos, pois a maior parte dos estudos refere-se a neurodegeneração em humanos. Nesse caso, é conhecido para Oreochromis niloticus (tilápia) que o Al possui um efeito anti-esteroidogênico, pois esse metal em pH 5,5 foi capaz de reduzir a concentração plasmática de 17 α – OHP , após exposição aguda (96 h); porém, os mecanismos bioquímicos pelos quais o Al causa essa desregulação endócrina ainda são desconhecidos (Correia e col., 2010). Sabe-se que os progestágenos são produzidos sob o controle do LH (Young e col., 2005), portanto a diminuição na concentração de 17 OHP de O. niloticus poderia estar relacionada a um efeito tóxico na hipófise suprimindo a síntese, ou a expressão do LH, ou ainda um efeito tóxico sobre o hipotálamo em que a síntese/expressão do GnRH tenha sido suprimida/reduzida. No entanto, devido aos conhecidos efeitos do Al e de outros metais sobre a atividade enzimática, a possibilidade de este metal ter estimulado a atividade da enzima 20β-hidroxiesteróide desidrogenase (20β HSD), responsável pela conversão da 17 OHP em 17 α, 20 β-diidroxi-4-pregnen – 3 - one (17,20 P), também conhecida por MIS (do inglês, maturation induction steroid) não pode ser excluída (Young e col., 2005). Como nos mamíferos, o controle da síntese de esteróides nos ovários de peixes é mediado pelo FSH e LH, sendo esta uma via que envolve pelo menos parcialmente, proteínas quinases (PK) (Méndez e col., 2003) e cAMP nas camadas foliculares (Planas e col., 1997). Substâncias que promovem o aumento do cAMP intracelular também podem estimular a esteroidogênese (Kanamori e Nagahama, 1988). Antagonistas de cAMP podem bloquear parcialmente a ação esteroidogênica das gonadotropinas (Planas e col., 1997). Na verdade, o efeito estimulante do LH na síntese de esteróides está relacionado à ativação de PKA/cAMP (Méndez e col., 2003). Portanto, o conhecido efeito do Al sobre a fosforilação anormal na ativação da PK dependente de cAMP pode ser a causa dos níveis plasmáticos alterados de 17 OHP em resposta à ação do LH após a exposição ao Al (Correia e col., 2010). Nesse contexto, é importante notar que Morrissey e col. (1983) observaram que o Al reprimiu a síntese do hormônio da paratireóide devido a uma diminuição dos níveis de cAMP. Sabe-se também que o Al em teleósteos é capaz de inibir a síntese e/ou exportação de vitelogenina (VTG) do fígado para o plasma, no entanto o exato mecanismo pelo qual este metal inibe a síntese de VTG não é bem compreendido. Como mencionado acima, o Al é conhecido por induzir ou inibir fosforilações anômalas pela ativação das proteínas
- 415. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.405 quinases dependentes de cAMP (Johnson & Jope, 1987). O Al pode interferir sobre a fosforilação da VTG, que em sua constituição normal contém um grupo altamente fosforilado, a fosvitina (Mugyia e col., 1998). Outro efeito do Al está na sua capacidade de impedir a transcrição do RNAm da VTG (Hwang e col., 2000), pois também é possível que os íons de Al possam atuar sobre os receptores de E2, impedindo a formação do complexo ER-E2, inibindo dessa forma a ativação do gene da VTG pelo E2. Este mecanismo foi sugerido para o Al, pois foi observado para o Zn e Cu (Yeo e col., 1997), cujos efeitos sobre a vitelogênese da mesma forma que o Al, são reversíveis. Hwang e col. (2000) sugerem que a influência do alumínio sobre os níveis transcricionais do RNAm da VTG depende da concentração deste metal, e a VTG quando transportada no plasma, liga-se a íons metálicos, como o Zn, Ca e Mg (Falchuk & Montorzi, 2001).Sugere-se que o Al, quando em altas concentrações no plasma também seja capaz de se ligar a VTG, possivelmente nos mesmos locais que os íons essenciais ligam-se nesta molécula. Desregulação endócrina causada pela exposição ao Mn Vários estudos com mamíferos in vivo e in vitro têm relatado que o Mn altera os níveis de neurotransmissores como a dopamina (DA), o glutamato (Glu), e o ácido gama aminobutírico (GABA) (Quintanar, 2007); esses três neurotransmissores são intimamente relacionados e, por conseguinte, uma alteração em um deles inevitavelmente terá efeito sobre os outros. Por exemplo, no metabolismo de Glu e GABA, o Glu é transformado em glutamina (Gln), por uma enzima chamada glutamina sintetase – Mn, e a Gln, por sua vez pode ser convertida em GABA pela enzima ácido glutâmico desidrogenase (Hazell, 2002). Todas essas inter-relações têm complicado a interpretação dos resultados referentes aos níveis de neurotransmissores em consequência da neurotoxicidade do Mn (Erickson e Aschner, 2003) Embora seja conhecido que o Mn é um desregulador neuroendócrino, o mecanismo pelo qual altera os níveis de Glu, GABA e DA ainda não foi elucidado, e apesar de que tais estudos sejam conduzidos devido a relação deste metal com neuropatias humanas, deve-se levar em consideração que a desestruturação no metabolismo da DA, principalmente, pode afetar o controle neuroendócrino da reprodução em vertebrados, pois a DA é um agente inibidor na síntese de hormônios hipofisários (Erickson e Aschner, 2003). O Mn pode aumentar/estimular a liberação de LHRH (hormônio liberador de LH) no hipotálamo de roedores devido a sua capacidade de estimular a atividade da óxido nítrico sintetase (ONS), resultando em aumento na produção de óxido nítrico (ON) e, consequentemente, no aumento do cGMP (guanosina monofostato cíclico), PKG (proteína
- 416. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 406 Julho/2010 quinase G) e finalmente, no aumento da liberação de LHRH (Lee e col., 2007; Pine e col., 2005). Globalmente, estes resultados sugerem que, embora este metal possa facilitar a secreção de LHRH. existem importantes diferenças quanto à sensibilidade entre sexos e o estágio de maturação (Prestifilippo e col., 2007). Paralelamente aos mecanismos bioquímicos envolvidos na liberação do LHRH acima mencionados, o GLU e as catecolaminas são importantes neurotransmissores envolvidos na liberação deste neurohormônio (Cheng, 2005). O GLU estimula os terminais neuronais noradrenérgicos resultando na liberação de norepinefrina (NE); que por sua vez, ativa receptores α 1 - adrenérgicos localizados em neurônios nitridérgicos, assim, aumentando o cálcio intracelular (Ca2+ ). Este ativa a ONS e leva a produção de ON (Rettori e col., 1993). Além disso, o Mn (na forma MnCl2) é capaz de estimular a secreção de DA e a atividade da NOS. Foi demonstrado que a DA pode induzir ONS / ON (Melis e col., 1994, 1996), e com base no importante papel do ON no controle da LHRH (Rettori e col., 1993), sugere-se que a ativação de DA / ON pode mediar a estimulação e a secreção de LHRH (Quintanar, 2007). Os conhecidos efeitos do Mn na estimulação do controle hipotalâmico na secreção de gonadotropinas, como por exemplo, na relação LHRH/LH e na alteração/elevação dos níveis séricos de LH, FSH e E2 gonadal (Lee e col, 2007) deixa evidente seu potencial em impactar a reprodução em mamíferos (Pine e col., 2005). Efeitos similares são esperados para os demais vertebrados, embora dados na literatura a este respeito sejam escassos ou praticamente inexistentes. A exposição ao Mn (roedores machos) diminui a concentração plasmática de testosterona (T); estes dados sugerem que as células de Leydig podem ser um alvo para o Mn nos testículos (Cheng e col., 2003). No início da esteroidogênese gonadal, o transporte de colesterol nas células é mediado pela proteína StAR (steroidogenic acute regulatory), sendo esta uma proteína da família das fosfoproteínas mitocondriais expressas nos tecidos adrenal e gonadal por estimulação dos hormônios ACTH, LH e FSH (Stocco e Clark, 1996); Após isso, o colesterol é convertido em pregnenolona através da atividade do complexo enzimático localizado na membrana interna das mitocôndrias, o citocromo P450scc (side chain clivage), que promove a clivagem da cadeia lateral do colesterol (Martyniuk e col., 2006). Experimentos conduzidos por Chang e col, (2005) demonstraram que o Mn é capaz de suprimir a expressão da proteína StAR, impedindo que o colesterol chegue como substrato para a enzima P450scc, bloqueando a esteroidogênese nas células de Leydig. Tal fato é possível pois este metal interrompe o gradiente eletroquímico através da membrana mitocondrial interna (Walsh e col., 2000). Muito pouco é conhecido sobre a relação entre o Mn e os hormônios da tireóide. Postula-se que o Mn pode afetar a homeostase dos hormônios tireoidianos agindo
- 417. Ecotoxicologia Aquática Julho/2010 Pág.407 diretamente sobre glândula tiróide e seus respectivos hormônios (T3 e T4), ou indiretamente através de alterações no controle dopaminérgico da glândula tireóide (Soldin e Aschner, 2007). A dopamina é um modulador na secreção do TSH e os efeitos prejudiciais de manganês para os neurônios dopaminérgicos podem resultar em efeitos profundos sobre a síntese de hormônios tireoidianos. Os poucos dados disponíveis atualmente sugerem que o Mn pode afetar diretamente os hormônios tireoidianos, alterando a enzimas deiodinases (Soldin e Aschner, 2007). A concentração plasmática de prolactina (PRL) foi utilizada como biomarcador no índice de exposição biológica ao Mn em alguns casos específicos, como por exemplo, para trabalhadores (soldadores) no qual foi constatada uma elevação da concentração deste hormônio (Kim e col., 2007). Embora a PRL seja um dos hormônios que são produzidos/controlados pela hipófise, não existem estudos que expliquem a relação dos hormônios que controlam a secreção de PRL, tais como a DA e o hormônio estimulante da tiróide (TRH) com a exposição ao Mn (Ellingsen e col., 2003). Devido à complexidade das mudanças hormonais no sistema endócrino, ainda não se dispõe de uma ferramenta eficaz para a avaliação integrada das respostas e da interação entre os hormônios e os contaminantes metálicos. Bibliografia Ahearn, G.A., Duerr, J.M., Zhuang, Z., Brown, R.J., Aslamkhan, A. e Killebrew, D.A. (1999). Ion transport processes of crustacean epithelial cells. Physiological Biochemistry Zoology, 72, 1-18. Ahearn, G.A., Mandal, P.K. e Mandal, A. (2004). Mechanisms of heavy-metal sequestration and detoxification in crustaceans: a review. Journal of Comparative Physiology B. 174, 439-452. Ait-Aissa, S., Porcher, J., Arrigo, A. e Lambre, C. (2000). Activation of the hsp70 promoter by environmental inorganic and organic chemicals: relationships with cytotoxicity and lipophilicity. Toxicology. 145 (23), 147-157. Alcorlo, P., Otero, M., Crehuet,M., Baltanas,A. e Montes,C. (2006). The use of red swamp crayfish P. clarkia as indicator of the bioavailability of heavy metal in environmental monitoring in the river Guadiamar. Science of Total Environment, 366, 380-390. Ali, S.F., Duhart, H.M., Newport, G.D., Lipe, G.W. e Slikker, W. Jr. (1995). Manganese-induced reactive oxygen species: Comparison between Mn+2 and Mn+3 . Neurodegeneration. 4 (3),329– 334. Araújo, F. G. (1998). Adaptação do índice de integridade biótica usando a comunidade de peixes para o Rio Paraíba do Sul. Revista Brasileira de Biologia, 58, 547-558. Archibald, F.S., e Tyree, C. (1987). Manganese poisoning and the attack of trivalent manganese upon catecholamines. Archives of Biochemestry and Biophysics, 256 (2), 638–650. Ash, C. e Stone, R. (2003). A question of dose. Science, 300, 925.
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- 434. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 424 Julho/2010
- 435. Unidade 7 Fisiologia Comparadade Invertebrados Marinhos: Trocas Gasosas, Digestão e Sistema Imune Patrícia Lacouth Lab. de Biologia celular de invertebrados marinhos patricialacouth@usp.br Nesta unidade iremos abordar e caracterizar de forma geral os principais mecanismos fisiológicos que conferem à diferentes grupos de invertebrados marinhos a capacidade de exploração e colonização de seu ambiente. Descrever diferentes mecanismos fisiológicos utilizados pelos principais grupos marinhos para a integração de alguns de seus sistemas e atividades. Mostrando similaridades dos seus sistemas respiratório, digestório e imunológico com os de animais mais complexos. Buscando despertar a curiosidade e sentido de observação na descoberta de fenômenos fisiológicos nestes organismos. Foi estudando invertebrados marinhos que muitas descobertas foram feitas sobre os mecanismos mais simples de sobreviência e manutenção da homeostase.
- 436. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 426 Julho/2010 Todos os capítulos revisados pelo Prof Dr. Márcio Reis Custódio Capítulo 33 Trocas gasosas em invertebrados marinhos pág. 427 Suélen Felix Capítulo 34 Adquirindo energia: formas de alimentação e digestão em inverte- brados marinhos pág. 435 Camila Queiróz Capítulo 35 Efeitos da toxicidade de metais no metabolismo de organismos aquáticos pág. 455 Patrícia Lacouth Bibliografia pág. 467
- 437. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 427 Trocas gasosas em invertebrados marinhos Suélen Felix Lab. de Biologia Celular de Invertebrados Marinhos sufelixbio@usp.br Introdução O modelo de trocas gasosas em organismos com respiração aérea ou aquática é determinado por características anatômicas e circulatórias e por propriedades físicas do meio respiratório, especificamente com relação à solubilidade e à difusibilidade do oxigênio na água e no ar (Weibel, 1984; Bicudo e Weibel, 1987). Suprir com O2 as células metabolicamente ativas do interior do corpo dos indivíduos e retirar eficientemente o CO2 é um dos problemas fundamentais para a sobrevivência de todos os organismos (Schmidt-Nielsen, 2002). Os problemas são diferentes na água e no ar por duas razões principais: (1) o ar é rico em oxigênio enquanto que em uma mesma pressão parcial o conteúdo de oxigênio na água é 30 vezes menor por causa da sua baixa solubilidade; (2) o oxigênio se difunde 300 000 vezes mais rápido através do ar do que através da água (Tab. 1) (Schimidt-Nielsen, 2002). Por esses motivos os invertebrados marinhos desenvolveram estratégias e órgãos respiratórios diferentes para se adaptarem as peculiaridades exigidas pelo meio que habitam (Bicudo e Weibel, 1987). Tabela 1. Comparação entre ar e água enquanto meios respiratórios, destacando-se a concentração de oxigênio e sua constante de difusão nesses dois meios (Modificado de Schimidt-Nielsen, 2002). Princípios para a determinação dos modelos de trocas gasosas Em princípio, a função das trocas gasosas seja em organismos de respiração aérea ou de respiração aquática é supri-los constantemente com O2 para atender suas demandas e também eliminar dos compartimentos interiores do corpo o CO2 que é o gás final da combustão (Fig. 1) (Gray, 1954). A eficiência das trocas gasosas é determinada por certas
- 438. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 428 Julho/2010 propriedades estruturais que serão discutidas a seguir. Entretanto, as trocas gasosas entre a água ou o ar e o sangue são determinadas por três princípios básicos: a) quanto maior for a área da superfície da troca gasosa maior é sua eficiência; b) quanto menor for a espessura das barreiras de tecido que separa o capilar e o meio respiratório maior será a taxa de troca e; c) quanto maior o número de capilares sanguíneos expostos água ou ao ar mais melhor será a difusão dos gases (Meban, 1980). Figura 1. Troca gasosa entre o interior do corpo e o meio respiratório via difusão simples. Modificado de http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2002/lect17.htm (09/05/2010). Design dos órgãos respiratórios Por causa do conteúdo de O2 na água ser aproximadamente 30 vezes menor na água do que no ar e também por causa da baixa difusibilidade do O2 na água, os organismos com respiração aquática precisam renovar o meio ao redor da superfície de troca gasosa em uma taxa maior do que o sangue dos capilares é renovado (Bettex-Galland e Hughes, 1973). A ventilação é constante nos pulmões, mas normalmente contínua e unidirecional nas brânquias (Burri, 1985). O design básico das brânquias é um conjunto de fendas que fornece um fluxo laminar de água - as fendas branquiais - separadas pelos arcos branquiais (Fig. 2). Quando a demanda respiratória aumenta, a ventilação das fendas é realizada de forma mais complexa, adicionando-se estruturas secundárias (filamentos) e terciárias (lamelas) aos arcos branquiais (Fig. 3). Isso é alcançado pela construção dessas estruturas de troca gasosa sobre um sistema vascular estruturado hierarquicamente. Desta forma, a estrutura das brânquias forma-se como evaginações dos arcos branquiais dentro
- 439. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 429 das câmaras branquiais. O princípio dessa construção fornece ventilação através de um fluxo de água contínuo, sem a formação de bolsas de água e de espaços mortos virtuais, onde o O2 não conseguiria se difundir (Gray, 1954). Figura 2. Estrutura branquial mostrando fluxo laminar de água passando pelas fendas branquiais onde estão evidenciados os capilares sanguíneos e as trocas gasosas que ocorrem nessas estruturas. Modificado de http://www.biologyreference.com/Fo-Gr/Gas-Exchange.html (09/05/2010). Figura 3. Estrutura secundária (filamentos branquiais adicionais) e terciária (lamelas) que são formadas quando os organismos requerem maiores demandas respiratórias. Modificado de http://www.revisionworld.com/country.php (10/05/2010).
- 440. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 430 Julho/2010 Respiração aérea versus respiração aquática: contraste dos designs As trocas gasosas que evoluíram diferentemente para a respiração aérea e aquática, respectivamente, têm seus designs adaptados para as condições de limite das trocas gasosas impostas pelo meio respiratório (Bicudo e Weibel, 1987). Brânquias de invertebrados e peixes mostram basicamente o mesmo padrão de design: a vascularização está contida em lamelas paralelas que estão circundadas por um fluxo de água constante e o órgão respiratório é evaginado (Fig. 4a) (Weibel, 1984). Nos órgãos respiratórios aéreos os maiores riscos são a perda de água e os estresses mecânicos gerados na superfície ar- tecido. A invaginação da trocas gasosas contribui para a solução de ambos os problemas, sem haver desvantagem na ventilação (Fig. 4b) (Burri, 1985). As forças mecânicas são suprimidas nos insetos, pois a traquéia é composta por uma espiral rígida de quitina. Nos pulmões essas forças são compensadas montando os elementos das trocas gasosas (septos alveolares) em um sistema fibroso mantido constantemente sob tensão, e provendo a superfície com uma camada surfactante (Meban, 1980). Figuras 4a e b: figura 4a mostrando sistema respiratório aquático evaginado de um nudibrânquio, figura 4b mostrando a invaginação de sistema respiratório aéreo. Adaptações primárias em invertebrados para a respiração em meio aquático As esponjas são os invertebrados marinhos mais basais, não apresentam tecidos verdadeiros, portanto, nem brânquias e nenhum tipo de sistema, nesses animais as trocas gasosas acontecem por difusão simples em uma relação direta água-célula, devido á constante corrente de água que fui pelo interior do corpo desses indivíduos (Fig. 5a). Esta corrente de água é promovida pelo batimento dos flagelos de células especializadas chamadas coanócitos que se localizam dentro de câmaras no interior do corpo das esponjas (Randall e col., 2001). Da mesma forma que as esponjas, os cnidários, não possuem brânquias, nem outro tipo de órgão respiratório. Nos indivíduos pertencentes a este filo, as trocas gasosas acontecem por difusão simples através da superfície do corpo (Fig. 5b) (Randall e col., 2001).
- 441. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 431 Figura 5a e b. Trocas gasosas em esponjas e cnidários respectivamente. Moluscos aquáticos como polvos e lulas, têm brânquias especialmente desenvolvidas para as trocas gasosas, enquanto que nos bivalves, as brânquias exercem função dupla (respiração e alimentação por filtração). Os cefalópodes em geral são animais muito ativos requerendo trocas gasosas mais efetivas as quais são realizadas facilitadas pela circulação capilar nas brânquias e pela presença de pigmento respiratório no sangue, normalmente hemocianina (Fig. 6). Gastrópodes aquáticos, embora menos ativos que os cefalópodes também possuem brânquias e hemocianina como pigmento circulatório (Randall e col., 2001). Figura 6 – Brânquias de polvo. O esquema ao centro mostra o primeiro vaso aferente que leva para as brânquias o sangue desoxigenado que é distribuído inicialmente via vaso aferente secundário e então via vaso aferente terciário. Já os vasos eferentes secundários são responsáveis por levar até o vaso eferente primário o sangue rico em oxigênio, que será então conduzido para as demais partes do corpo do organismo. Acima brânquia de polvo mostrando vaso eferente primário e embaixo a esquerda vaso aferente terciário. http://tolweb.org/articles/?article_id=4200 (11/05/2010).
- 442. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 432 Julho/2010 Nos equinodermos as trocas gasosas normalmente são feitas através do sistema hidrovascular ou ambulacrário, entretanto, nos equinóides, além do sistema hidrovascular existem brânquias externas próximas a cavidade oral que auxiliam este processo. Nos holoturóides as trocas gasosas ocorrem de forma diferenciada, certa quantidade de água entra através da cloaca e fica em contato com uma grande estrutura chamada árvore respiratória por cerca de 6-10 minutos. Esse tempo é o necessário para as torças gasosas acontecerem, após esse período a água é liberada em uma única contração (Fig. 7) (Randall e col., 2001). Figura 7. Morfologia interna de holotúria, enfatizando a ampla estrutura da árvore respiratória, que é o órgão responsável pelas trocas gasosas nesses organismos. http://www.tolweb.org/Holothuroidea (11/05/2010). Crustáceos aquáticos apresentam brânquias que são normalmente ventiladas por movimentos de apêndices especiais o que garante um maior aporte de água nessas estruturas e conseqüentemente maior oxigenação (Fig. 8). Crustáceos de maior tamanho são melhores vascularizados e contém pigmento circulatório (hemocianina) no sangue, embora não desenvolvam capilares como os encontrados nos cefalópodes (Randall e col., 2001).
- 443. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 433 Figura 8. Diagrama do sistema ventilatório em crustáceos decápodes, mostrando o padrão de fluxo de água através da câmara branquial, com a água entrando pela base dos pereópodes, fluindo através das brânquias e saindo pelo canal exalante (Modificado de Taylor, 1982).
- 444. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 434 Julho/2010
- 445. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 435 Adquirindo energia: formas de alimentação e digestão em invertebrados marinhos Camila Queiroz Lab. de Biologia Celular de Invertebrados Marinhos cami_quei@yahoo.com.br Os animais precisam se alimentar para prover a energia necessária para permanecerem vivos e manterem processos físicos como a contração muscular, crescimento e reprodução. Utilizam o alimento também como matéria-prima para formar e manter mecanismos celulares e metabólicos (Eckert, 2000). Este alimento é conseguido por meio de uma diversidade de métodos mecânicos, que determinam a natureza do que um dado animal pode obter e utilizar (Shmidt-Nielsen, 2002). Obter uma alimentação adequada em quantidade e qualidade dispende muito tempo da rotina comportamental da maioria dos animais. Certamente sua fisiologia e morfologia são o resultado da seleção natural que favorece a aquisição efetiva de energia dos alimentos, evitando que o predador se torne presa ao se alimentar. A principal razão para que os animais utilizem diversos mecanismos de alimentação relaciona-se com os nutrientes que devem ser adquiridos pelo predador. Esta captura envolve como a presa deve ser localizada, identificada, subjugada e ingerida. Em contraste com a simplicidade das palavras, a diversidade dos mecanismos existentes é complexa. Esponjas marinhas carnívoras, cnidários com toxinas, estrelas do mar que se alimentam invaginando sua presa no estômago. Entre os invertebrados marinhos há um grande número de espécies com níveis de complexidade alimentar diferentes. O método de alimentação que é menos especializado envolve a absorção de nutrientes diretamente através da superfície do corpo. Este processo chamado de endocitose ocorre a nível celular e pode ser dividido em fagocitose e pinocitose. As outras formas de alimentação incluem a filtração, comum em uma ampla variedade de espécies; animais que se alimentam de detritos orgânicos depositados no substrato, e outros que possuem mecanismos que evoluíram para manipular maiores massas alimentares, incluindo vários dispositivos para a apreensão, raspagem, perfuração, mordedura e mastigação (Hickman et al 2001). O alimento obtido consiste de matéria orgânica e grande parte dele pertence a três grupos principais: proteínas, lipídios e carboidratos. Estes três tipos de compostos orgânicos dominam completamente a composição de quase todos os vegetais e animais, que são presas potenciais de diversos outros. Seja o alimento utilizado como combustível, para desenvolvimento ou manutenção, as grandes moléculas de alimento são inicialmente degradadas em unidades mais simples; estas são então absorvidas e podem ser incorporadas ou metabolizadas para fornecer
- 446. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 436 Julho/2010 energia. A principal função da digestão é decompor com o auxílio de enzimas, as moléculas grandes e complexas presentes no alimento de modo a torná-las absorvíveis e disponíveis para as células (Fig. 1) (Shmidt-Nielsen 2002). Figura 1 - Sequência de acontecimentos durante a digestão. Todos os filos animais evoluíram no mar, um habitat muito estável e uniforme, a não ser nas zonas costeiras e entre-marés. As espécies marinhas necessitam então, de dois requisitos principais para a sobrevivência – ambos relacionados com a alimentação. Elas devem obter alimento em quantidade suficiente e evitar transformar-se em alimento de outros organismos. A forma de obtenção do alimento e a otimização de seus nutrientes entre os invertebrados marinhos é bastante diversa e uma abordagem dos processos que ocorrem em esponjas, cnidários, moluscos, crustáceos e equinodermos são abordadas neste capítulo. Poríferos Quase todas as esponjas dependem da digestão intracelular, e, portanto, da fagocitose e pinocitose como captura de alimento. Para que estes processos ocorram nas esponjas, a circulação da água é feita de forma orientada. Ao entrar a água traz partículas alimentares; ao sair, remove excretas nitrogenadas. Esponjas são consumidoras seletivas em relação ao tamanho das partículas, com tamanhos de poros variando na maioria das espécies entre 5 e 50 µm. (Bergquist, 1978; Simpson, 1984) Cerca de 80% da matéria orgânica absorvida por demosponjas tinham tamanho menor do que o observável por microscopia ótica e 20% são bactérias e dinoflagelados (Reiswig 1970). A água penetra na esponja pelos poros inalantes, percorre os canais do corpo e alcança uma grande cavidade central — o átrio ou espongiocele (Fig. 2). Os coanócitos revestem o átrio ou, na maioria dos casos, pequenas câmaras que ficam no trajeto dos canais. O agitar dos flagelos dessas
- 447. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 437 células provoca um fluxo de circulação da água, puxando-a de fora para dentro do corpo. Ondulações nos colares dos coanócitos movem as partículas alimentares capturadas em direção ao corpo celular destas células, onde são ingeridas por pinocitose ou fagocitose. Esponjas não possuem cavidade digestiva específica, e todo processo alimentar é intracelular. Os coanócitos digerem as partículas parcialmente e passam diretamente para outra célula no interior da matriz para a digestão final. A fagocitose também pode ser realizada diretamente pelos arqueócitos, com a formação de vacúolos digestivos (Bergquist, 1978; Simpson, 1984). Embora a maioria possua a filtração como modo de alimentação, algumas esponjas marinhas são conhecidas por abrigar organismos fotossintetizantes. Esses simbiontes, cianobatérias e dinoflagelados, produzem compostos utilizados pela esponja, e a utilizam como substrato. Figura 2 - Morfologia e funcionamento da digestão em esponjas. Disponível em: http://www.mun.ca/biology/scarr/Porifera.htm. Outra forma de obtenção de alimento diferenciada ocorre em espécies de esponjas da família Cladorhizidae. Espécies desta família não possuem sistema aqüífero e são carnívoras, se alimentando de pequenos crustáceos (Fig. 3). Utilizam espículas em forma de gancho para capturar as presas, que depois são envolvidas por células que efetuam a digestão e a absorção. (Vacelet & Boury-Esnault 1995).
- 448. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 438 Julho/2010 Figura 3 - Esponja carnívora se alimentando; a. microcrustáceos sendo presos nas espículas; b. presa sendo envolvida pela esponja. (Vacelet & Boury-Esnault 1995) Cnidários Diferentemente das esponjas, os cnidários apresentam uma cavidade digestiva, a cavidade gastrovascular ou celêntero, vindo dai o nome do grupo (gastro= estômago; cele = oco; êntero= intestino) (Fig. 4). No entanto, não possuem uma abertura anal, o que caracteriza um tubo digestivo incompleto. A gastroderme possui células glandulares que produzem enzimas digestivas e atacam o alimento no celêntero (digestão extracelular), e células que fazem a digestão intracelular dos fragmentos alimentares parcialmente digeridos. Os resíduos são expulsos pela boca. Figura 4: Esquema geral do corpo de cnidário (Brusca e col.,2003) Nas formas mais volumosas, a cavidade digestiva ou celêntero é ramificada, facilitando a chegada do alimento a todos os pontos do corpo. De certa forma, essa ramificação da cavidade digestiva substitui o aparelho circulatório (por isso é chamada cavidade gastrovascular) (Brusca & Brusca 2005, Eckert 2000, Hickman 2001).
- 449. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 439 Cnidários são conhecidos como predadores nas cadeias ecológicas marinhas e sua alimentação consiste principalmente de animais macroscópicos, embora alguns utilizem microzooplâncton, outros que habitam substratos perto da superfície podem conter formas simbiontes, e alguns consomem diretamente material orgânico dissolvido (Arai, 1997). Entretanto, são considerados últimos consumidores nestas cadeias alimentares, já que não são muito predados, provavelmente devido a seu corpo gelatinoso possuir baixo valor energético (Sommer et al.2002). Na maioria dos cnidários, defesa e alimentação estão intimamente relacionadas. Os tentáculos da maioria das anêmonas e águas-vivas servem a ambos os propósitos, e os pólipos defensivos das colônias de hidrozoóides frequentemente auxiliam também na alimentação. Esses animais utilizam toxinas, a maioria com atuação no sistema nervoso, para subjugar a presa mas também para espantar predadores. Os nematocistos, concentrados em grandes quantidades sobre os tentáculos alimentares, injetam toxinas paralisantes nas presas e as imobilizam enquanto os tentáculos levam o alimento até a boca (Eckert, 2000) (Fig. 5) Para facilitar a digestão, há na gastroderme células produtoras de enzimas que facilitam a digestão e cílios que ajudam a misturar os conteúdos do trato digestivo. Como resultado dessa fase inicial é produzido um caldo de polipeptídios, gorduras e carboidratos que células absorvem por processos de endocitose. A digestão se completa no interior dessas células, com a formação de vacúolos alimentares. Como vários organismos aquáticos, os cnidários obtém parte do alimento de populações de algas simbióticas – autótrofos sintetizantes. Após as algas sintetizarem moléculas orgânicas de precursores inorgânicos utilizando luz solar, elas exportam algumas das moléculas orgânicas para o tecido do animal hospedeiro. Os corais formadores de recife são os mais famosos animais que obtem compostos orgânicos através de algas simbiontes endógenas. Todas as seis mil espécies de corais tropicais conhecidos contem algas simbiontes. Alem de prover energia ao coral, estas algas facilitam a formação do esqueleto de calcário desses cnidários (Hill e col 2008). Figura 5: Sistema digestório de cnidários (Modificado de Hill e col., 2008)
- 450. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 440 Julho/2010 Vários outros grupos de cnidários também adotaram métodos de alimentação que não dependem do uso direto dos tentáculos e nematocistos. Algumas espécies de anêmonas apreendem crustáceos e pequenos peixes com o disco oral formando uma espécie de rede de captura. A presa encosta no disco e três segundos a partir de estimulação das células, três segundos após o disco ter sido estimulado há o fechamento completo desse disco. Muitas espécies de corais são também suspensívoras e utilizam uma rede formada por uma fina camada de cordões de muco, que cobre a superfície da colônia e que coleta a fina matéria particulada que se precipita na coluna d´água. O muco, já com alimento fixado, é levado para a boca pelos cílios. Este muco contém uma mistura variável de componentes macromoleculares como glicoproteínas, lipídios e mucopolissacarídeos e possui características específicas para cada espécie. Figura 6- a. Recife de coral tropical; b. Pólipos de coral; c. Esquema de um único pólipo seccionado. (Modificado de Hill e col., 2008). Cnidários são bem conhecidos por sua ampla predação em ovos de peixes, sendo uma importante fonte de recursos para muitas espécies. Por exemplo, a espécie Aurelia aurita tem de 2 a 5 % de seu alimento diário constituído por ovos de arenque (Moller 1980). Outro estudo calculou que Rhizophysa eysenhardti consumiu 28% das larvas de peixe disponíveis a cada dia, e Purcell (1984c) estima que 60% de larvas de peixes poderiam ter sido consumidos por Physalia physalis em um único local.
- 451. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 441 Moluscos Moluscos marinhos podem ser predadores (herbívoros ou carnívoros) ou suspensívoros. Possuem tubo digestivo completo no qual a boca conduz à cavidade bucal, que em muitos organismos contém várias glândulas salivares secretoras de enzimas. Com exceção dos bivalves, a maioria apresenta a rádula, uma estrutura exclusiva dos moluscos e que se modificou entre as espécies dependendo da presa potencial. O aparelho radular é constituído por uma faixa de tecido conjuntivo, repleto de dentes e esticado sobre uma haste cartilaginosa. A rádula é composta de uma esteira de dentes quitinosos recurvados, podendo ser simples, serrilhados ou modificados de outras maneiras (Fig. 7b). O aparelho chamado rádula, é composto por duas partes: a base cartilaginosa, com o músculo protrator da rádula e o músculo retrator da rádula; e a rádula propriamente dita, com suas fileiras longitudinais de dentes quitinosos recurvos. A base cartilaginosa se move para fora e para dentro da boca do animal por intermédio dos músculos protratores e retratores, e a rádula se movimenta (Fig. 7a ). Através desses movimentos os dentes da rádula se erguem e raspam a superfície, cortando e recolhendo partículas de alimento que são conduzidas ao esôfago. Os dentes são recobertos por muco (secretado por uma glândula salivar), que facilita o recolhimento e a ingestão da comida. À medida que se desgastam são substituídos por novos dentes que são continuamente produzidos na parte posterior da cavidade bucal, no saco radular. O número, a forma e o arranjo dos dentes variam e são adaptados ao tipo de alimentação, sendo usados para identificar as várias espécies. Em geral, os herbívoros possuem mais dentes, e nos carnívoros estes são menores. O maior número de dentes na rádula é encontrado em um gastrópode, Pleurotomaria, com cerca de 200 dentes por fileira. Certos gastrópodes usam a rádula para caçar outros gastrópodes e bivalves, ralando e ingerindo as partes macias. Alguns possuem uma rádula formada por um único dente que pode ser atirado como um arpão contra a presa, liberando uma neurotoxina (Fig. 7d) (Hill e col., 2008). A digestão extracelular é efetuada por enzimas e ocorre principalmente no estômago e nos cecos digestivos, enquanto a absorção e digestão intracelular ocorrem nas paredes dos cecos e intestino. Na maioria dos moluscos, a digestão é intracelular, na qual as partículas alimentares são fagocitadas por células da parede de dutos alimentares. No entanto, em grupos mais derivados como os cefalópodes predomina a digestão extracelular. As enzimas secretadas principalmente pelos cecos e estômago, digerem o alimento e a absorção ocorre no estômago, nos cecos e no intestino. Bivalves são animais ecologicamente importantes, e um exemplo interessante de quão diferentes dos vertebrados alguns animais podem ser, em relação a seus processos digestivos e de absorção dos nutrientes. Nesta classe não existe a rádula, e estes são
- 452. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 442 Julho/2010 animais filtradores. Primeiramente, esses moluscos dependem fortemente da ação de cílios junto a contrações musculares para mover o alimento através do trato digestivo. A ação ciliar é importante, pois é capaz de selecionar as partículas de acordo com seu tamanho e outras características. A segunda grande diferença é que na maioria dos bivalves a digestão é intracelular. Figura 7- a. Cavidade da boca de um gastrópode mostrando a rádula; b. Rádula com a fileira de “dentes”; c. Concha de um molusco morto por outro molusco carnívoro; d. Rádula com toxina de um molusco. (Hill et al 2008). Nos bivalves o estômago é associado com divertículos digestivos O processamento do alimento nos bivalves ocorre com auxilio do estilete cristalino, uma haste circular, cilíndrica e transparente alojada numa dilatação do estômago e apoiada nas extremidades por dois escudos gástricos quitinosos que lhe proporciona um movimento de rotação. O
- 453. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 443 estilete contém redutoras de amido, muito úteis na digestão do plâncton. Os movimentos rotativos do estilete funcionam como um molinete para recolher o muco contendo o alimento para o estômago (Hill e col., 2008) (Fig. 8). Outro exemplo diferencial ocorre em nudibrânquios. Estes são pequenos animais marinhos pertencentes ao grupo dos moluscos gastrópodes e chamados popularmente de lesmas-do-mar. Os nudibrânquios são animais carnívoros que se alimentam de outros invertebrados, como cnidários, esponjas, cracas e ascídias. Algumas espécies se alimentam dos ovos de outros nudibrânquios e, até mesmo, de indivíduos adultos. Figura 8- Esquema de digestão em molusco bivalve. (Hill et al 2008). Geralmente, a relação entre estes moluscos e sua presa é muito estreita, e é comum que cada espécie se alimente apenas de alguns tipos específicos de presa. Nudibrânquios aeolíeos possuem uma reputação devido ao seu modo particular de obter alimento, no qual porções do corpo dos cnidários que constituem suas presas são agarradas pelas mandíbulas acionadas por músculos, enquanto a rádula arranca pedaços para ingestão. Algo impressionante neste sistema, é que muitos nudibrânquios ingerem os nematocistos da presa sem que este seja disparado. Os nematocistos são deslocados ao longo do tubo
- 454. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 444 Julho/2010 digestivo do nudibrânquio, mas como isto acontece sem que eles sejam disparados não é bem documentado. Possivelmente as secreções mucosas do nudibrânquio limitam as descargas desses nematocistos e ocorra uma inativação temporária. Muitas vezes os nematocistos são armazenados em estruturas chamadas cnidossacos no interior dos ceratos dorsais. Este armazenamento foi mostrado em diversos trabalhos e presumivelmente ajudam na defesa do nudibrânquio. Outras espécies de nudibrânquios também utilizam suas presas não apenas para obtenção de energia, mas também para obter compostos químicos. As “dançarinas espanholas”, Hexabranchus sanguineus, utilizam para sua própria defesa um composto químico obtido da esponja que se alimenta (Conklin & Mariscal 1977). Dentre os moluscos, entretanto, são os cefalópodes aqueles predadores mais vorazes no ambiente marinho. Estes animais são bem adaptados a uma alimentação predatória e uma dieta carnívora. A presa é localizada pelos olhos bem desenvolvidos e a captura efetuada pelos tentáculos ou braços. Nos cefalópodes as rádulas são muito fortes e em forma de bico, cuja função é perfurar e rasgar grandes pedaços de tecidos das presas. Figura 9: Anatomia interna de um cefalópode (Hickman 2001) Ao contrário das sépias e lulas que rasgam sua presa com as mandíbulas, o hábito alimentar dos polvos é mais semelhante ao das aranhas. Eles injetam veneno na presa e em seguida, quando a presa está segura, secretam enzimas sobre ela. Os tecidos parcialmente digeridos são absorvidos. O mesmo mecanismo é realizado para remover os gastrópodes das conchas. Após perfurar a concha com a rádula, os polvos secretam as enzimas. O esôfago e estômago desses animais é bastante muscular. Há também glândulas digestivas, divididas em pâncreas e uma outra parte, comparada a um fígado, mas ainda primitivo.Principalmente devido a eficiência dessas glândulas secretoras de enzimas, a digestão nos cefalópodes é extracelular. As enzimas de ambas as divisões celulares chegam através de um duto comum no interior do estômago e reto. A absorção do alimento ocorre diferentemente nas espécies, podendo ocorrer nos cecos ou nas glândulas
- 455. Fisiologia de InvertebradosMarinhos Julho/2010 Pág. 445 digestivas. Os resíduos indigeríveis passam do estômago para o intestino e são transportados pelo ânus com auxílio de um jato d´água exalante. Crustáceos Crustáceos exploram diversas dietas e estratégias de alimentação. Alguns representantes deste filo assumiram hábitos bentônicos, e determinados apêndices tornaram-se mais fortes e adaptados para o rastejamento e a escavação. As ações de apêndices adaptaram-se para o consumo de suspensão, a predação ou a coleta de alimento, e as maxilas e a mandíbula funcionam na preensão, na mordedura e no direcionamento do alimento para a boca. O trato digestivo dos crustáceos é quase sempre reto, composto por uma boca ventral, seguida por um esôfago tubular e um estômago. Condições ácidas são criados no estômago durante a digestão, mas não tão os ácidas como na digestão humana. Nos crustáceos o pH é em torno de 4, ao contrário de 2 ou 1 em muitos mamíferos. O estômago é dividido em duas câmaras. A câmara anterior é chamada estômago cardíaco e é bastante muscular, e muitas vezes especializada para além de armazenar, também triturar o alimento. Esta trituração é auxiliada com a adição de enzimas digestivas que chegam ao estômago anterior por movimentos retrógrados do intestino. A segunda parte do estômago é chamada de estômago pilórico, sendo este menor que o primeiro. Seu revestimento cuticular frequentemente tem cerdas singulares, que agem coletivamente, como uma peneira, impedindo as partículas de alimento de deixarem o estômago antes que sejam reduzidas para um tamanho pequeno. O intestino médio de crustáceos varia em complexidade, sendo um tubo relativamente simples em algumas espécies ou partes elaboradas com divertículos anteriores e posteriores (cecos) em outros. A digestão química acontece principalmente com o auxílio de grandes glândulas digestivas esponjosas chamadas de hepatopâncreas. Este é um órgão que consiste de numerosos túbulos cegos, conectado a parte anterior do sistema digestivo por dutos. Cada túbulo é composto de células que funcionam na secreção enzimática, na endocitose e na digestão intracelular do alimento particulado, na absorção e armazenamento de nutrientes, além de participar da remoção de detritos. Como os crustáceos são primariamente aquáticos há um grande número de crustáceos filtradores e nestes, a filtração envolve cerdas em vez de cílios. O pente de cerdas localiza-se em um ou vários pares de apêndices, mas a localização varia de um grupo de crustáceos para outro. As cerdas finas funcionam como filtros na coleta de partículas alimentares, e é possível que o espaçamento das cerdas determine o tamanho da partícula coletada. Este mecanismo é realizado através de um processo em que a corrente hídrica é produzida por batimento de apêndices filtradores. As partículas coletadas são
- 456. VII Curso deInverno: “Tópicos em Fisiologia Comparativa” Pág. 446 Julho/2010 removidas das cerdas do filtro por outras cerdas em forma de pente e transportadas para as partes bucais pelos apêndices. Figura 10: Sistema digestório de crustáceos (Modificado de Hill 2008). Figura 11: Crustáceo com numerosas cerdas utilizadas para coletar algas unicelulares e pequenos animais. Estas cerdas são e