Criopreservação de sêmen e inseminação artificial em equinos

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CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN
E INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM
EQUINOS
Prof. José Antonio Ribas

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INTRODUÇÃO
 Viabilidade da criação de cavalos
= sucesso na reprodução
 Industria do cavalo - movimenta
cerca de R$ 7,5 bilhões anuais
 3,2 milhões de empregos diretos e
indiretos
 Investimento no melhoramento
genético

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INTRODUÇÃO
 1947  Barker e Gardier –
nascimento 1º potro de IA com
sêmen congelado eqüino
 Inseminação com sêmen congelado:
liberação pelas associações
 Não existe um protocolo ideal para a
criopreservação de sêmen equino
 Pesquisas relacionadas ao
congelamento e a inseminação
artificial

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Criopreservação de sêmen
 Coleta e avaliação do sêmen
1. Volume do ejaculado
2. Motilidade
3. Vigor (0.5)
4. Concentração – x 106 sptz/ml

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 Patologia espermática

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EJACULAÇÃO E O SÊMEN
 O sêmen
• Avaliação
• Macroscópica
• Microscópica
• CBRA/MA
• Mot. Prog >70%
• Vigor > 3
• Defeitos
Totais < 40%
Maior < 20%

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 Sêmen refrigerado
 Sêmen mantém a viabilidade  tempo
 Porque é desejável refrigerar o sêmen
  o metabolismo do sptz a temperatura
corporal e ambiente é máximo.
  produtos do catabolismo do sptz (ác.
lático e/ou CO2)  a acidez do meio 
danos as células espermáticas.
 peroxidação das membranas lipídicas
 danos as células espermáticas.
 Limitações
 Choque térmico: alterações no
espermatozóides quando eles são
rapidamente resfriados da temperatura
corporal até próximo a 0C
 Choque osmótico

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Sêmen refrigerado
 SPTZ para cada 15C de redução
 o metabolismo é reduzido em
45%.
 SPTZ armazenados a 5C 
requerimentos metabólicos serão
apenas de 10%
 Faixa crítica = 19 a 8C
 SPTZ são insensíveis a
velocidade de resfriamento até
atingir 19C
 A partir de 19ºC  veloc.
0,05C/min.

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Sêmen refrigerado
 Diluição 1:1 – Utilização 24-48 h
 Efeitos do choque térmico podem ser
minimizados pela
 adição de lipídios (gema de ovo),
lipoproteínas (leite)
 velocidade de refrigeração lenta
 Diluidor mais utilizado: diluidor de
Kenney (1975)
 Glicose - 49g
 Leite desnatado - 24g
 Bicarbonato de sódio a 10% - 7,5ml
 Gentamicina - 200mg
 Água bidestilada - 1000ml
 Doses inseminates: 109, 10 a 30 mL

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Sêmen refrigerado
 Refrigeração computadorizada
 Unidades de refrigeração e
conservação (contêiner):
 Equitainer I, II e III
 ExpectaFoal
 Equine Express
 Salsbro Box (contêiner sueco)
 Celle container (container alemão)
 Botutainer, Botubox (containers
brasileiros)

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Sêmen Congelado
 Grande vantagem de conservação
de sêmen por tempo indeterminado
 Forma de seguro reprodutivo do
animal
 Causa graves lesões ao
espermatozóide
 Apenas 24% dos garanhões
apresentam boas taxas de
concepção
 Não existe um protocolo ideal

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SÊMEN
COLETA
(VAGINA ARTIFICIAL)
FILTRAÇÃO
EXAME AO
MICROSCÓPIO
ÓPTICO
ANÁLISE
ESTOCAGEM
CÂMARA NEUBAUER
CENTRIFUGAÇÃO
LÍQ.
N 2
100 Msptz/ml
RESSUSPENSÃO
EXAME AO
MICROSCÓPIO
ÓPTICO
REVITALIZAÇÃO
37 ºC/30 seg.
CONCENTRAÇÃO
> 300 Msptz/ml
SOBRENADANTE
PRECIPITADO
DILUIÇÃO
CONCENTRAÇÃO
< 300 Msptz/ml
DESCARTE
Fluxograma do
método utilizado na
coleta, diluição,
congelamento e
revitalização das
amostras de
sêmen.




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Sêmen Congelado
 Centrifugação
 Pickett et al. (1975) concluíram que as
centrifugações entre 370 e 829x g não
produziram efeito deletério no sêmen
 Jasko (1994); Heitland et al. (1996) -
400 a 550 x g
 Períodos de centrifugação acima de 12
minutos - alta taxa de recuperação
espermática mas predispõem as
células a injúrias
 Recomendável: 600x g por dez minutos
 recuperação espermática de 87%
 sem alterações significativas nos
parâmetros espermáticos
(Dell´Aqua Jr., 2000)

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Sêmen Congelado
 Diluidores
 Tampão, antibióticos, gema ou
leite, açucares e crioprotetor
 Avanços na composição dos
diluidores
 Açucares: lactose, rafinose e
trealose
 AA: glicina
 Lipoproteínas de baixa densidade
da gema, lecitina de soja

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Sêmen Congelado
 Crioprotetores
 Glicerol
 Dimetilformamida
 Metilformamida
 Dimetilacetamida
• Menor viscosidade associada ao seu menor peso molecular
• Melhor permeabilidade destes crioprotetores através da
membrana plasmática, induzindo conseqüentemente um menor
dano osmótico
 Resultados
 Melhorou de 27% para 50% a motilidade do sêmen de garanhões
da raça Mangalarga Marchador e de 18% para 36% da Pantaneira,
30% para 40% da raça Árabe e Quarto de milha

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Sêmen Congelado
 Proteínas do plasma seminal
 Efeitos deletérios ao sêmen x benéficos
 10 KDa concentradas 10x
 Acrescentar 10%
 Melhora de até 50%
 Plasma heterólogo
 Melhorou de 26% para 40% a congelabilidade com plasma
concentrado e dimetilformamida em cavalos Pantaneiros

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Sêmen Congelado
 Onde congelar
 Pallhetas de 0,5 mL
 Palhetas de 0,25 mL
 Macrotubos

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Efeito de solução
x
Formação de gdes cristais de gelo
•Grande desidratação sptz
•Exposição a condições osmóticas
extremas
•Menor desidratação sptz
•Predisposição a formação de
cristais de gelo intracelulares
Efeito de solução
Lesão pela formação dos cristais

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Sêmen Congelado
 Máquinas para congelamento- TK3000® - TK
 Máquina Sousa (Patente) - tecnologia em congelação

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Curvas de congelamento e
descongelamento compatíveis
Congelamento
-196ºC
Descongelamento 37ºC
descongelamento
ótimo
muito rápido
muito lento
adaptado de Amann and Pickett, 1987

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Sêmen Congelado
 Descongelamento
 Rápido x lento ?
 37º C / 30 seg.
 46ºC / 20 seg.
 75°C / 7 seg.
 98ºC/ 4 seg.

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Sêmen Congelado
 Equipamentos de descongelamento
Controlador de
Temperatura
Termômetro
Digital
Controlador
Eletrônicodo
TIMER
Controlador
Eletrônicodo
Nívelador
Transformador
1 1
2
3
3
4
5
6
7
8
9
11
10

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Inseminação Artificial
 Entende-se por inseminação
artificial o depósito mecânico de
sêmen no aparelho reprodutivo
da fêmea
 Vantagens da utilização de um programa de I.A. na
espécie eqüina.
 Melhor aproveitamento do Garanhão
 Evita doenças transmissíveis através da cobertura
 Evita ferimentos durante a cobertura do garanhão e
da égua

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• Identificação do cio

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• Preparo para I.A.
 24 hs antes da ovulação
 Folículo pré-ovulatório (35 mm ou maior)
 Uso de 2500 a 3300 UI de hCG
 Ovulação em 24-48 h

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Inseminação imediatamente antes ou após a ovulação
Sobrevida em horas
Sêmen cong./descong.:
 12 h   4-6 
----------------------------------
Ov!
 ========= % gest. =====
Sêmen I.A. fresco ou Monta natural
 48 h { 8 }
----------------------------------------------------------
Ov!
==================== % gestação =====

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 Anatomia dos órgãos genitais da égua

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 Inseminação clássica

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• Dose inseminante
•Doses reduzidas
250 a 400 X106 sptz/ml (mot)
CBRA / MA 200X106 sptz/dose (mot)
350 a 1000 X106 sptz/ml (600)
CBRA / MA 200X106 sptz/dose (mot)

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 Motivos da diminuição da fertilidade
 sptz demoram em atingir o
oviduto
 diminui sua capacidade de se
aderirem com as células
epiteliais do oviduto (Bader,
1982)
 alterações membrana ≈
capacitação   Sobrevida

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 Inseminação histeroscópica
 o sêmen depositado próximo ao oviduto, sobre a junção útero-
tubárica (papila), através de um aparelho de endoscopia via lumen
uterino

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 Fibroendoscópio
 Redução da quantidade de espermatozóides: 5 a 40 x 106
 Deposição ipsilateral da ovulação
 Sêmen sexado

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 Inseminação no corno uterino através do desvio da pipeta
 IA no ápice do corno
 Utilizada para sêmen com baixa motilidade e concentração
 Incremento de até 60% nas taxas de prenhez
 Pouco inferior a
histeroscópica
 Maior reação inflamatória

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 Inseminação Intrafolicular/ Intratubária / Intraperitonial
 Experimentais
 Utilizadas em outras espécies
 Bons resultados

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Considerações finais
 Importante para manter
a lucratividade de um
haras
 Novas biotécnicas da
reprodução

40
Muito obrigado!
ribasjas@vm.uff.br

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