Genotipagem de 10 isolados de Cryptococcus neoformans encontrados em fezes de pombos na cidade de Manaus, Brasil. Todos os isolados foram identificados como genótipo VNI através do método de PCR-RFLP (URA5), que se mostrou eficaz para caracterizar isolados ambientais deste fungo patogênico. Os resultados fornecem informações úteis para estudos epidemiológicos sobre as fontes de infecção por C. neoformans na região.

1. GENOTIPAGEMPCR-RFLP (URA5) DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
ISOLADOS EM FEZES DE POMBOS (COLUMBIA LIVIA) NO CENTRO URBANO DE
MANAUS.
Amaury dos Santos Bentes(1); Ana Karla Lima Freire(1); João Fernando Vieira
Ennes(2);Lauriane Conceição Lima(2); João Vicente Braga de Souza(3)
(1)
Universidade do Estado do Amazonas/Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado; (2)Universidade Paulista(3)Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia
Introdução: O Cryptococcus neoformans é um fungo leveduriforme
patogênico, cosmopolita e na forma parasitária apresenta uma cápsula que
desempenha um papel crítico na virulência do fungo. É responsável pela
micose sistêmica associada a condições de imunodepressão celular conhecida
como Criptococose. Leveduras pertencentes a este gênero estão distribuídas
na natureza, associadas a resíduos orgânicos, sendo principalmente
encontradas em excretas de aves, sobretudo de pombos (Columbia livia).
Objetivo: Genotipagem de Cryptococcus neoformans isolados de fezes de
Pombos (Columbia livia) do Centro Urbano de Manaus. Métodos e
Resultados: Neste projeto, um total de 10 isolados de C. neoformans de fezes
de pombos (Columbia livia)da praça São Sebastião em Manaus-AM,
pertencentes a coleção de fungos do Laboratório de Micologia do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA foram identificados pelo método de
PCR-RFLP (URA5).As amostras que estavam conservadas em água destilada
foram reativadas em meio de cultivo ágar níger, posteriormente foram
identificados pelo meio CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol)
confirmando que todas as amostras pertenciam à espécie C. neoformans.Para
a extração de DNA, os isolados foram transferidos para meio de cultivo ágar
Sabouraud líquido. Em seguida foi procedida a extração de DNA pelo sistema
de extração DNeasyBlood e Tissue Kit (QIAGEN Group - DU BeckmanInstruments, Inc.) e foi realizada conforme protocolo do fabricante. As
mostras de DNA, após análise da concentração e pureza, foram submetidas à
amplificação por PCR-RFLP (URA5) com solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH
8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 U de Taq DNA
polimerase (Recombinante Invitrogen) e 50 ng de cada primer, URA5 (5´ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC´-3). A PCR foi realizada em
termocicladorVerite 96, AppliedBiosystens, foi iniciada com 2 min de
desnaturação (94ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94ºC, 30 s de
anelamentoà 61 ºC e 1 min de extensão à 72ºC, por fim foi realizado uma etapa
de extensão final de 10 min à 72ºC. 8μL dos produtos de PCR foram
misturados a 1 μL de tampão da enzima HhaI e digeridos duplamente com
Sau96I (10U/ μL) e HhaI (20U/ μL) por 3 horas e separados por eletroforese em
gel-agarose1,5% a 100 V por 40 minutos. Os padrões de RFLP foram
visualizados e comparados com os padrões obtidos das cepas de referência
(VNI-VNIV e VGI-VGIV). Com o método de PCR-RFLP (URA) foi possível
genotipar as 10 amostras de C. neoformans, sendo todas caracterizadas como

2. Cryptococcus neoformansgenótipo VNI. Conclusão:O método de PCR-RFLP
(URA5) se mostrou um excelente método para a caracterização de isolados
ambientais de Cryptococcus neoformans. Esses dados são importantes para
estudos epidemiológicos e estudos das possíveis fontes de infecção desta
levedura patogênica nas regiões da cidade de Manaus. Apoio Financeiro:
CAPES e FAPEAM