1. O documento descreve uma pesquisa sobre a dinâmica e estrutura das comunidades de bactérias e archaea na represa de Itupararanga, SP. 2. Amostras de água foram coletadas em dois pontos da represa em diferentes profundidades e analisadas por qPCR e DGGE. 3. Os resultados mostraram maior número de bactérias em uma profundidade de 4m no ponto da barragem, e archaea foram encontradas em ambos os pontos, indicando que esses organismos se distribuem em diversos ambient

1. III Seminário de Pesquisa da APA Itupararanga:
Água e Saneamento, desafios à conservação
28 e 29 de Novembro de 2012
Sorocaba - SP
Dinâmica e Estrutura da Comunidade Procarionte na Represa de
Itupararanga - SP
Laís Américo Soares 1; Emiliana Manesco Romagnoli2, Maria do Carmo Calijuri 3, André
Cordeiro Alves dos Santos1 (1 Universidade Federal de São Carlos – campus – Sorocaba;
2
Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz – Esalq/USP; 3 Departamento de
Hidraulica e Saneamento EESC/USP)
americo.lais@gmail.com
RESUMO
As comunidades microbianas em reservatórios sofrem alterações de acordo com as propriedades
do corpo d’água no qual se inserem, podendo causar doenças à população que estão em contato
com a água destes reservatórios. Com este trabalho, objetivou-se determinar a riqueza de
bactérias e archaea em dois pontos do reservatório de Itupararanga ao longo da coluna d’água.
Para tanto amostras de água foram coletadas na barragem e na entrada da represa (seis e três
profundidades respectivamente) e filtradas com membrana de poro 0,22µm. O DNA microbiano foi
extraído da membrana, quantificado por Reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR)
e a estrutura da comunidade foi analisada por eletroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE). O maior e o menor número de bactérias (6,79.10 7 e 2,16.107) foram encontrados em
uma profundidade de 4M no ponto da barragem e da entrada, respectivamente. Apesar de
diversos trabalhos considerarem a ocorrência de Archaea apenas em condições extremas, foram
encontradas até 57 comunidades deste domínio em ambos os pontos de estudo, indicando que
estes organismos, assim como as bactérias, distribuem-se nos mais diversos ambientes.
Palavras – Chave: Archaea; Bacteria; PCR/DGGE/PCR tempo real.

2. 1. Introdução
Os organismos procariontes são distribuídos em dois domínios: Bacteria, cujos
organismos são conhecidos desde o século XIX; e Archaea, descoberto a partir da
metade do século XX (Woese e Fox, 1977). Apesar das comunidades serem conhecidas,
as condições de sobrevivência, tipos de metabolismo e interação entre bactéria e
arquéias em condições naturais é pouco entendido (Beman et al., 2011)
Por terem sido encontradas em condições extremas, inicialmente acreditou-se que as
Archaea ocorriam apenas em ambientes muito específicos, como em altas temperaturas e
salinidade, baixo pH e sob efeito de elevada pressão. No entanto, estes organismos têm
sido encontrados em diversos ambientes, como sedimento de manguezais (Taketani, et
al., 2010); solos alagados amazônicos (Pazinato, et al., 2010); água marinha litorânea
(Cury, et al., 2011); em associação com corais (Lins de Barros, et al., 2009) e em rumem
de cabras (Cunha, et al., 2011).
Embora apenas parte da diversidade de bactérias planctônicas seja conhecida, este
grupo é melhor caracterizado do que o domínio Archaea, além disso várias espécies já
foram isoladas e seus papéis no metabolismo do ecossistema já foi desvendado porém há
um número ainda muito maior de espécies desconhecidas e com papel no ecossistema
não compreendido.. Portanto, o estudo das comunidades de microrganismos procariontes
em ambientes aquáticos continentais além de permitir o melhor entendimento do
metabolismo aquático é também importante na descoberta de uma biodiversidade que
tem influência em todos os processos de manutenção deste ecossistema.
2. Material e Métodos
2.1. Área de Amostragem
O reservatório de Itupararanga localizado no interior de São Paulo pertence à Unidade de
Gerenciamento Hídrico - 10 (UGRHI -10). A UGRHI-10 compreende a bacia do rio
Sorocaba e possui área de drenagem de 11.829Km2, sendo 17,5% de sua extensão
coberta por vegetação nativa, e população de aproximadamente 1.811.904 habitantes.
A represa de Itupararanga apresentou em 2009 o melhor índice de qualidade da água da
UGRHI-10 apesar de também ter sido observado, a partir deste ano, o predomínio de
cianobactérias na comunidade fitoplanctônica (Relatório de situação dos recursos
Hidricos-2010) podendo ocasionar aumento no processo de eutrofização do reservatório
que atualmente classifica-se como mesotrófico.

3. Foram coletadas amostras de água com garrafa de Van Dorn e sedimento com Draga de
Birke-Eckman em dois pontos ao longo da represa de Itupararanga, na entrada dos rios
(Trans) e próximo à Barragem do reservatório (Estação de coleta 3 - EC3), conforme a
figura 2.
Figura 1: Estações de amostragem: EC3- Barragem e Trans - Entrada dos rios.
Na estação de coleta Trans foram amostradas águas de três profundidades, superfície,
meio e fundo (0,0 m; 4,0 m; 8,0m), enquanto que na EC3, por apresentar maior
profundidade com relação ao ponto anterior, as amostras de água foram retiradas de
cinco profundidades (0,0 m; 2,0 m; 4,0 m; 10,0 m; 15,5 m), conforme figura 3.
Figura 2: Esquema de amostragem de água nas duas estações de amostragem, Trans e EC3 nas
diferentes profundidades.

4. As coletas ocorreram no dia 16 de abril de 2012, na EC3 às 14h00min e na estação Trans
por volta das 15h30min. No momento da amostragem havia sol com nuvens e vento forte.
As amostras de água e sedimento coletadas nos dois pontos, Trans e EC3, foram
armazenadas à 4ºC até o momento das análises.
As análises físico-químicas, temperatura, pH, condutividade e concentração de nutrientes
foram realizadas no momento da coleta Através de sonda multiparâmetros e
posteriormente no Laboratório de Microbiologia Ambiental do Campus Sorocaba da
UFSCar e no Laboratório de Hidráulica e Saneamento da Escola de Engenharia de São
Carlos da USP através de métodos padrão APHA (2005)
Amostras de DNA presentes na água dos dois pontos nas diferentes profundidades foram
extraídas com o Kit para isolamento de DNA metagenômico de água (Epicentre), segundo
o protocolo do fabricante.
A região V6 do gene 16S do rDNA de Bacteria foi amplificada com os iniciadores:
U968FGC e 1378 e Archaea em duas etapas, a primeira com ARCH21F ARCH 958R e a
segunda reação (nested PCR) com: ARCH340FGC e ARCH519R .
Para as análises de DGGE, os produtos de PCR de Bacteria foram aplicados em gel de
eletroforese com 8% de acrilamida, bisacrilamida (37,5:1) à um gradiente 30% a 60% de
formamida e ureia, em que 100% de desnaturação apresentam 7M de ureia e 80% de
formamida . A eletroforese foi realizada a 180V e 60ºC por 4 horas. Para o domínio
Archaea, os produtos da PCR foram adicionados em gel de eletroforese com 8% de
acrilamida:bisacrilamida, em um gradiente de 15% a 55% de formamida e ureia. A
eletroforese foi realizada durante 3,5 horas a 200V e 60 ºC.
Para quantificação do gene 16S DNAr foi realizada reação em cadeia de polimerase em
tempo real (qPCR) no laboratório de Genética da Esalq/USP. As reações foram feitas em
duplicata e corridas no equipamento Bio-Rad iQ5 Optical System. Os iniciadores usados
para Bacteria foram: P1 (5’- CCT AGC GGA GGC AGC AG - 3’) e P2 (5’ - ATT ACC GCG
GCT GCT GG – 3’).

5. 3. Resultados e Discussão
Nas duas estações de amostragem ocorreu estratificação química na concentração de
oxigênio dissolvido, com maiores concentrações na superfície: 8,29 mg.L -1 e 5,65 mg.L-1,
e menores na região próxima ao sedimento: 1,40 mg.L -1 e 2,5 mg.L-1, EC3 e TRANS,
respectivamente.
Não foi encontrada condição anóxica próximo aos sedimentos em nenhuma das estações,
porém em ambas foi observada hipoxia (concentrações de 1,4 mg.L-1 em EC3 e 2,5 mg.L-
1
em TRANS) podendo estar relacionada ao descarte de esgoto sem tratamento prévio
adequado, uma vez que, segundo dados da CBH-SMT (2008), apenas 20% do esgoto
doméstico gerado na sub-bacia do Alto Sorocaba é tratado.
Os maiores valores de pH foram encontrados na superfície da estação EC3 e em TRANS
(7,34 e 6,92, respectivamente). Enquanto que na estação TRANS o menor pH foi
verificado próximo ao sedimento (6,33), e na EC3 o menor valor foi encontrado à 10
metros de profundidade (6,15) aumentando para 6,45 à 15,5 metros, região próxima ao
sedimento.
Na estação de coleta EC3 foi observada estratificação térmica, com variação de 1,69 ºC,
embora as maiores temperaturas (26,16 ºC) tenham sido verificadas à 4 metros de
profundidade nesta estação e na superfície ( 23,14 ºC) da estação de coleta TRANS, em
ambas as estações, a menor temperatura foi encontrada na região próxima ao sedimento
(22,7 ºC e 22,28 ºC, EC3 e TRANS, respectivamente).
A estação de coleta TRANS apresentou condutividade mais alta em relação à EC3, onde
o maior valor (98 µS.cm-1) foi encontrado no fundo do reservatório. Tais condições são
padrão em ambientes ou períodos com pouca influência de vento e pode ser observado
em diversos reservatórios da região sudeste do Brasil (Tundisi et al., 2004).
Na estação de coleta EC3 há predomínio de sólidos suspensos orgânicos e na TRANS de
sólidos suspensos inorgânicos. Correlação positiva foi encontrada entre sólidos
suspensos inorgânicos e quantidade de comunidades bacterianas (r=0,84 p=0,005), que
também se correlacionou com a concentração de nutrientes dissolvidos: ortofosfato
(r=0,95 p=0,005), nitrato (r=0,97 p=0,005), nitrito (r=0,92 p=0,005).
Análises de qPCR para bactéria foi realizada para ambas as estações de coleta.
Quantitativamente, na EC3 foram observadas maiores densidades de bactérias do que na
estação TRANS.

6. Na estação TRANS, a densidade de bactérias por litro de água aumentou de 4,19 x107
bactéria.L-1 na superfície para 6,55 x107 no fundo. Já na EC3 na superfície foi encontrada
6,64 x107 bactérias e no fundo 4,89 x107.
A técnica de DGGE permite separação dos fragmentos de DNA com sequências
nucleotídicas distintas, porém com a mesma quantidade de pares de base, devido ao
gradiente de desnaturação cuja dupla hélice do DNA é submetida. Para o domínio
Bacteria, o gradiente desnaturante (ureia-formamida) aplicado foi de 30 a 60%.
A partir das análises da eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) pode-se
verificar a presença de comunidades de organismos dos domínios Archaea e Bacteria na
coluna d’água da represa de Itupararanga. No entanto, a riqueza (quantidade de
comunidades) de bactérias foi maior do que a de arqueias.
A presença de Archaea em ambientes aquáticos continentais como rios já foi observada
(Fan et al, 2010), porém não há, até o momento, outros relatos na literatura da presença
de Archaea em reservatórios e devido ao pouco conhecimento sobre seu metabolismo
esta presença pode abrir novas alternativas para se entender a dinâmica do metabolismo
destes ecossistemas (Dolan, 2005).
A partir da distribuição da comunidade pode se afirmar que a comunidade de Archaea é
relacionada a profundidade do reservatório, enquanto que a comunidade de Bacteria
sofre, além desta, influencia de outras variáveis como, por exemplo, a disponibilidade de
nutrientes.
Em trabalhos recentes (Barberán e Casamayor,2011) foi observado o endemismo de
bactérias em algumas profundidades em ambientes de águas continentais estratificados e
com camadas anóxicas, porém neste trabalho os dados preliminares parecem indicar uma
maior homogeneidade entre as comunidades observadas nas diversas profundidades.
As Archaea não extremófilas mais descritas na literatura são espécies metanogênicas, as
quais são anaeróbias estritas ou facultativas, com isso esperava-se encontrar maior
riqueza deste grupo em regiões profundas do reservatório, no entanto, foram observados
filotipos em todas as profundidades analisadas da coluna d’água o que pode indicar
outros tipos de metabolismos.
Estudos mais aprofundados sobre a composição especifica destas comunidade já estão
sendo realizados para permitir um melhor entendimento da contribuição desta diversidade
no metabolismo do ecossistema.

7. 4. Conclusões
 Foram encontradas comunidades de Archaea e Bacteria em ambas as
estações, nas diferentes profundidades de coleta;
 A presença de comunidades de Archaea em reservatórios, apesar de ser
esperada, não foi ainda reportada na literatura.
 Foi observada uma maior riqueza (número de comunidades) de Bacteria em
relação à Archaea em ambos as estações de coleta;
 As comunidades de Bacteria foram mais similares entre as profundidades do
que as comunidades de Archaea;
 Existe um padrão de distribuição claro das comunidades de Archaea em
relação a profundidade. Esta distribuição não foi observada para bactéria,
porém esta comunidade parece estar relacionada com maiores
concentrações de nutrientes.
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