1. UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIVISÃO DE PESQUISA
MICHELL GLEISON SÁLES CARDOSO
ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS E
ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DOS GALHOS DE H. crenata Pohl ex Benth
MACAPÁ
2013

2. MICHELL GLEISON SÁLES CARDOSO
ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS E
ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DOS GALHOS DE H. crenata Pohl ex Benth
Plano de Trabalho submetido ao
Programa Institucional de Iniciação
Científica da Secretaria de Ciência e
Tecnologia do Amapá –
SETEC/FAPEAP
MACAPÁ
2013

3. SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................05
2 HIPÓTESES..........................................................................................................06
3 OBJETIVOS..........................................................................................................07
4 JUSTIFICATIVA....................................................................................................08
5 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................09
6 PROBLEMA...........................................................................................................12
7 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................13
8 ANÁLISE DE DADOS............................................................................................17
9 CRONOGRAMA....................................................................................................18
REFERÊNCIAS........................................................................................................19

4. 5
1 INTRODUÇÃO
A preocupação com a cura de doenças sempre se fez presente ao longo da
história da humanidade, muito antes do surgimento da escrita. Por esse motivo,
diversas espécies vegetais amazônicas têm despertado o interesse de estudos
científicos nas mais diversas áreas, dentre as quais se destacam aquelas com o
caráter medicinal e com propriedades terapêuticas, fomentando assim o interesse
pela investigação de espécies vegetais da Região Amazônica, dando um enfoque
maior naquelas que possuem um expressivo potencial farmacológico.
No Estado do Amapá as atividades de cultivo de plantas que possuem
finalidade terapêutica têm crescido de maneira substancial. Conforme menciona
Carvalho (2010), as práticas que associam as atividades de extração e manejo
sustentável dos produtos florestais, com processos de beneficiamento, valoração e
endogeneização das funções de produção na economia local, têm sido mencionadas
como mecanismos eficazes de promoção regional de um desenvolvimento que
mantém as condições naturais do meio ambiente na Amazônia.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 80% da
população de países em desenvolvimento ainda utilizam práticas tradicionais na
atenção primária à saúde; desse total, 85% fazem uso de plantas medicinais. O
Brasil segue essa tendência mundial, incentivando o emprego de práticas
complementares nos programas de atenção à saúde (CARVALHO et al., 2007;
BARROS, 2008).
Como a exploração comercial de plantas medicinais, tanto para consumo
interno como para exportação é ainda muito limitada, visto que produção e
produtividade dependem de incentivos e estudos que possibilitem agregar valor a
estes produtos agrícolas, há necessidade de investigações fitoquímicas, além de
desenvolvimento de novas tecnologias na área de fitoterápicos para o controle de
qualidade das mesmas (CARVALHO et al. 2006).
Os resultados da pesquisa com plantas medicinais podem ter
desdobramentos em vários níveis. Individualmente, a descoberta de novos fármacos
ou de fármacos acessíveis, pode determinar a melhoria da qualidade de vida em
doenças crônicas ou a própria sobrevivência do paciente afetado. Socialmente, a
descoberta de fontes naturais e locais de compostos químicos usualmente
importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de fabricação nacional pode ter
consequências econômicas significativas, além de possibilitar a autonomia de cada
país no gerenciamento de suas políticas de saúde (ELIZABETSKY; SOUZA, 2003).

5. 6
2 HIPÓTESES
Hipótese Nula (H0): os extratos brutos não apresentam atividade antimicrobiana.
Hipótese Não-Nula (H1): os extratos brutos apresentam atividade antimicrobiana.

6. 7
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
• Realizar ensaios microbiológicos e análises físico-químicas nos galhos da
espécie Hyptis crenata Pohl ex Benth (Lamiaceae);
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar a eficiência atividade microbiológica em linhagens bacterianas gram-
positivas e gram-negativas, bem como em fungos;
• Realizar análises físico-químicas clássicas dos galhos de H. crenata tais como:
pH, teor de lipídios, resíduo por incineração, teor de carboidratos e teor de
umidade.
• Determinar biodisponibilidade mineral por espectrofotometria de absorção atômica
nos galhos de H. crenata.

7. 8
4 JUSTIFICATIVA
Pelo levantamento bibliográfico levantado para a espécie Hyptis crenata
(Pohl) ex Benth (Lamiaceae), nota-se que há informações incipientes à respeito das
atividades biológicas, do estudo químico e fitoquímico. As informações acerca de
suas propriedades terapêuticas dessa espécie se limitam ao conhecimento das
populações tradicionais, muitas das quais sem comprovações científicas sobre as
suas supostas potenciais propriedades farmacológicas, ainda que já existam
estudos comprovando sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória de seus óleos
essenciais.
É com base nestes achados que surge a iniciativa de realizar um estudo que
vise contribuir ao conhecimento das propriedades químicas e biológicas da espécie
Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae), em nível regional, agregando valores
científicos, econômicos e culturais, ainda que a sua utilização no viés do contexto
sócio-cultural ainda repouse no âmbito do conhecimento popular, difundida na região
amazônica.

8. 9
5 REVISÃO DE LITERATURA
5.1A UTILIZAÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS PELO HOMEM
O uso de plantas medicinais na cura ou alívio de doenças, que para muitos
poderia parecer misticismo, feitiçaria ou folclore, torna-se hoje objeto de pesquisas
científicas com validade comprovada diante da fitoquímica e da farmacologia. Desta
forma, define-se o conceito de plantas medicinais como toda e qualquer planta que
atue de maneira benéfica no combate ou minimização de qualquer malefício no
organismo humano (BARLEM et al., 1995; MARTINS et al., 2005).
A planta denominada papoula (Papaver somniferum L.) é um exemplo de que
as plantas medicinais possuem componentes capazes de aliviar dores; dela foi
isolada em 1806 a morfina, utilizada até hoje nos tratamentos da dor, e tem papel
importante para os pacientes terminais diagnosticados com vários tipos de câncer,
por amenizar as dores intensas peculiares a estas enfermidades (RODRIGUES et
al., 2010).
Essa interseção da etnografia médica e estudos biológicos de ação
terapêutica é denominada de Etnofarmacologia, ou seja, uma exploração
transdisciplinar que abrange as ciências biológicas e sociais. O objetivo principal da
etnofarmacologia foi para descobrir novos compostos, derivados de plantas e
animais utilizados nos sistemas médicos indígenas, que podem ser empregados no
desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos. A exploração etnofarmacológica,
envolvendo ambas as visitas de campo, bem como a pesquisa experimental levou
no passado a informações altamente valiosas sobre plantas medicinais usadas em
diferentes culturas, onde muitos foram desenvolvidos em novas drogas
(CUNNINGHAN; MENEZES, 2011).
O interesse pela elucidação dos constituintes do metabolismo secundário das
plantas tem estimulado a busca, nos vegetais, de compostos com atividades
farmacológicas. A fitoquímica tem colaborado para o conhecimento da constituição
química dos vegetais, suas propriedades e funções, direcionando sua utilização,
seja como alimentos ou fármacos, confirmando ou não sua indicação no
conhecimento popular (BEZERRA et al., 2011).
5.2 ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS NATURAIS
A busca por novos compostos antimicrobianos é particularmente motivado
pela grande diversidade de espécies de plantas brasileiras cujas atividades

9. 10
biológicas são completamente conhecidas. Extratos de plantas e óleos essenciais
têm sido amplamente relatado para inibir o crescimento de ambos os fungos e
bactérias (RAMOS et al., 2009).
As propriedades antimicrobianas de substâncias presentes em extratos e
óleos essenciais produzidos pelas plantas como uma consequência do metabolismo
secundário, também são reconhecidas empiricamente há séculos e foram
comprovadas cientificamente apenas recentemente. Uma vez que as plantas
medicinais produzem uma variedade de substâncias com propriedades
antimicrobianas, é esperado que programas de triagem possam descobrir
compostos candidatos para o desenvolvimento de novos antibióticos (DUARTE,
2006).
5.3 A ESPÉCIE Hyptis crenata Pohl ex Benth (Lamiaceae)
A espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth pertence à família Lamiaceae e à
ordem Lamiales – segundo classificação taxonômica proposta por Dahlgren. Esta
família é constituída por ervas, arbustos ou árvores (FALCÃO, 2003) e compreende
mais de 252 gêneros e 7.000 espécies (HUSSAIN, 2009).
O gênero Hyptis compreende cerca de 400 espécies (MAIA et al., 2001;
ANDRADE et al., 2002 apud REBELO et al., 2008) é exclusivamente neotropicais,
distribuídas desde o sul dos Estados Unidos e Caribe até a Argentina, excluindo-se
somente o extremo sul. Algumas espécies invasoras são bem estabelecidas na Ásia,
África e norte da Austrália. O centro da diversidade do gênero se encontra nos
campos cerrados do Brasil Central, mais especificamente nos estados de Minas
Gerais, Bahia e Goiás (FALCÃO, 2003).
Já descrita por Corrêa à espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae)
é uma planta aromática e medicinal (BRAVIM, 2008) e é conhecida como "salva-do-
marajó", "salsa-do-campo" ou "hortelã-do-campo” e utilizada pelas comunidades
ribeirinhas como especiarias para aromatização de alimentos e na medicina como
antiinflamatória (REBELO et al., 2009).
O chá de suas folhas é usado popularmente como sudorífico, tônico,
estimulante, para tratar inflamação dos olhos e garganta, constipação e artrite
(BERG, 1993 apud BRAVIM, 2008). Além do chá, suas folhas são utilizadas como
repelente de insetos quando friccionadas sobre a pele (BRAVIM, 2008). O néctar de
suas flores é utilizado para a produção de mel (BRAVIM, 2008). O óleo e extrato
apresentam atividade antioxidante e citotóxica (REBELO, 2009). Estudos sobre a

10. 11
composição química de seu óleo essencial demonstraram a riqueza de
monoterpenos e sesquiterpenos (SCRAMIN et al., 2000; ZOGHBI et al., 2002).

11. 12
6 PROBLEMA
Diante do levantamento bibliográfico realizado neste projeto, observou-se que
existem muitos estudos envolvendo a família Lamiaceae, o gênero Hyptis e as suas
espécies. Esses estudos tem mostrado a ampla utilização das espécies do gênero
Hyptis principalmente na fitoterapia e medicina popular.
Regionalmente, porém, os estudos de atividade biológica e fitoquímica
envolvendo a espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae) ainda são muito
incipientes necessitando de investigações científicas que venham contribuir
principalmente no campo da farmacologia de produtos naturais, percebendo assim a
escassez de informações a respeito das atividades biológicas, de estudo químico e
fitoquímico encontradas na estrutura da planta em análise, a salva-do-Marajó,como
é conhecida popularmente. Informações estas que se limitam ao conhecimento das
populações tradicionais, muitas das quais sem comprovações científicas acerca das
suas supostas potenciais propriedades farmacológicas, ainda que já existam
estudos comprovando sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória de seus óleos
essenciais.
Que componentes químicos bioativos estão presentes em seus galhos? Quais
grupos de metabólitos são potencialmente ativos na condição de princípios ativos
com atividade farmacológica considerável? Seu extrato inibe pragas em outras
plantas?
Com essa pesquisa pretende-se averiguar quais as propriedades químicas e
biológicas que os galhos dessa espécie podem oferecer na condição de droga
vegetal no que se refere ao seu uso enquanto planta medicinal, através da
investigação experimental na busca da confiabilidade dos resultados encontrados
após a conclusão do projeto.

12. 13
7 MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo tem caráter experimental, exploratório e de natureza quali-
quantitativa.
As análises físico-químicas e a avaliação da atividade antimicrobiana serão
realizadas nos laboratórios de Química e Microbiologia, respectivamente, da
Universidade do Estado do Amapá (UEAP). A análise de metais através da
espectrofotometria por absorção atômica será feita em parceria com a Universidade
Federal do Amapá (UNIFAP), no Laboratório de Bioprospecção e Absorção Atômica.
Esta pesquisa utilizará micro-organismos (fungos e bactérias), onde serão
adquiridos do Laboratório de Farmacognosia e Fitoquímica da Universidade Federal
do Amapá (UNIFAP).
7.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS
Os galhos serão secos à temperatura ambiente e em seguida fragmentados
mecanicamente em moinho de facas. Este será submetido a um processo de
extração etanólica a quente sob refluxo à 45 °C, durante 45 minutos, sendo este
processo repetido 3 vezes. Em seguida, o material será filtrado e o extrato etanólico
obtido será concentrado em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, obtendo-se
assim, os Extratos Brutos Etanólico dos galhos de H. crenata (EBEGHC)
(FALKENBERG et al., 2003; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010; KIANTIKOSKI,
2011). Os EBEFHC e EBEGHC foram utilizados para a triagem fitoquímica. Apenas
o EBEFCH foi utilizado nos ensaios antimicrobianos.
Para a obtenção do extrato aquoso, o material vegetal moído (galhos) será
submetido à extração aquosa à quente sob refluxo, em 45 °C, durante 45 minutos,
em 700 mL de água destilada. O extrato aquoso será obtido por filtração simples e
seco à temperatura ambiente obtendo-se assim, o Extrato Bruto Aquoso dos Galhos
de H. crenata (EBAGHC) (TREVISAN, 2010).
Os EBEGHC e EBAGHC serão utilizados para os testes antimicrobianos.
7.2 ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA
Entre os parâmetros físico-químicos que serão avaliados nesta pesquisa
estão o pH, teor de lipídios, teor de cinzas e umidade. As análises seguirão as
recomendações de Macêdo (2005), as normas do Instituto Adolfo Lutz (2008) e da
Farmacopéia Brasileira (2010) e realizadas em triplicatas.

13. 14
7.2.1 Determinação de pH
A determinação de pH, será feita de acordo com Macêdo (2005) e com as
normas estabelecidas pelo Instituto Adolfo Lutz (2008). Serão pesados 10 g do
material vegetal em um béquer e diluídos com auxílio de 100 mL de água. O
conteúdo será agitado até que as partículas fiquem uniformemente suspensas. O pH
será determinado utilizando-se um aparelho pHmetro previamente calibrado,
operando-o de acordo com as instruções do manual do fabricante.
7.1.2 Determinação de Lipídios
Serão pesados 2 a 5 g do material vegetal em cartucho de Soxhlet ou em
papel de filtro e amarrados com fio de lã previamente desengordurado. O cartucho
ou o papel de filtro amarrado será transferido para o aparelho extrator tipo Soxhlet.
O extrator será acoplado ao balão de fundo chato previamente tarado a 105° C. Será
adicionado éter em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio adaptando-se a
um refrigerador de bolas. O aquecimento será mantido em chapa elétrica em
extração contínua por 8 (quatro a cinco gotas por segundo) ou 16 h (duas a três
gotas por segundo). O cartucho ou o papel de filtro amarrado será retirado, o éter
destilado e o balão com o resíduo extraído transferido para uma estufa a 105° C,
mantendo por cerca de 1 h. Após, este material será resfriado em dessecador até a
temperatura ambiente. Este será pesado repetindo-se as operações de aquecimento
por 30 min. na estufa e resfriamento até peso constante (no máximo 2 h).
Cálculo:
= % LIPÍDIOS, m/m
Onde:
N = massa em g de lipídios
P = massa em g da amostra
7.1.3 Determinação de Resíduo por Incineração – Cinzas Totais
As cinzas totais incluem cinzas fisiológicas e cinzas não fisiológicas. Serão
pesados, exatamente, cerca de 3 g do material vegetal pulverizado e transferindo
para um cadinho (de silício ou platina) previamente tarado. Distribuir a amostra
uniformemente no cadinho e incinerar aumentando, gradativamente a temperatura

14. 15
até, no máximo, 600 ± 25º C, até que todo o carvão seja eliminado. Um gradiente de
temperatura (30 min. a 200º C, 60 min. a 400º C e 90 min. a 600º C) poderá ser
utilizado. Resfriar em dessecador e pesar. Em caso de borbulhamento, será
adicionado inicialmente algumas gotas de óleo vegetal para auxiliar o processo de
carbonização. Nos casos em que o carvão não puder ser eliminado totalmente,
resfriar o cadinho e umedecer o resíduo com cerca de 2 mL de água ou solução
saturada de nitrato de amônio. Evaporar até secura em banho-maria e, em seguida,
sobre chapa quente, e incinerar até peso constante. Calcular a porcentagem de
cinzas em relação à droga seca ao ar.
Cálculo:
= % CINZAS, m/m
Onde:
N = massa em g de cinzas
P = massa em g da amostra
7.1.4 Determinação de Carboidratos
Para determinação do teor de carboidratos, 0,5 g do material vegetal serão
pulverizados, fazendo-se a extração usando 10 mL de etanol-água destilada (8:2
v/v) por centrifugação por duas vezes e depois coletando-se os sobrenadantes. O
resíduo da extração hidroetanólica será posteriormente utilizado para a extração de
polissacarídeos com água fervente. Será utilizado um espectrofotômetro UV-visível
para a medição da absorbância e o conteúdo de carboidratos será estimado por
método colorimétrico.
7.1.5 Determinação de Umidade – Método Gravimétrico
Serão pesados cerca de 1 a 2 g do material vegetal e transferida para pesa-
filtro chato previamente dessecado. Após resfriamento em dessecador, pesar o
pesa-filtro, tampado, contendo a amostra. Um agitamento brando será feito no pesa-
filtro para que o material vegetal seja distribuída da maneira mais uniforme possível,
a uma altura ideal de 5 mm. O pesa-filtro será colocado na estufa para secagem da
amostra (geralmente a 105 °C) e por um determinado prazo, geralmente 2 h. A

15. 16
amostra será esfriada até temperatura ambiente em dessecador. Será pesada,
repetindo-se a operação até peso constante.
Cálculo:
X 100
Onde:
Pa = massa da amostra em g.
Pu = massa do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação.
Ps = massa do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação.
7.2 PESQUISA DE BIODISPONIBILIDADE MINERAL
As amostras serão calcinadas em mufla à 580-600°C durante 10-12h, até que
se constate a decomposição de toda a matéria orgânica. As cinzas obtidas serão
solubilizadas em ácido clorídrico 1:1 (v/v) e transferidas para balões volumétricos,
completando-se o volume de 100mL com água destilada. Os metais com presença
evidenciada nas amostras calcinadas serão determinados quantitativamente
empregando-se espectrofotometria de absorção atômica para Ca, Mg, Zn, Mn, Al,
Fe, Na e K (ALMEIDA et al., 2002).
7.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Para a determinação das atividades antimicrobiana, será adotada como
referência a metodologia do Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI
(2009), com algumas modificações pertinentes. Para estes testes serão utilizadas as
cepas de duas bactérias Gram-positivas, Staphylococcus aureus e Staphylococcus
epidermidis e, duas Gram-negativa, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa,
assim como para a atividade fungicida que utilizará linhagens da espécie Aspergillus
niger.

16. 17
8 ANÁLISE DOS DADOS
Para os ensaios físico-químicos clássicos e de determinação
espectrofotométrica por absorção atômica, serão utilizados testes estatísticos
convencionais como média e desvio-padrão, além de obtenção de curvas de
absorbância obtidos do equipamento e gerados em software específico. Para os
testes antimicrobianos, serão aplicados testes estatísticos de análise de variância
(ANOVA) obtidos a partir da utilização do software Biostat®
.

17. 18
9 CRONOGRAMA

18. 19
REFERÊNCIAS
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