A cromatografia líquida de alta eficiência separa componentes de uma mistura usando uma fase estacionária e móvel. A separação ocorre quando moléculas interagem de forma diferente com a fase estacionária, saindo em tempos diferentes. A cromatografia líquida moderna usa colunas fechadas, altas pressões, injeções automáticas e detectores para medir propriedades das amostras. Diferentes detectores são usados dependendo das propriedades a serem medidas.

1. Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (HPLC/CLAE)
Khauane Jansen e Lívia Abib

2. O que é Cromatografia Líquida?
 Trata-se de uma técnica físico-química para separar componentes
de uma mistura;
 Existe a fase estacionária e a fase móvel.
Também chamada
de eluente.

3. Processo de Separação
 Em t1, os compostos estão
misturados;
 Em t2, as moléculas de B
tornam-se desaceleradas;
 Em t3, as moléculas de A
estão separadas.
Figura 1 – Representação da separação de dois compostos em
uma coluna cromatográfica.
Fonte: Lanças (2016).

4. Processo de Separação
Figura 2 – Cromatograma obtido durante a
análise anterior.
Fonte: Lanças (2016).
 Componente A: menos retido na
coluna por ter baixa interação com
a fase estacionária;
 Componente B: maior interação
com a fase estacionária, sendo
mais retido na coluna.

5. Diferenças entre Cromatografia Líquida Clássica
e Moderna
CLÁSSICA
 As colunas eram tubos abertos;
 Força da gravidade ou pequenas
pressões;
 Gráfico em papel milimetrado a
partir da diferença de massa
entre o peso das vidrarias.
MODERNA
 Colunas com as extremidades
fechadas;
 Pressões elevadas;
 Injeções: automáticas ou não;
 Detectores substituíram o uso
de coletores e de balanças
analíticas.

6. Diferenças entre Cromatografia Líquida Clássica
e Moderna
Figura 3 – Etapas envolvidas na cromatografia líquida clássica.
Figura 4 - Etapas da cromatografia líquida moderna.

7. Detectores
 Medem, de maneira contínua, as propriedades da amostra,
enviado um sinal para ser registrado;
 Devem apresentar certas características;
 Classificação de acordo com a seletividade
 Classificação de acordo como tipo de resposta
Detectores universais;
Detectores seletivos.
Sensíveis à concentração;
Sensíveis ao fluxo de massa.

8. Detectores
 Detectores de absorção no UV-VIS: são os mais utilizados.
Detector UV de comprimento de onda fixo: é o mais
simples e econômico;
Detector UV de comprimento de onda variável:
possibilita a análise de amostra mais complexas que
absorvem diferentes comprimentos de onda;
Detector por arranjo de diodos (DAD): neste tipo, o
sistema óptico é invertido.

9. Detectores
Figura 5 – Representação de um detector UV de comprimento de
onda variável.
Figura 6 – Representação de um detector por arranjo de diodos.
Fonte: Swartz (2010). Fonte: Swartz (2010).

10. Detectores
 Detectores por fluorescência: a luz de comprimento de onda
adequado excita a amostra, que retorna para o estado fundamental
reemitindo comprimentos de onda maior;
 Detectores por índices de refração: acompanham a diferença do
índice de refração entre o efluente que sai da coluna e a fase móvel
pura;
 Detectores por espalhamento de luz: utilizados para analitos pouco
voláteis e termicamente estáveis;
 Detectores eletroquímicos: detectam compostos oxidáveis ou
reduzíveis.