E a pergunta que nunca quer calar é.....O que você quer medir: tamanho, concentração, fluorescência? Ao assistir este webinário você terá a oportunidade de conhecer os fundamentos básicos da técnica de NTA e sua complementariedade com a técnica de DLS e suas principais aplicações. ÁUDIO DESTA APRESENTAÇÃO EM: http://www.malvern.com/br/support/events-and-training/webinars/W140611nanoparticles-tracking-analysis.aspx

1. Apresentadora:
Msc. Geisi Rojas Barreto
Applications Scientist
Malvern Instruments, Inc.
Moderador:
Henrique Kajiyama
Technical Manager
Malvern Instruments, Inc.
Para ver a lista completa de webinários, visite nosso website:
www.malvern.com/br
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA):
Contagem, visualização e análise de tamanho de nanopartículas

2. Sumário
› Introdução à Tecnologia NTA
› Princípios Básicos do DLS
› Técnicas Complementares: NTA & DLS
› Capacidades Adicionais do NTA
› Aplicações e Benefícios

3. Nanoparticle Tracking Analysis

4. Arranjo Óptico para os Instrumentos Nanosight
› VISUALIZAÇÃO da luz espalhada das
nanopartículas no caminho da fonte do laser
Microscópio
Partículas espalham
quando laser incide
Partículas para serem
visualizadas estão suspensas
em um líquido
Fonte de Laser
(aprox. 50 µm)
Vidro Superfície Metalizada
Líquido

5. Princípio de Medição – NTA
› Nanopartículas se movem
› Movimento Browniano
› Partículas pequenas se movem mais
rápido do que partículas maiores
› Coeficiente de Difusão pode ser
calculado acompanhando e analisando
o movimento de cada partícula
separadamente, mas simultaneamente

6. Tamanho!
Como calcular
tamanho?
Mede o
Movimento
Browniano em
tempo real
Obtém o
Coeficiente
de Difusão
d(H)=
3 p h D
KB T
Princípio de Medição – NTA
KB = Constante de Boltzmann
h= Viscosidade
T = Temperatura

7. Princípio de Medição – NTA
› “Rastreamento” do Movimento Browniano de partículas individuais
para medir o coeficiente de difusão
› A aplicação da equação de Stokes-Einstein resulta no diâmetro
hidrodinâmico
Captura do vídeo
Acompanha movimento
Análise

8. Software em Ação – NTA

9. Resolução de Pico-a-Pico do NTA
-5,00E+06
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00
Particleconcentration
Particle Size (nm)

10. Tamanho Concentração
MÍNIMO: 10 – 40 nm
 Tipo de material
 Comprimento de onda e potência da
iluminação
 Sensibilidade da câmera
MÁXIMO: 1000 – 2000 nm
 Movimento Browniano
 Viscosidade do solvente
MÍNIMA: Aprox 106 / mL
 Requer maior duração da análise
MÁXIMA: Aprox 109 / mL
 Dificuldade de distinção das
partículas ao seu redor
Limites de Detecção do NTA

11. Regulamentação
 Definição de Nanomaterial pela União Europeia (2011)
 European Commission - IP/11/1202, 18/10/2011
 Revisão em 2014
 Nanomaterial é qualquer material que contenha 50% ou mais das
partículas, na distribuição de tamanho baseada em número, com uma
ou mais dimensões externas entre 1 nm e 100 nm.
http://europa.eu/rapid/press-release_IP-11-1202_pt.htm

12. Dynamic Light Scattering

13. Dynamic Light Scattering (DLS)
› DLS é uma técnica estabelecida em vários tipos
de indústrias e em inúmeras aplicações por mais
de 40 anos
› Rapidez, Reprodutibilidade e Precisão

14. Laser
Particle Size Distribution Correlation Function Intensity Fluctuation
Princípio de Medição – DLS

15. • Amostras polidispersas: tamanho médio1
• Distribuição de tamanho: razão > 3:12
• Sem informação de concentração3
Limitações do DLS
 quando o NTA pode ajudar

16. Comparação entre
DLS e NTA

17. NTA vs. DLS – Amostra Monodispersa
Análise DLS Resultado Equivalente no NTA
100 nm polystyrene reference particles in water

18. 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
50 100 200 400
Measuredparticlediameterinnm
Standard Latex Particle size in nm
NTA
DLS
Validação do NTA por DLS
 Comparação esferas de referência: 50, 100, 200 e 400 nm

19. NTA vs DLS – Amostra Bimodal
Esferas de poliestireno referência dispersas em água (100nm e 200nm)
Equipamento: Zetasizer Nano
?
› No DLS as
nanopartículas de
100 nm não são
detectadas
› Sua presença é
“mascarada” pelo
espalhamento das
nanopartículas de
200 nm

20. Data reproduced from Filipe, Hawe and
Jiskoot (2010) “Critical Evaluation of
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by
NanoSight for the Measurement of
Nanoparticles and Protein Aggregates”,
Pharmaceutical Research, DOI:
10.1007/s11095-010-0073-2
NTA (curva
vermelha) vs.
DLS (barra azul)
para misturas
de poliestireno
de diferentes
tamanhos
Mistura PSL

21. Capacidades Adicionais
do NTA
Para aqueles que precisam mais do que tamanho

22. Capacidades Adicionais
do NTA
CONCENTRAÇÃO

23. Medindo Concentração…
 Distribuição de partículas mostra
contagem em número vs tamanho da
partícula
 Mistura de esferas de 100 nm e
200 nm de látex dispersas em
água na proporção de 1:1
Com NanoSight, a análise mostra os picos tanto para 100 nm quanto para 200 nm

24. Cálculo da Concentração
› NTA mede partículas individuais em um volume
conhecido
› Extrapola-se os valores obtidos para estimar a
concentração da amostra
› Quantos agregados há na amostra?
› Qual o tamanho do meu lipossomo? (onde ele
pode ser entregue)
› Quantos existem? (quantos serem entregues)

25. Cálculo da Concentração
› NTA mede a concentração em partículas/mL
› A concentração estimada é medida por unidade
de tempo
› Portanto, partículas movendo-se para fora e
dentro do campo de visão não irão afetar na
concentração estimada

26. Concentration Measurement Of 100 nm Duke Latex
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 10 20 30 40 50 60
Theoritical concentration (E+08)particles/ml
MeasuredNTAconcentration
(E+08)particles/ml
concentration of
100 nm Duke
sample
Linear
(concentration
of 100 nm Duke
sample)
Concentration Measurement Linearity

27. Tamanho vs. Intensidade vs. Número
NanoSight possui habilidade única de plotar cada tamaho de
partícula em função da intensidade de espalhamento de luz

28. Capacidades Adicionais
do NTA
INTENSIDADE DE ESPALHAMENTO

29. • Gráficos de alta resolução:
tamanho/número/intensidade
• Alterações mínimas de
tamanho levam a altas
variações na intensidade
• Pode identificar diferentes
materiais
• Qualitativa, mas valiosa
Número
200 nm
100 nm
100 nm
dímeros?
Intensidade de Espalhamento – Um parâmetro
adicional

30. Separando Populações de Tamanhos Similares?
Mistura de Poliestireno (92nm) e Nanopartícula de ouro (90nm)
Au NP
Poliestireno

31. Capacidades Adicionais
do NTA
FLUORESCÊNCIA

32. Modo de Fluorescência
Câmera
CCD
Objetiva do
Microscópio As partículas espalham o feixe de laser
e se ela é fluoresente irá fluorescer
Sem filtro de fluorescência, toda luz é transmitida
Com o filtro de fluorescência, a luz espalhada é
bloqueada
Opção com ou sem filtro de fluorescência:

33. › 4 opções de laser disponíveis
405nm
488nm
532nm
635nm
Aumenta
Sensibilidade
para Partículas
Menores
Modo de Fluorescência

34. › Permite a medição de partículas específicas
Esferas de 100nm em 100% FBS (Fetal Bovine Serum)
Modo de luz espalhada Modo de fluorescência
(565 nm long pass)
Modo de Fluorescência
Moda: 103 nm
Concentração: 9.5 x108 partículas/mL

35. • Marcadores fluorescentes são
fotodegradados em um curto período de
tempo.
• A Bomba de Seringa, introduz
continuamente amostras novas na
câmara, expulsando o marcador “gasto”.
• Software pode distinguir o movimento
do fluxo da bomba do Movimento
Browniano e ainda calcular o tamanho da
partícula.
Modo de Fluorescência – em fluxo

36. APLICAÇÕES NTA
1. Vesículas Extracelulares/ Exossomos
2. Carreamento de Fármacos
3. Virologia/ Vacinas
4. Agregação de Proteínas
5. Nanomateriais/ Nanotoxicologia

37. APLICAÇÕES: Fluorescência
› Carreamento de fármacos
– a nanopartícula agrega no sangue?
› Vírus
› Exossomos / Microvesículas
– Identificar populações
› Marcação de anticorpos
› Fluorescência inerente
– Quantum dots

38. APLICAÇÕES: Vesículas Extracelulares
› O quê são? – partículas em Nanoescala provenientes de células
de mamíferos.
 Exossomos: 30-100 nm
 Microvesículas ou Micropartículas: 100-1000 nm
› O que fazem? Estão envolvidos na sinalização celular.
A “mensagem na garrafa”

39. Aplicações: Vesículas Extracelulares
› O quê exatamente?
› Por exemplo, doenças como o câncer, pré-eclâmpsia,
etc.
› Mas, pode me explicar um pouco mais?
› Se você entende a mensagem e de onde ela veio e para
onde ela vai, então você talvez pode diagnosticar e
tratar mais efetivamente.

40. Vesículas Extracelulares
O que
foi?
Socorro!
Preciso de
estrógeno. Vou
ovular!
› NTA “CONTA”– Pico da população de exossomos
pode estar relacionado ao aparecimento da doença
(i.e. Células que sinalizam outras de que algo está
errado)

41. Vesículas Extracelulares
› NTA mede FLUORESCÊNCIA – marcadores
exossomais alertam os pesquisadores de que a
partícula é um exossomo e não um agregado de
proteínas
› Marcadores também podem indicam a origem do
exossomo, por exemplo

42. Vesículas Extracelulares
› Alta Resolução de TAMANHO
› Subpopulações de exossomos e microvesículas
pode ter funções diferentes
› Todos esses parâmetros em APENAS UMA
MEDIÇÃO – tamanho, concentração e tipo
da população do exossomo
› Citômetros de Fluxo: medem partículas
vesiculares acima de 300 nm

43. Mistura de partículas fluorescentes
de 50 nm e de 200 nm não
fluorescentes analisadas no modo
de luz espalhada
A mesma mistura quando a luz
espalhada foi removida pelo filtro de
fluorescência
Detecção de Partículas Fluorescentes em
uma Mistura

44. VÍRUS – Desenvolvimento de Vacina +
Gene Delivery
Mistura complexa: Influenza:
Ensaios biológicos alternativos levam de 5-7 dias para
determinar a concentração viral

45. Agregação de Proteínas: Indução pelo
aquecimento
1 mg/mL de IgG – 50ºC

46. Agregação de Proteínas: Indução pelo
aquecimento

47. Instrumentos NTA Nanosight em todo o mundo
18
700+ equipamentos
1440+ publicações

48. Matrix de Complementaridade
Faixa de Tamanho
Amostras monodispersas
Fluorescência
Concentração
(partículas/mL)
Ver é crer!

49. DLS NTATécnicas
Complementares

50. Informações de contato
› Apresentadora: Geisi Rojas Barreto
 Email: geisi.barreto@malvern.com
› Moderador: Henrique Kajiyama
 Email: henrique.kajiyama@malvern.com
Agradecemos pela sua participação
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