PREPARAÇÃO DE NANOBIOCONJUGADOS DE 
NANOESTRELAS DE OURO E TIROSINASE PARA 
DESENVOLVIMENTO DE SENSORES 
Rui Pedro Fernand...
Introdução 
Nanotecnologia: um campo multidisciplinar! 
Bionanoconjugados 
nanopartículas com biomuléculas 
adsorvidas à s...
Sumário 
1. Síntese de núcleos de crescimento; 
2. Síntese de Nanoestrelas; 
3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoes...
1. Síntese de núcleos de de crescimento 
Funcionalização com PVP: 
• 60 moléculas / nm2 
N O 
H 
H 
n 
Diâmetro médio 
13,...
2. Síntese de Nanoestrelas 
Método de Liz-Marzán 
Reagentes 
• Percursor metálico: HAuCl4 
• Agente Redutor: DMF 
• Agente...
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Imagens T.E.M.* de AuNS...
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4. Funcionalização de nanoestrelas 
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AuNPs +...
5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase 
tirosinase de Agaricus bisporus 
(PDB - 2Y9W) 
• Massa atómica : 119500 Da...
5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase 
0 100 200 300 400 500 600 
TYR (μL) 
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Potencial ...
Considerações Finais 
Conclusões: 
• A centrifugação diferencial de seeds permite um maior controlo do tamanho e forma fin...
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Funcionalização de nanoestrelas de ouro

  1. 1. PREPARAÇÃO DE NANOBIOCONJUGADOS DE NANOESTRELAS DE OURO E TIROSINASE PARA DESENVOLVIMENTO DE SENSORES Rui Pedro Fernandes Ribeiro Orientadora: Prof.ª Doutora Eulália Pereira Coorientadora: Mestre Leonor Soares Julho 2013
  2. 2. Introdução Nanotecnologia: um campo multidisciplinar! Bionanoconjugados nanopartículas com biomuléculas adsorvidas à superfície tornando-a mais biocompatível. Biossensores e Bioremediação imagem adaptada de http://nanotech.ica.ele.puc-rio.br/nano_introducao.asp
  3. 3. Sumário 1. Síntese de núcleos de crescimento; 2. Síntese de Nanoestrelas; 3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas; 4. Funcionalização de nanoestrelas; 5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase.
  4. 4. 1. Síntese de núcleos de de crescimento Funcionalização com PVP: • 60 moléculas / nm2 N O H H n Diâmetro médio 13,71 ± 1,52 nm 10 12 14 16 18 20 22 Diâmetro (nm) Contagem 0 20 40 60 80 100 120 140 A450nm ⁄ ASPR T.E.M D.L.S. Potencial ζ 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 300 400 500 600 700 800 (nm) AuNPs 14,3 nm 13,7 ± 1,5 nm 16,0 ± 3,6 nm - 45 ± 19 mV AuNPs + PVP 19,1 nm - 18,7 ± 1,4 nm - 37,2 ± 13 mV 0 Abs AuNPs AuNPs + PVP
  5. 5. 2. Síntese de Nanoestrelas Método de Liz-Marzán Reagentes • Percursor metálico: HAuCl4 • Agente Redutor: DMF • Agente de Revestimento: PVP • Núcleo de Crescimento (NP-PVP)
  6. 6. 2. Síntese de Nanoestrelas 1 0.8 0.6 0.4 0.2 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs Cfg1 Cfg2 Cfg3 Cfg4 1 0.8 0.6 0.4 0.2 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs Racio 9 Rácio 11 Rácio 15 Espetro de extinção de AuNSs (rácio 9) sintetizadas com diferentes tamanhos de seeds: • Cfg1 - 19,3 nm • Cfg2 - 18,9 nm • Cfg3 - 17,9 nm • Cfg4 - 15,9 nm Espetro de extinção de AuNSs sintetizadas com seeds Cfg3 em diferentes rácios.
  7. 7. 2. Síntese de Nanoestrelas Racio 9 Racio 11 Racio 15 AuNSs Calculado T.E.M. Rácio 9 38,8 nm 36,1 ± 6,05 nm Rácio 11 41,2 nm 39,7 ± 5,30 nm Racio 15 45,3 nm 47,6 ± 9,09 nm Schematic representation imagem adaptada de of Rodríguez-a 4-fold Oliveros nanostar, et al., with 2012. two relevant symmetry plane ! where the number of tips is varied and the polarization plane . (b)
  8. 8. 2. Síntese de Nanoestrelas 0.25 0.245 0.24 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Abs AuNSs (DMF) AuNSs (Etanol) AuNSs (Água) 395 400 405 410 0.235 Diâmetro (nm) Contagem 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 Diâmetro médio 50,25 ± 8,53 nm Síntese de uma solução stock de 120 mL de AuNSs Espetro de extinção de AuNSs antes e após as lavagens.
  9. 9. 3. Estudos de estabilidade coloidal de nanoestrelas 1 0.8 0.6 0.4 0.2 Espectros de extinção de AuNSs após a variação do pH e da força iónica. 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs pH 3 pH 5 pH 6,45 (neutro) pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs sem sal 27 mM 55 mM 110 mM 145 mM 182 mM Espetro de extinção de AuNSs variando o pH numa gama entre 3 e 10. Espetro de extinção de AuNSs variando a força iónica pela adição de NaCl.
  10. 10. Estabilidade com NaCl 3. Estudos de estabilidade coloidal Estabilidade com Na dCel n anoestrelas Imagens T.E.M.* de AuNSs após a adição de NaCl AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds NaCl AuNS 3/4 nm NaBH4 seeds 0 M 0,5 M 3 M 0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl 0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl 0M NaCl 0,5M NaCl 3M NaCl Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda? Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda? Ando a tentar pesquisar o fenómeno NaCl oxidar as AuNS (bizarro!) já que as AuNS estão lavadas, não há DMF em solução (3 passos de lavagem por centrifugação foram antecedidos!) mas ainda não cheguei a nenhuma conclusão… podem dar-me uma ajuda? * Imagens T.E.M. cedidas gentilmente pela Mestre Leonor Soares
  11. 11. 4. Funcionalização de nanoestrelas Determinação da concentração e área Permissas superficial das AuNSs 1.A reação de síntese de AuNSs é completa. 2.O ouro adicionado distribui-se igualmente por todas as partículas. 3.Crescimento esférico. Esta equação prevê o raio final da partícula (esférica) após o seu crescimento.
  12. 12. 4. Funcionalização de nanoestrelas Funcionalização com CALNN e 11-MUA: • 6 moléculas / nm2 HS N H H N NH2 O NH2 O N H O O H N O OH OH O O NH2 Cis Ala Leu Asn Asn O SH OH CALNN 1 CALNN 2 MUA 1 MUA 2 Potencial ζ inicial / mV - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 - 40,00 ± 19,0 Potencial ζ após / mV -33,03±24,9 -19,87±29,6 -9,00±10 -10,93±10,7 Potencial ζ (6dias) / mV -15,67 ±12,2 -21,97±21,8 - - Potencial ζ 10mL / mV -33,47 ±26,8 -29,13±30,4 - - CALNN 11- MUA
  13. 13. 4. Funcionalização de nanoestrelas 1 0.8 0.6 0.4 0.2 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs AuNPs AuNPs + CALNN AuNPs + CALNN (pH 3,80) 0.8 0.6 0.4 0.2 300 400 500 600 700 800 900 1000 (nm) 0 Abs AuNPs AuNPs + CALNN AuNPs + CALNN (pH 3,85) AuNPs + CALNN (após 6 dias) AuNPs + 11-MUA AuNPs + 11-MUA (pH 3,82) Espect ro de ext inção de 1,5 mL AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH. Espectro de extinção de 10 mL de AuNSs funcionalizadas antes e após a diminuição do pH.
  14. 14. 5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase tirosinase de Agaricus bisporus (PDB - 2Y9W) • Massa atómica : 119500 Da • Raio: 3,25 nm • Diâmetro: 6,50 nm 195 enzimas por partícula (1,6 ng / mL de AuNSs)
  15. 15. 5. Formação de bionanoconjugados de tirosinase 0 100 200 300 400 500 600 TYR (μL) 0 -5 -10 -15 -20 -25 Potencial % (mV) 100 80 60 40 20 Diâmetro médio (nm) Potencial % D.L.S.
  16. 16. Considerações Finais Conclusões: • A centrifugação diferencial de seeds permite um maior controlo do tamanho e forma final de AuNSs e uma maior reprodutibilidade; • As AuNSs são estáveis numa gama de pH entre 3 e 10 • A diminuição do pH permite ter uma ideia se a funcionalização ocorreu; • A AuNSs são passíveis de serem funcionalizadas. Perspetivas futuras: • Verificar a funcionalização por técnicas mais sensíveis (XPS); • Estudar a influência do NaCl na alteração das forma das AuNSs; • Realizar estudos aprofundados sobre interação entre as AuNSs e a tirosinase: ‣ Alterar as concentrações do tampão; ‣ Alterar as concentrações de enzima.

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