O documento descreve diferentes métodos para quantificação de proteínas, incluindo absorvância a 280 ou 205 nm, BCA, biureto, Bradford e Lowry. Cada método possui limitações como interferência de outros compostos e variação na ligação ao corante entre diferentes proteínas. O método de Coomassie Dry possui o tempo total de ensaio mais curto, enquanto o Micro BCA requer o maior tempo.

1. Métodos de dosagem de
proteínas
BQI 305

2. • Absorvância 280 ou 205 nm
280 nm - Baseado na absorção da luz UV por aminoácidos
aromáticos (triptofano, tirosina e fenilalanina).
205 nm – Baseado na absorção da luz UV pela ligação
peptídica, mais sensível porém maior nº de interferentes
20 µg à 3 mg/mL
BSA – 3 mg/mL = A280=1,98
A > 2 não deve ser usada
Limitações e interferentes:
conteúdo de aa aromáticos, interferentes com absorvância na faixa do ensaio
(duplas ligações, ácidos nucléicos), alteração da faixa de absorção pela variação do
pH (ex.: tirosina em pH básico)
[proteína] = 1,55 x A280 – 0,76 x A260(interferência de DNA,RNA)

3. BCA
INTERFERENTES

4. BIURETO
BICINCONÍNICO

9. Método de Bradford ou Coomassie blue-
dye

10. Um dos pontos limitantes da técnica é a ligação
heterogênea do corante com diferentes proteínas

13. Método de Lowry

14. Um dos pontos limitantes da técnica é a ligação
heterogênea do corante com diferentes proteínas

15. INTERFERENTES

17. Table 1. Pierce Protein Assay Reagents and their Working Ranges
Reagent Protocol used
Estimated Working
Range
Coomassie Protein Assay
standard tube or
microplate
micro tube or microplate
100 - 1,500 µg/ml
1 - 25 µg/ml
Coomassie Plus Protein Assay
standard tube or
microplate
micro tube or microplate
100 - 2,000 µg/ml
1 - 25 µg/ml
Coomassie-Dry Protein Assay standard microplate 30 - 300 µg/ml
BCA Protein Assay
standard tube or
microplate
room temp tube
enhanced (60°C) tube
20 - 2,000 µg/ml
20 - 2,000 µg/ml
5 - 250 µg/ml
Micro BCA Protein Assay
standard tube
standard microplate
0.5 - 40 µg/ml
2 - 40 µg/ml
Modified Lowry Protein Assay standard tube 1 - 1,500 µg/ml

18. Table 2. Protein-to-Protein Variation
BCA Micro BCA Mod. Lowry Coomassie Coomassie Plus Coomassie Dry
Protein Ratio Ratio1
Ratio Ratio Ratio Ratio2
1. Albumin, bovine serum 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
2. Aldolase, rabbit muscle 0.85 0.80 0.94 0.76 0.74 0.44
3.α-Chymotrypsinogen 1.14 0.99 1.17 0.48 0.52 0.43
4. Cytochrome C, horse heart 0.83 1.11 0.94 1.07 1.03 0.57
5. Gamma Globulin, bovine 1.11 0.95 1.14 0.56 0.58 0.68
6. IgG, bovine 1.21 1.12 1.29 0.58 0.63 0.58
7. IgG, human 1.09 1.03 1.13 0.63 0.66 0.73
8. IgG, mouse 1.18 1.23 1.20 0.59 0.62 0.57
9. IgG, rabbit 1.12 1.12 1.19 0.37 0.43 0.45
10. IgG, sheep 1.17 1.14 1.28 0.53 0.57 0.71
11. Insulin, bov. pancreas 1.08 1.22 1.12 0.60 0.67 0.45
12. Myoglobin, horse heart 0.74 0.92 0.90 1.19 1.15 0.81
13. Ovalbumin 0.93 1.08 1.02 0.32 0.68 0.54
14. Transferrin, human 0.89 0.98 0.92 0.84 0.90 0.81
Avg. ratio 1.02 1.05 1.09 0.68 0.73 0.63
S.D. 0.15 0.12 0.13 0.26 0.21 0.17
CV 14.7% 11.4% 11.9% 38.2% 28.8% 27%
1. All of the proteins were tested using the standard tube protocol with the Micro BCA Protein Assay at a protein concentration of 10 µg/ml.
2. All of the proteins were tested using the standard protocol with the Coomassie Dry Protein Assay Plates at a protein concentration of 150 µg/ml.

19. Table 3. Times required to assay 20 samples and 8 standards using the test tube
procedure.
Handling times are considerably less using the microplate procedure.
Method Product # Incubation Time Total Assay Time
Coomassie-Dry Plate Assay 23296 0 min 48 minutes
Coomassie Plus Assay 23236 10 min 80 minutes
Coomassie Assay 23200 10 min 80 minutes
BCA Assay 23225 30 min 100 minutes
Modified Lowry Assay 23240 10 min & 30 min 110 minutes
Micro BCA Assay 23235 60 min 130 minutes