1) O documento discute a utilização de biomarcadores em peixes como ferramenta para análise de contaminação por metais pesados. 2) É realizada uma revisão bibliográfica sobre métodos de bioindicação de poluição aquática por metais pesados usando biomarcadores. 3) Os biomarcadores podem identificar exposição precoce a contaminantes e seus efeitos, antes que danos maiores ocorram nos ecossistemas.

1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
Volume 20 - Número 2 - 2º Semestre 2020
UTILIZAÇÃO DE BIOMARCADORES EM PEIXES COMO FERRAMENTA DE
ANÁLISE DE CONTAMINAÇÃO POR METAIS PESADOS
Júlia Sacramento Barbosa*; Marielce de Cássia Ribeiro Tosta
RESUMO
Ecotoxicologia Aquática é a ciência que fornece suporte no enfrentamento dos problemas de contaminação
dos corpos d’água por compostos tóxicos. O ambiente marinho é altamente complexo e diverso, mas é
particularmente vulnerável a efeitos tóxicos de poluentes, gerando-se uma mistura complexa de substâncias
nestes locais que são modificadas em respostas biológicas nos organismos, conhecidas como biomarcadores.
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo realizar uma revisão bibliográfica buscando o
aperfeiçoamento de metodologias de bioindicação de poluição aquática por metais pesados, para que sejam
esclarecidas suas potencialidades e minimizadas suas limitações. Os métodos utilizados neste trabalho são:
Método de Bradford; CLAE, CG-EM, CLAE-EM; Cálculo do Índice de Alteração Histológica (IAH); Análises
biomátricas, morfométricas e estereológicas; Teste de contagem de células que contenham um ou mais
micronúcleos citoplasmáticos; Método “Tempo de Retenção do Vermelho Neutro” (NRRT); Avaliação
espectro-fotométrica, ensaio de substituição metálica, análise eletroquímica e técnicas radioimunológicas.
Como os biomarcadores têm especificidades distintas e em ambientes aquáticos normalmente podem ser
encontrados diversos contaminantes, com isso para uma boa análise é necessário o uso de uma bateria de
marcadores tem se mostrado mais eficaz, além de estabelecer a espécie indicadora dos danos.
Palavras-chave: Marcadores, Avaliação Ambiental, Poluição, Ecossistemas Aquáticos.
USE OF BIOMARKERS IN FISH AS A HEAVY METAL CONTAMINATION ANALYSIS
TOOL
ABSTRACT
Aquatic Ecotoxicology is the science that insures support for coping water bodies contamination by toxic
compounds. The marine environment is highly complex and diverse but is particularly vulnerable to pollutants
toxic effects, that act creating complex substance moisture in this places that are modified by biological
responses in organisms, best known as biomarkers. Thus, this present study aims to review the literature about
heavy metal contamination, biomarkers analysis, and methodologies applied in papers, filtering the best of
them to ameliorate the biomarkers mechanisms used to identify heavy metal contamination, to clarify
potentialities and minimize any limitations. The methodology used is Bradford Method, CLAE, CG-EM,
CLAE-EM, Histological Alteration Index (HAI); Biometric, Morphometric and Stereological Analysis; One
or More Cytoplasmic Micronuclei Counting Test; Neutral Red Retention Time (NRRT) Method;
Spectrophotometric evaluation; Metallic Substitution Essay; Electrochemical Analysis; and
Radioimmunological Technics. As each biomarker has distinct specificities and many contaminants can be
normally founded in aquatic environments, the use of a battery test has been shown the most efficient strategy.
Determine what biomarkers to use, what the species going to be more impacted are very important strategies
to a good analyze, always considering the study area, besides the sentinel species and biomarkers
characteristics.
Keywords: Markers, Environmental Assessment, Pollution, Aquatic Ecosystems.
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2. INTRODUÇÃO
Ecotoxicologia aquática é a ciência que
fornece suporte no enfrentamento dos problemas
de contaminação dos corpos d’água por
compostos tóxicos (MAGALHÃES et al., 2008).
Seu objetivo é avaliar o efeito de substâncias
químicas sobre organismos representativos do
ecossistema. Esta área envolve o transporte, a
distribuição, a transformação e o destino final
dos contaminantes no ambiente aquático
(MAGALHÃES et al., 2008; ZAGATTO &
BERTOLETTI, 2006).
Este ambiente é altamente complexo,
diverso, e particularmente vulnerável a efeitos
tóxicos de poluentes, desde o considerável
aumento do uso de produtos químicos nas
indústrias, agricultura, urbanização e metais
provenientes da mineração (SEN & SEMIZ,
2007). A partir da mistura complexa de
substâncias nestes locais são geradas
modificações as respostas biológicas dos
organismos (OLIVEIRA, 2013), no qual, há uma
necessidade crescente em identificar estas e
avaliar seu potencial tóxico através dos animais
aquáticos (FREIRE et al. 2008; SARKAR et al,.
2006).
Contudo, para os estudos
ecotoxicológicos a escolha do organismo-teste é
preponderante, e devem-se usar mecanismo de
seleção de espécies, que se baseia nos seguintes
critérios: abundância e disponibilidade;
representação ecológica; conhecimento da sua
biologia, fisiologia e hábitos alimentares;
importância comercial; facilidade de cultivo em
laboratório e, se possível, a espécie deve ser
nativa para a melhor representatividade dos
ecossistemas (FREIRE et al. 2008). Diante disso,
os peixes vêm sendo modelo experimental bem
estabelecido no meio científico no que se trata da
ecotoxicologia aquática, por possuírem
características que fazem deles, bons modelos,
como, a sua distribuição, tamanho do corpo, ciclo
de vida, facilidade de manuseio e por possuírem
mecanismos celulares de resposta ao estresse
químico Além disso, a ictiofauna constitui um
grupo muito sensível às modificações do
ambiente em que vivem por serem
fisiologicamente mais complexos se comparados
com a maioria dos outros organismos
(FERREIRA, 2004). Eles são expostos
continuamente ao contaminante no seu hábitat
natural e constituem uma importante parte da
dieta humana, especialmente na região costeira.
Substâncias contaminantes podem afetar
seres humanos através da contaminação de
organismos aquáticos utilizados como alimento
(RAJAGURU et al., 2002). Diante disso, o
consumo de peixe e a ingestão de água
contaminada é a forma mais comum de
exposição de populações humanas à
xenobióticos, sendo os peixes e crustáceos
reconhecidos como os maiores veículos nessa
transferência de contaminantes aos humanos,
acarretando perigos. Dentro destes perigos
encontram-se as toxinas de origem natural que se
acumulam nos peixes; a contaminação biológica
do pescado, que pode resultar da contaminação
das águas ou do mau manuseamento e/ou
conservação e, por último, os contaminantes
químicos que se encontram nas águas, de forma
natural ou como resultado da atividade
antropogênica, e que podem ser transferidos e
acumulados nos peixes, gerando complicações
em tecidos e órgãos, ocasionando doenças e
alterações biológicas.
Por isso, é de extrema importância para a
indústria do pescado, regida pela Lei nº 1.283,
Art 2º de 18 de dezembro de 1950, em que os
produtos da pesca e aquiculturas devem prezar a
saúde do consumidor, a segurança dos produtos
processados, e a sua influência sobre a
comercialização desses produtos. Devido, a
contaminação ser uma das principais
consequências dos impactos antrópicos nos
ambientes costeiros e, potencialmente, um fator
de risco para a saúde humana.
Desta forma, para avaliar os impactos dos
poluentes na qualidade de ambientes aquáticos e
no pescado é pertinente que sejam mensurados os
efeitos que estas substâncias causam nos
organismos vivos destes ecossistemas. Neste
contexto, um grupo apropriado de respostas
biológicas – biomarcadores – pode ser útil para
determinar o grau de impacto na saúde da biota,
além de identificar os estressores ou poluentes
responsáveis por estes efeitos (FUENTES-RIOS
et al. 2005).
Os avanços no campo da ecotoxicologia
fornecem vários biomarcadores no organismo,
que podem ser usados para estimar a exposição a
substâncias químicas ou efeitos resultantes
(HANDY et al., 2003), no qual o estresse
químico pode alterar a capacidade do peixe de

3. realizar várias funções fisiológicas que, uma vez
caracterizadas, podem ser utilizadas como
biomarcadores de poluição aquática (VASSEUR
& COSSU-LEGUILLE, 2003). A partir disso,
biomarcadores podem ser definidos como
alterações biológicas que podem ser avaliadas
em tecidos ou fluidos corporais ou em nível de
organismo, avaliando precocemente evidências
de exposição e/ou efeitos de um ou mais
contaminantes, ademais que expressam a
exposição e os efeitos tóxicos dos poluentes
presentes no ambiente e podem ser usados para
identificar sinais iniciais de danos aos peixes e
sugerir relações de causa e efeito entre a
exposição aos contaminantes e os efeitos
observados no organismo, e documentar os
efeitos integrados do estresse químico nos peixes
(BODIN et al., 2004). Além disso, no que tange
a exposição ao poluente, pode ser interpretado
como, o nível de organismo situa-se no meio da
escala hierárquica de resposta a estressores,
integrando os níveis bioquímico, celular e
fisiológico. Portanto, antes que os efeitos possam
se expressar no nível de populações,
comunidades e ecossistemas, a resposta de
organismos individuais fornece uma boa
avaliação, como análise molecular, celular,
tecidual, etc. que indica o risco de extinção local
de alguns grupos de organismos susceptíveis.
A análise de biomarcadores é considerada
mais adequada para avaliações ambientais uma
vez que ao contrário de outras técnicas que
apenas detectam o dano quando já existente,
estas respostas subletais antecedem a ocorrência
de danos ambientais em maior escala,
possibilitando desta forma uma gestão
preventiva – e não somente remediadora – da
contaminação dos ecossistemas aquáticos,
devido tais respostas poderem antecipar danos
potenciais em níveis mais elevados de
organização biológica, como a morte de
organismos, alterações em populações,
comunidades ou ecossistemas (FREIRE et al.,
2008).
Entretanto, estudos relacionados à
toxicidade dos metais pesados focando a
contaminação de peixes e da água e seu risco para
a população humana, vêm sendo realizados tanto
em escala mundial (CASTILHOS et al., 2006)
quanto em escala nacional (OLIVEIRA, 2013;
FREIRE et al., 2008). Tendo em vista a
importância dos estudos com modelos biológicos
para avaliar a qualidade dos ambientes aquáticos
e que o amplo estudo de biomarcadores em
peixes é explicado pela resposta a compostos
tóxicos e que este enfoque ainda é utilizado como
uma ferramenta ecotoxicológica na prática do
manejo ambiental e estudo de qualidade da água
e animais para o consumo humano, o presente
estudo teve como objetivo realizar uma revisão
bibliográfica dos trabalhos referentes à
contaminação de metais pesados, às análises de
biomarcadores, e a junção das metodologias para
trabalhos buscando o aperfeiçoamento de
metodologias de bioindicação de poluição
aquática por metais pesados, para que sejam
esclarecidas suas potencialidades e minimizadas
suas limitações.
Contaminação por metais pesados
A contaminação de corpos d’água e
organismos não alvos por metais pesados ocorre
principalmente como consequência: da
exploração e do processamento de minérios; das
indústrias de galvanização, manufatura de tintas
e têxteis; das descargas de resíduos produzidos
em embarcações; e da deposição de esgotos e
entulhos de dragagens (OLIVEIRA, 2013). Os
metais pesados atuam sobre a vida aquática
isoladamente ou como a mistura de mais de um
metal ou em combinação com poluentes
orgânicos. De acordo com a literatura, os peixes
absorvem metais pesados de seus alimentos e
pela água que passa pelas brânquias. Além disso,
muitos fatores podem influenciar na absorção
dos metais tais como o sexo, a idade, o tamanho,
o ciclo reprodutivo, os padrões de nado, os
hábitos alimentares e o habitat (ZHAO et al.,
2012).
Dessa forma, é preponderante observar os
metais pesados mais característicos que
acometem o ambiente aquático, que são:
alumínio (Al), cádmio (Cd), chumbo (Pb), cobre
(Cu), mercúrio (Hg) e zinco (Zn), por isso, são os
principais elementos nos estudos de
contaminação em peixes (COSTA; HARTZ,
2009; CUI et al., 2011; GOMES; SATO, 2011;
MUTO et al., 2011; PEREIRA et al., 2010; YI et
al., 2012;) e principalmente, por serem metais
que são influenciados no que tange a mobilidade
e consequentemente a potencialidade tóxica,
quando ocorre alteração de fatores como o pH,
temperatura e oxigênio dissolvido.

4. Para a pesca industrial, é de extrema
importância à qualidade do pescado, desde a
captura até a mesa do consumidor, por isso, são
necessárias análises para identificar as
concentrações de metais pesados nestes animais,
pois existe concentração de metais permitidos
sem ser danosos ao indivíduo, no qual valores
acima destas concentrações pode ocasionar
danos como descrito no Quadro 1.
Quadro 1: Concentração limite dos metais pesados em peixes como percentual de contaminação
METAL
PESADO
CONCENTRAÇÃO
EFEITOS
NOCIVOS
Alumínio
(Al)
0,1 mg/kg de peso fresco
Doença de Alzheimer Causa
Osteoporose
Cádmio
(Cd)
1,0 mg/kg Alterações no fígado e nos rins
Chumbo
(Pb)
5-50 ng/L
Interfere nos processos genéticos ou
cromossômicos, inibindo reparo de
DNA
Cobre (Cu) 0,2-0,5 mg/kg de peso fresco de músculo
Danos peroxidativos serveros na
membrana celular
Mércurio
(Hg)
0,5 mg/kg
Mortalidade; reduz fertilidade, e
comportamento abnormal que afeta a
sobrevivência
Zinco (Zn) 3-5 mg/kg
Alterações em enzimas e proteínas
Tendo em vista as consequências
causadas pela contaminação destes metais
pesados, estes podem ser considerados grandes
ameaças a fauna e a saúde humana, por isso, para
uma avaliação mais precisa do impacto destes
contaminantes é necessário que o estudo esteja
auxiliado pelo uso de biomarcadores. Ademais,
no campo da ecotoxicologia aquática, diversos
métodos para análise de biomarcadores têm sido
desenvolvidos e extensivamente aplicados em
diferentes organismos. Dentre estes métodos este
trabalho ressalta: Método de Bradford
(BRADFORD, 1976); CLAE, CG-EM, CLAE-
EM (LIMA, 2001); Cálculo do Índice de
Alteração Histológica (IAH), adaptado de
Poleksic e Mitrovic – Tutundzic (1994); Análises
biométricas, morfométricas e estereológicas;
Teste de contagem de células que contenham um
ou mais micronúcleos citoplasmáticos
(VIARENGO et al. 2007); Método “Tempo de
Retenção do Vermelho Neutro” (NRRT) (RANK
et al. 2007); Avaliação espectrofotométrica,
ensaio de substituição metálica, análise
eletroquímica e técnicas radioimunológicas
(VIARENGO et al. 2007), além disso, por serem
métodos importantes serão descritos na próxima
seção.
Biomarcadores como resposta
biológica para avaliação ambiental
Os biomarcadores podem ser usados para
vários propósitos, dependendo da finalidade do
estudo e do tipo da exposição química. Podem ter
como objetivos avaliar a exposição (quantidade
absorvida ou dose interna), avaliar os efeitos das
substâncias químicas e avaliar a suscetibilidade
individual. Além disso, podem ser utilizadas
independentemente da fonte de exposição, seja
através da dieta, do meio ambiente geral ou
ocupacional (KELLY & JANZ, 2009). A
utilização destes pode ter como finalidade
elucidar a relação causa-efeito e dose-efeito na
avaliação de risco à saúde; para fins de

5. diagnóstico clínico; e para fins de monitorização
biológica, realizada de maneira sistemática e
periódica como uma resposta biológica para a
avaliação ambiental (MAGALHÃES et al.,
2008).
O uso dos biomarcadores na avaliação de
risco fornece uma ligação crítica entre a
exposição à substância química, dose interna e
prejuízo à saúde, e eles são valiosos na avaliação
de risco. Contudo, existe uma necessidade de
identificar e validar para cada sistema orgânico
estes parâmetros característicos que disfunção
orgânica, alteração clínica e toxicidade
patológica, além de estabelecer a especificidade
e sensibilidade de cada biomarcador e seu
método para determinação. Por isso, diversos
métodos para análise têm sido desenvolvidos e
extensivamente aplicados em diferentes
organismos, principalmente em peixes, este se
destaca: biomarcador bioquímico,
histopatológico e celular, além das suas
subclassificações.
Biomarcador Bioquímico
A bioquímica toxicológica tem por
objetivo a compreensão dos mecanismos
envolvidos no estabelecimento do dano, com ou
sem morte celular, induzido por xenobióticos.
Quando as células são expostas a um estímulo
nocivo e sua capacidade de se adaptar ao mesmo
tempo é ultrapassada, estabelece-se uma
condição fisiologicamente alterada. A depender
da severidade e da duração do estímulo as células
danificadas podem progredir até um estágio
chamado de “ponto de não retorno” (OLIVEIRA,
2013). Os parâmetros bioquímicos por terem sido
largamente testados em peixes com relação a
suas respostas a substâncias tóxicas podem
afirmar que entre os indicadores mais
investigados nesses animais estão às enzimas
presentes no tecido hepático, envolvidas na
detoxificação de xenobióticos e seus metabólitos,
englobando as enzimas de biotransformação de
fase I. fase II, as enximas antioxidantes e a
peroxidação lipídica.
Biotransformação
A biotransformação consiste em uma
conversão, catalisada por enzima, de um
composto xenobiótico em uma forma mais
hidrossolúvel, que possa ser excretada do
organismo mais facilmente do que o composto
original. A biotransformação de xenobióticos
químicos geralmente envolve enzimas que têm
um grau relativamente baixo de especificidade ao
substrato quando comparadas a enzimas
envolvidas no metabolismo de compostos
constitutivos (VAN DER OOST et al., 2003). As
reações de biotransformação são divididas em
duas fases, como por exemplo, fase I a
Citocromo P450 e fase II Glutationa S-
Transferase (GST).
Levando em consideração a análise da
atividade hepática das enzimas de
biotransformação de fase I e fase II tem sido
amplamente aplicada como biomarcadores de
efeito, complementarmente às análises químicas
(FERREIRA et al., 2004). A fase I é responsável
por reações de hidrólise, redução e oxidação, e
resultam em inserção ou exposição de
grupamentos no xenobiótico. Estas reações
eventualmente culminam com aumento da
toxicidade do composto. A fase II consiste
principalmente de reações de conjugação, que
podem ocorrer entre os xenobióticos e compostos
endógenos como a glutationa reduzida (GSH)
(NELSON & COX, 2018).
Citocromo P-450 (EROD)
O Citocromo P-450 é um biomarcador de
hepatotoxicidade, além de ser uma família de
enzimas que apresenta muitas isoformas, com
diferentes funções no metabolismo de compostos
endógenos e xenobióticos (FERREIRA et al.,
2004). Muitas subfamílias do citocromo P-450
são conhecidas por terem seu metabolismo
oxidativo ativado por distintos substratos e
dentre elas pode-se destacar a subfamília CYP1A
e em especial a enzima etoxiresorufina-O-
desetilase (EROD) devido ao seu papel na
biotransformação de compostos orgânicos,
incluindo HPAs, PCBs e dioxinas (FREIRE et al.
2008). Estes compostos químicos estão entre os
mais perigosos liberados nos ambientes
marinhos, podendo impactar de forma severa a
biodiversidade aquática.
A enzima etoxiresorufina-O-desetilase
(EROD) é presente em organismos vertebrados e
invertebrados, e possui o papel de transformar
estes xenobióticos lipofílicos em compostos mais
hidrofílicos favorecendo a excreção destas

6. substâncias. Após a exposição, muitos
metabólitos formados durante o processo de
detoxicação, são altamente reativos podendo ser
genotóxicos e causar danos ao DNA, além de
influenciar em um aumento dos níveis de EROD,
sendo considerada a base do uso desta enzima
como biomarcador (FREIRE et al. 2008). Este
biomarcador é talvez um dos mais bem estudados
e é considerado extremamente eficaz para
detectar os efeitos de compostos orgânicos
principalmente em peixes (PACHECO et al.,
2005).
Glutationa S-transferase (GST)
Segundo PISONI e colaboradores (2004),
a glutationa S- transferase (GSH) pertence há
uma superfamília multigênica de enzimas
diméricas, multifuncionais, principalmente
solúveis. Esta enzima apresenta a capacidade de
metabolizar diversos xenobióticos, além de
possuir a função de conjugação de compostos
eletrofílicos (ou fase Metabólitos) com
glutationa (GSH) que é catalisada pela glutationa
S-transferases (GSTs). Além de suas funções
essenciais intracelulares como transporte (heme,
bilirrubina e ácidos biliares) e a biossíntese de
leucotrienos e prostaglandinas, um papel crítico
para glutationa S-transferases (GSTs) é a defesa
contra danos oxidativos e produtos peroxidativos
de DNA e lipídicos (JÖNSSON et al., 2009;
NAHRGANG et al, 2009).
No que tange a suscetibilidade de
diferentes espécies de peixes à carcinogênese
química, que podem ser moduladas pela
atividade de glutationa S-transferase (GST).
Além de apresentar o mecanismo de indução para
a maioria dos GSTs efeitos da indução na
atividade hepática total da GST (PISONI et al.,
2004). Uma forma adicional de indução de GST
que funciona independentemente do receptor Ah
foi elucidado e requer metabolismo do composto
antes ativação transcricional da respectiva
subunidade gene pode ocorrer.
Peroxidação Lipídica
Outro parâmetro bioquímico utilizado é a
Peroxidação Lipídica (LPO), denominado um
biomarcador de estresse oxidativo muito
utilizado. A LPO é iniciada pela reação de um
radical livre com um ácido graxo insaturado e
propagado por radicais peroxila (LIMA et al.,
2001). Resulta na formação de hidroperóxidos
lipídicos e aldeídos. Durante este processo
grupos hidroperóxidos são introduzidos nas
caudas hidrofóbicas de ácidos graxos
insaturados. A presença desse grupo perturba as
interações hidrofóbicas entre lipídeo/lipídeo e
lipídeo/proteína, levando a alterações estruturais
das biomembranas e lipoproteínas.
Além disso, os lipídeos hidroperóxidos
são fontes para formação de radical livres que
podem induzir secundariamente modificações
em outras membranas e/ou constituintes
lipoprotéica. Quando a bicamada lipídica das
biomembranas é oxidada, ela pode perder sua
função de barreira e assim colocar a integridade
das organelas ou da célula inteira em risco. A
peroxidação lipídica é um dos principais
processos induzidos pelo estresse oxidativo por
xenobióticos como pesticidas, herbicidas e
fungicidas e tem sido observado em diversas
espécies de peixes (OLIVEIRA, 2013).
Biomarcador Histopatológico
O uso da histopatologia como
biomarcadores no estudo dos efeitos de agentes
químicos capazes de levar a danos teciduais, e
consequentemente permite avaliar as
consequências para as funções vitais dos
organismos expostos (RIBEIRO et al., 2012).
Alterações histológicas em tecidos de peixes
constituem ferramentas sensíveis para detectar os
efeitos tóxicos diretos de compostos químicos
em órgãos-alvo e, portanto, são indicadores
potentes da exposição prévia a estressores
ambientais (HINTON et al., 2008). Dessa forma,
o estudo histopatológico traduz a lesão em
função da duração e da intensidade da exposição
ao elemento tóxico e a capacidade adaptativa de
um determinado tecido (FERREIRA, 2004).
Os peixes evidenciam lesões em células e
tecidos primeiramente do que as mudanças
significativas no ambiente por meio do
comportamento ou na aparência externa. Por
isso, o exame histopatológico é reconhecido cada
vez mais como uma ferramenta valiosa para a
avaliação de metais pesados em peixes (CENGIZ
E UNLU, 2006), sendo utilizado os seguintes
orgãos: brânquias, o fígado e o rim posterior.
Portanto, a histopatologia é um dos métodos mais
rápidos e eficientes para detectar o nível dos

7. efeitos tóxicos em órgãos e tecidos, pois permite
a identificação eficiente dos efeitos subletais e
crônicos dos contaminantes de modo
relativamente rápido e de baixo custo (SILVA,
2010). Entretanto os efeitos histopatológicos,
quando utilizados de forma isolada, não são
suficientes para um diagnóstico preciso sobre a
ação de agentes tóxicos, sendo necessária a
associação com outros biomarcadores presentes
em outros níveis de organização biológica
(RIBEIRO et al., 2012).
Os peixes evidenciam lesões em células e
tecidos primeiramente do que as mudanças
significativas no ambiente por meio do
comportamento ou na aparência externa. Por
isso, o exame histopatológico é reconhecido cada
vez mais como uma ferramenta valiosa para a
avaliação de metais pesados em peixes (CENGIZ
E UNLU, 2006), sendo utilizado os seguintes
orgãos: brânquias, o fígado e o rim posterior.
Portanto, a histopatologia é um dos métodos mais
rápidos e eficientes para detectar o nível dos
efeitos tóxicos em órgãos e tecidos, pois permite
a identificação eficiente dos efeitos subletais e
crônicos dos contaminantes de modo
relativamente rápido e de baixo custo (SILVA,
2010). Entretanto os efeitos histopatológicos,
quando utilizados de forma isolada, não são
suficientes para um diagnóstico preciso sobre a
ação de agentes tóxicos, sendo necessária a
associação com outros biomarcadores presentes
em outros níveis de organização biológica
(RIBEIRO et al., 2012).
Biomarcador Celular
Os biomarcadores celulares são usados
para testar danos em células e vários aspectos de
estresse por radicais livres em animais
experimentais. Dessa forma, pode-se observar no
Quadro 2, deste biomarcador e as suas
aplicações.
Quadro 2: Biomarcadores celulares mais utilizados em Ecotoxicologia Aquática
BIOMARCADOR FUNÇÃO
Micronúcleos
Avalia a frequência de formação dos pequenos
fragmentos de cromatina, para identificar os danos
cromossomais em diferentes organismos causados
por estressores ambientais (FREIRE et al. 2008).
Membrana Lisossomal
Com excesso de substâncias exógenas, a
armazenagem intralisossomal pode aumentar a
permeabilidade da membrana levando ao efluxo
de enzimas hidrolíticas e aumento da atividade
autolítica da célula (VIARENGO et al. 2007).
Metalotioneínas
Apresenta como função biológica, a homeostase
de importantes metais e a detoxicação de metais
tanto essenciais quanto não essenciais
(MONSERRAT et al. 2006).

8. MATERIAL E MÉTODOS
Segundo GIL (2008), a metodologia
utilizada caracteriza-se como uma abordagem
qualitativa, no qual foi desenvolvido um
levantamento bibliográfico, a partir de uma
análise de documentos, com pesquisas na
internet, em sites de buscas, jornais, revistas e
livros utilizando como palavras-chaves:
biomarcadores, biomarkes, análise ambiental.
A coleta de dados foi realizada no período
de 11 de março a 20 de abril de 2019, e utilizou-
se para a pesquisa as bases de dados Google
Acadêmico, Periódico CAPES, SCIELO,
ELSEVIER e outras revistas da área. Foi
definido como critério de inclusão: artigos
publicados entre os anos de 2000 e 2019, pois
levantamentos com maior detalhamento dos
métodos para análise de biomarcadores se
concentram neste período, referências que
ultrapassa esse período, são apenas dos autores
das metodologias. Para as pesquisas não foi
limitado idioma na tentativa de obter quantidade
relevante de referencial teórico, contudo, foram
detectados que as publicações em português
eram as que mais continham informações
relevantes ao estudo. Como resultados, foram
selecionados 100 artigos, após a seleção dos
artigos conforme os critérios de inclusão
previamente definidos foram seguidos, nessa
ordem, os seguintes passos: leitura exploratória;
leitura seletiva e escolha do material que se
adéquam aos objetivos e tema deste estudo,
finalizando com a realização de leitura
interpretativa e redação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Consonantes ao exposto há uma
necessidade constante de procurar e validar
biomarcadores e metodologias adequadas nas
análises de toxicidade em estudos
ecotoxicológicos, principalmente em relação a
misturas de contaminantes (COSTA et al., 2009).
O uso de vários biomarcadores e diferentes
metodologias para análise da qualidade
ambiental tem sido recomendado por vários
pesquisadores (CAJARAVILLE et al., 2000;
FERNANDES et al., 2007; LINDE-ARIAS et
al., 2008; SANCHEZ et al., 2008).
PACHECO E SANTOS (2005) relata que
as informações fornecidas por um determinado
biomarcador individualmente são limitadas,
devido à grande probabilidade de interpretação
incorreta. Portanto, o uso de um conjunto deste
deve ser usado para avaliar melhor a condição
ambiental (ARAÚJO, 2018). Porém, os
biomarcadores apresentam metodologias
específicas, como mostrado no Quadro 3.
Quadro 3: Metodologias apropriadas para cada tipo de biomarcador
BIOMARCADOR METODOLOGIA OBSERVAÇÕES
Citocromo P-450
Método de Bradford
(BRADFORD,
1976).
Assim, em seguida, é necessária a
realização da leitura em 595nm utilizando
o espectrofluorímetro (SpectraMax,
Molecular Devices). Os resultados foram
comparados com uma curva padrão de
proteínas.
Glutationa S-
transferase (GST)
Método de Bradford
(BRADFORD,
1976).
Assim, em seguida, é necessário a
realização da leitura em 595nm utilizando
o espectrofluorímetro (SpectraMax,
Molecular Devices). Os resultados foram
comparados com uma curva padrão de
proteínas.

9. Peroxidação
Lipídica
Técnicas: CLAE,
CG-EM, CLAE-EM
(LIMA, 2001).
Um método considerado ideal na
mensuração da LPO deve: (1) identificar e
quantificar produtos derivados
especificamente do processo de
peroxidação; (2) ter um baixo coeficiente
de variação, quando analisadas amostras
diferentes de um mesmo indivíduo; (3)
não estar sujeito a interferências de outras
biomoléculas; (4) empregar técnicas
robustas e, portanto, mais confiáveis
(CLAE, CG-EM, CLAE-EM); (5) não
sofrer interferência direta da dieta e (6) ter
sensibilidade para mensurar níveis basais
dos produtos. (LIMA, 2001).
Histopatologia
Cálculo do Índice de
Alteração
Histológica (IAH),
adaptado de Poleksic
e Mitrovic –
Tutundzic (1994);
Análises biomátricas,
morfométricas e
estereológicas.
Para a histologia básica as amostras
devem ser fixadas em formalina a 10% por
24 horas e posteriormente descalcificado
em ácido nítrico a 10%, desidratado em
concentrações crescentes
de alcoóis, diafanizado em xilol,
impregnado e incluso em parafina. Os
cortes de espessura de 5µm foram corados
com hematoxilina e eosina (LUNA,
1968).
Micronúcleos
Teste de contagem
de células que
contenham um ou
mais micronúcleos
citoplasmáticos
(Viarengo et al.
2007)
Em peixes pode ser analisado em
diferentes tipos de células, como por
exemplo, eritrócitos periféricos, células
das guelras, rins, fígado e até de
barbatana.
Membrana
Lisossomal
Método “Tempo de
Retenção do
Vermelho Neutro”
(NRRT) (Rank et al.
2007)
O corante é sequestrado para o
compartimento lisossomal quando as
células vivas são pré incubadas com
vermelho neutro (NR). Através da
visualização por micróscopio poderá ser
avaliado se o corante vazou para o citosol
da célular, o que caracterizará danos nas
membranas lisossomais.
Metalotioneínas
Avaliação espectro-
fotométrica, ensaio
de substituição
metálica, análise
eletroquímica e
técnicas
radioimunológicas
(Viarengo et al.
2007).
Além disso, estudos estão focando a
estrutura dos promotores dos genes de MT
têm trazido informações mais específicas
sobre a resposta dos organismos a metais.
Evidência de indução metal-específica a
diferentes isoformas de MT aumentará a
especificidade de MTs como
biomarcadores da exposição de metais.
Fonte: (BRADFORD, 1976); (LIMA, 2001); (VIARENGO et al. 2007); (LUNA, 1968).

10. As metodologias expostas são
consideradas apropriadas para cada tipo de
biomarcador, pois em peixes, tais metodologias
respondem positivamente a grandes alterações
dos tecidos biológicos, além de serem as mais
utilizadas em trabalhos científicos e as que
obtiveram resultados satisfatórios e
principalmente por ser considerado como
metodologias práticas e eficientes, o que é de
fundamental importância para a aplicabilidade
massiva desses estudos no intuito de proteger o
ambiente.
Dessa forma, é importante considerar que
em estudos ecotoxicológicos é recomendada
a utilização de uma bateria de biomarcadores, e
consequentemente uma bateria de metodologias,
uma vez que apenas a avaliação de uma única
resposta biológica pode não refletir de forma
ampla os danos à saúde dos organismos vivos de
determinado ambiente impactado (ZORITA et
al. 2008). Além disso, o concomitante de vários
biomarcadores é importante para minimizar
interpretações errôneas nos casos de situações
complexas de poluição.
Nestes estudos é importante considerar os
fatores extrínsecos e intrínsecos do processo que
possam causar alterações na avaliação, para que
não sejam tiradas conclusões errôneas. Em
conclusão, o uso de biomarcadores em avaliações
do impacto da contaminação de ambientes
aquáticos é fortemente recomendado para que se
possa produzir dados confiáveis que
possibilitarão a implementação de medidas
adequadas para a proteção e/ou recuperação dos
ecossistemas aquáticos (FREIRE et al., 2008).
Cabe ressaltar que o uso de
biomarcadores no monitoramento ambiental
exige um profundo conhecimento das funções
biológicas dos organismos utilizados. Além
disso, é necessário identificar todas as possíveis
variações naturais que possam influenciar essas
respostas, para padronizar o processo analítico
(RICCIARDI et al. 2006). Além da pertinência
das respostas biológicas estudadas como
potenciais biomarcadores de estresse ambiental
são de importância primordial avaliar a
influência exercida pelas variações naturais
causadas por fatores intrínsecos e extrínsecos,
para diferenciar os efeitos da poluição
da influência de outros fatores ambientais e das
variações fisiológicas sazonais normais de um
possível biomarcador (GUERLET et al. 2007).
CONCLUSÃO
Neste contexto, pode-se concluir que o
uso de biomarcadores é uma ferramenta bastante
útil para a avaliação de ambientes aquáticos,
devido suas especificidades distintas e em
ambientes aquáticos normalmente serem
encontrados diversos contaminantes, em
programas de biomonitoramento, o uso de uma
bateria de marcadores biológicos têm se
mostrado mais eficaz que a avaliação de apenas
um indicador de poluição.
Para um bom resultado de monitoramento
é importante que seja pré-determinada a
metodologia e quais ferramentas serão utilizadas,
além de reconhecer qual espécie será indicadora
dos danos, levando em consideração as
particularidades da área em estudo, além das
características inerentes de cada biomarcador e
da espécie sentinela. Deve-se também considerar
os fatores extrínsecos e intrínsecos do processo
que possam causar alterações na avaliação, para
que não sejam tiradas conclusões errôneas.
Em conclusão, o uso da ferramenta em
estudo nas avaliações do impacto da
contaminação de ambientes aquáticos é
fortemente recomendado para que se possa
produzir dados confiáveis que possibilitarão a
implementação de medidas adequadas para a
proteção e/ou recuperação dos ecossistemas
aquáticos.
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Brasil.
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