A fosforilação Ampk de Ulk1 é necessária para direcionar mitocôndrias a lisossomos em mitofagia induzida por exercício.pdf

20/07/2021 A fosforilação Ampk de Ulk1 é necessária para direcionar mitocôndrias a lisossomos em mitofagia induzida por exercício
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5601463/ 1/35
Nat Commun. 2017; 8: 548.
Publicado online em 15 de setembro de 2017. doi: 10.1038 / s41467-017-00520-9
PMCID: PMC5601463
PMID: 28916822
A fosforilação Ampk de Ulk1 é necessária para direcionar mitocôndrias a lisossomos em
mitofagia induzida por exercício
Rhianna C. Laker , Joshua C. Drake , Rebecca J. Wilson , Vitor A. Lira , Bevan M. Lewellen , Karen A. Ryall ,
Carleigh C. Fisher , Mei Zhang , Jeffrey J. Saucerman , Laurie J. Goodyear , Mondira Kundu , e Zhen Yan
Department of Medicine, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA 22908 USA
Center for Skeletal Muscle Research at Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville,
VA 22908 USA
Department of Biomedical Engineering, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA 22908 USA
Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA 22908 USA
Department of Pharmacology, University of Virginia School of Medicine, Charlottesville, VA 22908 USA
Research Division, Joslin Diabetes Center, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA 02215 USA
Department of Pathology, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN 38105 USA
Present Address: Department of Health and Human Physiology, Obesity Research and Education Initiative, Fraternal Order of Eagles Diabetes
Research Center, University of Iowa, Iowa, IA 52242 USA
Zhen Yan, Email: zhen.yan@virginia.edu.
Corresponding author.
Contributed equally.
Received 2016 Jun 17; Accepted 2017 Jul 5.
Copyright © The Author(s) 2017
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation,
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Abstrato
A saúde mitocondrial é crítica para a função do músculo esquelético e é melhorada pelo treinamento físico por meio da biogênese
mitocondrial e da remoção de mitocôndrias danificadas / disfuncionais por meio da mitofagia. Os mecanismos subjacentes à mitofagia
induzida por exercício não foram totalmente elucidados. Aqui, mostramos que a corrida em esteira aguda em camundongos causa estresse
oxidativo mitocondrial em 3-12 he mitofagia em 6 h pós-exercício no músculo esquelético. Essas mudanças foram monitoradas usando um
novo gene repórter fluorescente, pMitoTimer, que permite a avaliação do estresse oxidativo mitocondrial e mitofagia in vivo, e foram
precedidos por aumento da fosforilação da proteína quinase ativada AMP (Ampk) na tirosina 172 e da cinase 1 de ativação autofágica tipo
unc-51 (Ulk1) na serina 555. Usando camundongos que expressam Ampk dominante negativo e constitutivamente ativo no músculo
esquelético, demonstramos que a ativação de Ulk1 é dependente de Ampk. Além disso, a adaptação metabólica induzida pelo exercício
requer Ulk1. Esses achados fornecem evidências diretas de mitofagia induzida por exercício e demonstram a importância da sinalização
Ampk-Ulk1 no músculo esquelético.
Introdução
É sabido desde a antiguidade que o treinamento físico melhora o desempenho físico e a saúde. Somente há 50 anos a comunidade científica
começou a entender a importância das adaptações bioquímicas e celulares do músculo esquelético em resposta ao exercício . O turnover
da proteína do músculo esquelético (ou seja, a culminação da síntese de proteínas e dos processos de degradação), particularmente das
proteínas mitocondriais, desempenha um papel central na mediação dos benefícios para a saúde do treinamento físico (Drake et al.,
2015). O papel do treinamento físico e os mecanismos que controlam a síntese de novas mitocôndrias (ou seja, biogênese mitocondrial) têm
sido amplamente estudados , no entanto, nossa compreensão de como o exercício promove a remoção de mitocôndrias danificadas e
disfuncionais ainda está em sua infância .
A autofagia é um processo catabólico que envolve o sequestro de proteínas e organelas citoplasmáticas de longa duração ou danificadas por
uma estrutura de membrana dupla denominada autofagossomo . Durante a autofagia, um autofagossomo então se funde com um
lisossoma para executar a degradação do conteúdo engolfado . Um baixo grau, nível basal de autofagia parece ser responsável pela
manutenção da homeostase celular e função celular normal . A autofagia pode, no entanto, ser regulada positivamente em condições de
estresse, como em resposta à fome e ao exercício . Embora geralmente se acredite que a autofagia desempenha um papel importante
na remodelação do músculo esquelético em resposta ao exercício , os mecanismos moleculares e de sinalização subjacentes
permanecem obscuros.
,
1 2
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3 6
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3 7 8
9
10
11
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13 14
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7 14 16

Quatro estudos anteriores no músculo esquelético de camundongos mostraram que uma única sessão de exercício aumentou os níveis da
proteína associada aos microtúbulos, cadeia leve 3-II (Lc3-II; a forma conjugada de fosfatidiletanolamina de Lc3-I), um marcador para a
montagem do autofagossomo. Junto com a diminuição do conteúdo de p62, um receptor de carga para substratos ubiquitinados que também
é degradado durante a autofagia , é sugestivo de aumento do fluxo de autofagia após o exercício. Recentemente, nós e outros
demonstraram que a maquinaria de autofagia e os marcadores de fluxo de autofagia também aumentam após o treinamento de exercícios
de resistência, sugerindo aumento do fluxo de autofagia basal e capacidade de autofagia. De particular interesse, observamos a expressão
aumentada da proteína 3 de interação de Bcl-2 / adenovírus E1B 19KD (Bnip3) com treinamento físico , que se localiza na membrana
mitocondrial externa e presumivelmente interage com Lc3 para iniciar a autofagia específica da mitocôndria (mitofagia) . Finalmente,
Vainshtein e colegas demonstraram aumento da associação de Lc3-II com mitocôndrias e aumento do fluxo de autofagia após corrida
exaustiva em esteira em camundongos .
Usando um novo gene repórter mitocondrial, chamado pMitoTimer , mostramos que a dieta rica em gordura a longo prazo induz estresse
oxidativo mitocondrial e acúmulo de mitocôndrias danificadas no músculo esquelético de camundongo , que pode ser devido a uma
combinação de aumento da sobrecarga de lipídios nas mitocôndrias e mitofagia estagnada. Essas descobertas ilustram a utilidade do
MitoTimer no monitoramento da saúde mitocondrial in vivo. Além disso, a formação de puncta de MitoTimer vermelho puro co-localiza
com a proteína mitocondrial Cox4 e a proteína lisossomal Lamp1, indicativo de mitocôndria sendo seletivamente degradada através da
mitofagia . Dado que não há atualmente nenhuma evidência direta de que o exercício ativa a mitofagia ou quais são os sinais iniciais que
desencadeiam a indução da mitofagia em resposta ao exercício, concluímos que o pMitoTimer permitiria uma nova dissecção in vivo dessas
questões pendentes.
A proteína quinase ativada por 5′-AMP (Ampk) tem sido extensivamente estudada e altamente implicada na adaptação do músculo
esquelético em resposta ao treinamento físico . A ligação do Ampk à autofagia / mitofagia no músculo esquelético vem de dados em
camundongos nocaute Ampk específicos do músculo que têm indução prejudicada da sinalização relacionada à autofagia / mitofagia em
resposta ao jejum e desenvolvem anormalidades mitocondriais mais pronunciadas com o envelhecimento . Na verdade, Ampk e um
regulador a jusante de autofagia / mitofagia, unc-51 como a autofagia ativando quinase 1 (Ulk1), mostraram desempenhar papéis críticos na
mitofagia em hepatócitos primários e eritrócitos . AMPK activa Ulk1 através da interacção física directa e fosforilação em múltiplos
locais , incluindo a serina 555, o que é importante para a activação, as interacções proteína-proteína, e a translocação de Ulk1 para as
mitocôndrias . Além disso, estudos em camundongos e humanos mostraram que o exercício agudo estimula a fosforilação de
AMPK e Ulk1 . Juntos, esses achados apóiam uma associação entre Ampk e Ulk1 no músculo esquelético, no entanto, não
houve evidência direta ou dissecção mecanística do mecanismo de sinalização para Ampk e Ulk1 no controle da mitofagia no músculo
esquelético em resposta ao exercício. A elucidação da sinalização Ampk-Ulk1 no controle da mitofagia pode revelar uma das etapas mais
importantes na melhora mediada por exercícios na saúde mitocondrial do músculo esquelético: a remoção de mitocôndrias danificadas /
disfuncionais.
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14 17 19 20 16
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13 ,
13 26
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28 31 33 34
, , ,
18 31 35 36

Aproveitamos um sistema de imagem de músculo de montagem inteira usando pMitoTimer em combinação com o gene marcador
lisossomal, pLamp1-YFP ( Lysosome Associated Membrane Protein 1) , para obter evidências diretas de mitofagia no músculo esquelético
em resposta ao exercício. Além disso, usando camundongos com alteração genética do eixo de sinalização Ampk-Ulk1, incluindo modelos
com superexpressão específica do músculo de Ampk dominante-negativa (isoforma α2) ou constitutivamente ativa (isoforma γ1) e nocaute
específico do músculo de Ulk1, investigamos rigorosamente o papel do Ampk na ativação de Ulk1 em resposta ao exercício, bem como seus
papéis funcionais individuais na mitofagia induzida por exercício. Descobrimos que o Ampk é necessário para a fosforilação específica do
local induzida por exercício de Ulk1 e isso é necessário para a resolução do dano mitocondrial induzido por exercício através da mitofagia
durante a recuperação. É importante ressaltar que o Ulk1 é necessário para a adaptação metabólica ao treinamento físico crônico.
Resultados
Estresse mitocondrial induzido por exercício e mitofagia
Avaliamos o status oxidativo mitocondrial e a mitofagia no músculo esquelético flexor curto dos dedos transfectados com pMitoTimer
transfectado com pMitoTimer (FDB) em um curso de tempo de 24 horas após uma única sessão (90 min) de corrida em esteira. MitoTimer é
uma proteína fluorescente sensível à oxidação, chamada Timer , que tem como alvo a mitocôndria , daí o nome MitoTimer. O
MitoTimer apresenta fluorescência verde quando é recentemente sintetizado e muda a fluorescência para o espectro vermelho após a
oxidação . A imagem simultânea dos canais verde (488/518 nm) e vermelho (543/572 nm) via microscopia confocal permite a
avaliação do estado oxidativo geral do retículo mitocondrial, relatado como uma razão vermelho: verde . Além disso, usando MitoTimer, o
número de pontos mitocondriais vermelhos puros pode ser determinado como uma indicação de mitocôndrias degeneradas passando por
mitofagia, uma vez que demonstramos anteriormente que pontos vermelhos puros co-localizam com imunocoloração de Cox4 e Lamp1-
YFP . Aqui, descobrimos que a proporção vermelho: verde do retículo mitocondrial foi significativamente alterada para fluorescência
vermelha em 3, 6 e 12 horas após o exercício agudo (Fig. 1a, b, Fig. complementar ). Esta mudança dependente do tempo em direção à
fluorescência vermelha, indicativa de estresse oxidativo, é ainda apoiada por um aumento no marcador de peroxidação lipídica 4HNE em 3
e 6 horas após o exercício agudo em frações enriquecidas com mitocôndrias do músculo gastrocnêmio (Fig. Suplementar ). Além disso, o
número de pontos vermelhos puros por área de fibra aumentou significativamente apenas 6 horas após o exercício agudo (Fig. 1c) Nós co-
transfectamos o músculo esquelético FDB de camundongo WT com pMitoTimer e o marcador lisossoma pLamp1-YFP , os submetemos a
corrida em esteira e coletamos os músculos FDB 6 h pós-exercício, correspondendo ao pico de estresse oxidativo mitocondrial e mitofagia
(Fig. 1a – c, Suplementar Fig. ). É importante notar que observamos a co-localização de puncta de MitoTimer vermelho puro com Lamp1-
YFP 6 h após o exercício (Fig. 1d) Isso é considerado evidência de mitocôndrias engolfadas por autofagossomo que se fundiram com o
lisossoma, sugerindo fortemente que o aumento nos pontos vermelhos durante a recuperação de exercícios agudos é devido à degradação
seletiva das mitocôndrias por meio da mitofagia. Juntos, esses achados fornecem a primeira evidência direta de mitofagia induzida por
exercício associada ao aumento do estresse oxidativo mitocondrial.
23
37 23
,
23 37
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1A
2
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Abra em uma janela separada
Figura 1

O exercício agudo causa estresse mitocondrial transitório e mitofagia durante a recuperação. a Imagens representativas de fibras FDB de
camundongo C57BL / 6J (10-12 semanas) transfectadas com pMitoTimer em pontos de tempo após o exercício agudo. As imagens são canais
vermelhos e verdes mesclados . Barra de escala = 20 µm. Consulte também a Fig. suplementar . b Quantificação do vermelho MitoTimer :
intensidade de fluorescência verde e c pontos vermelhos puros em n = 7–10 camundongos por ponto de tempo. d Imagens representativas de fibras
FDB de camundongo co-transfectadas compMitoTimer e pLamp1-YFP às 6 h após o exercício ilustrando que puncta vermelho puro de MitoTimer
co-localizado com puncta Lamp1-YFP. e Imagens representativas de fibras FDB de camundongos contralaterais transfectadas com pER-Timer em
pontos de tempo após o exercício agudo. Barra de escala = 20 µm. Consulte também a Fig. suplementar . f Quantificação de ER-Timer
vermelho : intensidade de fluorescência verde eg pontos de vermelho puro em n = 5-6 camundongos por ponto de tempo. hWestern blot
representativo para Lc3 em frações de músculo esquelético enriquecidas com mitocôndrias. A banda superior corresponde a Lc3-I e a banda
inferior a Lc3-II, com Vdac como o controle de carga, em momentos após o exercício agudo. i Quantificação da abundância da proteína Lc3-II e j
Lc3-I em relação a Vdac, n = 5. Consulte também a Fig. suplementar . Dados apresentados como média ± erro padrão da média. Os resultados de
ANOVAs de uma via são * p <0,05, ** p <0,01 e *** p <0,001. F = 8,07 ( b ), F = 3,10 ( c ), F = 1,29 ( f ), F = 0,91 ( g ), F = 5,15 ( i ), F =
0,74 ( j ). DF = 5 MitoTimer e ER-Timer vermelho puro puncta c , g foram transformados em log para contabilizar a variância desigual
Para determinar se essas descobertas eram específicas para o retículo mitocondrial, transfectamos o músculo FDB contralateral com ER-
Timer , um repórter de retículo endoplasmático (ER) análogo ao pMitoTimer , mas em vez disso contendo uma sequência de direcionamento
ER fundida ao gene repórter Timer. Não encontramos nenhuma mudança na razão vermelho: verde ou no número de pontos vermelhos
puros no músculo FDB contralateral (Fig. 1e – g, Fig. complementar ). Além disso, não encontramos nenhuma alteração nos níveis de
proteína do marcador de conteúdo de ER Sec61a (Fig. suplementar ). Em conjunto, estes dados suportam que as alterações induzidas
pelo exercício de pMitoTimer são específicas de organela.
Tanto a proporção vermelho: verde quanto o número de pontos vermelhos puros (Fig. 1a – c, Suplementar Fig. ) em músculos FDB
transfectados com pMitoTimer , bem como os níveis de 4HNE em mitocôndrias isoladas (Suplementar Fig. ) voltaram aos níveis de
controle 24 horas após o exercício. Esses achados sugerem que o exercício agudo induz um estresse oxidativo mitocondrial transitório junto
com uma indução transitória de mitofagia. É razoável acreditar que a mitofagia ativada em resposta às funções de exercício remove certas
partes do retículo mitocondrial que estão severamente estressadas / danificadas, auxiliando na restauração de uma população mitocondrial
saudável dentro de 24 horas da sessão de exercício.
A fim de caracterizar melhor a degradação mitocondrial após exercício agudo, realizamos análise de western blot para proteínas específicas
da mitocôndria; a proteína de controle de qualidade mitocondrial, quinase 1 putativa induzida por PTEN (Pink1) (Fig. suplementar ),
bem como canal de ânion dependente de voltagem (Vdac) e translocase da membrana externa 20 (Tom20) (Fig. suplementar) ) Não
vimos mudanças na abundância das proteínas acima em lisados

de músculo inteiro (Fig. Suplementar ). Também quantificamos o DNA
1
1
5
1B
3A, E
1A
2
3A, D
3A-C
3

mitocondrial (mtDNA) em relação ao DNA nuclear para obter uma medida do conteúdo mitocondrial. Não encontramos diferenças
significativas nos níveis de mtDNA entre sedentários e 6 horas após o exercício (Fig. suplementar ) Nenhuma mudança no conteúdo
mitocondrial é provavelmente devido ao número relativamente pequeno de mitocôndrias degeneradas passando por mitofagia (conforme
avaliado pelo MitoTimer) em relação a todo o retículo e, portanto, os ensaios acima não são sensíveis o suficiente para detectar essas
pequenas mudanças.
Finalmente, nas frações enriquecidas com mitocôndrias do músculo gastrocnêmio, observamos um aumento de Lc3-II 3 h após a corrida em
esteira (Fig. 1h, eu), mas nenhuma alteração em Lc3-I em qualquer momento, o que está de acordo com relatórios anteriores . O momento
do recrutamento de Lc3-II é importante, pois Lc3 deve ser degradado por hidrolases lisossomais após a fusão de autofagossomo e
lisossoma. Portanto, o recrutamento de Lc3 para mitocôndrias antes da co-localização do MitoTimer com Lamp1-YFP suporta a ordem
cronológica dos mecanismos de mitofagia e mostra definitivamente a mitofagia induzida por exercício no músculo esquelético. Esta
descoberta destaca ainda mais a utilidade do MitoTimer como uma ferramenta sensível para detectar a dinâmica de organelas individuais.
Ativação da sinalização de mitofagia em resposta ao exercício
É bem conhecido que o Ampk pode ser ativado por uma sessão aguda de exercício . Descobrimos que a corrida em esteira aumentou a
fosforilação de Ampk na tirosina (T) 172 e seu substrato a jusante Acetil-CoA Carboxilase (Acc) na serina (S) 79 no músculo gastrocnêmio
imediatamente após a sessão de exercícios (Fig. 2a – c) Este efeito foi transitório e não foi observado em momentos posteriores durante o
período de recuperação. Ao mesmo tempo, o exercício agudo aumentou a fosforilação de Ulk1 apenas no local ativação S555 (Fig.
2a, d) Os locais de fosforilação inibitórios de S467 ou S757 permaneceram inalterados (Fig. 2a, e, f) Essas descobertas sugerem que o
exercício leva a uma fosforilação transitória de Ampk e Ulk1 nos locais de ativação, antes da degradação mitofágica das mitocôndrias-alvo
durante a recuperação do exercício (Fig. 1a – c, Fig. complementar ).
3F, G
19
,
38 39
de 28
28
1A

Figura 2

Ampk, Ulk1 e Drp1, são temporariamente ativados imediatamente após o exercício agudo. Ampk e seu substrato Acc são fosforilados em Thr172 a
, be S79 a , c , respectivamente, imediatamente após a cessação do exercício e retornam aos valores basais 3 h após o exercício em camundongos
C57BL / 6 J com idades entre 10-12 semanas. Ulk1 é fosforilado em Ser555, mas não em Ser467 ou Ser757, imediatamente após o exercício agudo,
que retorna aos níveis basais 3 h após o exercício a , d - f . Drp1 é fosforilado no músculo esquelético em Ser616 a , g imediatamente após a
interrupção do exercício e Ser637 a ,h alcançando significância 3 e 6 h após o exercício. A abundância da proteína Mfn2 permanece inalterada após
corrida aguda em esteira a , i . Western blots representativos são mostrados a e toda a quantificação é apresentada como fosforilação da proteína
para a proporção de abundância de proteína total b - f . Dados apresentados como média ± erro padrão da média. n = 5 (exceto 24 h, n = 4). Veja
também as Figs suplementares. e . Os resultados de ANOVAs de uma via são * p <0,05, ** p <0,01. F = 6,44 para b , F = 3,56 parac , F =
6,50 para d , F = 0,89 para e , F = 0,33 para f , F = 3,34 para g , F = 2,76 para h , F = 0,31 i . DF = 5. p-Ampk (T172 / Total) b foi transformado
em sqrt para contabilizar a variância desigual., DF = 5. S637 / dados de Drp1 total foram transformados em log para contabilizar a variância
desigual
A fissão mitocondrial é essencial para separar áreas danificadas / disfuncionais das mitocôndrias do retículo mitocondrial e, portanto,
facilita a mitofagia. A proteína 1 relacionada à dinamina (Drp1) é uma importante GTPase que promove a fissão mitocondrial quando
fosforilada em S616 . Descobrimos que a fosforilação de Drp1 neste local (S616) aumentou transitoriamente imediatamente após a
corrida em esteira (Fig. 2a, g) Também descobrimos que a fosforilação no local S637 foi elevada após o exercício agudo, atingindo
significância 3 e 6 horas após a interrupção do exercício (Fig. 2a, h) S637 fosforilação tem sido demonstrado que o aumento de fissão em
resposta ao Ca de sinalização , mas pode também inibir a actividade Drp1 sob condições de proteína cinase A (PKA) dependente de
fosforilação , e tem sido sugerido como um alvo AMPK . Esta discrepância na literatura destaca a importância da especificidade
de contexto da sinalização molecular. Finalmente, não encontramos alterações na proteína de fusão mitocondrial Mfn2 ao longo do curso de
24 horas após o exercício agudo (Fig. 2a, i)
Ampk é necessário para a fosforilação induzida por exercício de Ulk1
Para determinar se o Ampk é necessário para a ativação induzida por exercício de Ulk1, submetemos camundongos transgênicos específicos
do músculo de uma forma negativa dominante da subunidade α2 catalítica de Ampk (dnTG) ao exercício agudo. Esses ratos foram
capazes de completar a sessão de exercícios com a mesma capacidade que os companheiros de ninhada do tipo selvagem. A fosforilação
Ampk em T172 foi atenuada em camundongos dnTG em resposta ao exercício (análise de duas vias de variação (ANOVA) efeito de
interação p = 0,044, F = 4,45, DF = 1) (Fig. 3a, b); no entanto, a fosforilação de Acc induzida por exercício não foi perturbada (Fig. 3a, c),
conforme relatado anteriormente para este modelo de mouse Ampkα e outros . É importante ressaltar que a fosforilação Ulk1 S555 foi
completamente ablada no músculo esquelético dnTG após o exercício (efeito de interação ANOVA de duas vias p = 0,015, F = 6,71, DF =
1) (Fig. 3a, d) A fosforilação de Ulk1 no local de inibição S757 não foi alterada pelo exercício em ambos os camundongos WT e dnTG, no
6 7
40
2+ 41
-
42 44
,
45 46
47
-
48 50

entanto, houve um efeito genótipo de fosforilação inferior no dnTG (Fig. 3a, e) De forma consistente, camundongos transgênicos
específicos do músculo que expressam uma forma constitutivamente ativa da subunidade γ1 reguladora de Ampk (caTG) mostraram um
nível aumentado de fosforilação de Ampk T172 (Fig. 3f, g) , bem como um aumento significativo na fosforilação de Ulk1 em S555, mas
não S757, sob condições sedentárias (Fig. 3f, i, j) Esses camundongos também exibiram fosforilação Acc elevada (Fig. 3f, h), fornecendo
evidências adicionais de aumento da atividade Ampk. Juntos, esses dados demonstram que a ativação de Ampk é suficiente e necessária
para a fosforilação de Ulk1 S555 induzida por exercício.
51

Fig. 3

Ampk é necessário e suficiente para a fosforilação de Ulk1 em Ser555 em resposta ao exercício agudo. A fosforilação de Ampk em T172 em
resposta ao exercício agudo é bloqueada em Ampk dnTG a , b , enquanto a fosforilação aumentada de Acc em Ser79 pós-exercício ainda é
observada a , c . Em camundongos Ampk caTG, ambos T172 Ampk e S79 Acc são elevados em condições sedentárias f - h . A fosforilação de
Ulk1 em Ser555 é embotada no músculo esquelético dnTG imediatamente após o exercício agudo a , d , mas elevada em camundongos caTG
basalmente f , i. Não houve efeito na fosforilação de S757 em camundongos dnTG pós-exercício a , e ou camundongos caTG sedentários ( f , j ).
Western blots representativos são mostrados para camundongos dnTG a e camundongos caTG f . Veja também as Figs suplementares. e . Toda a
quantificação é apresentada como fosforilação de proteína para proporção de abundância de proteína total b - e , g - j . Os dados são apresentados
como média ± erro padrão da média. Para o estudo dnTG n = 10 WT ou 5-7 dnTG (12-13 semanas). Os resultados de ANOVAs de duas vias são *
p <0,05, **p <0,01 para comparações de sedentários vs. exercícios, F = 4,57 e DF = 1 c . p <0,001 para comparações entre grupos, F = 14,03
e DF = 1 ( e ). Testes de comparação múltipla de Tukey foram realizados quando um efeito de interação significativo foi observado, em que * p
<0,05, ** p <0,01 para comparações de exercícios WT sedentários vs. WT e p <0,01, p <0,001 para exercícios WT vs. comparações de
exercícios dnTG, DF = 27. Para o estudo caTG n = 3 (WT) ou 5 (caTG) (13-15 semanas). Os resultados dos testes t de duas caudas são * p <0,05 e
** p <0,01 para comparações WT para caTG, t = 4,94 ( g ), t = 2,57 ( h ), t = 2,71 ( i ), t = 1,72 ( j ), DF = 6
Para investigar se a dinâmica mitocondrial foi regulada por Ampk, também medimos a fosforilação Drp1 e a proteína Mfn2 em
camundongos dnTG e caTG Ampk. Conforme observado em camundongos WT exercitados, a fosforilação de Drp1 foi significativamente
aumentada após exercício agudo em camundongos Ampk dnTG em ambos S616 e S637 (Fig. 4a – c) Na verdade, a fosforilação de S637 foi
induzida a um nível quase duas vezes maior do que o de camundongos WT por exercício agudo (efeito de interação ANOVA de duas vias p
= 0,007, F = 8,69, DF = 1) (Fig. 4c) Além disso, em condições sedentárias, os camundongos caTG exibiram níveis semelhantes de
fosforilação Drp1 em seus irmãos WT (Fig. 4e – g) e não houve alterações na proteína Mfn2, independentemente do genótipo ou exercício
(Fig. 4a, d, e, h) Esses achados sugerem que a fosforilação induzida por exercício de Drp1 ocorre independentemente de Ampk no músculo
esquelético.
8 9
###
$$ $$$

Fig. 4
Ampk não é necessário para a fosforilação induzida por exercício de Drp1. A fosforilação de Drp1 em S616 e S637 é significativamente aumentada
em camundongos dnTG pós-exercício ( a - c ), enquanto não houve efeito de caTG Ampk na fosforilação de Drp1 em S616 e , f ou S637 e , g em
condições sedentárias. Não houve efeito na abundância da proteína Mfn2 em camundongos dnTG, independentemente do exercício d , ou
camundongos caTG h sedentários . Western blots representativos são mostrados a , e e toda a quantificação é apresentada como fosforilação da
proteína para a razão de abundância de proteína total b ,c , f , g ou proteína total d , h . Os dados são apresentados como média ± erro padrão da
média. Para o estudo dnTG n = 10 WT ou 5-7 dnTG (12-13 semanas). Consulte também a Fig. suplementar . Os resultados de ANOVAs de
duas vias são * p <0,05, *** p <0,001, para comparações de sedentários vs. exercícios, F = 19,39, DF = 1 ( b ). Testes de comparação múltipla de
Tukey foram realizados quando um efeito de interação significativo foi observado, em que * p <0,05, *** p <0,001 para comparações de
exercícios WT sedentário vs. WT e p <0,001 para comparações de exercício WT vs. exercício dnTG, DF = 26. Para estudo caTG n = 3 WT ou
5 caTG (13-15 semanas). Os resultados dos testes t de duas caudas são t = 0,42 ( b ), t = 0,02 ( c ), t = 0,29 ( d ), DF = 6
10
$$$

Ampk é necessário para mitofagia induzida por exercício no músculo
Uma vez que o Ampk é necessário para a ativação do Ulk1 pelo exercício (Fig. 4), investigamos se a mitofagia induzida por exercício é
dependente de Ampk. Realizamos co-transfecção em músculos FDB com pMitoTimer e pLamp1-YFP em camundongos dnTG. Como já
descrito, camundongos dnTG foram submetidos a corrida em esteira e o FDB foi colhido 6 h pós-exercício, correspondendo ao pico de
estresse oxidativo mitocondrial e mitofagia (Fig. 1, Suplementar Fig. ). Consistente com nosso experimento anterior, observamos um
aumento geral da proporção vermelho: verde 6 h após o exercício em camundongos WT (Fig. 5a, b) Em contraste, camundongos dnTG
mostraram estresse oxidativo moderadamente elevado, mas não houve aumento adicional após o exercício (efeito de interação ANOVA de
duas vias p = 0,037, F = 4,92, DF = 1) (Fig. 5a, b) O aumento em puncta vermelho puro de MitoTimer 6 h pós-exercício observado em
camundongos WT foi completamente abolido em camundongos dnTG (efeito de interação ANOVA de duas vias p <0,0001, F = 36,26, DF
= 1) (Fig. 5a, c), demonstrando que a mitofagia induzida por exercício é bloqueada em camundongos dnTG. É importante ressaltar que o
exercício agudo causou um aumento no puncta Lamp1 em camundongos WT, indicativo de aumento da biogênese lisossomal (Fig. 5a, d)
Este efeito do exercício na biogênese lisossomal estava ausente em camundongos dnTG (efeito de interação ANOVA de duas vias p =
0,019, F = 6,35, DF = 1) (Fig. 5a, d), que está de acordo com um relatório recente de que a deficiência de Ampk reduz drasticamente a
expressão do gene mestre da biogênese lisossomal, Tfeb . Consistente com a noção de que Ampk é necessária para mitofagia induzida por
exercício, a co-localização de puncta Lamp1 com puncta mitocondrial vermelho puro foi abolida em camundongos dnTG (efeito de
interação ANOVA de duas vias p = 0,0002, F = 20,08, DF = 1) ( FIG. 5e) Este efeito também foi severamente embotado quando os pontos
de Lamp1 co-localizados foram avaliados como uma porcentagem do total de pontos de Lamp1 (Fig. 5f) Juntos, esses achados fornecem a
primeira evidência direta de que o Ampk é necessário para a mitofagia induzida por exercícios no músculo esquelético.
1
52

Fig. 5

Ampk é necessário para mitofagia aguda induzida por exercício e gênese lisossomal. a Imagens representativas de fibras FDB de camundongo WT
e Ampk dnTG co-transfectadas com pMitoTimer e Lamp1-YFP . Barra de escala = 20 µm. Quantificação de b vermelho : intensidade de
fluorescência verde (efeito de interação p = 0,03), c pontos de MitoTimer vermelho puro por área de fibra (efeito de interação p <0,0001), d
pontos de Lamp11-YFP totais por área de fibra (efeito de interação p = 0,01), epontos Lamp1-YFP co-localizados por área de fibra (efeito de
interação ( p = 0,0002), f por cento de co-localização de pontos vermelhos puros de MitoTimer com pontos Lamp1-YFP. Dados apresentados como
média ± erro padrão da média. n = 7 WT ou 6 dnTG (12–13 semanas). Os resultados de ANOVAs de duas vias são * p <0,05 para comparações de
sedentários vs. exercícios, F = 5,97, DF = 1 f e p <0,05 para comparações entre grupos, F = 7,41, DF = 1 ( f ). Testes de comparação múltipla de
Tukey foram realizados quando um efeito de interação significativo foi observado, em que * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 para comparações
de exercícios WT sedentários vs. WT e p <0,001 para comparações de exercícios WT vs. dnTG, DF = 22
Ulk1 é necessário para direcionamento lisossomal induzido por exercício
Uma vez que Ulk1 é um regulador crítico da autofagia e é ativado por exercício agudo (Fig. 2), Ulk1 pode ser importante para a mitofagia
para remover mitocôndrias danificadas / disfuncionais durante a recuperação em resposta ao exercício agudo (Fig. 1, Suplementar Fig. ).
Para resolver esta questão, nós novamente co-transfectamos músculos FDB com pMitoTimer e pLamp1-YFP em camundongos nocaute
Ulk1 específico de músculo (MKO). Conforme descrito acima, os camundongos foram então submetidos a exercício agudo e os músculos
FDB foram colhidos 6 h mais tarde (Fig. 1, FIG. 6e Suplementar Fig. ). Não houve diferença na razão basal vermelho: verde de
MitoTimer entre os camundongos WT e MKO (Fig. 6a, b) Além disso, o aumento geral da razão vermelho: verde 6 h após o exercício foi
semelhante entre os genótipos (Fig. 6a, b), indicando que a exclusão de Ulk1 não alterou a capacidade de resposta das mitocôndrias ao
exercício em relação ao estresse oxidativo. Em camundongos WT, houve um aumento nos pontos vermelhos puros do MitoTimer após o
exercício (Fig. 6a, c), que foi simultâneo a ambos os aumentos nos pontos Lamp1 (Fig. 6d) e colocalização entre os dois sinais (Fig. 6e, f)
Essas descobertas consolidam aquelas de nossos experimentos anteriores (Fig. 1 e a Fig. 5), portanto, estamos confiantes de que a mitofagia
aumenta durante a recuperação em resposta ao exercício. Além disso, não houve aumento nos pontos vermelhos puros no músculo
esquelético em camundongos MKO (efeito de interação ANOVA de duas vias p = 0,039, F = 4,62, DF = 1) (Fig. 6a, c), embora tenha
havido um aumento significativo de pontos Lamp1 acima dos níveis de WT com o exercício (Fig. 6d) Esses achados indicam que Ulk1 não
é necessário para a biogênese lisossomal. É importante ressaltar que a co-localização de puncta Lamp1 com puncta vermelho puro de
MitoTimer foi dramaticamente prejudicada em camundongos MKO em comparação com camundongos WT (Fig. 6e, f) Isso foi evidente
tanto na co-localização de puncta Lamp1 por área de fibra (efeito de interação ANOVA de duas vias p = 0,059, F = 4,01, DF = 1) (Fig. 6e)
e porcentagem de colocalização para pontos Lamp1 total (efeito de interação ANOVA de duas vias p = 0,10, F = 2,81, DF = 1) (Fig. 7f) Ao
todo, esses resultados demonstram fortemente que Ulk1 é necessário para a mitofagia induzida por exercício e tem um papel importante no
direcionamento do lisossoma para as mitocôndrias selecionadas para degradação.
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1
1

Fig. 6

Ulk1 é necessário para a mitofagia aguda induzida por exercício no músculo esquelético. a Imagens representativas de fibras FDB de camundongos
WT e Ulk1 MKO co-transfectadas com pMitoTimer e Lamp1-YFP. Barra de escala = 20 µm. Quantificação de b vermelho : intensidade de
fluorescência verde , c pontos de MitoTimer vermelho puro (efeito de interação p = 0,03), d pontos de Lamp1-YFP totais por área de fibra, e
pontos de Lamp1-YFP co-localizados por área de fibra (efeito de interação p = 0,1) , e f por cento de co-localização de vermelho puro
MitoTimerpuncta com puncta Lamp1-YFP (efeito de interação p = 0,05). Dados apresentados como média ± erro padrão da média. n = 6 (12–13
semanas), ** p <0,01 e *** p <0,001 para comparações de sedentários vs. exercícios. p <0,05 para comparações entre grupos
#

Fig. 7

Ulk1 no músculo esquelético é importante para a adaptação metabólica induzida pelo treinamento físico. Os camundongos MKO e iMKO exibiram
adaptação normal ao treinamento de exercício, conforme avaliado pela distância de corrida diária a , d , teste de exercício exaustivo b , e e níveis de
lactato no sangue c , f . Os camundongos WT exibiram tolerância à glicose melhorada após 4 semanas de treinamento físico, conforme avaliado
pelo perfil de glicose no sangue durante GTT g e AUC i . Em contraste, os camundongos iMKO não conseguiram mostrar tolerância à glicose
melhorada após o treinamento físico durante GTT h e AUC i. Dados apresentados como média ± erro padrão da média. Para estudo MKO n = 7-8
WT e n = 6-7 MKO (12-13 semanas). Bicaudal t -Testes foram usadas para (A: T = 0,84 e DF = 9) e (C: WT Sed t = 3,73 e DF = 12, WT Ex t =
2,97 e DF = 14, MKO Sed t = 6,35 e DF = 10, MKO Ex t = 5,25, DF = 12). Os dados de lactato c foram transformados em 1 / Y para contabilizar a
variância desigual. Uma ANOVA two-way foi usada para b com ** p <0,01 para comparação exercício vs sedentário, F = 11,50, DF = 1. Para
estudo Imko n = 3 WT e n = 4 iMKO (18–20 semanas). Testes t de duas caudas foram usados

para (D: t = 0,10 e DF = 5), (F: WT Sed t = 3,98,
DF = 4), (F: WT Ex t = 0,98, DF = 4), ( F: iMKO Sed t = 7,35, DF = 6), e (F: iMKO Ex t = 3,99, DF = 6). Uma ANOVA de duas vias foi usada
para e , i com *** p <0,001, F = 35,16 e DF = 1 para comparações de sedentários vs. exercícios. O teste de comparação múltipla de Tukey foi
realizado para o efeito de interação significativo em i , em que *** p <0,001 para comparações de exercícios WT sedentários vs. WT e p <0,05
para comparações de exercício WT vs. exercício iMKO, DF = 10
Ulk1 é importante para a adaptação metabólica ao exercício
Uma vez que relatamos que Ulk1 é fundamental para a mitofagia aguda induzida por exercício, raciocinamos que também desempenharia
um papel crítico na adaptação ao treinamento de exercício e capacidade de resistência. Portanto, submetemos camundongos MKO e WT a 6
semanas de corrida voluntária na roda e realizamos um teste de exercício exaustivo na cessação do treinamento de exercício.
Inesperadamente, a distância de corrida voluntária diária foi semelhante entre os genótipos, e ambos os genótipos melhoraram sua
capacidade de corrida de resistência após 6 semanas de corrida voluntária em comparação com controles sedentários (Fig. 7a, b), sugerindo
que Ulk1 não é necessário para melhorar o desempenho físico em resposta ao treinamento de exercício. A fim de validar ainda mais esses
achados e descartar a compensação do desenvolvimento para a perda de Ulk1 no início da vida, geramos camundongos nocaute Ulk1
específico para músculo esquelético (iMKO) induzível por tamoxifeno e os submetemos ao mesmo protocolo de treinamento físico após 5
dias de tamoxifeno injeção (para excluir o gene Ulk1 no músculo esquelético). De forma consistente, os camundongos iMKO demonstraram
distância de corrida voluntária diária semelhante em comparação com camundongos WT, bem como melhora semelhante na capacidade de
resistência após 6 semanas de treinamento de exercício voluntário (Fig. 7d, e) As alterações na concentração de lactato sanguíneo com o
exercício foram consistentes com a exaustão e melhor adaptação metabólica com o exercício em ambos os modelos genéticos de
camundongos (Fig. 7c, f); no entanto, os camundongos iMKO tinham lactato sanguíneo significativamente maior do que o tipo selvagem
após a exaustão (Fig. 7f, Suplementar Fig. ).
$
5

Para investigar a importância do músculo esquelético Ulk1 na adaptação induzida pelo treinamento de exercício, realizamos testes de
tolerância à glicose (GTTs) em camundongos WT e iMKO após 4 semanas de roda voluntária. Camundongos WT que realizaram
treinamento de exercício exibiram tolerância à glicose significativamente melhor em comparação com seus homólogos sedentários, bem
como camundongos iMKO treinados com exercício, conforme indicado pela melhora da depuração de glicose no sangue durante GTT e
área sob a curva de glicose (efeito de interação ANOVA de duas vias p = 0,001 F = 19,52, DF = 1) (Fig. 7g-i) Em contraste, os
camundongos iMKO não mostraram nenhuma melhora na tolerância à glicose após 4 semanas de treinamento físico (Fig. 7h, eu) Em
conjunto, esses dados sugerem que, embora o músculo esquelético Ulk1 possa não contribuir para melhorias na capacidade de resistência, o
Ulk1 no músculo esquelético é importante para conferir os benefícios metabólicos do treinamento físico.
Discussão
Nossos dados fornecem a primeira evidência direta de que uma única sessão de exercício induz mitofagia no músculo esquelético durante a
recuperação. Observamos aumento do estresse oxidativo mitocondrial entre 3–12 h com puncta vermelho puro de MitoTimer aumentado 6 h
após o exercício agudo, sugerindo que os mecanismos de sinalização upstream foram iniciados antes dos eventos de mitofagia. Consistente
com esta noção, observamos a ativação temporal de Ampk e Ulk1 imediatamente após o exercício agudo e demonstramos que Ampk foi
necessário e suficiente para a fosforilação de Ulk1 em S555 no músculo esquelético. É importante ressaltar que obtivemos evidências
abrangentes de que Ampk e Ulk1 são necessários para a mitofagia induzida por exercício durante a recuperação. Enquanto Ampk está
envolvido na ativação de Ulk1 e biogênese lisossomal, nossos dados não suportam a noção de que Ampk promove a fissão mitocondrial por
meio de Drp1. Finalmente, demonstramos a nova descoberta de que Ulk1 é necessário para a mitofagia na etapa de direcionamento
lisossomal de mitocôndrias danificadas / disfuncionais (Fig. 8) Portanto, mostramos pela primeira vez que a mitofagia durante a recuperação
do exercício no músculo esquelético é dependente da ativação transitória de Ulk1 por meio de Ampk.

Fig. 8
A mitofagia aguda induzida por exercício é regulada através do eixo de sinalização Ampk-Ulk1. A ativação de Ampk através da fosforilação em
T172 é necessária para a fosforilação induzida por exercício de Ulk1 S555 e biogênese lisossomal no músculo esquelético. Simultaneamente, o
exercício inicia a fissão mitocondrial, que não depende da ativação do Ampk. Demonstramos que Ulk1 é crítico para o direcionamento do
lisossoma para o dano / pontos mitocondriais disfuncionais para degradação subsequente
As mitocôndrias são a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente por meio do vazamento de elétrons únicos da
cadeia de transporte de elétrons durante a fosforilação oxidativa . Durante o exercício exaustivo, as concentrações de radicais livres
(por exemplo, espécies reativas de oxigênio ou ROS) dentro da mitocôndria aumentam , interrompendo a homeostase redox e causando
estresse oxidativo . A oxidação do mtDNA, complexos da cadeia respiratória e / ou lipídios são considerados os alvos primários dos
radicais livres, resultando em disfunção mitocondrial e iniciando a adaptação de manutenção mitocondrial , como por meio de sua
remoção e degradação . No estudo atual, a mudança geral na proporção vermelho: verde do MitoTimer é indicativa de um aumento no
,
53 54
55
56
,
55 57
7

estresse oxidativo mitocondrial 6 horas após o exercício. Em consonância com essa observação, 4HNE, um marcador comum de estresse
oxidativo, também foi aumentado nas frações enriquecidas com mitocôndrias 3 e 6 horas após o exercício. Esses dados são consistentes com
a noção de que durante a recuperação do exercício, a fosforilação oxidativa contínua e a redução dramática do consumo de ATP dominam a
produção excessiva de ROS mitocondriais. Essas observações são importantes para o desenvolvimento de intervenções futuras para
melhorar a recuperação muscular de uma sessão aguda de exercícios.
Vale ressaltar que o exercício agudo não levou à oxidação da proteína Timer quando direcionada ao retículo endoplasmático (ER-Timer).
Embora outros tenham mostrado que o exercício de resistência aguda ativa o estresse ER no músculo esquelético , devemos destacar
que o ER-Timer detecta apenas a oxidação da proteína Timer e não a ativação específica da resposta proteica não dobrada (UPR). Embora
as mudanças no redox celular possam de fato causar estresse no ER, a regulação aberrante do Ca e a privação de glicose também foram
implicadas no início da UPR . Uma vez que o status oxidativo do ER não foi medido em estudos que relataram estresse ER induzido por
exercício , alertamos contra a interpretação exagerada de nossos achados com ER-timer em oposição à literatura atual.
Embora tenhamos demonstrado aqui que Ampk e Ulk1 são de fato necessários para a mitofagia no músculo esquelético no contexto do
exercício, o mecanismo de como o sinal de dano mitocondrial e a ativação da maquinaria mitofágica são coordenados ainda não foi
totalmente elucidado. O dano mitocondrial causa o acúmulo de Pink1 na membrana mitocondrial externa, recrutando Parkin. A parkin
subsequentemente ubiquitina as proteínas mitocondriais , iniciando a separação dessa região do retículo por meio da fissão após o
acúmulo, levando então à degradação por meio da mitofagia . Enquanto o treinamento físico aumenta o mRNA de Pink1 no músculo
esquelético humano e o teor de proteína Parkin diminui após o exercício em ratos , essas descobertas estão longe de ser conclusivas.
Não encontramos mudanças significativas na proteína Pink1 no músculo esquelético após exercício agudo. Não podemos descartar um
papel para Pink1 na mitofagia induzida por exercícios. Em nossas mãos, é igualmente provável que não tenhamos detectado alterações em
Pink1 usando western blot por causa da pequena fração de pontos mitocondriais vermelhos “marcados na orelha”. Se Ampk / Ulk1 interagir
com Pink / Parkin para facilitar a mitofagia em resposta ao exercício ou por meio de outro mecanismo desconhecido, para distinguir
mitocôndrias danificadas permanece uma questão pendente.
Notamos que os pontos vermelhos puros estão sempre dissociados do retículo mitocondrial no músculo esquelético (Figs. 1, 5, 6e
Suplementar Fig. ). Isso é consistente com a noção de que a mitofagia seletiva em regiões da mitocôndria que são disfuncionais requerem
fissão mitocondrial. Curiosamente, Ampk também demonstrou promover a fragmentação da rede mitocondrial e fosforilar diretamente o
fator de fissão mitocondrial (Mff), que é um receptor Drp1 necessário para recrutar Drp1 para a membrana mitocondrial . Em apoio a este
conceito, Vainshtein e colegas relataram um aumento do Drp1 associado à mitocôndria imediatamente após exercício exaustivo em
camundongos . Também descobrimos que a fosforilação de Drp1 foi iniciada imediatamente após o exercício agudo no músculo
esquelético, apoiando a noção de fissão mitocondrial direcionada antes da degradação mitofágica. No entanto, se o Drp1 foi especificamente
associado com mitocondrial danificado ou disfuncional permanece desconhecido. Em contraste com alguns relatórios , em nossas
mãos o Ampk não parece ser responsável pela fosforilação de Drp1 em S616 ou S637, uma vez que observamos aumentos significativos nos
,
58 59
2+
60
,
58 59
,
61 62
,
62 63
64 65
1
66
19
,
45 46

níveis de fosforilação após exercício agudo em camundongos dnTG. No entanto, pode-se especular que Ampk desempenha um papel no
ajuste fino de Drp1 e fissão mitocondrial após o exercício, uma vez que a fosforilação de S637 em camundongos dnTG foi aumentada acima
dos níveis de WT após o exercício.
É importante ressaltar que em camundongos sem Ampk funcional (dnTG) no músculo esquelético, observamos uma tendência para uma
proporção elevada de vermelho: verde do MitoTimer, mesmo no nível basal. Essas observações podem refletir o papel da Ampk na
regulação da defesa antioxidante e sugere uma elevação basal do estresse oxidativo mitocondrial. No entanto, não houve aumento
adicional na proporção vermelho: verde após o exercício agudo, sugerindo que a produção mitocondrial de ROS atingiu o nível basal no
músculo esquelético dnTG e o exercício agudo não causou nenhuma elevação adicional. Nos camundongos MKO, no entanto, não houve
elevação da razão vermelho: verde do MitoTimer, no nível basal, sugerindo que a deleção do Ulk1 gene, ao contrário da inibição de Ampk,
não causa estresse oxidativo mitocondrial.
Por outro lado, os camundongos MKO exibiram um fenótipo semelhante de ausência de pontos vermelhos puros aumentados em resposta ao
exercício. Esta mitofagia prejudicada não indica necessariamente que não há mitocôndrias danificadas, particularmente à luz da elevada
proporção geral vermelho: verde do MitoTimer após o exercício. Em vez disso, essas observações são indicativas de direcionamento
defeituoso da maquinaria autofágica para a mitocôndria específica danificada. Esta noção é apoiada por estudos que identificaram uma
interação crítica entre Ulk1 e a proteína-esqueleto Htt, que é necessária para autofagia seletiva (incluindo mitofagia), mas não autofagia não
seletiva . Rui e colegas mostram que a interação física de Htt com Ulk1 é necessária para guiar Ulk1 ao local de formação do
autofagossomo, e a perda de Htt causa sequestro autofagossomo prejudicado de carga seletiva . Essas observações são consistentes com
nossos achados atuais quando Ulk1 foi especificamente depletado no músculo esquelético. Portanto, na ausência de Ulk1, o direcionamento
seletivo de Htt para o local de formação de autofagossomo pode ser prejudicado ou ineficaz, uma vez que o papel de Ulk1 na regulação da
formação de autofagossomo pode não ser realizado. A consequência aguda disso é o sequestro defeituoso de alvos autofágicos / mitofágicos
seletivos e o acúmulo potencial de organelas danificadas na célula. Na verdade, parece que Ulk1 pode desempenhar um papel importante na
adaptação metabólica induzida pelo treinamento de exercício, uma vez que os camundongos iMKO não apresentaram melhora na tolerância
à glicose após 4 semanas de corrida voluntária na roda e adaptação limitada no metabolismo do lactato durante um teste de corrida
exaustivo. Portanto,
Em resumo, demonstramos pela primeira vez que o exercício agudo induz mitofagia por meio da ativação dependente de Ampk de Ulk1 no
músculo esquelético. Além disso, a deleção do gene Ulk1 no músculo esquelético inibe a mitofagia sem afetar a formação de lisossomas em
resposta ao exercício, o que nos sugere um novo papel para Ulk1 no direcionamento de lisossomos para mitocôndrias danificadas /
disfuncionais que tem implicações para adaptações metabólicas ao treinamento de exercício.
Métodos
Animais
,
67 68
69
69

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela University of Virginia, Institutional Animal Care and Use Committee. Para
experimentos de curso de tempo pós-exercício, camundongos C57BL / 6 J machos (10-12 semanas de idade) foram obtidos comercialmente
(Jackson Laboratories). Para avaliar a sinalização relacionada à mitofagia basalmente, imediatamente após o exercício e 6 h após o
exercício, específico do músculo masculino, dominante negativo (dnTG) Ampk α2 (12–13 semanas de idade) e masculino
constitutivamente ativo (caTG) Ampk γ1 (13–15 semanas) foram criados e criados em casa na Universidade da Virgínia. Camundongos
MKO e iMKO foram obtidos por cruzamento entre Ulk1 e MCK-Cre (Jackson Laboratory) e entre Ulk1 eCamundongos HAS-
MerCreMer (presente generoso da Dra. Karyn Esser), respectivamente. Para examinar a mitofagia 6 h após o exercício e após o
treinamento, camundongos MKO (12–13 semanas de idade) e camundongos iMKO (18–20 semanas de idade) foram criados em casa. Antes
do uso, iMKO foram injetados ip com tamoxifeno (1 mg / 25 mg de peso corporal) uma vez ao dia por 5 dias para induzir o knock out do
Ulk1gene. Todos os camundongos foram alojados em quartos com temperatura controlada (21 ° C) com ciclo claro-escuro de 12: 12 h e
acesso ad libitum a água e ração (Purina). Optamos por estudar o músculo FDB localizado na base do pé posterior. Esta decisão foi baseada
principalmente nas vantagens práticas da localização e tamanho do músculo para facilidade de transfecção de plasmídeo e imagem de
montagem inteira. Além disso, o músculo FDB é conhecido por ser recrutado durante o exercício e se adapta ao treinamento de exercício
e exibe aumento da atividade Ampk em resposta à contração ex vivo . O FDB é composto principalmente por fibras do tipo IIa, que são
rápidas, oxidativas e contêm um pool mitocondrial de tamanho intermediário e a abundância de proteínas autofágicas também é
intermediária, entre os tipos musculares do tipo I e IIb . Portanto, é um músculo ideal para os fins deste estudo.
DNA de plasmídeo e transfecção
Projetamos e validamos o pMitoTimer como uma ferramenta útil para medir a saúde e os danos mitocondriais, conforme publicado
anteriormente . pLamp1-YFP foi adquirido na Addgene (Plasmídeo # 1816). Os construtos de plasmídeo foram transfectados no músculo
FDB por transferência de genes somáticos como publicado anteriormente . Resumidamente, os camundongos foram anestesiados
(isofluorano) e a base de cada pata de membro posterior, onde o FDB está localizado, foi injetada com 10 μl de hialuronidase (0,36 mg / ml;
Sigma) por via subcutânea. Uma hora depois, os camundongos foram anestesiados uma segunda vez e o FDB injetado com 20 μg de DNA
de plasmídeo. Nos casos em que pMitoTimer e pLamp1-YFPforam co-transfectados, foram misturados na proporção de 1: 1 e 20 μg de
DNA plasmídico total foram injetados. Dez minutos depois, um par de agulhas de acupuntura banhadas a ouro foi inserido sob a pele no
calcanhar e na base dos dedos paralelos entre si e perpendiculares ao longo eixo do pé. Dez pulsos com duração de 20 ms a 1 Hz e 75 V /
cm foram aplicados a cada pé. Para permitir que os camundongos se recuperassem e a expressão do plasmídeo fosse estável, esperamos 10
dias antes de realizar qualquer experimento.
Preparação de tecido e microscopia confocal
47
51
f / f 27 f / f
23
,
70 71
16
23
,
23 72

No momento da colheita do músculo, o FDB foi imediatamente fixado em paraformaldeído a 4% por 20 min e todo montado em lâminas
revestidas de gelatina com glicerol a 50% em solução salina tamponada com fosfato com uma lamela. As imagens foram adquiridas com
ampliação de 100 × sob um microscópio confocal (Olympus Fluoview FV1000) usando os canais verde (excitação / emissão 488/518 nm) e
vermelho (excitação / emissão 543/572 nm) com parâmetros de aquisição pré-determinados idênticos para todas as amostras para garantir
que não haja saturação dos sinais e intensidade semelhante dos canais verde e vermelho nas amostras de controle. As imagens Lamp1-YFP
foram adquiridas usando o canal amarelo (excitação / emissão 515/527). Os sinais do MitoTimer foram analisados

usando nosso algoritmo
baseado em Matlab de design personalizado, conforme publicado anteriormente . A co-localização de pontos MitoTimer vermelhos puros
e pontos Lamp1 amarelos foi quantificada por um algoritmo atualizado.
Exercício agudo
Os camundongos foram aclimatados à esteira por 3 dias consecutivos antes do dia experimental. A aclimatação consistiu em 10 min de
corrida em esteira com inclinação de 0% e velocidade de 13 m / min por dia. No dia do exercício agudo, os camundongos alocados para
realizar corrida em esteira foram submetidos a 5% de inclinação e 10 min a 13 m / min, 10 min a 16 m / min, 50 min a 19 m / min e, em
seguida, 20 min a 21 m / min. Os camundongos foram sacrificados nos pontos de tempo indicados após corrida na esteira.
Treinamento físico, capacidade de resistência e tolerância à glicose
Os irmãos Ulk1 MKO, iMKO e WT foram alojados individualmente em gaiolas com rodas de corrida e ratos sedentários que mantivemos
juntos em gaiolas não equipadas com rodas de corrida. Os ratos em exercício tiveram acesso livre à roda de corrida e todos os ratos
receberam comida e água ad libitum. A distância diária de corrida foi registrada por meio de monitoramento de computador. Em ratos
iMKO, após 4 semanas de rodagem voluntária, as rodas foram travadas por 24 he os ratos foram submetidos a um GTT. Após um jejum de
6 h, a glicose no sangue da veia da cauda foi medida antes e após a injeção ip de d esterilizado-glucose (2 mg / g) em 30, 60 e 120 min. As
rodas de corrida foram posteriormente desbloqueadas e, uma semana depois, os ratos foram submetidos a um exaustivo teste de exercício.
Os camundongos foram aclimatados à esteira como descrito acima. No dia do teste, a esteira foi ajustada para 5% de inclinação e funcionou
a 13 m / min por 30 min. A velocidade de corrida foi aumentada em 3 m / min a cada 30 min até a exaustão percebida. O lactato sanguíneo
foi medido antes e no momento da interrupção do exercício.
Western blotting
Proteína total ou lisados

enriquecidos com mitocôndrias foram submetidos a eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida e
transferidos para membrana de nitrocelulose. Os lisados

enriquecidos com mitocôndrias foram isolados por centrifugação diferencial do
músculo gastrocnêmio congelado. Resumidamente, os músculos foram pulverizados por almofariz e pilão e colocados em tampão de
fracionamento de 1 ml (FRAC) [HEPES 20 mM, sacarose 250 mM, EDTA 0,1 mM, mais protease (Roche Diagnostics) e inibidores de
fosfatase (Sigma)] e então sonicados. Os lisados

de tecido inteiro foram então centrifugados a 800 × g durante 10 min a 4 ° C. Os
23

sobrenadantes foram então centrifugados a 9000 × g durante 10 min a 4 ° C. Os sedimentos mitocondriais resultantes foram ressuspensos
em tampão FRAC, em seguida, girados a 11.000 × gpor 10 min a 4 ° C. Os pellets enriquecidos com mitocôndrias resultantes foram
ressuspensos em 50 μl de tampão Lamelli, fervidos por 5 min a 97 ° C e, em seguida, congelados a -80 ° C até análise posterior.
As membranas foram sondadas com os seguintes anticorpos primários na diluição de 1: 1000, visando Lc3A / B (CST # 4108), T172 Ampk
(CST # 2535), Ampk α1 / 2 (CST # 2532), Ampk γ1 (Abcam # 32508), S79 Acc (CST # 3661), Acc (CST # 3662), S555 Ulk1 (CST #
5869), S757 Ulk1 (CST # 6888), S467 Ulk1 (CST # 4634), Ulk1 (Sigma-Aldrich # A7481), S616 Drp1 (CST # 3455), S637 Drp1 (CST #
4867), Drp1 (CST # 8570), Vdac (CST # 4866), Tom20 (CST # 42406), Mfn2 (CST # 56889), Pink1 (Santa Cruz # 33796), Sec61a (CST #
14867), 4HNE (Abcam # 48506), α-Tubulina (camundongo, Abcam # 11304) e Gapdh (CST # 2118). Todos os anticorpos são provenientes
de coelho, salvo indicação em contrário acima. Todos os blots foram cortados em intervalos de kDa desejados, dependendo da localização
prevista para proteínas de interesse após a coloração de Ponseau-S para maximizar a utilidade de cada blot por sondagem de proteínas
múltiplas, com a mesma fonte, de uma vez só. os anticorpos secundários foram IR680 de cabra anti-rato e IR800 de cabra anti-coelho
(LICOR). As membranas foram digitalizadas usando o sistema de imagem infravermelho Odyssey (LICOR). As proteínas foram analisadas
em comparação com um padrão de proteína comum carregado em gel, antes do cálculo da proporção fosfo: total. Todas as varreduras não
cortadas podem ser encontradas nas Figs Suplementares. - .
Quantificação de DNA mitocondrial
O DNA foi isolado dos músculos gastrocnêmio e plantar usando procedimentos de isolamento de DNA padrão e qPCR em tempo real foi
usado para quantificar o mtDNA (Citocromo B) e expresso em relação ao nDNA (Gapdh). As sequências de primers usados

são as
seguintes; Citocromo B: (f) 5′ — ACG TCC TTC CAT GAG GAC AA — 3 ′; (r) 5′ — GGA GGT GAA CGA TTG CTA GG — 3 ′ e
Gapdh: (f) 5′ — ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG — 3 ′; (r) 5′ — CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC — 3 ′.
análise estatística
Os dados são apresentados como a média ± SEM. Os experimentos de curso de tempo são analisados

por meio de ANOVA unilateral com
análise post-hoc de Newman-Keuls. Quando duas variáveis

estão presentes, os dados foram analisados

usando ANOVA de dois fatores com
análise post-hoc de Tukey, quando apropriado. Onde uma variável está presente, os dados foram analisados

usando o teste t de Student . Os
dados com variância significativamente desigual foram transformados antes da análise estatística. A significância estatística foi estabelecida
a priori como p <0,05.
Disponibilidade de dados
Os dados gerados neste estudo estão disponíveis com o autor correspondente, mediante solicitação razoável.
Material eletrônico suplementar
5 11

Informações suplementares Figuras suplementares
Arquivo de revisão por pares
Reconhecimentos
Este trabalho foi apoiado por NIH (R01-AR050429) para ZY, bolsa de pós-doutorado AHA (14POST20450061) para RCL, NIH (T32
HL007284-38) e bolsa de pós-doutorado ADA (1-16-PDF-030) para JCD NIH (T32 HL007284-37), bolsa de pré-doutorado da AHA
(114PRE20380254) para RJW, NIH (R01-DK101043) para LJG e NIH (5P30 DK36836) para Joslin Diabetes Center. Agradecemos à Dra.
Karyn Esser pelo generoso presente dos ratos HAS-MerCreMer . Agradecemos também ao Dr. David F. Kashatus, membros dos laboratórios
Yan e Hoehn pelo feedback crítico e discussão.
Contribuições do autor
RCL planejou o estudo, realizou experimentos, analisou dados e escreveu o manuscrito, JCD planejou o estudo, realizou experimentos,
analisou dados e escreveu o manuscrito. RJW realizou experimentos, forneceu assistência técnica e editou o manuscrito, VAL elaborou o
estudo e analisou os dados, KAR e JJS projetaram o programa MATLAB e forneceram consultoria computacional especializada, MZ
realizou experimentos e forneceu assistência técnica, BML e CCF forneceram assistência técnica, LJG e MK forneceu modelos de
camundongos, conselhos de especialistas e fez críticas ao manuscrito, e ZY projetou o estudo, analisou os dados e escreveu o manuscrito.
Notas
Interesses competitivos
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Notas de rodapé
Rhianna C. Laker e Joshua C. Drake contribuíram igualmente para este trabalho.
Material eletrônico suplementar
Informações suplementares acompanham este documento em doi: 10.1038 / s41467-017-00520-9.
(26M, pdf)
(286K, pdf)

Nota do editor: a Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
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